EMOCOMPONENTI PER USO TOPICO: LA MEDICINA … · pagina 7 Emocomponenti per uso topico 2.1 Generalità In generale due sono le modalità di guarigione dei tessuti danneggiati: mediante

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Emocomponenti per uso topico

EMOCOMPONENTI PER USO TOPICO:LA MEDICINA TRASFUSIONALE INCONTRA

LA MEDICINA RIGENERATIVA

Gaetano Caloprisco, Alessio Borean

Dipartimento di Immunoematologia e Medicina TrasfusionaleOspedale San Martino di Belluno

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SOMMARIO

Sempre più esteso è l'interesse, in diversi ambiti

clinici, per l'applicazione a scopo riparativo di

emocomponenti prodotti da sangue periferico.

Nella maggioranza si tratta di concentrati piastrinici

in grado di rilasciare localmente fattori di crescita

(GFs) che stimolano il risanamento tessutale.

Parallelamente sono in aumento studi e pubblica-

zioni da parte di gruppi di ricerca che stanno rivalu-

tando anche il ruolo e l' utilizzo della componente

leucocitaria assieme a quella piastrinica.

Questa esposizione vuole essere una rassegna

dell'evoluzione che hanno subito nel tempo gli

emocomponenti utilizzati a scopo riparativo, e vuo-

le individuare i futuri scenari sia produttivi che ap-

plicativi. In particolare evidenziare l'incontro fra la

medicina trasfusionale e rigenerativa, due aree che

si sovrappongono per storia, competenze scientifi-

che e normativa.

Key words:

Emocomponenti, rigenerazione, fattori di crescita,

cellule mononucleate.

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Da quando un chirurgo maxillofacciale americano(Marx RE) pubblicò nel 1998 i primi risultati riguar-danti l'accelerazione della crescita dell'ossomandibolare, ottenuta con l'aggiunta locale al tra-pianto di osso spugnoso di concentrati piastrinici(1), si è progressivamente sviluppato un grande in-teresse per l'applicazione topica delle piastrine, in-cluse o meno in una matrice fibrinica, quali fonte difattori di crescita per lo stimolo alla riparazionetissutale. Questo impiego iniziato in campoodontostomatologico, si è allargato rapidamenteall'ortopedia e ad altri ambiti specialistici per la te-rapia di patologie caratterizzate da difetto dei pro-cessi di riparazione, riguardante anche i tessuti mollicome ulcere cutanee di varia origine, tendini, epiteliocorneale (2-7).In questo processo di ampliamento, la medicinatrasfusionale si trova a confrontarsi con l'attualecampo di grande interesse costituito dalla medici-na rigenerativa. L'eterogeneità degli ambiti di ap-plicazione e dei metodi di preparazione e applica-zione del prodotto, hanno arricchito la letteratura dinumerose pubblicazioni, la maggioranza delle qualirappresentate da comunicazioni aneddotiche matutte caratterizzate, da una parte da promettenti ri-sultati, dall'altra dalla mancanza di un concorde eben definito standard di prodotto, al di là di un co-mune riconoscimento di un range di efficacia rela-tivo alla concentrazione ottimale delle piastrinecompreso tra 1 e 2 milioni per microlitro (8,9).

Numerosi dispositivi del commercio sono stati pro-posti per semplificare l'ottenimento più o menoestemporaneo del gel piastrinico (questa è ancoral'attuale denominazione acquisita dalla normativavigente del PRP attivato con trombina e utilizzato a

scopi rigenerativi).Ciònonostante, considerata l'origine umana e leimplicazioni inerenti la produzione, conservazione,sicurezza e controlli di qualità, il prodotto è annove-rato tra gli emocomponenti sebbene destinato aduso topico, e quindi soggiace alle norme che rego-lano l'attività trasfusionale.Con la presente rassegna si intende richiamare lebasi fisiopatogenetiche della riparazione tissutalee il razionale dell'attuale impiego degliemocomponenti ad uso topico come il classico gelpiastrinico (PG) e allo stesso tempo, aprire una fi-nestra che lasci intravedere nuove prospettive nel-l'ambito della medicina rigenerativa, alla ricerca diuna sinergia tra fattori di crescita piastrinici, celluleematiche e tissutali. Tra le cellule ematiche, si è de-lineato in particolare il ruolo delle cellule staminalida sangue periferico, riscontrate (ex-post) negliemocomponenti ottenuti mediante leucopiastrino-aferesi senza stimolazione del paziente, e il cui uti-lizzo prescinde da qualsiasi manipolazioneestensiva.La sinergia fra i protagonisti cellulari e umorali del-la rigenerazione, presenti nell'emocomponenteleuco-piastrinico, tende a mimare nel sito di appli-cazione, il fisiologico processo di riparazionetissutale. Infatti, riuscire a porre in atto per finiterapeutici, una replica del suddetto processo fi-siologico, al di là della complessità dei fenomeniche lo caratterizzano, si sostanzia in un rafforza-mento e amplificazione dello stimolo nella sededella lesione. I risultati ottenuti in diversi contesti diricerca e di impiego clinico indicano un prometten-te campo di sviluppo della medicina trasfusionalecon un'interessante prospettiva di attivitàmultidisciplinare.

1.0 - I1.0 - I1.0 - I1.0 - I1.0 - INTRNTRNTRNTRNTROOOOODDDDDUZUZUZUZUZIIIIIOOOOONNNNNEEEEE

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2.1 Generalità

In generale due sono le modalità di guarigione deitessuti danneggiati:✓ mediante un processo di rigenerazione cheesita nella completa ricostituzione morfologica e

✓ mediante un processo di riparazione checomporta la sostituzione del tessuto danneggiatocon un connettivo.

Qualsiasi tipo di riparazione tissutale,schematicamente, prende origine dalla formazio-ne di un coagulo ematico e segue un comune an-damento di eventi costituito da tre frasi:1. una fase infiammatoria2. una fase di formazione del tessuto di

granulazione3. una fase di rimodellamento tissutale

In realtà, queste fasi si svolgono attraverso unainterazione molto precisa, biologicamente bilanciatae programmata, tra le cellule costituenti la struttu-ra tissutale e un network di fattori umorali (10).La prima risposta dell'organismo ad una lesione, èla formazione del coagulo ematico costituito fon-damentalmente da filamenti di fibrina, formatisi dalfibrinogeno plasmatico, e delle piastrine attivate.Questo mira alla creazione di un'efficiente barrieraemostatica, previene l'ingresso dei microorganisminel sito danneggiato e rappresenta una guida lun-go la quale le cellule possono migrare e proliferareper rimpiazzare quelle danneggiate o distrutte.Successivamente alla formazione del coagulo ini-zia la fase infiammatoria innescata da specifichemolecole segnale liberate da piastrine e leucociti.Il risultato è il reclutamento nella zona del tessutodanneggiato di leucociti che, rimuovendo i fram-menti delle cellule morte e qualsiasi materiale estra-neo, preparano il sito per la replicazione e migra-zione delle nuove cellule tissutali.La fase del ripristino tissutale passa attraverso lacreazione di un ambiente fisiologico che favorisceil reclutamento nel coagulo di cellule indifferenziatee orienta la loro proliferazione.Questa fase richiede la partecipazioneconcomitante della matrice extracellulare, costitu-

ita da diverse macromolecole tra cui la fibrina, e lepiastrine attivate da molecole segnale rilasciate dadiverse sorgenti. Le piastrine attivate rilasciano lo-calmente fattori di crescita (GFs) che inducono unprimo e potente segnale rigenerativo (sopravvivenzae replicazione cellulare).Anche i leucociti, in particolare i monociti/macrofagi, partecipano attivamente al processorigenerativo rilasciando, quando attivati, un networkdi GFs in particolare VEGF (Vascular EndotelialGrowth Factor) che gioca un ruolo decisivo nell'av-vio dell' angiogenesi. Importante nella riparazioneè anche la matrice extracellulare, in particolare dellemacromolecole che favoriscono la citoconduzionenel sito di lesione come la fibrina e la fibronectina(11).

2.2 Meccanismi di riparazione dei tessuti

La lesione di un tessuto, come accennato, com-porta nell'immediato la distruzione dei vasi sangui-gni locali e la formazione del trombo piastrinico. Lepiastrine attivate localmente, oltre ad esercitare unafunzione emostatica, rilasciano dagli alfa-granuliuna serie di GFs che inducono attivazione di cellu-le residenti come macrofagi e fibroblasti, essenzia-li nel processo di riparazione (10). In questa faseiniziale numerosi fattori chemiotattici e vasoattivisono prodotti dalla coagulazione e dall'attivazionedel complemento. Nel sito di lesione infatti vengo-no reclutati oltre che granulociti neutrofili anchemonociti, che infiltrano il tessuto leso e si trasfor-mano in macrofagi rilasciando a loro volta citochineinfiammatorie e GFs importanti nel processo di ri-parazione. Questa trasformazione da monocita amacrofago è facilitata dall'interazione con la matri-ce extracellulare del tessuto leso. Il ruolo centraledel macrofago nella transizione da infiammazionea riparazione è stato storicamente dimostrato dalfatto che animali depleti di macrofagi difettano nellarigenerazione tessutale (12). Dai margini della le-sione le cellule tendono a migrare verso il centro,tra il collagene e la fibrina, procedono degradandola matrice extracellulare grazie alle collagenasi at-tivate dalla plasmina. Questo processo di migrazio-ne e proliferazione inizia uno due giorni dopo la le-sione: il rilascio di GFs e l'aumento dei relativi

2.0 - LA RIPARAZIONE DEI TESSUTI

funzionale del tessuto;

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recettori innescato dalle piastrine e proseguito damacrofagi e fibroblasti sembra esserne lo stimoloefficace (13).In linea generale, perché il processo di riparazionesi compia correttamente, sono necessari tre ele-menti fondamentali: l'impalcatura (matriceextracellulare), le cellule del tessuto, i fattori di cre-scita. Questa triade manifesta la sua importanzadurante la formazione del tessuto di granulazione.Dopo circa quattro giorni nuovo tessuto, costituitoda neovasi, fibroblasti e macrofagi, invade il sito dilesione. I macrofagi attivati, fonte continua di GFs,inducono uno stimolo fibroblastico e angiogeneticoimportante per il mantenimento del processo.I fibroblasti attivati oltre che essere anch'essi fontedi GFs, producono nuova matrice extracellulare chesupporta la proliferazione e migrazione delle cellu-le. Le molecole della matrice extracellulare infatticostituiscono una impalcatura che guida e favori-sce la formazione e migrazione delle cellule deltessuto di granulazione. In un sito tissutale leso lemolecole della matrice presenti e neosintetizzatenell'immediato sono rappresentate da fibrina,fibronectina e acido ialuronico; mentre il collageneviene prodotto in un secondo momento. In partico-lare, la fibronectina con i relativi recettori cellulari ela fibrina, sembrano essere dei fattori limitanti nelprocesso di formazione del nuovo tessuto (14).I fibroblasti sono i responsabili della sintesi, depo-sizione e rimodellamento della matriceextracellulare; inversamente, la matrice può avereun ruolo positivo o negativo sull'abilità dei fibroblastidi sintetizzare, depositare e rimodellare. Come ac-cennato, perché la migrazione cellulare avvenga ef-ficacemente attraverso il coagulo ematico, deveessere operativo un efficiente sistema proteoliticocostituito sia da enzimi plasmatici, sia da quelli pro-venienti dagli stessi fibroblasti (attivatore delplasminogeno, collagenasi). I fibroblasti migrati nellalesione e attivati dai GFs, sintetizzano una provvi-soria matrice extracellulare insieme a fibrecollagene (15). La sintesi di collagene procede finoad un certo punto oltre il quale un segnale induceapoptosi dei fibroblasti, permettendo in questomodo una corretta riparazione del tessuto leso.Nella rigenerazione tissutale la formazione di nuo-vi vasi è necessaria al sostentamento del tessuto

neoformato. L'angiogenesi è un complesso proces-so che coinvolge la matrice extracellulare e lo sti-molo mitogeno delle cellule endoteliali. Laproliferazione delle cellule endoteliali è indotta daalcuni GFs fra cui i più importanti sono il fibroblastgrowth factor (FGF), trasforming growth factor

in questa situazione il macrofago attivato sembragiocare un ruolo chiave essendo un grande pro-duttore dei GFs menzionati. Contestualmente, lecellule epiteliali attivate a loro volta producono no-tevoli quantità di VEGF. Il FGF sembra essereimportante nei primi 3 giorni del processo di ripa-razione, mentre il VEGF è critico per l'angiogenesidal 4° al 5° giorno. Fattori angiogenetici secreti daimacrofagi stimolano l'endotelio a rilasciarel'attivatore del plasminogeno e procollagenasi. Il pri-mo converte il plasminogeno in plasmina mentre ilsecondo è convertito in collagenasi, ed entrambi insinergia digeriscono la membrana basale permet-tendo alle cellule endoteliali di migrare e formarenuovi gettoni vasali nella sede della lesione (16).Riempita la lesione con tessuto di granulazione,l'angiogenesi cessa e molti nuovi vasi regrediscono;questa morte cellulare programmata è regolata davarie molecole della matrice extracellulare(trombospondina, angiostatina, angiopoietina).Dopo circa due settimane da una lesione cutanea,ad esempio, i fibroblasti sempre sotto lo stimolo di

della membrana cellulare microfilamenti di actina,favorendo la contrazione della lesione. Contempo-raneamente la continua sintesi e degradazione delcollagene, controllata da enzimi proteolitici secretida macrofagi, endotelio ed epitelio, rimaneggia erimodella il tessuto di granulazione portando allariepitelizzazione e guarigione la lesione cutanea(17).Questi, in sintesi sono i processi fisiologici base del-la riparazione di un danno tissutale; tuttavia, vi sonocircostanze nelle quali il processo potrebbe risul-tare inefficiente per alcune ragioni come ad esem-pio ridotto flusso ematico, ridotte capacitàrigenerative dovute all'invecchiamento, inattivazionedi fattori di crescita e dei rispettivi recettori. Ciò de-termina come conseguenza, una compromissionee/o un ritardo di guarigione. Per superare una tale

(TGF-b1) e vasal-endotelial growth factor (VEGF);

TGF-b1e PDGF producono sul lato citoplasmatico

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endoteliali, inibisce gli osteoclasti e il riassorbimentoosseo.

EEEEEGGGGGFFFFF (Epidermal growth factor): stimola le cellulemesenchimali ed epidermiche.

IIIIIGGGGGF-IF-IF-IF-IF-I (Insulin like growth factor-I): favorisce laproliferazione degli osteoblasti attivandone i precur-sori, stimola la deposizione di osso, svolge una azio-

ne paracrina e autocrina su fibroblasti e macrofagi.

VEVEVEVEVEGGGGGFFFFF (Vascular endotelial growth factor): secreto damacrofagi e fibroblasti ma anche contenuto nellepiastrine, induce la formazione di nuovi vasi sia daparte dei progenitori delle cellule endoteliali(vasculogenesi durante lo sviluppo embrionale) chemediante gemmazione di nuovi capillari dai vasi esi-stenti (angiogenesi).

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3.1 Produzione del gel piastrinico

La produzione del classico gel piastrinico (PG) vie-ne effettuata presso numerose strutture utilizzan-do emocomponenti autologhi oppure omologhi, rac-colti con diverse metodologie (9,21). Il PG è unemocomponente che risulta dalla attivazione del mixdi due emocomponenti tradizionali: il concentratopiastrinico e il crioprecipitato.Il concentrato piastrinico è fonte di fattori di cre-scita e il crioprecipitato di fibrinogeno, fibronectinae altri fattori procoagulanti base per la formazionedella colla di fibrina.L'attivazione del mix, effettuato attualmente contrombina (ottenuta da un campione di sangue coa-gulato oppure dal crioprecipitato), in presenza dicalcio gluconato (o cloruro), determina la forma-zione di un gel costituito da colla di fibrina (CDF) eaggregato piastrinico. La presenza di CDF, oltre cheapportare proteine della matrice come lafibronectina, aumenta la plasticità e malleabilità delPG che risulta così facilmente manipolabile in fun-zione alle esigenze pratiche di applicazione (ulce-re, tessuto osseo). Il mix può essere aliquotato ste-rilmente e conservato a -40° in forma di lisato dipiastrine, sospese in crioprecipitato e utilizzato indifferita per applicazioni successive.

La raccolta degli emocomponenti necessari perprodurre il PG viene effettuata sostanzialmente contre modalità:

1) Prelievo e processazione in provette:1) Prelievo e processazione in provette:1) Prelievo e processazione in provette:1) Prelievo e processazione in provette:1) Prelievo e processazione in provette: si trattaper lo più di dispositivi specifici esistenti in com-mercio, sistemi miniaturizzati e/o semi automaticidi prelievo e separazione. Il metodo risultaapplicabile in pazienti il cui trattamento non preve-da uno stimolo reiterato, con necessità di piccolequantità di prodotto. Forniscono un concentratopiastrinico variabile a seconda del dispositivo tra 5e 7 mL da attivare e applicare estemporaneamente.

2) Prelievo di sangue intero in sacca multipla:2) Prelievo di sangue intero in sacca multipla:2) Prelievo di sangue intero in sacca multipla:2) Prelievo di sangue intero in sacca multipla:2) Prelievo di sangue intero in sacca multipla:dopo il salasso di sangue intero si procede alla se-parazione di plasma povero e concentratopiastrinico con eventuale reinfusione dei globulirossi.

3.0 - MODALIT3.0 - MODALIT3.0 - MODALIT3.0 - MODALIT3.0 - MODALITÀ DI PRODUZIONE E APPLICAZIONE DEGLIÀ DI PRODUZIONE E APPLICAZIONE DEGLIÀ DI PRODUZIONE E APPLICAZIONE DEGLIÀ DI PRODUZIONE E APPLICAZIONE DEGLIÀ DI PRODUZIONE E APPLICAZIONE DEGLIEMOCOMPONENTI PER USO RIGENERAEMOCOMPONENTI PER USO RIGENERAEMOCOMPONENTI PER USO RIGENERAEMOCOMPONENTI PER USO RIGENERAEMOCOMPONENTI PER USO RIGENERATIVOTIVOTIVOTIVOTIVO

3) Prelievo multicomponente: 3) Prelievo multicomponente: 3) Prelievo multicomponente: 3) Prelievo multicomponente: 3) Prelievo multicomponente: si ottengono con ilseparatore cellulare piastrine concentrate e plasmapovero il quale, come per il plasma ottenuto da clas-sico prelievo, può seguire l'iter per la produzionedel crioprecipitato che verrà il giorno successivo,miscelato con il concentrato piastrinico.Diverse modalità di raccolta permettono di calibrarela quantità e qualità del prodotto in funzione dellecaratteristiche di estensione e tipologia della lesio-ne da trattare.Ogni paziente viene indirizzato alla metodica di pro-duzione (aferesi multicomponente con separatorecellulare o salasso con sacca multipla) degliemocomponenti necessari per la formazione del PGin funzione all'idoneità dell'accesso venoso e allanecessità di ottenere più o meno materiale. Pro-durre una buona quantità di materiale permette diripartire e conservare lo stesso in più aliquote daapplicare successivamente come lisato piastrinico(piastrine sospese in crioprecipitato e conservatea - 40°C).Risulta comodo, sicuro, funzionante e poco costo-so, conservare su un supporto sterile a -40°C laparte eventualmente restante del gel già attivato,dopo averne utilizzata la frazione necessaria pertrattare la lesione.Per motivi clinici e pratici (tempi e modalità opera-tive, standardizzazione del metodo, restituzione de-gli eritrociti post separazione e vincoli per il pazien-te) può essere preferibile il prelievo medianteseparatore cellulare. In seduta unica, si possonocosì ottenere emocomponenti di partenza che sod-disfano qualitativamente e quantitativamente iltarget per la produzione del PG. Preimpostandoalcuni parametri si può modulare la procedura diprelievo in modo da ottenere le caratteristiche ri-cercate degli emocomponenti. In questo modo èpossibile ottenere concentrati piastrinici a elevataresa tale che, anche dopo miscelazione concrioprecipitato, conservano una concentrazione diPLT nel range di efficacia (1000-2000 x103

�L)(1,8).Le concentrazioni di PLT ottenute rendono possi-bile calibrare i volumi in funzione delle aree da trat-tare e delle eventuali aliquote da conservare perapplicazioni successive (con semplificazione e ri-duzioni dei costi). La raccolta con separatore

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cellulare, inoltre, riduce ad un tempo unico il prelie-vo, con minor disagio per il paziente e minore im-piego di tempo tecnico ed infermieristico.Per entrambe le modalità di raccolta prospettate,l'intervallo di tempo necessario intercorrente tra lafase di raccolta e la prima applicazione del gel è dialmeno 24 ore, necessarie per la formazione dalplasma del crioprecipitato. In verità, per ridurre ildisagio del paziente, una piccola aliquota di con-centrato leuco-piastrinico presente nel tubicino ditrasferimento dell'ultimo ricircolo può essere subi-to utilizzata per la prima applicazione a fine proce-dura. Stimolo risultante efficace.Da sottolineare infine anche la possibilità di utiliz-zo di emocomponenti omologhi in quei pazienti che

Finestra dei metodi: Raccolta con separatore cellulare del concentrato leuco-piastrinico e delplasma (Figura 1) - - - - - La procedura di raccolta da noi adottata prevede l'utilizzo del separatore cellulareHaemonetics MCS+ (Haemonetics Corp., Braintree, MA, USA), un circuito per la raccolta delle cellule staminaliperiferiche (Cod. 971E) e un protocollo di separazione modificato. La modifica dei parametri di separazione èstata eseguita per ottenere a fine procedura due emocomponenti intermedi, il plasma e un concentrato leuco-piastrinico (CLP) ricco di piastrine e cellule mononucleate. La configurazione modificata, prevede uno o duericircoli ogni circolo a seconda delle esigenze. L'inizio della raccolta delle cellule mononucleate è stato fissatoal 70% della trasmittanza totale e la rilevazione degli eritrociti al 12%. Il volume di eritrociti raccolti per ogniciclo è stato fissato a 30 mL e per ogni ricircolo a 10 mL. L'anticoagulante utilizzato durante la raccolta è statol'ACD nel rapporto di 1:9. Alla fine della procedura della durata di circa 30-60 minuti (uno o due ricircoli), sonostati ottenuti in sacche separate due emocomponenti intermedi, plasma e CLP.

Finestra dei metodi: Produzione del concentrato leuco-piastrinico arricchito in crioprecipitato(Figura 1) - La nostra procedura prevede che il concentrato leuco-piastrinico (CLP) ottenuto col separatorecellulare sia arricchito delle proteine contenute nella frazione insolubile del crioprecipitato. Per produrre ilcrioprecipitato la sacca di plasma viene connessa sterilmente ad una sacca satellite con un saldatore TSCD(Terumo Italia, Segrate, MI, Italia) e congelata mediante un abbattitore di temperatura (Challeng 250, AngelantoniIndustrie, Italia) per 30 minuti a -80°C. Successivamente la sacca di plasma viene lentamente scongelata persifonamento a 4°C per 18 ore per ottenere il crioprecipitato. Dopo completo deflusso del plasma nella saccasatellite il crioprecipitato adeso sulle pareti della sacca viene risolubilizzato a temperatura ambiente ritrasferendouna quota di plasma della sacca satellite. Temporaneamente il CLP viene riposto in agitatore meccanico atemperatura controllata per 18 ore a 22K 2°C per mantenere in sospensione le cellule. Dopo18 ore daltubicino satellite della sacca del CLP viene asportato un piccolo segmento contenente circa 500 L di CLPnecessari per i conteggi cellulari e i test clonogenici.Il CLP viene quindi addizionato di crioprecipitato aggiungendo DMSO (Cryo-Sure-DMSO, Wak-Chemie MedicalGMBH) se si vuole mantenere la vitalità cellulare nel prodotto congelato, per una quota rispettivamente del15 e 5 percento sul volume totale, ottenendo l'emocomponente finale (CLPmix). Il crioprecipitato e il DMSOvengono aggiunti utilizzando un dispositivo (rubinetto a tre vie) per la somministrazione di soluzioni intravenose(Aries, Biomedical Devices), dopo connessione sterile alla sacca del CLP. Queste operazioni vengono esegui-

non sono idonei per l'impraticabilità dell'accessovenoso e/o scadute condizioni generali. La possi-bilità di aliquotazione e conservazione dei compo-nenti omologhi permette la riduzione del numerodi donatori necessari per completare il ciclo di te-rapia con PG nel caso ad esempio delle ulcerecutanee. Inoltre, lo stesso donatore potrebbe es-sere "dedicato" al trattamento di un determinatopaziente reiterando le donazioni, se necessario, congli intervalli previsti per le donazioni di piastrine.L'impiego omologo impone delle accortezze e al-cuni interrogativi in relazione alla sicurezza che ob-bligano a specifica emovigilanza (compatibilità digruppo, compatibilità Rh, immunizzazione, infezionivirali, distribuzione, tracciabilità).

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3.2 Attivazione e applicazione del gelpiastrinico

La formazione del PG (attivato con le modalità de-scritte) avviene nel tempo di 0,5 - 2 minuti in fun-zione del tipo di siero ricco in trombina utilizzato,prodotto da crioprecipitato o da sangue intero.Durante questo lasso di tempo l'operatore potrà in-dividuare il momento più idoneo all'applicazione delgel in funzione della patologia da trattare. Nel casodi lesioni con perdita di sostanza o cavità l'attiva-zione potrà essere effettuata miscelando le singo-le componenti in siringa introducendole nella le-sione dove si completerà la gelificazione. Nei casipiù frequenti in cui si richieda un'applicazione perapposizione (ulcere cutanee), l'attivazione del pro-dotto può essere completata in capsula di Petri osu altro specifico supporto (acido ialuronico,idrofibra).Nella preparazione del PG l'aggiunta delcrioprecipitato al concentrato piastrinico permettedi ottenere una consistenza superiore del prepara-to rendendolo facilmente modellabile e applicabile.Il crioprecipitato è fonte, oltre che di elevate con-centrazioni di fibrinogeno anche di fibronectina im-portante glicoproteina della matrice extracellulareche media l'adesione con le cellule. Questo forni-sce (insieme all'acido ialuronico) alle cellulerigeneranti un supporto che favorisce la loro mi-grazione nel sito di lesione. In sintesi, l'obiettivo èorientato a ricreare un ambiente nel sito della le-sione il più possibile simile a quello che si ha nelleriparazioni naturali portando localmente fattori di

crescita, fattori plasmatici chemiotattici e vasoattivi(prodotti dalla coagulazione e dall'attivazione delcomplemento) ed elementi della matriceextracellulare (22).L' applicazione su lesioni cutanee del prodotto uti-lizzando un supporto consente anche una appros-simata stima della dose dei fattori di crescita som-ministrati. Infatti da dosaggi effettuati presso piùstrutture trasfusionali è emerso che i principali fat-

numero di piastrine presenti nel prodotto (23). Sipuò calcolare quindi la quantità di fattori di crescitapresenti per unità di volume di prodotto. Nella no-stra esperienza, considerando una concentrazionemedia di piastrine di 1500 x103/ �L, l'applicazionedi un millilitro di prodotto, sufficiente a inbibire cir-ca 12.5 cm² di idrofibra o foglietto di acidoialuronico e quindi altrettanta superficie di lesione,si è dimostrato terapeuticamente efficace in oltre6000 applicazioni in lesioni cutanee. Questo pre-parato nelle opportune frazioni può essere conser-vato anche in forma preattivata a -40°C, pronto persuccessive applicazioni, risultando sempreterapeuticamente efficace.Data la consistenza legata al contenuto incrioprecipitato e/o al supporto sopra descritto il PGpuò essere facilmente modellato conformandoloalla geometria della lesione da trattare. Nel caso diapplicazione per infiltrazione (tendinopatie, ecc.), ilprodotto viene inoculato nella compagine del tes-suto da stimolare subito dopo l'aggiunta degliattivatori e prima che si formi il gel.

te sotto cappa sterile a flusso laminare (Steril-VBH compact, MI, Italy). Dopo l'aggiunta la saccadell'emocomponente finale (CLPmix) viene delicatamente agitata per 15 minuti per miscelare i costituenti efavorire la penetrazione del DMSO nelle cellule. Dal tubicino collegato alla sacca del CLPmix viene asportatoun segmento contenente circa 1 mL di CLPmix, utilizzato per eseguire i conteggi cellulari e il dosaggio delfibrinogeno. Il CLPmix viene frazionato quindi in otto aliquote utilizzando delle sacche pediatriche connessesterilmente (Maco Pharma, Tucoing, Francia). Dopo etichettatura, le otto sacche pediatriche contenenti lefrazioni di circa 6 mL di CLPmix vengono rapidamente trasferite nell'abbattitore di temperatura per 30 minutia -80°C per il congelamento. Ottenuto il congelamento le otto frazioni di CLPmix vengono immediatamentetrasferite in un congelatore a -80°C (Polar 530sv, Angelantoni Industrie, Italia) per la conservazione di lungoperiodo.Nel caso non interessi la vitalità della componente mononucleata il DMSO può essere omesso e il CLPmixconservato a meno 30°C con lo scopo di preservare solo i GFs.

tori di crescita (PDGF, TGF-b1) correlano con il

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Finestra dei metodi: Produzione degli attivatori trombinici ( Figura 1)Per ottenere la formazione di un gel dal concentrato leuco-piastrinico arricchito in crioprecipitato (CLPmix),viene utilizzato siero riccho in trombina, in grado di indurre la coagulazione, la degranulazione delle piastrinee l'attivazione dei leucociti. Da ogni procedura si possono preparare due tipi di siero ricco in trombina, prove-nienti dal sangue intero e/o dal crioprecipitato.Trombina da sangue intero. Dal mini-bag associato alla sacca o al kit di aferesi vengono raccolti cam-pioni di sangue intero con provette sterili da 4.5 mL contenenti granuli di caolino (S-Monovette, Sarstedt,Numbrect, Germany). Dopo 10 minuti a 37°C nelle provette si forma il coagulo, quindi centrifugandole per 10minuti a 3000 rpm si ottiene il siero surnatante ricco in trombina senza necessità di rimuovere il coagulo. Senon utilizzate nell'immediato le provette contenenti il siero vengono congelate a -80°C per essere usate intempi successivi (utilizzo nelle lesioni cutanee).Trombina da crioprecipitato. La quota residua di crioprecipitato rimasta dopo la miscelazione con il CLPviene utilizzata per produrre siero ricco in trombina. Il metodo prevede, in cappa sterile, l'introduzione nellasacca del crioprecipitato di calcio gluconato, in soluzione iniettabile al 10% equivalente a 446 mEq/L diCa2+ (Monico, VE, Italy), nel rapporto volumetrico di 1:5 con il crioprecipitato. Subito dopo l'introduzione delcalcio gluconato il contenuto della sacca viene prelevato in provette da 4.5 mL contenenti granuli di caolino.Le provette vengono quindi incubate per 10 minuti a 37°C per facilitare la formazione del coagulo fibrinico.Dopo centrifugazione delle provette per 10 minuti a 3000 rpm si ottiene il siero surnatante ricco in trombinasenza necessità di rimuovere il coagulo. Se non utilizzate nell'immediato le provette contenenti il siero vengo-no congelate a -80°C per essere usate in un secondo tempo (utilizzo nelle lesioni cutanee).Dove è maggiormente critica la sterilità si utilizza una variante dell'estrazione di trombina da crioprecipitato. Inbreve la sacca del crioprecipitato viene connessa sterilmente con il dispositivo a tre vie (Aries, BiomedicalDevices), attraverso il quale in cappa sterile viene aggiunto il calcio gluconato nel rapporto di 1:5. La saccaviene quindi incubata per 10 minuti a 37°C per facilitare la formazione del coagulo fibrinico; successivamen-te, il coagulo viene spremuto dolcemente attraverso le pareti, per ottenere il siero surnatante ricco in trombina.Il siero viene trasferito dalla sacca in un contenitore sterile mediante un transferset solo al momento dell'at-tivazione in sala operatoria. Operazione che non viene ostacolata dal coagulo fibrinico che rimane adeso allaparete della sacca. Anche questa variante di siero ricco in trombina se non utilizzato nell'immediato puòessere conservato a -80°C (utilizzo in campo operatorio).

Figura 1: Processo generale di produ-zione del gel leuco-piastrinico da noiadottato dal prelievo con separatorecellulare all'applicazione. CLP, concen-trato leuco-piastrinico; CRIO,crioprecipitato; DMSO, criopreservantedimetilsulfos-sido; CLPmix, concentra-to leuco-piastrinico addizionato dicrioprecipitato e DMSO; T, temperaturadi conservazione.

PLASMA(~200 mL)

CRIO(~20 mL)

CLP(~33 mL) CLPmix

(~41 mL)

CLP = 80%CRIO = 15%DMSO = 5%

TROMBINA

Calcio gluc.

GEL

PAZI

EN

TE/ D

ON

ATO

RE

SEPARATORECELLULAREHaemonetics

MCS+

APPLICAZIONE

DMSOT = -80 °C

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4.1 Dal gel piastrinico al gel leuco-piastrinico

Recenti evidenze scientifiche hanno dimostrato l'im-portanza, oltre che delle piastrine, anche deimonociti/macrofagi e delle cellule staminali adul-te, residenti e circolanti, nei processi dirigenerazione e differenziazione dei tessuti, e lacapacità dei GFs piastrinici di stimolare l'espansio-ne delle cellule staminali mesenchimali (24-28). Unruolo importante nella rigenerazione come sopraaccennato hanno anche le macromolecole dellamatrice extracellulare, come la fibrina e la fibro-nectina che costituiscono l'impalcatura per la mi-grazione cellulare nel tessuto leso (22,29,30).Fin dal 1999 il nostro gruppo ha prodotto e utiliz-zato tutte le tipologie sopra descritte diemocomponenti per uso rigenerativo. Una partico-lare attenzione però è stata posta agli emocompo-nenti prodotti con separatore cellulare. La caratte-rizzazione biologica di questi emocompo-nenti haevidenziato la presenza di una notevole concentra-zione di leucociti, inizialmente tollerata e non

4.0 - EVOLUZIONE DEL GEL PIASTRINICO E NUOVI EMOCOMPONENTIPER USO RIGENERATIVO

volutamente cercata, ma dovuta semplicemente allamodifica dei parametri di raccolta del separatorecellulare utilizzato (3).

Essendo la rigenerazione legata non solo alle pia-strine ma anche ai monociti/macrofagi e alle cellu-le staminali, da alcuni anni il nostro gruppo in virtùdi quanto detto sopra ha maggiormente focalizzatol'attenzione sulla composizione del concentratoleuco-piastrinico (CLP) arricchito in fibrinogenodove sono rappresentati i componenti cellulari piùimportanti della rigenerazione (3).Lo scopo è stato quello di produrre da sangue pe-riferico e senza manipolazione cellulare unemocomponente capace di integrare l'efficaciadello stimolo con la praticità di produzione, l'agevo-le applicazione, conservabilità e sicurezza.La nostra speculazione quindi si è ampliata versola produzione e applicazione di emocomponenti piùcomplessi, con lo scopo di cercare una sinergia traGFs piastrinici e cellule mononucleate, mimando iprocessi fisiologici di riparazione dei tessuti (Figu-ra 2).

Figura 2: Sinergie innescatedall'applicazione del gelleuco-piastrinico nella ripara-zione dei tessuti, imitazionedei fisiologici processi dirigenerazione.

StaminaleDA SANGUEPERIFERICO

GEL attivazione del CLP con

trombina e Ca2+

MACROFAGI

MONOCITI

GFs

GFs

MIDOLLOOSSEO

Staminale

CD34+

CITOCHINE

DIFF. / PROLIF.

RECLUTAMENTO

EPITELIO, ENDOTELIOFIBROBLASTI, OSTEOBLASTI

TESSUTO

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I risultati dei conteggi cellulari sugli emocomponentiprodotti con la metodica sopra descritta, e studiatisu 45 procedure, dimostrano un incremento di con-centrazione per tutte le tipologie cellulari, con i piùalti fattori di arricchimento proprio per le popola-zioni mononucleate (Tabella 1).Il CLP è risultato molto ricco in PLT le qualicorrelano significativamente con la concentrazio-ne dei più rappresentativi fattori di crescita

trombina (23). Questo permette entro certi limiti distimare, valutando il conteggio delle PLT, la con-centrazione dei GFs espressa dall'emocomponenteattivato e applicato sulle lesioni.Le correlazioni evidenziate (Tabella 1) fra le con-centrazioni delle cellule Pre-raccolta e del CLP aiu-ta la stima dei livelli di concentrazione per singolapopolazione cellulare in ogni singolo donatore/pa-ziente. Questa dipendenza dimostra come la confi-gurazione di separazione adottata possa fornireun'emocomponente di composizione prevedibile,con la possibilità di giudicare cosa e quanto si vaad applicare sul tessuto leso, a tutto vantaggio del-la qualità della terapia.Studi di caratterizzazione del CLP prodotto hannopermesso di verificare inoltre una discreta presen-za di progenitori CD34+ (81.3 � 26.7 / �L), cel-

lule ottenute senza preventiva stimolazione con GFsemopoietici del paziente/donatore e processandoun volume ematico relativamente basso (1544 191mL). La discreta correlazione (r = 0.52) rilevata nelCLP fra cellule mononucleate e CD34+ permetteun calcolo approsimativo della concentrazione deiprogenitori CD34+ raccolti con il separatorecellulare, confermando efficacia e standardizzazio-ne della procedura di separazione adottata.I saggi clonogenici effettuati sui CLP hannoevidenziato che l'87% degli emocomponenti testatidanno origine a Colony Forming Units (CFU) con-tabili, dimostrando che i progenitori CD34+, impli-cati nella formazione delle CFU, sono funzionali neiCLP che hanno dato crescita clonale. Dati prelimi-nari di un nostro studio Regionale Sanitario Fina-lizzato concluso nel 2008 e di uno in corso pressoil Policlinico Umberto I di Roma (Girelli G, FerrazzaG et al.), concordano sul fatto che una discreta quo-ta delle CD34+ raccolte possiede anche delle ca-ratteristiche fenotipiche (CD133+) e colturali deiprogenitori mesenchimali, dati confermati dalla let-teratura (31-38). Infine la possibilità di conservarea -80°C previa aggiunta di un criopreservante(DMSO) permette di avere a disposizione nel tem-po un prodotto con una componente cellulare sem-pre vitale.

Tabella 1. Composizione cellulare dei concentrati leuco-piastrinici (CLP), comparazione e correlazione con i controlli Pre-aferesi (n = 45).PLT, platelets; WBC, white blood cells; NE, neutrofili; LY, linfociti; MO, monociti; MN, cellule mononucleate totali. I dati sonorappresentati come media SD. Comparazione, p<0.001 CLP vs. Pre-aferesi. Correlazione CLP / Pre-aferesi, p<0.001.Livello di significatività p<0.05.

Pre-aferesi

CLP

Fattore di arricchimento

Coefficiente di correlazione

PLT (x 103 /µL) 274 ±64 4454 ±1239 ∗ 16.6 ±4.2 0.58 ∗∗ WBC (x 103 /µL) 6.37 ±1.7 80.9 ±24 ∗ 13 ±3.3 0.57 ∗∗ NE (x 103 /µL) 3.8 ±1.5 15.2 ±13.3 ∗ 3.9 ±2.8 0.53 ∗∗ LY (x 103 /µL) 1.75 ±0.4 45.7 ±12.5 ∗ 26.5 ±6 0.57 ∗∗ MO (x 103 /µL) 0.55 ±0.18 18.7 ±7.2 ∗ 35.6 ±12 0.52 ∗∗ MN (x 103 /µL) 2.3 ±0.5 64.4 ±15.2 ∗ 28.3 ±5.5 0.61 ∗∗

piastrinici (PDGF-AB, TGF-b1), dopo attivazione con

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4.2 Dal gel leuco-piastrinico alla membra-na leuco-fibrino-piastrinica

Durante la Ricerca Regionale Finalizzata è statamessa a punto, presso il nostro Servizio in collabo-razione con l'U.O. di Ortopedia, la procedura di pro-duzione dal gel di una membrana leuco-fibrino-piastrinica applicabile ad esempio in lesionicartilaginee articolari di natura degenerativa e/opost-traumatica.La membrana, costituita dalle componenti cellularie molecolari che normalmente intervengono nellarigenerazione, viene prodotta senza manipolazioniestensive e senza apertura del sistema, ma in per-fetta contiguità con la produzione del gel, median-te semplici processi di centrifugazione in sistemachiuso. Come illustra la Tabella 2 il metodo di pro-duzione adottato mostra nella membrana un im-portante incremento di concentrazione delle cellu-le staminali, presenti originariamente nel concen-

trato leuco-piastrinico arricchito di crioprecipitato(CLP-mix), con elevato numero assoluto per sin-gola membrana: 584667 � 289743 di CD34+.La membrana veicola sull'area di lesione, assiemeai GFs piastrinici, una importante quantità di cellu-le monucleate per unità di superficie tra cui circa65000 CD34+ per cm2. Già durante la formazionedella membrana, la ricalcificazione del CLP-mix,induce una blanda attivazione piastrinica con lentorilascio dei GFs che agiscono sia sul tessuto lesoche sulle cellule della membrana stessa. Da ogniprocedura si possono ottenere fino a 4 membranedella dimensione di circa 9 cm2 e con uno spesso-re di 1-2 mm, quindi con la possibilità di stimolaredelle superfici relativamente estese. Inoltre la con-sistenza ottenuta facilita l'applicabilità e lamanipolabilità, anche endoscopica, importante ne-gli interventi in cavità articolare per la riparazionedelle cartilagine quando si voglia evitare l'interven-to a cielo aperto.

Tabella 2. Composizione cellulare media della membrana comparata con la composizione del concentrato leuco-piastrinico(CLP) e concentrato leuco-piastrinico arricchito in crioprecipitato (CLP-mix) da cui e stata prodotta la membrana.I dati sono rappresentati come media SD. Vol. aliq., volume di una aliquota in sacca; PLT, platelets; WBC, white blood cells;CD34+, progenitore endoteliale/emopoietico.

Vol. aliq. (mL)

PLT (x 103 /µL)

Monociti (x 103 /µL)

CD34+ (µL)

CLP 8.1 ±1 4522 ±1700 13.5 ±6 89 ±18 CLP-mix 14.2 ±2 1833 ±296 6.4 ±3 48 ±16 Membrana 2.9 ±0.7 8798 ±1043 25.9 ±13 200 ±81

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Quanto detto nei paragrafi precedenti ha costitui-to il presupposto teorico all'utilizzo degliemocomponenti in circostanze diverse ma acco-munate dall'esigenza di attivare un processo di ri-parazione tissutale.In diversi contesti clinici si è cercato di miglioraree/o accelerare i processi di guarigione, quandoquesti si presentavano difficili, utilizzando lepotenzialità rigenerative degli emocomponenti as-sociate o meno a medicazioni e presidi biologicidirettamente nel contesto della lesione.

5.1 Chirurgia maxillofacciale -odontostomatologia - ortopedia

Nella chirurgia orale e maxillofacciale l'utilizzo delgel di piastrine (PG) è ampiamente descritto e con-solidato in letteratura da anni. Viene impiegato indifferenti tipi di patologie maxillofacciale quali: ri-costruzione dei difetti mandibolari, fistole o orali edoro/nasali, patologia dei seni (rialzo del senomascellare), interventi di resezione, asportazione dineoformazioni cistiche.Negli interventi ablativi della regionemaxillo-facciale il PG è stato utilizzato nelle fasidi ricostruzione. Effettuata la sutura dei tessuti instrati sovrapposti, una sottile membrana di PG vie-ne applicata suturandola al tessuto sottostante. Nerisulta un miglioramento dell'emostasi nell'imme-diato, una migliore chiusura dei piani sovrappostiper l'effetto collante del PG ed un più rapido edefficace processo di riparazione conseguente alrilascio dei fattori di crescita.Negli interventi di ricostruzionemandibolare il PG è stato adoperato in associa-zione al trapianto allogenico o alloplastico o all'usodi PCBM (particulate cancellous bone and marrow).Un completo rispetto dei criteri di successo di rico-struzione secondo Marx (1) è stato osservato inquesto tipo di intervento.Negli interventi più aggressivi nei quali la dissezio-ne ampia comporta la perforazione dei tessuti mol-li e il formarsi di comunicazioni orali il PG viene uti-lizzato per apposizione di uno strato suturabile.Analogamente, l'utilizzo del PG si è dimostrato ef-ficace nel trattamento chirurgico delle brec-ce alveolari e nel trattamento delle fistole

5.0 - AMBITI DI APPLICAZIONE DEGLI EMOCOMPONENTIPER USO RIGENERATIVO

oronasali in combinazione con osso da impianto.L'uso del PG viene anche indicato negli interventidi rialzo del seno mascellare (39,40,41) cono senza immediato posizionamento dell'impianto.La scarsa altezza di osso alveolare conseguentead un riassorbimento osseo dovuto al venir menodello stimolo trofico prodotto dai denti assieme auna concomitante pneumatizzazione del senomascellare rappresenta un impedimento all'inseri-mento di impianti nel mascellare posteriore. Perdare all'osso un maggiore spessore e poter proce-dere ad impianti nelle gravi atrofie dell'arcata su-periore si impiega la tecnica del sinus lift che con-siste nel rialzo della membrana del seno mascellarecon innesto al di sotto di essa di materiale autologoe/o eterologo e/o alloplastico. L'utilizzo di un gelosteopiastrinico accelera i processi diattecchimento dell'innesto e di guarigione.La proprietà osteogenetica del PG viene peraltroutilizzata nella chirurgia implantare dove il rila-scio dei fattori di crescita stimola la formazione diosso nel sito determinando un più efficaceposizionamento dell'impianto, colmando lo spaziotra l'osso e la superficie dell'impianto. Nella chirur-gia implantare il PG è stato utilizzato da solo o inassociazione con osso spugnoso ottenuto dal tubero da altri siti extra orali, nella stessa seduta opera-toria (25). Sono stati impiegati anche materialiallogenici come l'osso di banca o liofilizzato, mate-riali artificiali come il biovetro. Le particelle da in-nesto vengono conglobate nel PG prima che soli-difichi fino a costituire una maglia fibrosa facilmen-te manipolabile che, applicata in situ, aderisce spon-taneamente alle pareti ossee. I benefici correlanonell'immediato in un arresto del sanguinamento ein una riduzione del rischio di dispersione del ma-teriale particolato utilizzato. Il successivo rilascio deiGFs piastrinici determina una più rapidamaturazione degli innesti accrescendo ilrimodellamento e la mineralizzazione, aumenta il po-tere osteoconduttivo dei materiali osteosostitutivi,e favorisce la cicatrizzazione riducendo il rischio dideiscenza dell'innesto e quello della contaminazio-ne batterica (42). E' stato appurato mediante studiistologici seriati (Colafranceschi M. Università di Fi-renze 2003) che lo scaffold costituito da spongiosaautologa esita in una osteointegrazione con ripri-

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stino di una struttura propria dell'osso mentre altrimateriali risultano solo osteoinclusi, con un lentis-simo e parziale riassorbimento. In ambitoodontoiatrico è stato peraltro descritto l'uso del PGanche nella chirurgia parodontale e nella chirurgiaorale in pazienti che, per patologie concomitanti,risultano maggiormente esposti al rischio disanguinamento o a difetti di cicatrizzazione.In tutti i casi trattati con PG è stata osservata unaefficace emostasi, la riduzione dell'edema, una piùrapida guarigione dei tessuti molli e una accelera-ta rigenerazione ossea. Necessariamente, per l' in-duzione della rigenerazione ossea, sia in ambitoodontostomatologico che ortopedico, è stata fattauna sola applicazione in occasione dell'interventochirurgico e il paziente valutato nel tempo median-te esami clinici e strumentali (radiografia) (43).I pazienti valutati con radiografia a 6 mesi dall'ap-plicazione hanno dimostrato un chiaro incrementodi tessuto osseo nel sito trattato.La chirurgia ortopedica è un ambito speciali-stico dove utilmente può essere applicato il PG.Richiamandosi ai principi generali di funzionamen-

la loro azione sull'osso può essere meglio descrittaper comprendere il razionale che ne giustifichi l'uso.Schematicamente, è stato ipotizzato che nel sitoosseo di lesione ci sia un rilascio iniziale di PDGF,TGF-� e IGF-I e II per effetto della degranulazionedelle piastrine presenti in loco. Il PDGF stimola lamitosi delle cellule staminali midollari presenti nell'osso mentre, in virtù dell'effetto angiogenetico,determina la formazione di nuovi capillari nelle sedidi lesione. Contemporaneamente si assiste ad unaproliferazione di fibroblasti e di proosteoblasti pereffetto del TGF-� . Successivamente lo stessoTGF-� induce la differenziazione dei proosteoblastiverso le forme più mature. L'attività del TGF-� siesplica anche su queste ultime (osteoblasti) chevengono stimolati a produrre matrice ossea, e suifibroblasti che depositano la matrice di collagenedestinata a sostenere la crescita vasale. La pre-senza nel sito delle piastrine veicolate dal torrenteematico rifornisce di continuo l'area di rigenerazionedel tessuto osseo dei growth factors necessari alsuo completo sviluppo. In una fase più avanzatadel processo, il rilascio di IGF-I e II agisce sugli

osteoblasti dell'endostio che iniziano a riempire letrabecole dell'osso spugnoso.Si può genericamente affermare che gli interventidi osteosintesi e il riempimento di cavità insie-me a matrice ossea costituiscono un ambito di ap-plicazione primario per gli effetti sulla rigenerazioneossea dei fattori di crescita. In ortopedia l'effettoosteogenetico del PG è stato sfruttato negli inter-inter-inter-inter-inter-venti di resezione dell'ileoventi di resezione dell'ileoventi di resezione dell'ileoventi di resezione dell'ileoventi di resezione dell'ileo. In questi pazienti laresezione esita spesso in larghe cavità intraosseeche possono diventare nel postoperatorio sedi diimportante sanguinamento. E' stata segnalatal'apposizione di PG in 21 pazienti sottoposti aresezione dell'ileo nei quali la tecnica ha nell'im-mediato contrastato il sanguinamento e la forma-zione di ematomi per l'azione emostatica del pro-dotto ed influito favorendo la rigenerazione osseain tempi più rapidi rispetto ai controlli.La nostra esperienza in ambito ortopedico dell' usodel gel piastrinico (PG) verte su circa 60 casi dipseudoartrosi, traumatologia consistente in frattu-re comminute del piatto tibiale, calcagno e altreregioni ossee. Circa un terzo delle pseudoartrosiquale esito di processi osteomielitici caratterizzatispesso da estesa mancanza di sostanza e daproblematiche terapeutiche complicate da:✓ estensione del difetto associato a perdita di

sostanza ossea.✓ cronicità.✓ complicanze settiche.✓ fallimento di precedenti procedure

chirurgiche.Le pseudoartrosi, in particolare se associate a si-gnificative perdite di sostanza, sono difficili da trat-tare chirurgicamente e hanno spesso esiti non sod-disfacenti, nonostante le varie tecniche utilizzate.La possibilità di aggiungere uno stimolo efficacealla rigenerazione ossea aumentando la densitàtrabecolare dell'osso, favorendo la mineralizzazionee l'osteoconduzione, è ritenuto un ausilio importantealle tecniche chirurgiche.I pazienti trattati nelle diverse casistiche presentiin letteratura, talvolta già sottoposti a precedentiinterventi chirurgici senza esito, mostrano un evi-dente consolidamento della pseudoartrosi in tem-pi relativamente rapidi con evidenza clinica eradiologica di un valido callo osseo. Citiamo ad

to dei fattori di crescita piastrinici sopra menzionati,

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esempio, tratto dalla nostra esperienza, un caso dipseudoartrosi settica che ha beneficiato anche dellarapida chiusura di una fistola cutanea associata. IlPG in questi casi è stato applicato con inclusioni dimateriale osseo autologo (prelevato dalla crestailiaca) o eterologo (suino deantigenato) inserendolonel sito cruentato della pseudoartrosi. L'ossospongioso, oltre che riempire il sito è fonte diosteoblasti ed elemento di osteoconduzione, men-tre il gel leuco-piastrinico nella cui componenteleucocitaria prevale la quota monocitaria con signi-ficativa presenza di cellule staminali CD34+, for-nisce lo stimolo rigenerativo.È riportato in letteratura il successo dell'utilizzazio-ne di gel piastrinico anche a cielo coperto, dopoapplicazione di onde d'urto, in tre sedute distanzia-te per il trattamento di pseudoartrosi vitali in cui ildifetto di consolidamento non eccede lo spessoredi 1 cm (44)

5.2 Esperienze su lesioni dei tessuti molli:Cute (ferite di difficile guarigione), epiteliocorneale, connettivo

Alle ulcere cutaneeulcere cutaneeulcere cutaneeulcere cutaneeulcere cutanee, solitamente non viene data lastessa attenzione riservata ad altre patologie seb-bene siano molto frequenti.Nell'Europa occidentale, circa 6 milioni di personesoffrono di ferite difficili o ulcere con un costo me-dio di $ 1000 per paziente. In Italia, circa 800000persone ogni anno si presentano con questa con-dizione, ma questo numero è costantemente inaumento a causa del prolungamento dell'aspetta-tiva di vita; la gestione di questi pazienti assorbe il60% dell'attività di personale infermieristico chelavora nel territorio.Negli USA si stima che ogni anno 6,5 milioni dipersone presentino ulcerazioni croniche causate dapressione, stasi venosa o diabete. Il peso socio-economico è notevole per giornate di degenza,costo delle medicazioni, assistenza infermieristicadomiciliare, perdita di giornate lavorative da partedel paziente e/o dei suoi familiari. La disponibilitàdi innumerevoli topici e dispositivi medico-chirurgi-ci per la cura delle ulcere, assieme alla variabilità ditrattamento, ha comportato spesso modalità irra-zionali, condotte per tentativi o su informazioni de-

rivanti da esperienze riferite da altri. L'errore preva-lente è quello di considerarle tutte uguali e che laloro cura sia un' arte acquisita con la pratica e nonscienza basata su acquisizioni che riguardanol' eziopatogenesi e i meccanismi di guarigione del-la cute. La terapia locale delle ulcere ha fondamen-talmente nella prassi clinica lo scopo di creare lecondizioni ideali per la formazione del tessuto digranulazione e la riepitelizzazione, che non posso-no avvenire se le cause che hanno provocato la le-sione continuano ad esercitare la loro influenza.L' inquadramento etiopatogenetico delle ulcere èdunque di estrema importanza per poter ottenerela guarigione, senza di esso qualsiasi medicazionenon darà alcun beneficio.La dimostrazione dell'efficacia dello stimolorigenerativo sul tessuto osseo apportato dalle pia-strine attivate ha presto indotto a esplorare la pos-sibilità di somministrare lo stesso stimolo sui tes-suti cutanei lesi (ulcere, ferite di difficile guarigio-ne, necrosi, fistole ecc.).L'applicazione del PG nel trattamento adiuvantedella rigenerazione tessutale, inserita in maniera ap-propriata nel quadro complessivo e pluridisciplinaredella cura, ha dimostrato una evidente efficacia. Inparticolare ha permesso a pazienti affetti da ulcerecroniche inveterate agli arti inferiori di ottenere ra-pidamente l'induzione della granulazione con inver-sione dell'andamento clinico torpido oingravescente, giungendo alla chiusura della lesio-ne (2-5).Mentre la granulazione si evidenzia già dalle primeapplicazioni, il tempo di completa riepitelizzazioneè funzione ovviamente dell'estensione e della pa-tologia sottostante. Infatti nelle ulcere post-trauma-tiche di pazienti relativamente giovani in buone con-dizioni generali e senza componenti vasculopatiche,il processo di guarigione sembra essere più rapidoe completo. Più stimoli con PG sembrano neces-sari per la guarigione di ulcere post-irradiazione.L'applicazione del PG nelle ulcere ingravescenti de-termina nei pazienti trattati la riparazione tissutaleper l'intervento dei growth factors piastrinici indi-pendentemente dalla natura delle lesioni (45-50).Il gruppo dei pazienti trattati appare, infatti, polimorfoper la diversa origine delle lesioni ulcerose: trau-matica, vascolare (arteriosa e venosa), neuropatica,

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da pressione e diabetiche. Quest'ultime spesso sicaratterizzano per la coesistenza delle componentineuropatiche e vascolari che esitano in difetti dicicatrizzazione importanti (45).La nostra esperienza dal marzo 1999 conta ormaioltre 400 pazienti portatori di ulcere (datanti da 3mesi a più anni) trattati con PG. Le lesioni cutaneeulcerose che giungono alla nostra attenzione, comeaccennato sopra, sono di varia etiologia epatogenesi, prevalentemente vascolari seguite dalleulcere da pressione, dalle diabetiche eradiodermitiche. Il range di età dei pazienti affettida queste patologie afferenti al trattamento è ab-bastanza ampio, compreso fra 35-90 anni. Ognipaziente viene valutato a tempo zero e quindi acadenza settimanale, ed i parametri rilevati (docu-mentati anche fotograficamente) sono, ad ognicontrollo: numero e sede, dimensione, margini, fon-do e cute perilesione secondo il criterio del Woundbed preparation applicando i principi del TIME (51).Tale acronimo è formato dalle iniziali dei parametridi valutazione delle lesioni per guidare ad un cor-retto trattamento delle stesse, tramite medicazioniappropriate per rimuovere le barriere locali allacicatrizzazione e utile per formulare un giudizioprognostico rispetto ai tempi di guarigione attesi(T= tessuto: vitale, non vitale, necrosi; I= infezio-

ne/infiammazione:presente-assente; M = macerazione o secchezza: bilanciamento dei fluidi-secre-zioni; E = epidermide: proliferazione dei margini).Il PG viene mantenuto a contatto con la lesioneper 3 giorni. Con il maturare dell' esperienza è di-venuto prassi l'utilizzo dell' acido ialuronico e, menocostoso, di idrofibra di metilcellulosa sotto forma difoglietti per favorire l'applicazione del PG.La fine del trattamento viene decisa, in funzionedel progresso rigenerativo, del numero ed esten-sione delle lesioni.In tutti i pazienti trattati, è stata sempre osservatal'induzione di una significativa granulazione giàdopo una settimana dalla prima applicazione, con-solidata dalle successive con incremento dellagranulazione e fenomeni di convergenza dei mar-gini della lesione.In un nostro studio pilota applicazioni a cadenzasettimanale hanno indotto in modo evidente nellamaggioranza dei casi la formazione di tessuto digranulazione dopo 15 giorni, con ulteriore incre-mento a 90 giorni. La diversa etiopatogenesi delleulcere trattate sembra non influenzare significati-vamente la risposta a medio termine (90 giorni) allostimolo valutata come incremento del tessuto digranulazione (3,4).

Finestra dei metodi: Controllo clinico, monitoraggio e misura delle lesioni cutaneeI pazienti affetti da ulcere cutanee croniche vengono da noi trattati con applicazioni a cadenza settimanale digel leuco-piastrinico. L'applicazione viene eseguita topicamente apponendo su tutta la superficie ulcerata ilgel. Prima di ogni applicazione su lesioni che presentano delle zone di necrosi viene eseguito un debridmentmediante somministrazione, con apposito applicatore, di ultrasuoni (Ultrasound®, Sonoca, Söring) allo scopodi preparare adeguatamente il letto dell'ulcera (wound bed preparation), e rendere massima e comparabile larisposta allo stimolo rigenerativo. Il gel viene tenuto a contatto con la lesione per tre giorni, quindi, rimosso ilresiduo non assorbito il sito di lesione viene trattato con semplice soluzione fisiologica e ipoclorito di sodio5%.Di essenziale importanza è il controllo clinico e il monitoraggio dell'evoluzione delle lesioni che deve esserefatto in modo obiettivo quantificando il progresso e/o il regresso delle lesioni.Le nostre procedure prevedono una pianificazione per ogni paziente della documentazione fotografica(Fotocamera digitale EPSON) di tutte le lesioni ad ogni accesso, al tempo zero e prima di ogni applicazionesettimanale. Si costruisce un archivio fotografico delle lesioni per ogni paziente, in modo da seguirne obietti-vamente l'evoluzione nel tempo. Abbiamo individuato allo scopo due parametri da monitorare:1 - Riduzione nel tempo della superficie della lesione ulcerosa2 - Incremento nel tempo del tessuto di granulazione

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Per oggettivare questi parametri viene utilizzato un programma di elaborazione dell'immagine (ImageJ, ImageProcessing and Analysis in Java) che permette di calcolare l'area di granulazione (AG) per monitorare larisposta precoce allo stimolo somministrato, e l'area totale della lesione ulcerosa (AU) per monitorare larisposta a medio e lungo termine. Oltre a questi due parametri un indice (H) rappresentato dal rapportopercentualizzato di AG/AU valuta sintetizzando in un valore che oscilla da "0" a "100" la tendenza allaguarigione della lesione. L'indice rappresenta un utile strumento dinamico che permette di cogliere in parti-colare regressioni della lesione dovute a incremento di aree di necrosi e/o allargamento dell'area dell'ulcera.Ogni lesione viene quindi monitorata con un profilo comprendente la variazione di AG di AU e dell'indice H.L'endpoint di questo sistema di monitoraggio è la valutazione quantitativa della velocità di riparazione indottadelle applicazioni, la valutazione viene fatta considerando sia l'incremento del tessuto di granulazione che lariduzione dell'area dell'ulcera.Un esempio di applicazione di questo sistema di monitoraggio è documentato nelle Figure 3 e 4 che illustra-no rispettivamente la rilevazione fotografica di una lesione nel tempo e la quantificazione con l'applicazionedei parametri sopra descritti. In breve nello specifico caso le lesioni trattate, sono state valutate nella se-guente cadenza temporale (Figura 3): (T0) valutazione all'accettazione prima del trattamento, (T1) doposette giorni dal primo trattamento, (T2) dopo quattordici giorni e due trattamenti, (T3) dopo ventuno giorni etre trattamenti, (T4) dopo ventotto giorni e quattro trattamenti, (T5) dopo sessanta giorni e otto trattamenti,(T6) dopo novanta giorni e sedici trattamenti. Nello specifico caso la sintesi grafica della dinamica dell'areadell'ulcera (AU) e dell'indice H sono illustrati nella Figura 4.Nel caso riportato ad esempio, il sistema permette di cogliere una precoce risposta allo stimolo, evidenziatadal rapido incremento dell'indice H influenzato fondamentalmente dalla produzione di tessuto di granulazionepoiché il decremento dell'area dell'ulcera (AU) ha una evoluzione più lenta.Tutti i dati clinici relativi al paziente e alle lesioni monitorate vengono inseriti in una cartella clinica informatizzatache permette di documentare l'evoluzione della singola lesione in accordo con la classificazione TIME-H(T= presenza di necrosi, I= presenza di infiammazione/infezione, M= presenza di macerazione, E=proliferazione dei margini, H= tempo di guarigione). Il sistema di classificazione TIME-H permette, la valuta-zione nel tempo del paziente e di tutte le lesioni.

Figura 3: Esempio di monitoraggio fotografico delle lesioni ulcerose (paziente CS).

T0 T1

T2 T3

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paziente CS

0

20

40

60

80

100

120

T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6

tempi di monitoraggio

per

cen

tual

e

AU

H=AG/AU

Figura 4: Esempio di sintesi grafica della variazione dell'area totale dell'ulcera AU e

dell'indice H=AG/AU (paziente CS della Figura 3).

T4 T5

T6

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Finestra dei metodi: Approntamento di plasma e/o siero per uso oftalmologico.

Metodica -1 (Ospedale di Crotone) plasma ricco di piastrine per uso oftalmologicoEffettuare dei prelievi di sangue venoso con vacuteiner in provetta da emocromo.Centrifugare a 1000 - 1400 rpm per ottenere plasma ricco di piastrine per un tempo di 5 o 8 min.Aspirare in siringhe monouso il plasma facendo attenzione a non aspirare emazie.In tal caso eliminare il prodotto se è inquinato da emazie.Somministrare due gocce in ogni congiuntiva tre volte al giorno (non di più) per cicli di 15, max. 20 giorni.Se fosse necessario protrarre il trattamento, rispettare comunque una pausa di 5 - 7 giorni.Queste siringhe monouso del tipo siringhe da insulina, vanno congelate e ogni giorno viene scongelata lasiringa che si utilizzerà nella giornata.

Metodica -2 (Ospedale di Belluno) siero arricchito di fattori di crescita piastrinici per uso oftalmologicoPrelievo: Procedere al prelievo di una unità di sangue di millilitri 250-400 in sacche multiple.In relazione ai valori di Hb del paziente e al volume di prelievo, decidere se restituirgli o meno i globuli rossi.Approntamento emocomponenti piastrine e crioprecipitato:Prepararazione di un concentrato piastrinico in circa 12 mL di plasma.g PRP: prima centrifugazione a 1400 rpm per 10 min a 20 °C.g Concentrato piastrinico: seconda centrifugazione del PRP a 4000 rpm per 8 min a 20 °C.g Risospensione del concentrato piastrinico in circa 12 mL di plasma.Prepararazione del crioprecipitato.g Congelare il plasma povero di piastrine per un'ora a -80 °C.g Scongelare per una notte il plasma a 4 °C trasferendo, per sifonamento nella sacca satellite,

il plasma sovranatante del crioprecipitato.g Il crioprecipitato adeso alle pareti della sacca madre, verrà poi sospeso in 12 mL di plasma.Prepararazione del mix (crioprecipitato+concentrato piastrinico).g Mediante connessione sterile sospendere le piastrine nel crioprecipitato.g Volume finale: 25 mL di mix piastrine in crioprecipitato.Approntamento del siero-collirio pronto all'uso:g Connettere sterilmente tubicino con rubinetto a tre vie di cui una dotata di diaframma perforabile.g Attraverso il diaframma perforabile, sotto cappa sterile, aggiungere nella sacca calcio gluconato

nel rapporto di 1:5, miscelare e attendere la formazione del coagulo, favorito dalla esposizione a 37° C.g Spremere il coagulo attraverso la parete della sacca stessa.g Preparare una serie di siringhe monouso da insulina da 0,5 - 1 mL.g Utilizzando il diaframma perforabile riempire ogni siringa con 0,5 mL.g Si ottengono circa 50 siringhe contenenti siero autologo nel quale sono stati rilasciati i fattori di

crescita provenienti dalle piastrine attivate.Trattamento:g Somministrare due gocce in ogni congiuntiva tre-quattro volte al giorno per cicli di 15, max 20 giorni.g Se fosse necessario protrarre il trattamento, rispettare comunque una pausa di 5 - 7 giorni.g Le siringhe, consegnate al paziente, non tutte ma a più riprese nel numero sufficiente al trattamento

di alcuni giorni, dovranno essere conservate, a domicilio, nello scomparto freezer del frigorifero.

g Ogni giorno sarà scongelata la siringa che si utilizzerà nella giornata, conservandola nel frigorifero.

Altre indicazioni all'uso del PG sono state descrittein ambito oculistico nella chirurgia del foro macu-chirurgia del foro macu-chirurgia del foro macu-chirurgia del foro macu-chirurgia del foro macu-larelarelarelarelare. La nostra esperienza ha visto 12 pazienti af-fetti da foro maculare trattati con piastrineautologhe iperconcentrate (2.5 - 4.5 x 106/�L) sen-za attivazione per indurre uno stimolo fibroblasto-rigenerativo nella sede della lesione (52, 53, 54).

L'impiego più diffuso a tutt'oggi, consiste in colliriottenuti da PRP o dal sovranatante del coagulopiastrinico ricco di fattori di crescita, per la guari-gione di ulcere corneali di diversa origine e pre-venzione in molti casi della necessità del trapiantodi cornea (55).

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Recentemente l'utilizzo di emocomponenti topici siè allargato al trattamento di patologie degenerativepatologie degenerativepatologie degenerativepatologie degenerativepatologie degenerativee/e/e/e/e/o traumatiche di tessuti di origine mesenchi-o traumatiche di tessuti di origine mesenchi-o traumatiche di tessuti di origine mesenchi-o traumatiche di tessuti di origine mesenchi-o traumatiche di tessuti di origine mesenchi-malemalemalemalemale diversi dall'osso. In particolare si sta diffon-dendo il trattamento di lesioni tendinee, originatespesso anche da eventi traumatici (6). Il gel in que-sto caso viene utilizzato, come stimolo rigenerativoadiuvante e antiinfiammatorio, soprattutto in lesio-ni del tendine di Achille con ritardo di riparazione,epicondiliti, fasciti ecc. I pazienti sono per lo più gio-vani, portatori di lesioni da trauma sportivo o con-nessi all'attività lavorativa e con importante limita-zione dell'attività motoria. L'applicazione del gel inqueste lesioni può essere fatta sia durante l'inter-vento chirurgico ricostruttivo e prevalentementemediante infiltrazione dell'emocomponente attiva-to, prima che gelifichi. L'osservazione clinica e stru-mentale dei casi trattati nella nostra esperienza, dinumero ancora contenuto (25 pazienti), ha permes-so di rilevare importanti benefici del trattamento.Si è osservata infatti una scomparsa del dolore, chesi attenua dopo una settimna e si riduce sostan-zialmente dopo 15 giorni accompagnato da una ri-duzione della tumefazione. La seconda infiltrazio-ne a distanza di 20-30 giorni risulta generalmenterisolutiva, e spegne la sintomatologia infiammato-ria con ripristino pressoché completo dell'attivitàmotoria, segno evidente di un'accelerazione di unprocesso riparativo inefficente, soprattutto se rap-portato al tempo di inabilitazione sofferta del pa-

ziente. Ancora più recente è l'applicazione diemocomponenti topici in degenerazioni dei dischiintervertebrali. Il principio è sempre quello di indur-re uno stimolo rigenerativo grazie ai GFs piastrinicie, portare eventualmente nel sito di lesione anchecellule mononucleate autologhe importanti nellarigenerazione (56,57). Il disco intervertebrale è fre-quentemente colpito da fenomeni degenerativi le-gati ai processi di invecchiamento e a microtraumiripetuti nel tempo che esitano in dolore e limitazio-ni importanti della motilità. Nella nostra esperienzaallo stato attuale sono stati trattati con gel leuco-piastrinico 12 pazienti affetti da discopatiadegenerativa, e i risultati preliminari mostrano si-gnificativi miglioramenti delle performance motoriee attenuazione del dolore associato perdurante da3-7 mesi. Anche in questo caso il gel viene appli-cato nella compagine del disco intervertebrale me-diante infiltrazione dell'emocomponente attivato,prima che gelifichi. L'infiltrazione Rx-guidata, ese-guita dal neurochirurgo, si configura come un in-tervento di chirurgia mininvasiva del rachide, senzagrande impegno clinico per il paziente (AlexandreR. Istituto E.U.N.I. Treviso 2008).Questo contesto di collaborazione multidisciplinarevede protagonista anche il medico di medicinatrasfusionale sia nella fase di preparazionedell'emocomponente, che nella modulazione dellasua appropriata applicazione e nel follow-up dei ri-sultati.

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Come accade per tutte le innovazioni, vi è un peri-odo più o meno lungo di assestamento delle meto-diche fino a giungere ad uno standard definito. Inquesto campo, risulta meno agevole stabilire unostandard in quanto trattasi di un prodotto biologicosoggetto a numerose variabili.Lo standard di prodotto, d'altronde, è un elementomolto importante nel momento in cui è necessariodefinirne i costi e quindi una tariffa di scambio.Ad ogni modo è possibile esporre alcuni punti ac-quisiti.Per quanto riguarda la colla di fibrina, esistecome emoderivato del commercio, ottenuto con pro-cedure industriali lavorando cospicui pool di pla-

130 per millilitro. L'emocomponente, prodotto daunità di plasma dalle strutture trasfusionali con mez-

costi molto più contenuti e costituisce altresì la baseper la produzione del gel piastrinico.Il gel piastrinico, ad oggi, esiste solo comeemocomponente il cui approntamento risulta diesclusiva pertinenza delle strutture trasfusionali.Il requisito minimo di qualità e di standardizzazioneconsiste nel garantire una concentrazionepiastrinica per microlitro non inferiore a un milionedi cellule (generalmente una concentrazione di cin-que volte i valori basali).I volumi sia degli emocomponenti intermedi (pla-sma-crioprecipitato-concentrato piastrinico- sieroricco di trombina ) sia della emocomponente finale(gel piastrinico) dipendono dalla valutazione delcontesto clinico per il quale è richiesto l'effetto deifattori di crescita piastrinici e condiziona la tipologiae le modalità di produzione, di applicazione, di con-servazione.Si evince da ciò che l'utilizzazione del prodotto èsottesa da un approccio multidisciplinare in cui ilmedico esperto di medicina trasfusionale gioca unruolo centrale che, non infrequentemente, lo coin-volge direttamente anche nel momento terapeutico.Pertanto, indicazione, ambito di applicazione (in

e volume del prodotto influiscono sul processo diproduzione ( che può variare in relazione alle diver-se metodiche e materiali necessari), sui tempi ope-rativi e, in definitiva, sui costi.

6.0 - COSTI CONNESSI ALLA TERAPIA CON GEL PIASTRINICO E IN RAPPORTOCON L'ORGANIZZAZIONE E LA FRUIBILITA'

Fatta questa necessaria premessa, la strutturatrasfusionale può avvalersi delle apparecchiature edispositivi di cui essa è dotata per il prelievo e lalavorazione di tutti gli altri emocomponenti, effet-tuando i test e i controlli di prassi più pertinenti agllemocomponenti ad uso topico. Può, però, anche av-valersi di dispositivi e/o apparecchiature che pro-gressivamente il mondo industriale propone nellaricerca di una finalizzazione produttiva di scopo (am-bito ortopedico, odontostomatologico, chirurgicoecc.).Generalmente l'impiego di questi dispositivi, i qualiper la maggior parte consistono in provette/conte-nitori e centrifughe di varia foggia o dimensioni, nonaggiunge nulla a quanto, nella sostanza, è in gradodi produrre la struttura trasfusionale con i proprimezzi a costi di gran lunga inferiori e con resequalitative e quantitative generalmente superiori.I dispositivi commerciali, mirano a semplificare lemetodiche qualora esse dovessero essere poste inatto in un contesto esterno alla strutturatrasfusionale. In tale ottica, fermo restando ilcoinvolgimento dell'esperto in medicinatrasfusionale al quale la legge delega la compe-tenza nell'approntamento degli emocomponenti, aqualsiasi uso essi siano destinati, cioè anche al-l'uso topico, nella formulazione di una tariffa, si do-vrebbe tener conto anche dei costi provenienti dal-l'impiego di alcuni di tali dispositivi.Pertanto, l'uso di metodiche e/o dispositivi diversicondiziona alcune variabili di processo che impli-cano un maggiore o minor impiego delle figure pro-fessionali operanti nella struttura trasfusionale.In sintesi, il processo consiste nella:

1. Valutazione dell'indicazione all'uso e del con

2. Valutazione del paziente per l'idoneità al tipo

3. Effettuazione del prelievo e dei test previsti.4. Approntamento delle emocomponenti inter

medie (plasma-crioprecipitato-piastrine-

5.6.7.

ne, risultati).

sma e che ha un ragguardevole costo di circa €

zi fisici semplici, è di prevalente origine autologa, a

unica soluzione oppure reiterata), concentrazione

testo clinico;

di prelievo;

trombina);Conservazione;

Controlli di qualità (sui prodotti, conservazioApplicazione;

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I punti elencati vanno considerati nei diversi conte-sti clinici e con le diverse modalità di prelievo/pre-parazione (sacca multipla, separatore cellulare, prin-cipali dispositivi del commercio), materiali impiegati,profili professionali coinvolti (con variabili connes-se alla organizzazione delle singole strutturetrasfusionali e alla esperienza del personale) e tem-pi operativi.Va specificato comunque che, al momento, in rela-zione alla interdipendenza stretta tra il momentodecisionale riguardante l'idoneità al prelievo, il tipopiù adatto di prelievo e di preparazione in relazioneal contesto clinico e alle caratteristiche ematologi-che riscontrate, la competenza operativa preponde-rante ha riguardato il profilo professionale medico.In relazione alla variabilità delle metodiche e del-l'impiego di strumentazione sembra utile stabilireun raffronto che si basi sulla concentrazionepiastrinica e sul volume di prodotto ottenuto, pren-dendo a riferimento il costo per millilitro di concen-trato piastrinico o crio-piastrinico.Nell'esigenza di rendere il più possibile fruibile ilprodotto, alcune Regioni hanno elaborato delle ta-riffe in ragione delle metodologie prevalentemen-te utilizzate. Ad esempio, esaminando il tariffarioapprovato dalla Regione Lazio si evince che la ta-riffa è stata elaborata a copertura dei costi per l'im-piego di apparecchiature del commercio e i volumidi prodotto tariffati (5-6 mL) si riferiscono alle resedi una procedura con le suddette apparec-chiature,

adoperate, prevalentemente in un contesto chirur-gico.Infine, tenuto conto della necessità di stabilire unpercorso idoneo a garantire la appropriatezza del-l'applicazione/utilizzo degli emocomponenti ad usotopico, della necessità di implementare una piùcomplessa tracciabilità di un prodotto, talvolta an-che di origine omologa, che può esserepluriframmentato e/o attribuito a più di un pazien-te, non tutte le strutture trasfusionali risultano pron-te a introdurre tale innovazione. In altri frangenti, viè l'esigenza di utilizzare questo emocomponentein strutture prive di servizio trasfusionale (ad esem-pio gli studi odontoiatrici). A questo scopo, la SIMTIha elaborato uno specifico schema di convenzioneper gli emocomponenti ad uso topico, adattabilead eventuali altri contesti clinico/specialistici in cuiè richiesto l'impiego dei fattori di crescita piastrinici.Nell'ambito della Regione Veneto, mediante un pro-cesso pluriennale basato sulla contabilità analitica,è stata effettuata la valorizzazione economica ditutte le prestazioni di medicina trasfusionale e de-gli emocomponenti.Recentemente, si è proceduto a stabilire il costodel gel piastrinico prodotto con il separatorecellulare e con la sacca multipla secondo le meto-diche precedentemente illustrate. È stato altresìdefinito il costo di un trattamento effettuato concolliri a base di fattori di crescita piastrinici (Tabelle3 - 7).

Tabella 3: Elaborazione (esercizio 2007); Valorizzazione derivata dall'analisi di processo svolta presso il SITdell'Azienda Ulss n. 1: il costo pieno viene determinato imputando una quota di costi comuni pari al 22,5%circa dei costi specifici. Detto valore percentuale rappresenta la media rilevata a livello regionale nell'eserci-zio di riferimento.

Costo unitario = costo di 5 aliquote (6 mL cadauna)

Costo unitario = costo singola aliquota (6 mL)

DESCRIZIONE Valorizzazione:Costo PIENO MEDIO

UNITARIO (Euro)

NOTE

Gel piastrinico da plasmapiastrinoaferesi

Autologo 305.93

Omologo 54.00

Gel piastrinico da sangue intero

Autologo 153.15 Costo unitario = costo insieme 4 aliquote (5 mL cadauna)

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GEL PIASTRINICO DA PLASMA-PIASTRINOAFERESI (USO AUTOLOGO)5 aliquote da 6 mL cadauna

SuperSit BL2007

Descrizione FASE I

FASE II

FASE III

Supervisionee Controllo

Qualità

Tot. min

Costo (*)

Costo medio orario perso-nale (€/ora)

pE Tempo Medico 20 10 10 2.5 42.5 54,65 77,15

Tempo Infermiere 40 40 18,83 28,25

Tempo Tecnico 5 25 30 14,63 29,26

T EMOCROMO 6,20

GRUPPO 8,88

M Kit aferesi 137 137

Provette trombina (5) 0.72 0,72

Provette tests (3) 1 1

Connessioni sterili (3) 6.198 6,198

Sacche pediatriche (4) 1.5 1,5

1 fiala Ca gluconato 0.11 0,11

Costo specifico medio unitario (unità = insieme delle 5 aliquote) 249,7

Costo pieno medio unitario (unità = insieme delle 5 aliquote) 305,9

GEL PIASTRINICO DA PLASMA-PIASTRINOAFERESI (USO OMOLOGO)5 aliquote da 6 mL cadauna

SuperSit BL2007

Descrizione FASE I

FASE II

FASE III


Qualità

Tot. min

Costo (*) Costo medio orario personale (€/ora)

pE Tempo Medico 20 10 10 2.5 42.5 54,65 77,15


Tempo Tecnico 5 25 30 14,63 29,26

T HIV 8,35

HBsAg 8,35

HCV 10,18

EMOCROMO 6,20

GRUPPO 8,88

M Kit aferesi 137 137 5 aliquote

Provette trombina (5) 0.72 0,72 5 aliquote


Connessioni sterili (3) 6.198 6,198



Costo specifico medio unitario (unità = aliquota singola 5 mL) 55,32 276,60

Costo pieno medio unitario (unità = aliquota singola 5 mL) 54,00 338,86

Tabella 4: Elaborazione (esercizio 2007); Dettaglio costi gel piastrinico autologo da plasma-piastrinoaferesi.

Tabella 5: Elaborazione (esercizio 2007); Dettaglio costi gel piastrinico omologo da plasma-piastrinoaferesi.

P: PersonaleT:Test,M:MaterialiFase I: visita-valutazioneFase II: prelievo-reinfusioneFase III: scomp.-cong.-test

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GEL PIASTRINICO DA SANGUE INTERO (USO AUTOLOGO)4 aliquote da 5-6 mL cadauna

SuperSit BL2007

Descrizione FASE I

FASE II

FASE III

FASE IV


Qualità

Tot. min

Costo(*)

Costo medio orario personale (€/ora)

p Tempo Medico 20 10 5 15 2.5 52.5 67,50 77,15


Tempo Tecnico 10 10 20 9,75 29,26

T EMOCROMO 6,20

GRUPPO 8,88

M Sacca multipla 8,5 8,5 4 aliquote

Provette trombina (4) 0.57 0,57 4 aliquote


Connessioni sterili (2)

1 siringa da 10 ml

1.03 1.03

0,09

2,06

0,095



Costo specifico medio unitario (unità = aliquota singola 5 mL) 31,77 127,07

Costo pieno medio unitario (unità = aliquota singola 5 mL) 38,80 155,21

GEL PIASTRINICO DA SANGUE INTERO (USO AUTOLOGO)4 aliquote da 5-6 mL cadauna

SuperSit BL2007

Descrizione FASE I

FASE II

FASE III

FASE IV


Qualità

Tot. min

Costo (*) Costo medio orario personale (€/ora)

p Tempo Medico 20 10 5 15 2.5 52.5 67,50 77,15


Tempo Tecnico 10 20 30 14,63 29,26

T EMOCROMO 6,20

GRUPPO 8,88

M Sacca multipla 8,5 8,5 4 aliquote

Provette trombina (4) 0,57 4 aliquote


Connessioni sterili (2)

30-60 siringhe da 1 a 2,5 ml

2.06 2.06

2.85

4,12

2,85



Costo specifico medio unitario (unità = 1 preparato) 129,9

Costo pieno medio unitario (unità = 1 preparato) 159,2

0.57

Tabella 6: Elaborazione (esercizio 2007); Dettaglio costi gel piastrinico omologo da sangue intero.

Tabella 7: Elaborazione (esercizio 2007); Dettaglio costi siero-collirio ricco in fattori di crescita.

P: PersonaleT: TestM: MaterialiFase I: visita-valutazioneFase II: prelievo-reinfusioneFase III: scomp.-cong.-test.Fase IV: mixing/aliquotazione

SIERO-COLLIRIO ARRICCHITO DI FATTORI PIASTRINICI

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La medicina trasfusionale è in continua evoluzioneanche dal punto di vista tecnologico edorganizzativo. La principale risorsa, costituita dalpersonale, si arricchisce di un più ampio bagaglioculturale mentre la responsabilizzazione dei singoliporta con sé un incremento dell'autonomia profes-sionale. Questa crescita spinge altresì ad embricarele competenze professionali in un'otticamultidisciplinare con numerosi ambiti specialistici.Una interessante opportunità di crescita professio-nale nell'ambito delle strutture trasfusionali consi-ste in un maggior avvicinamento del medico all'am-malato. Ben si indirizza verso tale impostazione ilcampo degli emocomponenti ad uso topico che, inun decennio, vede un significativo consolidamentoper l'evidenza dei risultati ottenibili e per le prospet-tive di ulteriore ampliamento nell'ambito della me-dicina rigenerativa. Per proseguire su questa stra-da, il Servizio trasfusionale dispone di attrezzaturee organizzazione sufficienti a implementare meto-diche standardizzate, economiche, verificabili edefficaci senza significative alterazioni dei routinariflussi di lavoro.Sebbene permangono alcune difficoltà per la defi-nizione di uno standard di prodotto, si mostranosempre più chiari nella letteratura i consensi sui

7.0 - CONCLUSIONI

fondamentali punti critici dei meccanismifisiopatogenetici. Sono fatti acquisiti le principalimetodiche di preparazione, prelievo in sacca o conseparatore cellulare; l'ottenimento del preparato,autologo oppure omologo, in sistema chiuso; la so-spensione delle cellule in crioprecipitato; la produ-zione di trombina da plasma, siero o crioprecipitato;la possibilità di conservazione dei fattori di crescitaassociati o meno a cellule mononucleate, eventual-mente preservando la vitalità di queste ultime conl'aggiunta di crioprotettore, per usi differiti e/oreiterati. Ciò fornisce al medico esperto di medici-na trasfusionale, al centro di tutto il processo, l'op-portunità di approfondire le proprie conoscenzearricchendo l'esperienza nel proficuo confrontomultidisciplinare. Egli può esprimere così una sortadi "ars medica" nell'adattare il prodotto per tipologiae sua preparazione, conservazione, dosaggio,somministrazione, all'ambito specialistico col qua-le si confronta.In accordo con Strada (Terrasini 2009), si può af-fermare che l'introduzione nella pratica medica del-l'impiego topico degli emocomponenti, in partico-lare del gel piastrinico, rappresenta una delle piùgrandi innovazioni apparse in medicinatrasfusionale negli ultimi decenni.

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