ELISA

HIV infekcijas pierādīšanas eksperiments.

HIV antivielu pierādīšana asinīs

Skolotāja sagatavošanās eksperimentam

• Mazgājošais buferšķīdums (900 ml)

805 ml H2Odest. + 90 ml PBS (10x) + 4,5 ml Tween 20 Mazgājošais buferšķīdums nepieciešams antivielu šķīduma atšķaidīšanai un mikrotitrēšanas stobriņu mazgāšanai.

• Tween 20 satur BSA buferšķīdumu ,kurš bloķēs brīvās proteīna virsmas molekulas.

1. Buferšķīdumu sagatavošana

• PBS-buferšķīdums (100 ml)

90 ml H2Odest. + 10 ml PBS buferšķīdums (10x)

PBS-bufferšķīdums nepieciešams hidrofīlo antigēnu un antivielu rehidratācijai.

2. Rehidratācija

•Iepiliniet pa 0,5 ml atšķaidīto PSB bufer šķ. antigēnu un primāro un sekundāro antivielu traukos!

Visi darba šķīdumu krājumi ir 50 x koncentrētāki!

•Atskrūvējiet korķi antivielu un antigēnu šķīdumu traukiem!

•Aizskrūvējiet traukus ar korķiem un kratiet ap 2 min.!

!

3. Etiķetes uzlīmēšana

Marķējiet ar etiķetēm polifenola pudeles:

- Antigēns

-Primārā antiviela

-Sekundārā antiviela Antigēns

Skolēnu sagatavošanās eksperimentam

8 darba grupām

Reaģentu daudzums ir pietiekošs 8 darba grupām 3 eksperimentiem!

(3 x 160 µl kopējais reaģentu patēriņš = 480 µl; 500 µl -pudeles tilpums )

Lietoto stobriņu pārskats:

Stobriņakrāsa

Apzīmējums Stobriņu saturs Tilpums

zaļš AG antigēns 800 µl

oranžs s AB Sekundārā antiviela 800 µl

brūns SUB substāts 800 µl

violēts p AV Primārā antiviela 120 µl

zils M B Mazgājošais buferšķīdums 120 µl

dzeltens - - - - Tukšs !

1. Paraugu sagatavošana P1 – P8

• Uzrakstiet uz 8 dzeltenajiem stobriņiem savas darba grupas Nr.!• Piepiliniet 60 µl primārā antivielu šķ. (p AV, pozitīvā testa rezultātu) vai • 60 µl mazgājošā buferšķīduma ( MB, negatīvā testa rezultātu) katrā no dzeltenajiem stobriņiem ar Nr. no P1 līdz P8! Numurējiet tos!• Izsniedziet pa vienam stobriņam katrai darba grupai!

!

Sagatavoto stobriņu pārskats:

Krāsa Apzīmējums Stobriņa saturs Tilpums

zaļš AG antigēns 800 µl

oranžs s AB Sekundārās antivielas 800 µl

brūns SUB substrāts 800 µl

violets p AB Primārās antivielas 120 µl

zils M B Buferšķīdums mazgāšanai 120 µl

dzeltens P1-P8 Asins serumu paraugi ” no 1- 8 60 µl katrā

2. ELISA testa veikšana

2.1 Antigēnu saistīšana uz mikrotitrēšanas stobriņiem

- Apzīmējiet stobriņus pēc sekojoša parauga!

-Iepiliniet 50 µl antigēnu šķ. (AG, zaļais stobriņš) – katrā no 12 stobriņiem!

- Inkubējiet tos 5 min.!

+ + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

Antivielu pierādīšana pamatlikums

•Antigēns piesaistās pie virsmas

2. Mikrotitrēšanas stobriņu mazgāšana

• Izkratiet stobriņu saturu uz salvetēm!

• Iepiliniet 250 µl mazgājošā bufera katrā no stobriņiem!

Uzmanību!Pilinot buferšķīdumu trauciņu mazgāšanai, tas nedrīkst ielīt citos stobriņos!

•Vēlreiz izkratiet stobriņu saturu uz salvetēm!

Antivielu pierādīšanapamatlikums

•Antigēni piesaistās pie virsmas

• Visa virsma ir “ aizņemta” ar piesaistītajām antivielām

•Pozitīvai kontrolei: piepiliniet 50 µl primāro antivielu

( p AV, violetajā stobriņā) divos ar “ + ”apzīmētajos stobriņos!

2.3. Paraugu sagatavošana kontrolei

• Negatīvai kontrolei: piepiliniet 50 µl mazgājošo buferšķ. ( MB,zilajā stobriņā) divos ar “ - ” lapzīmētajos stobriņos!

pAb

WB

+ + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

2.3. Paraugu sagatavošana kontrolei

•Inkubējiet tos 5 min.!

• Paraugos 1-8: piepiliniet 50 µl testējamo personu serumus P1- P8 katrā no atbilstošajiem 8 stobriņiem!

•Lietojiet jaunus uzgaļus katram stobriņam!

+ + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8

Antivielu pierādīšanapamatlikums

• antigēns piesaistās pie virsmas

• visa virsma ir “aizņemta” ar piesaistītajām antivielām

• pievienojot serumu, var pierādīt antivielu klātbūtni

2.4. Mikrotitrēšanas stobriņu mazgāšana(skatīt 2.2.)

tukšs + 250 µl M B tukšs

2.5. Sekundāro antivielu pievienošana

•Inkubējiet tos 5 min.!

• Piepiliniet 50 µl sekundāro antivielu šķ. (s AB, oranžais stobriņš) katrā no12 stobriņiem!

Antivielu pierādīšana pamatlikums

• antigēns piesaistās pie virsmas

• visa virsma ir “aizņemta” ar piesaistītajām antivielām

• pievienojot serumu, var pierādīt antivielu klātbūtni

• enzīma piesaistītās antivielas piesaistās pie antivielu epitopa

tukšs + 250 µl MB tukšs

2.6. Mikrotitrēšanas stobriņu divkārša mazgāšana (skatīt 2.2. )

2.7. Substrāta pievienošana

•Inkubējiet tos 5 min.!

• Piepiliniet 50 µl substrāta šķ.(SUB, brūnais stobriņš) katrā no 12 stobriņiem!

Antivielu pierādīšana pamatlikums

• antigēns piesaistās pie virsmas

• visa virsma ir “aizņemta” ar piesaistītajām antivielām

• pievienojot serumu, var pierādīt

antivielu klātbūtni

• enzīma piesaistītās antivielas piesaistās pie antivielu epitopa

• reakcija tiek pierādīta ar enzīmu iesaistīšanos reakcijās

3. Izvērtējums

Tests ir + , ja stobriņu saturs kļūst zils.

Tests ir - , ja to saturs paliek bezkrāsains ( kā kontrole).

Salīdziniet savas darba grupas rezultātus ar citām!

+ + - - P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8