Entwicklung einer mehrstufigenAnalysemethode zur

Identifizierung potentiellerBiomarker für die Alzheimer

Demenz im Blut

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zurErlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.

vorgelegt vonKatharina Müller

aus Würzburg

Als Dissertation genehmigt von der NaturwissenschaftlichenFakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 19.03.2010

Vorsitzender derPromotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch

Erstberichterstatter: Prof. Dr. Cord-Michael Becker

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Andreas Burkovski

i

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung 1

2 Summary 3

3 Einleitung 53.1 Die Alzheimer Demenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

3.1.1 Die Bedeutung von Demenzerkrankungen in der heutigen Zeit 53.1.2 Klinische Symptome und neuropathologische Merkmale der Alz-

heimer Demenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53.1.3 Demenzdiagnostik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63.1.4 Therapieansätzte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

3.2 Methoden der Proteomik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93.2.1 Geschichte der Proteomik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93.2.2 2D-Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103.2.3 DIGE-Technologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103.2.4 Flüssigkeitschromatographien . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113.2.5 LC-ESI-MS-Analytik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.3 Zielsetzung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

4 Material 154.1 Chemikalienliste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154.2 Geräteliste und Gebrauchsmaterialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164.3 Computerprogramme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184.4 Humanes Plasma und Liquor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

5 Methoden 215.1 Patientenauswahlkriterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215.2 Gewinnung von humanem Blutplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . 215.3 Abreicherung von hochkonzentrierten Plasmaproteinen . . . . . . . . 215.4 Proteinkonzentrierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235.5 Bestimmung der Proteinkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . 235.6 Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen . . . . . . . . . . . . . . . . . 255.7 Anionenaustausch-Chromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265.8 Umkehrphasenchromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 275.9 Proteintrennung mittels 1D-Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . 29

5.9.1 Probenvorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

ii Inhaltsverzeichnis

5.9.2 Durchführung der Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . 295.10 Färbungen der 1D-Polyacrylamidgele . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

5.10.1 Coomassie-Färbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 315.10.2 Silberfärbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

5.11 Proteintrennung mittels 2D-Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . 325.11.1 Probenpräparation und isoelektrische Fokussierung (IEF) . . . 325.11.2 Zweite Dimension: Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . 34

5.12 Scan und Bildauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 375.13 Visualisierung der Proteine auf den 2D-Polyacrylamidgelen . . . . . . 385.14 Massenspektrometrische Analyse (MS) . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

5.14.1 Probenvorbereitung für die MS . . . . . . . . . . . . . . . . . 395.14.2 Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie (ESI-MS) . . . . 40

5.15 Auswertung der Peptidmassen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

6 Ergebnisse 436.1 Statistische Auswertung der diagnostischen Liquoranalyse . . . . . . . 436.2 Etablierung der mehrstufigen Analysemethode . . . . . . . . . . . . . 44

6.2.1 Affinitätschromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 446.2.2 Anionenaustausch-Chromatographie . . . . . . . . . . . . . . . 466.2.3 Umkehrphasenchromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . . 546.2.4 Optimierung der zwei-dimensionalen Gelelektrophorese . . . . 56

6.3 Arbeitsschema der mehrstufigen Trennmethode zur Identifizierung po-tentieller Biomarker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

6.4 DIGE-Analyse der Patientenproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 606.5 ESI-MS-Identifizierung der unterschiedlich exprimierten Proteine . . . 63

7 Diskussion 677.1 Patientenauswahl und Diagnose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 677.2 Potentielle Kandidatenproteine mit Krankheitsbezug . . . . . . . . . 68

7.2.1 Prolin-reiches Protein-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 687.2.2 Vitronectin Vorläufer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 687.2.3 Lipocalin Vorläufer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 697.2.4 Hemopexin Vorläufer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 697.2.5 ApoH β-Glykoprotein 1 Vorläufer . . . . . . . . . . . . . . . . 707.2.6 Komplementfaktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 707.2.7 C4-bindendes Protein (C4bP) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 717.2.8 Serpin G1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 727.2.9 Perspektive der Biomarker-Identifizierung und Validierung . . 72

7.3 Methodische Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 737.3.1 Abreicherung von hochkonzentrierten Proteinen . . . . . . . . 737.3.2 Flüssigkeitschromatographie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 747.3.3 2D-Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 757.3.4 Mehrstufige Analysemethode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 767.3.5 Auswertung der 2D-DIGE-Gele . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

Inhaltsverzeichnis iii

7.3.6 MS-Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 777.4 Schlussfolgerung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 777.5 Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

Literaturverzeichnis 79

Abkürzungen 93

Danksagung 97

1

1 ZusammenfassungEin wichtiges Ziel aktueller Forschungsaktivitäten im Bereich der Alzheimer Demenz(AD) ist die Suche nach geeigneten Biomarkern für die neurochemische Diagnostik,um die Früh- und Differentialdiagnose von Morbus Alzheimer und anderen Demen-zerkrankungen zu unterstützen.

Gegenwärtig sind nur im Liquor Cerebrospinalis Biomarker für AD gut belegt. EinUmstand der die praktische Anwendung im Klinikalltag erschwert, da die notwendigeLumbalpunktion einen massiven, invasiven Eingriff darstellt. Wünschenswert wäre einvalider Bluttest. Für die Ermittlung neuer Biomarker im Blut könnte eine innovativeKombination modernster proteomischer Techniken gute Dienste leisten.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine mehrstufige Analysemethode zur Identifizie-rung neuer potentieller Biomarker der Alzheimer’schen Erkrankung im Blut erfolg-reich etabliert.

Der Ansatz umfasste die sequenzielle Kombination von Affinitätschromatographiezur Reduktion der prominenten Plasmaproteine, Anionenaustausch-Chromatographie,Umkehrphasenchromatographie, 2D-DIGE und schließlich Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie (ESI-MS).

Die 2D-DIGE-Technik (Differentielle Gelelektrophorese, two-dimensional fluore-scence differences in gel electrophoresis) ist eine Weiterentwicklung der 2D-Gelelektro-phorese und dient der Feststellung von geringen Unterschieden der Proteinexpres-sionsprofile zwischen zwei zu vergleichenden Proben auf nur einem 2D-Gel.

Verglichen wurden die vereinigten Plasmaproben von sieben Patienten mit derDiagnose Alzheimer mit denen von sieben Patienten, die nicht an Morbus Alzheimer,sondern an anderen Demenzen litten. Zunächst wurden aus diesen Proben durchAffinitätschromatographie 12 hochkonzentrierte Blutproteine entfernt, die diagno-stisch vermutlich keine Rolle spielen, aber den Nachweis von niedrigkonzentriertenProteinen und Peptiden erschweren. Nach der Abreicherung wurden die verbliebenenProteine aus den beiden diagnostischen Gruppen mit unterschiedlichen Fluoreszenz-farbstoffen markiert. Anschließend wurden die markierten Proben gemischt und imgleichen Ansatz mit Anionenaustausch- und Umkehrphasenchromatographie fraktio-niert.

Eine 3-Stufen-Elution lieferte Fraktionen mit annähernd gleichen Proteinkonzen-trationen und erwies sich bei der Anionenaustausch-Chromatographie als optimal.Diese drei Fraktionen wurden separat auf eine Umkehrphasenchromatographiesäu-le injiziert und mit jeweils individuell angepassten 3-stufigen Elutionen aufgetrennt.Jede der neun Fraktionen aus der Umkehrphasenchromatographie wurde mit einerhochauflösenden 2D-DIGE (25,5 x 20,5 cm) analysiert. Für die Auftrennung in derzweiten Geldimension wurden 2-Stufen-Tris-Bicin-Polyacrylamidgele verwendet.

2 1. Zusammenfassung

Nach siebenfacher technischer Wiederholung des Experiments mit den gleichenPatientenproben konnten insgesamt sechzehn Proteinspots detektiert werden, derenrelative Häufigkeit sich zwischen den vereinigten Alzheimer und nicht-Alzheimer Plas-maproben um mindestens den Faktor 2,0 und statistisch signifikant unterschied. FünfProteine davon wurden in den sieben Experimentwiederholungen zu 71-86 % detek-tiert. Die Identität von neun der unterschiedlich exprimierten Proteine konnte mittelsESI-MS und anschließender Auswertung der Peptidmassen geklärt werden. Bezug-nehmend auf eine Literaturrecherche deuten folgende der unterschiedlich reguliertenProteine auf eine potentielle relevante, funktionelle Beteiligung an der Pathophysio-logie der Alzheimer Demenz und/oder am β-Amyloidstoffwechsel hin: VitronectinVorläufer, Lipocalin-1 Vorläufer, Hemopexin Vorläufer, ApoH β-Glykoprotein 1 Vor-läufer, Komplementfaktor C1S, Komplementfaktor 6 Vorläufer C6, CFH Isoform 1des Komplementfaktors H sowie die Inhibitoren Serpin G1 Serin/Cystein ProteaseInhibitor und Serpin G1 Plasma Protease C1 Inhibitor Vorläufer. Letzterer wurde ineiner zweiten MS-Identifizierungsrunde erfolgreich verifiziert.Die vorliegende Arbeit demonstriert die erfolgreiche Entwicklung und Anwendung

eines neuen multi-dimensionalen Trennverfahrens, das zur quantitativen, differentiel-len Proteomanalyse von Blutproben eingesetzt werden kann, um gegebenenfalls aufdiese Weise in der Zukunft weitere Biomarker auch für andere Krankheiten im Blutzu finden.

3

2 Summary

One important aim of current research activities in the field of Alzheimer Dementia(AD) is the search for valid biomarkers to support the early and differential diagnosisof Alzheimer’s disease and other dementias.

Currently, well established and widely accepted AD biomarkers are found onlyin cerebrospinal fluid. This circumstance complicates the practical implementation inthe clinical daily routine, because lumbar puncture is an invasive intervention. A validblood-based diagnostic assay would be highly desirable. An innovative combination ofstate of the art proteomic technologies may support the discovery for novel biomarkersin blood plasma.

In this project a multi-step procedure for the identification of novel potential Alz-heimer’s Disease biomarker in blood was successfully established.

The approach comprised the combination of affinity chromatography for depletionof highly abundant plasma proteins, anion-exchange chromatography, reversed-phasechromatography, 2D-DIGE and finally electrospray ionization mass spectrometry.

The 2D-DIGE-technology (two-dimensional fluorescence differences in gel electro-phoresis), an advancement of the 2D-gelelectrophoresis, is suitable for detecting minordifferences in protein expression levels between samples on the same 2D-gel.

A pool prepared from blood plasma samples from seven Alzheimer patients anda pool of samples from seven patients with other dementias, but none AlzheimerDisease, were compared. By affinity chromatography 12 high-abundant blood pro-teins were depleted. They have no diagnostic role, but complicate the detection oflow-abundant proteins in plasma samples. After depletion of the high-abundant pro-teins, the remaining proteins from both diagnostic groups were labeled with differentfluorescent dyes. The differentially labeled samples were combined and fractionatedby anion exchange and by reversed phase chromatography with a three-step elutionprocedure.

The resulting fractions had almost identical protein concentrations which was con-sidered as optimal for the further analysis. The three fractions were injected consecu-tively onto a reversed-phase chromatography column and separated with individuallyadjusted 3-step-elutions. Each of the nine resulting fractions was finally separated ona high-resolution 2D-DIGE (25.5 x 20.5 cm). A two-step-Tris-Bicine-gel-system wasused for the second dimension.

Seven independent technical repeats of the experiments revealed sixteen potentialbiomarkers, which differed statistically significant by a factor at least 2 in terms oftheir average ratio between the Alzheimer and the non-Alzheimer plasma sample.Five of this sixteen proteins could be detected by a frequency from 71 to 86% of the

4 2. Summary

seven repeats. The identities of nine of the differentially expressed proteins were suc-cessfully determined by electrospray ionization mass spectrometry analysis (ESI-MS)and a consequently analysis of peptid masses. For several of the identified potentialbiomarker candidates, namely Vitronectin precursor, Lipocalin-1 precursor, Hemope-xin precursor, ApoH β Glycoprotein precursor, complement factor C1S, complementfactor 6 precursor C6, CFH isoform 1 of complement factor H, and two inhibitorsSerpin G1 Plasma Protease C1 inhibitor and Serpin G1 Serine/Cysteine Protease in-hibitor published findings suggest their potential involvement in the pathophysiologyof Alzheimer’s Disease and/or β-amyloid related mechanisms. The Serine/CysteineProteinase Inhibitor was successfully verified by a second MS-identification.In summary, this work describes the successful development and trial application

of a novel multi-dimensional separation approach, which may provide a potential toolto search for blood-based future biomarkers for other diseases as well.

3 Einleitung

3.1 Die Alzheimer Demenz

Morbus Alzheimer ist benannt nach dem deutschen Psychiater Alois Alzheimer, der1906 auf der „37. Versammlung der südwestdeutschen Irrenärzte” den Fall seinerPatientin Auguste D. vorstellte. Alzheimer beschrieb dabei und in seinem Aufsatz von1907 klinische Symptome (einer Demenz) und charakteristische neuropathologischeVeränderungen, Amyloide Plaques und Neurofibrillenbündel, die auch heute für diedefinitive post-mortem Diagnose entscheidend sind ([2], Übersicht bei [73] und [15]).

3.1.1 Die Bedeutung von Demenzerkrankungen in derheutigen Zeit

In der heutigen Zeit hat die Alzheimer Demenz (AD) vor allem in den Industrielän-dern mit stetig zunehmender Lebenserwartung eine enorme Bedeutung erlangt. NachAngabe der Deutschen Alzheimer Gesellschaft (DAG), litten im Jahr 2008 insgesamt1,1 Millionen Menschen in Deutschland an Demenzerkrankungen [9]. Die häufigsteUrsache für eine Demenz war Alzheimer. Aufgrund der steigenden Lebenserwartungist mit einem dramatischen Anstieg der Patientenzahlen zu rechnen. Die DAG warntvor einer Verdopplung der Demenzfälle bis 2050 falls keine erfolgversprechenden Prä-ventionsmethoden und Therapieansätze entwickelt werden können [9].

3.1.2 Klinische Symptome und neuropathologische Merkmaleder Alzheimer Demenz

Zu den klinischen Symptomen einer Alzheimer Demenz zählen progressive Gedächt-nisverluste, Sprachstörungen, Desorientierung, Einschränkungen des Denkvermögensund Verhaltensänderungen [2, 73, 101]. Anfangs zeichnen sich betroffene Patientendurch ein mangelhaftes Kurzzeitgedächtnis aus - wie auch bei anderen Demenzerkran-kungen häufig. Längerfristig ergeben sich zudem Probleme des Langzeitgedächtnisses.

Klinisch gesehen ist die Alzheimer Demenz eine auffällig klare Demenzerkrankung.In Übereinstimmung mit seinem üblichen Vorboten, der amnestische Typ der mildenkognitiven Störung (MCI), tritt AD gewöhnlich als vereinzelte, schleichende und pe-riodisch wiederkehrende Beeinträchtigung des deklarativen Gedächtnisses auf. Wobeianfänglichen Symptome, wie zum Beispiel Störungen der Gefühlswelt, des Verhaltens,oder des Bewegungsapparates, eher auf andere Diagnosen hindeuten [101].

6 3. Einleitung

Zusätzlich definieren neuropathologische Charakteristika, zwei Arten von Protein-aggregationen, den wesentlichen Phänotyp der Krankheit: β-Amyloid-Plaques, derenHauptkomponenten 40 bzw. 42 Aminosäuren lange Peptide sind und die neurofibrillä-ren Bündel, die aus hyperphosphoryliertem Tau-Protein bestehen. Zusätzlich gibt esZeichen für lokale Entzündungen, mit einer Zusammenlagerung von aktivierten Mi-kroglia und Astrozyten um die Aβ-Ablagerungen (anschauliche Abb. bei [94, 101]).Die neuronale Degeneration ist besonders bedeutend in den Parietal- und Tem-

poralkortizes, dem Hippocampus, dem entorhinalen Kortex und den Amygdala. Diefortschreitende neuronale Degeneration führt zu einer Abnahme der synaptischenKontakte. Dies ist womöglich eine Erklärung für den mehrfachen Ausfall der Neuro-transmitter bei AD [101].Die dominierende Theorie zur Entstehung und Entwicklung der Alzheimer Demenz

ist die Amyloidkaskadenhypothese, nach der die Akkumulation von bestimmten oli-gomeren oder aggregierten Formen der Aβ-Peptide in bestimmten Hirnregionen eineKaskade von pathologischen Ereignissen auslöst, die letztlich zu Fehlfunktionen undzum Verlust von Synapsen und Neuronen, und damit zu den klinischen Symptomenführt (zur Übersicht, s. [33]). Mit dieser Theorie kann jedoch nicht erklärt werden,warum die Anzahl der Plaques nicht mit dem klinischen Schweregrad im Zusammen-hang stehen [36, 37].Unterschiedliche Formen von Demenzen wie z. B. Alzheimer Demenz, Fronto-

temporal Demenz oder die Pick Demenz entstehen durch die fehlerhafte Hyperphos-phorlyierung der Tau-Proteine [14, 46, 48].

3.1.3 Demenzdiagnostik

Molekulare Krankheitsmarker können die klinische Diagnose von AD ergänzen unddazu beitragen Patienten mit einem großen Risiko oder im frühen Krankheitssta-dium zu diagnostizieren [35, 68]. Zusätzlich können Biomarker eine mögliche Hilfebeim Überwachen der Wirksamkeit von Medikamenten sein und dienen der Ent-wicklung von neuen Behandlungsmöglichkeiten. Biochemische Veränderungen die denpathologischen Prozess im Gehirn beschreiben, können im Liquor ermittelt wer-den. In AD-Patienten sind erniedrigte mittlere Liquor Konzentrationen von löslichenAß-Peptiden, die auf ein Alanin-42 enden und phospho-Tau-Proteinen gut belegt[5, 116, 123]. Erhöhte Werte von Gesamt-Tau Protein im Liquor können ebenfallsin einigen Gehirnen von beispielsweise Fronto-temoral-Demenz-Patienten festgestelltwerden [28]. Erhöhtes Gesamt-Tau im Liquor tritt bei axonaler sowie neuronaler De-generation auf und ist daher kein spezifischer Marker für eine bestimmte neurodegene-rative Funktionsstörung. Ein frühes Symptom in der Entwicklung von neurofibrillenVeränderungen in AD ist die abnormale Hyperphosphorylierung des Tau-Proteins.In vielen Studien wurden erhöhte Konzentrationen von phosphoryliertem Tau (phos-phosTau) im Liquor von AD-Patienten gemessen [87, 106].

3.1. Die Alzheimer Demenz 7

Anwendung der unterstützenden Liquordiagnostik

Die klinische Diagnose beim lebenden Patienten kann durch bildgebende Verfahrenund die Messung der in der Literatur gut belegten Liquor-Biomarker Aβ42 bzw. dasVerhältnis Aβ1-42/1-40, gesamt-Tau und Phospho-Tau unterstützt werden [35, 65,66, 68].

Gegenwärtig wird die Demenzdiagnose aufgrund mehrerer voneinander unabhän-gigen Untersuchungen gestellt, darunter bildgebende, neurochemisch-analytische undneuro-psychologische Verfahren. Dabei stellt die neurochemische Liquordiagnostikeinen immer wichtigeren unterstützenden Bestandteil bei der Differentialdiagnostikdar. In Tabelle 3.1 sind alle Liquorparameter angegeben, die bei der AD-Diagnostik inder Psychiatrischen und Psychotherapeutischen Universitätsklinik Erlangen berück-sichtigt werden. Auch das Alter des Patienten spielt eine Rolle. Die Referenzwertewurden jeweils soweit bekannt angegeben. In diesem Fall sprechen alle Liquorpara-meter für eine Alzheimer Demenz. Der Patient ist zudem genetisch prädisponiert.

Tabelle 3.1 – Fallbeispiel der Liquordiagnostik eines Patienten mit der Diagnose Alz-heimer.

Neurochemische-diagnostische Liquor-Parameter

Alter Aβ-1-42 Aβ-1-40 Aβ1-42/1-40 pTau ApoE

69 387 10.000 0,0387 147 4 x 3

Referenzwert Referenzwert Referenzwert Referenzwert< 500 pg/ml k.A. < 0,100 >60 pg/ml

Differential- und Blutdiagnostik

Die bisher vielfach eingesetzten Aβ-Biomarker scheinen mit neuropathogoloschen Ver-änderungen und Gedächtnis zu korrelieren. Diese Marker sind aber nicht für eine De-menzerkrankung spezifisch, was immer noch ein Problem in der Differentialdiagno-stik darstellt. Es gestaltet sich nicht nur die diagnostische Unterscheidung zwischenAlzheimer Demenz und anderen Demenzerkrankungen schwierig, hinzu kommt dieAbgrenzung von Untergruppen [47]. Die eindeutige Diagnose Alzheimer Demenz istderzeit nur post-mortem möglich.

Ein Bluttest würde den Diagnoseprozess für die Patienten erheblich erleichternund Mehrfachabnahmen für longitudinale Studien ermöglichen. Derzeit sind jedochkeine validen Biomarker für die Alzheimer Krankheit im Blut bekannt. Da wenigerinvasiv, wären valide AD-Biomarker im Blut ein großer Vorteil, v.a. wenn sie die Früh-und Differentialdiagnostik unterstützten könnten, um gegebenenfalls therapeutische

8 3. Einleitung

Maßnahmen so früh wie möglich einleiten zu können [109]. Dass Alzheimer relevanteBiomarker auch im humanem Blutplasma generell nachweisbar sind, haben Lewczuket al. bereits 2004 veröffentlicht [63]. Der aktuelle Stand der Demenzdiagnostik istbei Lewczuk et al. 2004 und 2008 zu finden [63, 65, 68].Eine Möglichkeit nach neuen Biomarkern im Blut zu suchen ist ein hypothesenfreier

proteomischer Ansatz.

Frühdiagnostik

Die Forderung nach einer Frühdiagnose wird in vielen wissenschaftlichen Publika-tionen gestellt [13, 86]. Eine frühe Erkennung einer Demenzerkrankung könnte dasweitere Fortschreiten durch den Einsatz einer geeigneten Therapie unterbinden unddamit die Lebenserwartung der Patienten drastisch erhöhen. Oft bemerkt jedoch derBetroffene die schwindende kognitive Leistung erst, wenn er nicht mehr in der Lageist, seinen Alltag alleine zu meistern. Zu diesem Zeitpunkt ist meistens die Demenzbereits fortgeschritten und der Untergang der Neuronen im Gehirn irreversibel. MitHilfe einer Frühdiagnostik könnten sich ältere Menschen einer Vorsorgeuntersuchungunterziehen um festzustellen, ob sie sich bereits im Anfangsstadium einer Demenzbefinden.Eine Gentypisierung der ApoE-Allele bringt zwar keine diagnostische Aussage,

stellt aber einen Risikofaktor für jedwede Gehirnerkrankung dar. Dabei verstärkt ernur die anderen Parameter, es erhärtet sich im jeweiligen Fall der Verdacht einer Er-krankung. Damit ist die ApoE4/ApoE4-Kombination als sogenannter Verstärkungs-faktor einzustufen. Zudem ist die Auswirkung von ApoE ernährungsspezifisch, da esein Fetttransportprotein darstellt und nur für die Menschen in den Industrieländernohne Nahrungsmittelknappheit, zum Risiko wird [90].

Tabelle 3.2 – Auflistung aller möglichen ApoE-Allel-Kombinationsmöglichkeiten undihre potentielle Gefahr für eine Gehirnerkrankung bei Menschen in den Industrieländern.

Allele Risikopotential

ApoE2/ApoE2 protektivApoE2/ApoE3 protektivApoE3/ApoE3 neutralApoE3/ApoE4 geringes RisikoApoE4/ApoE4 hohes Risiko

3.2. Methoden der Proteomik 9

3.1.4 Therapieansätzte

Die meisten heute eingesetzten Alzheimer-Medikamente bewirken eine Erhöhung desNeuotransmitters Acetylcholin [124]. Sie nützen aber nur vorübergehend. Ihre Wir-kung hält etwa sechs bis zwölf Monate an, da der Untergang von Neuronen so nichtaufzuhalten ist. Weitere mögliche Ansatzpunkte von Therapien sind daher die β-und γ-Sekretasen. Die γ-Sekretase stellt einen Multienzymkomplex dar, bei dem dasPrasenilin beteiligt ist [98]. Wolfe et al. veröffentlichten 1999, dass es sich bei derγ-Sekretase um eine Aspartat-Protease handelt [125]. Mögliche Hemmmoleküle derγ-Sekretase stehen zur Verfügung, die nicht direkt das reaktive Zentrum blockieren,sondern die räumliche Konfiguration verändern [124]. Eine Langzeittherapie mit Im-munoglobulinen befindet sich zur Zeit in der klinischen Testung [96].

Derzeit gibt es jedoch keine kausal wirksamen Therapien. Zugelassene Medikamentewirken sich bisher nur auf die Symptomatik aus, können aber weder die Krankheitheilen noch den progressiven Verlauf stoppen.

Pathologischen Veränderungen beginnen vermutlich viele Jahre vor dem Auftretender klinischen Symptome. Das wurde anhand von Positron-Emissions-Tomographie-Bildgebungstudien unter der Verwendung von der Pittsburgh Komponente-B heraus-gefunden (siehe z.B. [56, 92]). Daher müssten kausal wirksame Therapieansätze (z.B.Abeta Immunisierung) eigentlich vor den kognitiven Verlusten begonnen werden, umwirklich effektiv zu sein. Deshalb ist die Suche nach Biomarkern, die die Konversionvon MCI zu AD vorhersagen können, besonders wichtig.

3.2 Methoden der Proteomik

3.2.1 Geschichte der Proteomik

Unter Proteomik (engl. Proteomics) versteht man heutzutage die Untersuchung vonquantitativen Veränderungen von Proteinexpressionsstufen und ihre Anwendung fürMedikamentenentwicklung, -diagnose und -therapie [120]. Die ursprüngliche Definiti-on einer Proteom-Analyse lautet „The analysis of the entire PROTEin complementexpressed by a genOME, or by a cell or tissue type” [34, 119]. Somit untersuchenwissenschaftliche Projekte der Proteomik die Gesamtheit der Proteine in einer Zelleoder einem Organismus und deren Veränderungen. Anfangs bestanden die Technolo-gien der Proteomanalyse in erster Linie aus zwei-dimensionaler Elektrophorese unddie Proteine wurden mittels nachfolgender Massenspektrometrie identifiziert.

Probleme der Proteinanalytik treten häufig aufgrund von Konzentrationsunter-schieden zwischen Proteinspezies auf [3]. Gerade die niedrigkonzentrierten Proteinesind auch für die vorliegende Arbeit wichtig, da es sich gezeigt hat, dass gerade dieseProteingruppe ein großes Potential besitzt, krankheitsrelevant zu sein.

10 3. Einleitung

3.2.2 2D-Gelelektrophorese

Die 2D-Gelelektrophorese ist auch 30 Jahre nach ihrer Erfindung von O’Farrell undKlose [54, 85] die erste Wahl der Trennmethoden für die Proteomanalyse. Sie vereintdie Separation von zwei vollständig unabhängigen physikochemischen Parametern,isoelektrischer Punkt und Größe, und garantiert somit eine größtmögliche Auflösung.Mehrere tausend Proteine können auf einem Gel getrennt und dargestellt werden.Proteine in einer Größenordnung von 10 bis 200 kDa und mit einem isoelektrischenPunkt von 3 bis 10 können analysiert werden. Da die Trennung unter vollständigdenaturierten Bedingungen stattfindet, ist die Methode auch für stark hydrophobeProteine geeignet. Es scheint, dass die 2D-Gelelektrophorese die Hauptseparations-technik auch in der näheren Zukunft bleiben wird, da ihre Auflösung und der Vorteilder Lagerung der isolierten Proteine in der Gelmatrix zur späterer Analyse, gegenüberanderen alternativen Techniken überlegen ist [120].Görg et al. vereinfachten im Jahr 2000 die Handhabung der zweiten Dimension

mit der Entwicklung eines immobilisierten Trockengelstreifens mit einem vorgegebe-nen pH-Bereich für die isoelektrische Fokussierung [29]. Diese Methode wurde stetigweiterentwickelt [30].

3.2.3 DIGE-Technologie

Um Proteinproben von zwei unterschiedlichen Patientengruppen zu vergleichen, wur-den traditionell zwei Gele parallel angefertigt und untersucht, beispielsweise nacheiner Silberfärbung. Dabei konnten technische Variationen nie ganz ausgeschlossenwerden.Die aus der Methode resultierenden Unterschiede zwischen unterschiedlichen Gelen

lassen sich durch die Verwendung der DIGE-Fluoreszenzfarbstoffe vermeiden. Unlüet al. veröffentlichten 1997 „Eine einzige Gelmethode um Unterschiede in Proteinex-trakten zu detektieren”, der Beginn der DIGE-Technik [84].Die 2D-DIGE-Technik (Differentielle Gelelektrophoerese, engl. two-dimensional flu-

orescence differences in gel electrophoresis) ist eine Weiterentwicklung der zwei-dimen-sionalen Gelelektrophorese. Die Proben von Patienten und Kontrollgruppe werdenmit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und dann gemeinsam aufge-trennt. Dabei wirken sich systematische Fehler und äußere Einflüsse exakt gleich aufdie Trennung aus, wodurch minimalste Konzentrationsunterschiede im Nanogramm-bereich, zwischen den Proteinen von Patienten und Kontrollen sichtbar werden. DasDIGE- Verfahren stellt zur Zeit die universellste Methode zur Proteomanalyse dar,die es ermöglicht krankheitsspezifische Proteinexpressionsmuster zu erkennen [52].Seit dem Jahr 2001 wird die DIGE-Technik erfolgreich in Forschungslaboren ein-

gesetzt [71, 112]. Der Durchbruch dieser Methode gelang mit der Entwicklung undVerwendung eines dritten Farbstoffs, der als interner Standard fungiert. Eine kleineMenge aller in einem Experiment verwendeten Proben wurden vermischt und mitden dritten Farbstoff markiert. Erst damit war die Auswertung und der Vergleichvon wiederholten 2D-Gelelektrophoresen möglich, da alle detektierten Proteinspots

3.2. Methoden der Proteomik 11

auf den internen Standard normiert werden konnten [1].Die Vorteile des DIGE-Verfahrens im Vergleich zu herkömmlichen Färbemetho-

den für 2D-Gele bestehen im Folgenden: Unterschiedlich exprimierte Proteine wer-den schneller detektiert. Eine geringere Anzahl an 2D-Gelen muss hergestellt werden,da je zwei Proben auf einem 2D-Gel kombiniert werden und keine Replikate nötigsind. Die Gele werden direkt in den Glaskassetten analysiert, durch Abtastung einesScanners. Die Bildanalyse erfolgt von dem speziell dafür entwickelten Computerpro-gramm halbautomatisch, die Anwendeung ist einfach und bedarf nur einer kurzenEinarbeitungszeit. Gel-zu-Gel-Unterschiede werden eliminiert, da es das Proteinspot-Volumen-Verhältnisse relativ zum internen Standard berechnet. Der interne Stan-dard und der große linear-dynamische Bereich der Fluoreszenzfarbstoffe erlauben diequantitative Messung der geringeren Veränderungen des Expressionsgrads mit hoherstatistischer Verlässlichkeit. Die mit Cystein markierten Proben, die weniger als 1µgGesamtprotein enthalten, können mit 2D-Gelelektrophorese analysiert werden.

Der große Vorteil von DIGE besteht in der Berücksichtigung der technischen Vari-anz von verschiedenen Gelreplikaten. Was vor dieser Methodenentwicklung nur schwermöglich, ist nun dank der DIGE-Technik automatisch machbar. Selbst wenn die Lauf-front von technischen Gelreplikaten, die mit unterschiedlichen Elektrophoresen her-gestellt wurden, sich um bis zu 5 cm unterscheidet, ist es dennoch möglich aufgrundder automatischen Detektion die korrespondierenden Spots zu finden und zuzuordnen.Für die Detektion ist eine Silberfärbung nicht mehr zwingend nötig, dies geschiehtdurch Auswertung der digitalisierten Gelbilder.

3.2.4 Flüssigkeitschromatographien

Bei der Anionenaustausch-Chromatographie werden Proteine nach der Ladung ge-trennt. Negativ-geladene Proteine werden zunächst vom positiv-geladenen Säulen-material zurückgehalten und schließlich mit einem Salzgradienten von der Säule, ent-sprechend ihrer Ladung eluiert.

Bei der Umkehrphasenchromatographie erfolgt die Trennung der Proteine entspre-chend ihrer Hydrophobizität. Für die Elution wird meistens ein Lösungsmittelgradientverwendet, bestehend aus wässrigen Lösungen und organischen Lösungsmitteln.

3.2.5 LC-ESI-MS-Analytik

Die Massenspektrometrie (MS) ist eine Analysetechnik, die das Masse-zu-LadungVerhältnis (mass-to-charge ratio, m/z) von Ionen misst, basierend auf deren Bewe-gung in einem elektrischen oder magnetischen Feld [120]. Aufgrund dieser Spektrenkönnen die Molekularmassen genau bestimmt werden. In vielen Fällen lassen sichaufgrund der tryptischen Fragmente nach Datenbankvergleich exakte Aussagen zurIdentität der untersuchten Peptide treffen.

Bei der LC-ESI-MS handelt es sich um eine Flüssigkeitschromatographie-gekoppelteElektrospray-Ionisation Massenspektrometrie. Die Flüssigkeitschromatographie (LC,liquid-chromatography) bietet eine leistungsfähige Fraktionierungsmethode, die mit

12 3. Einleitung

nahezu jedem Massenspektrometer mit ESI kompatibel ist. Diese Methode trenntgroße Analytmengen auf einer HPLC-Säule mit großer Empflindlichkeit und ist au-tomatisierbar.Aufeinanderfolgende Trennmethoden, die verschiedene Separationsmedien in zwei

unabhängigen Schritten verwenden, bieten eine multi-dimensionale Fraktionierung dieüber die untersuchten Proteine sehr viele Informationen erzeugen können. Proteinemit einem großen Molekulargewicht werden tryptisch gespalten und die resultierendenFragmente untersucht, da sie selbst nicht mit LC-ESI-MS analysiert werden können[83].Lamond et al. waren die ersten Wissenschaftler, die eine Massenspektrometrie-

Anwendung zur Entdeckung von Biomarkern verwendeten [61].

3.3 Zielsetzung

In diesem Rahmen sollte ein mehrstufiges Analyseverfahren entwickelt werden, dasgeeignet ist hypothesenfrei in biologischen Flüssigkeiten nach Proteinen zu suchen,deren Menge sich in AD-Patienten signifikant von der in passenden Kontrollen unter-scheidet. Bei Erfolg könnte ein solcher Biomarker geeignet sein, die Diagnosestellungzu unterstützen. Humane Plasmaproben dienten als Ausgangsmaterial für die Suchenach krankheitsspezifischen Proteinen und Peptiden für die Alzheimer Demenz.Der Nachweis von niedrigkonzentrierten Plasmaproteinen sollte in dieser Arbeit

durch die Anwendung der DIGE-Technik (Differentielle Gelelektrophorese, differencesin gel electrophoresis) realisiert werden. Damit ist es möglich, Proteine von zwei zuvergleichenden diagnostischen Gruppen mit Fluoreszenzfarbstoffen unterschiedlich zumarkieren und mittels zweidimensionaler Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf dem-selben Gel aufzutrennen.Da sich im Plasma jedoch Proteine auf einen Konzentrationsbereich von über fünf

Größenordnungen verteilen, war es notwendig, diese vorzufraktionieren. Damit er-forderte das Gesamtkonzept die Entwicklung und Etablierung einer mehrstufigenVerfahrenstechnik. In einem ersten Schritt sollten die hochkonzentrierten Plasma-proteine abgetrennt werden, um die Analyse der niedrigkonzentrierten Proteine, dievermutlich diagnostisch eine größere Rolle spielen, zu erleichtern. Weitere Stufen derTrennmethode sollten mit Anionenaustausch- und Umkehrphasenchromatographiensowie mit 2D-Gelen durchgeführt werden. Dabei waren die Gradienten sinnvoll ein-zustellen und auch geeignete Säulen für das Vorhaben auszuwählen. In diesem Rah-men sollten sowohl die Fällung des Protein-Peptid-Gemisches und die Fraktionierungmit besonderen 2D-Stufengelen optimiert werden. Zudem war eine Gesamtkonzeptionder Analysemethode zu erstellen und darauf zu achten, dass die jeweiligen Methodenkompatibel sind.Die qualitative und quantitative Analytik sollte mit der oben beschriebenen DIGE-

Technik und einem entsprechenden Auswertungsprogramm erfolgen. Die Identifizie-rung von potentiellen Biomarkern sollte mittels ESI-Massenspektrometrie durchge-führt werden. Idealerweise sollten so potentielle Biomarker für die Alzheimer Demenz

3.3. Zielsetzung 13

ermittelt werden.

4 Material

4.1 Chemikalienliste

Acteton ≥ 99,5 %, zur Synthese Roth, KarlsruheAcetonitril für die HPLC AppliChem, DarmstadtAcrylamide, 99,9 %, Electrophoresis Biorad, Hercules, CA, USAPurity ReagentAgarose low melt, RotirGarose Roth, Karlsruhefür die MolekularbiologieAlbumin Fraktion V, biotinfrei Roth, KarlsruheAmershamTM Iodoacetamide GE Healthcare, FreiburgAmershamTM Thiourea (Thioharnstoff) GE Healthcare, FreiburgAmidoschwarz Merck, DarmstadtAmmoniumsulfat ≥ 99,5 %, p.a., ACS,ISO

Roth, Karlsruhe

Bicine, (N,N-bis-[2-Hydroxyethyl] USB, Cleveland, Ohio, USAglycine), ultrapureBIS N,N´-Methylene-bis-acrylamide, EPR Biorad, Hercules, CA, USABIS-TRIS, Bis-(2-hydroxyethyl)- Biomol, Hamburgimino-tris(hydroxymethyl)methaneBromphenolblau Merck, DarmstadtCoomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 Merck, DarmstadtCyDyeTM DIGE Fluor CyTM2 minimal dye GE Healthcare, FreiburgCyDyeTM DIGE Fluor CyTM3 minimal dye GE Healthcare, FreiburgCyDyeTM DIGE Fluor CyTM5 minimal dye GE Healthcare, FreiburgDeoxycholic acid, Minimum 99 % Sigma-Aldrich, SteinheimDMF, N,N-Dimethylformamid Sigma-Aldrich, SteinheimDTT, Dithiothreitol usb corporation, OH, USAEDTA Dinatriumsalz Dihydrat Roth, Karlsruhe≥ 99 % ,p.a., ACSEssigsäure, Rotipuranr 100 %, p.a. Roth, KarlsruheEthanol 96% (v/v) vergällt mit Apotheke des Universitätsklinikums,Ethylmethylketon ErlangenFormaldehydlösung mind. 37 % Merck, DarmstadtGlutardialdehydlösung 25 % Merck, DarmstadtGlycerin Rotipuranr ≥ 99,5 %, p.a. Roth, Karlsruhewasserfrei

16 4. Material

Glycin ≥ 99 %, p.a. Roth, KarlsruheHarnstoff für die Molekularbiologie AppliChem, DarmstadtKaliumhydroxid Plätzchen Merck, DarmstadtL-Lysin monohydrochlorid, minimum 98 % Sigma-Aldrich, SteinheimMethanol ≥ 99 % Roth, KarlsruheNatriumacetat ≥ 99 %, p.a., ACS Roth, KarlsruheNatriumazid reinst Merck, DarmstadtNatriumcarbonat wasserfrei ≥ 99,8 % Roth, KarlsruheNatriumchlorid ≥ 99,5 %, p.a., ACS, ISO Roth, KarlsruheNatriumhydroxid Plätzchen Merck, DarmstadtNatriumthiosulfat-Pentahydrat Merck, DarmstadtPlusOne APS (Ammoniumpersulphate) Amersham, Uppsala, SchwedenPlusOne CHAPS GE Healthcare, FreiburgPlusOne Dry Strip Cover Fluid Amersham, Uppsala, SchwedenPlusOne Glycerol (87 % w/w) Amersham, Uppsala, SchwedenPlusOne TEMED (N,N,N´,N´-Tetra-methylethylene-diamin)

GE Healthcare, Freiburg

PlusOne TRIS, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane

Amersham, Uppsala, Schweden

PlusOne Urea Amersham, Uppsala, SchwedenPlusOne SDS (Sodium dodecyl sulfate) Amersham, Uppsala, SchwedenpH-Fix 4,5-10, Indikatorstäbchen Machery-Nagel, Dürenortho-Phosphorsäure 85 % Merck, DarmstadtPharmalytheTM 3-10 for IEF GE Healthcare, Freiburg2-Propanol, Rotipuranr ≥ 99,8 %, Roth, Karlsruhep.a., ACS, ISORotiphoresegel (Acrylamid 30% T/ Roth, Karlsruhe2,6% C)Salzsäure rauchend, Rotipuranr 37 %, Roth, Karlsruhep.a., ACS, ISOSchwefelsäure 0,5mol/L, 1N Lösung Roth, KarlsruheSilbernitrat paesel+lorei, HanauThiourea EttanTM GE Healthcare, FreiburgTrichloressigsäure ≥ 99 %, p.a. Roth, KarlsruheTrifluoroacetic acid, 99 % Sigma-Aldrich, Steinheim

4.2 Geräteliste und Gebrauchsmaterialien

Alpha 1-4 Kühleinheit Christ, Osterode am HarzÄktapurifier HPLC GE Healthcare, FreiburgBioBasic-4 100 x 2,1 mm Thermo, LangenselboldBiofuge pico Heraeus, Hanau

4.2. Geräteliste und Gebrauchsmaterialien 17

CanoScan LiDE 20 Canon, KrefeldChromolithr Performance Merck, DarmstadtDrehschieber Vacuumpumpe Vacubrand, WertheimEDTA KE/9 ml S-Monovetter Sarstedt, NümbrechtElektrophorese Energieversorgung Amersham, Uppsala, Schweden(power supply)Ettan Dalt II System Separationseinheit, Amersham, Uppsala, SchwedenEnergieversorgung und GelgiessstandEttanLC und EttanµLC, HPLC GE Healthcare, FreiburgFunction Line Labfuge 400R Heraeus, HanauHCTultra-EDT II Massenspektrometer Bruker Daltonik, LeipzigHeidolph promax 1020 Heidolph, SchwabachHeizblock Grant-Boeckel, Cambridge, EnglandImmobilineTM DryStrip pH 3-10, 24 cm GE Healthcare, Uppsala, SchwedenIEF-Trog (strip holder), 24 cm Amersham, Uppsala, SchwedenIgY 12 LC 10 Beckman Coulter, KrefeldIKA Vibrax, VXR basic, Typ VX 2 E IKA, StaufenIPGphorTM IEF System Amersham, Uppsala, SchwedenKühlschrank Kombi Liebherr, NürnbergMagnetrührer MR 3000 Heidolph, SchwabachMicroplate Reader BioRad, MünchenMonoQTM 4.6/100 PE GE Healthcare, FreiburgNiedrigfluoreszent-Glassplatten Amersham, Uppsala, SchwedenNitrozellulose-Membran HybondTM- GE Healthcare, FreiburgECLTM

ParafilmrM Brand, WertheimpH-Elektrode Blue line pH 12 Schott, MainzPräzisionswaage Kern 470 Kern, Balingen-FrommernPräzisionswaage Kern 770 Kern, Balingen-FrommernReaktionsgefäße 0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml Eppendorf, HamburgSorvall RC 5B plus Thermo, LangenselboldSourceTM 5RPC ST 2,1/150 GE Healthcare, FreiburgSuperloop 50 ml Amersham, Uppsala, SchwedenTKA LAB Reinstwassersystem Aquatop Laborbedarf, NeufarnTiefkühlschrank -86 ◦C VIPTM Sanyo, Bad NenndorfTyphoon Trio Variable Mode Imager GE Healthcare, FreiburgUltraschallbad, Bandelin SonoRex Bandelin, BerlinVacuumzentrifuge RVC 2-18 Christ, Osterode am HarzVortex Mixer 7-2020 Neolab, HeidelbergZentrifuge 5415R Eppendorf, HamburgZentrifugationsfilter, 0,45 µm Porengröße Millipore, Schwalbach(spin columns)Zentrifugenröhrchen, 15 ml und 50 ml Roth, Karlsruhe

18 4. Material

Zentrifugenröhrchen, 50 ml, für Hoch- Herolab, Wieslochgeschwindigkeitszentrifugen

Die aufgeführten Firmen haben, wenn nicht anders angegeben, einen Sitz in Deutsch-land. Bei den Eigennamen handelt es sich um patentgeschützte Marken der Firmen.Diese wurden stellvertretend für die gesamte Arbeit nur in diesem Kapitel als solchekenntlich gemacht.

4.3 Computerprogramme

In Tabelle 4.3 sind alle in dieser Arbeit verwendeten Computerprogramme aufgelistet.

Tabelle 4.3 – Liste der verwendeten Spezialprogramme.

Programm Anwendung Firma

DeCyder 2D 6.5 Auswertungsprogramm GE Halthcare, Freiburg,Deutschland

ImageQuant 5.2 Bildbearbeitungsprogramm GE Halthcare, Freiburg,Deutschland

Metamorph Quantifizierungsprogramm Universal Imaging,Downingtown, PA, USA

QuantityOne Quantifizierungsprogramm BioRad, München,Deutschland

Unicorn 4.1 FPLC-Steuerungsprogramm GE Halthcare, Freiburg,der Äkta Deutschland

Unicorn 4.12 HPLC-Steuerungsprogramm GE Halthcare, Freiburg,der Ettan Deutschland

4.4 Humanes Plasma und Liquor

Für Vorversuche und Kontrollexperimente wurde Blutplasma von gesunden Spendernund Liquor eines Patienten mit der Diagnose eines Hydrocephalus externus verwen-det.Das Patientenkollektiv umfasste ausschließlich Individuen der Psychiatrischen und

Psychotherapeutischen Universitätsklinik Erlangen. Die von diesen Patienten stam-menden Plasmaproben wurden bei der direkten Durchführung der Analysemethodeeingesetzt.

4.4. Humanes Plasma und Liquor 19

Erlanger Demenzpatienten hatten im Vorfeld Liquor- und Blutproben der wissen-schaftlichen Forschung zur Verfügung gestellt. Vierzehn Plasmaproben von je 1mlwurden für die vorliegende Arbeit verwendet. Dabei handelte es sich um sieben Pati-enten mit der Diagnose Alzheimer und sieben Patienten mit Demenzen anderer Ge-nese. Letztere Gruppe setzte sich aus zwei Patienten mit Lewy-Körperchen-Demenz,einem Patienten mit Fronto-temporal-Demenz, einem Patienten mit vaskulärer De-menz, zwei Patienten mit Demenzen unklarer Genese und einem Patienten mit einerDemenz bei Morbus Parkinson zusammen.

Die vorliegende Untersuchung wird durch ein Votum der Ethikkommission der Me-dizinischen Fakultät unterstützt.

Tabelle 4.4 – Zusammensetzung der sieben Patienten mit einer Demenz anderer Geneseals Alzheimer.

Diagnostische Gruppe der nAD

Patientenzahl Erkrankung

1 Fronto-temporal-Demenz1 vaskuläre Demenz1 Demenz bei Morbus Parkinson2 Lewy-Körperchen-Demenz2 Demenz unklarer Genese

Σ 7 nAD-Patienten

5 Methoden

5.1 Patientenauswahlkriterien

Die Patienten wurden nach ICD-10-Standardkriterien [20], in zwei diagnostische Grup-pen (Alzheimer-Demenz und nicht-Alzheimer-Demenz) aufgeteilt und weiter nach Al-ter und Geschlecht unterteilt. Standard-Liquor-Parameter waren bestimmt und dieBeobachtung von großen Aβ-bindenden-Partikeln in Liquorproben aus diesem Pati-entenkollektiv waren bereits veröffentlicht worden [41].

Im Detail wurde die klinische Diagnose Alzheimer oder nicht-Alzheimer aufgrundmehrerer Kriterien gestellt. Dazu zählten neurochemische Liquoranalysen und neuro-psychologische Testungen, klinische Anamnesegespräche, funktionelle und strukturel-le Bildgebung (SPECT und MRT/CT) und genetische Risikoparameterbestimmung.Der behandelnde Arzt diagnostizierte aufgrund der Ergebnisse dieser Verfahren denklinischen Befund, nach dem die Patienten in die diagnostischen Gruppen AlzheimerDemenz (AD) und nicht-Alzheimer Demenz (nAD) eingeteilt wurden.

5.2 Gewinnung von humanem Blutplasma

Jedem Spender wurde 9ml Blut entnommen und direkt in ein EDTA-Röhrchen ge-geben. Der Komplexbildner Ethylendiamintetraessigsäure verhinderte dabei durchKalziumchelatierung die Blutgerinnung.

Die Röhrchen wurden 15min bei 1.636 rcf und Raumtemperatur zentrifugiert. An-schließend konnte der Überstand, das klar-gelbliche Plasma, entnommen und bei -20 ◦C gelagert werden.

5.3 Abreicherung von hochkonzentriertenPlasmaproteinen

Mögliche krankheitsrelevante Biomarker wurden vornehmlich in der Fraktion derniedrigkonzentrierten Plasmaproteine und -peptide vermutet. Diese Vorgabe machtedie Abreicherung der hochkonzentrierten Proteinen notwendig.

Zur Abtrennung der hochkonzentrierten Plasmaproteine wurde eine IgY-Affiniäts-chromatographie-Säule von Beckman Coulter auf einer Äkta-FPLC-Anlage verwen-det. Erstere hatte ein Volumen von 10ml und enthielt Antikörper gegen die 12 pro-minentesten Blutproteine.

22 5. Methoden

Tabelle 5.1 – Puffer des IgY 12 LC 10 Pakets. Zur Vermeidung von Kontaminationenwurde jedem Puffer zusätzlich 0,02% Natriumazid zugesetzt.

10 x Puffer Zusammensetzung

Verdünnungspuffer 100mM TrispH 7,4 mit HCl

1,5M NaCl

Elutionspuffer 1M GlycinpH 2,5 mit HCl

Neutralisierungspuffer 1M TrispH 8,0 mit HCl

Um die maximale Ladungsmenge zu erhöhen wurden zwei IgY-Säulen in Reihe ge-schaltet. Die humane Plasmaprobe wurde anders als vom Hersteller empfohlen, imVerhältnis 1:5 mit Verdünnungspuffer gemischt. Für jede Affinitätschromatographiewurden zunächst 200µl Patientenplasma mit 400µl Verdünnungspuffer versetzt undanschließend mit Hilfe eines Filters mit einer Porengrösse von 0,45µm 1min lang bei9.200 x g zentrifugiert. Um die optimale Beladungskonzentration herzustellen, wur-den nochmals 400µl Verdünnungsspuffer zugegeben und die Mischung anschließendauf die Säulen geladen. Die Durchflussfraktion der Affinitätschromatographie ent-hielt die niedrigkonzentrierten Plasmaproteine. Die Antigen-Antikörperbindungen der

Tabelle 5.2 – FPLC-Einstellungen während der Affinitätschromatographie.

Säule: IgY 12 LC 10Flussrate: Injektion: 0,5ml/min, Elution: 1ml/minProbenschleife: 1mlDetektion: UV-Detektion: λ1 =280 nm und λ2 =214 nmPuffersystem: A1: Verdünnungspuffer

B1: ElutionspufferA2: Neutralisierungspuffer

Gradient: Zeit [min] A1 [%] B1 [%] A2 [%]0 100 0 064 0 100 0127 0 0 100154 100 0 0

5.5. Bestimmung der Proteinkonzentration 23

hochkonzentrierten Plasmaproteine wurden mit Elutionspuffer gelöst und das Eluatverworfen. Anschließend wurden die Säulen mit Neutralisierungspuffer regeneriert.

Die eingestellten Geräteparameter der standardisierten Chromatographie sind inTabelle 5.2 aufgelistet. Zunächst wurde die FPLC-Anlage mit Verdünnungspuffergespült. Dabei wurde die Durchflussfraktion gewonnen. Nach 64 min schaltete dieAnlage auf Elutionspuffer um und die gebundene Fraktion wurde gesammelt. BeiMinute 127 wurden die Säulen mit Neutralisierungspuffer regeneriert. Den Abschlussbildete ein Waschvorgang mit Verdünnungspuffer.

5.4 Proteinkonzentrierung

Für die 2D-PAGE war eine Konzentrierung der Proteine als Probenvorbereitung nötig[55]. Die Proteinfällung mit Desoxycholsäure (DOC) und Trichloressigsäure (TCA)erwies sich als eine geeignete Methode für Plasmaproben.

Die Durchflussfraktionen nach Affinitätschromatographien von je sieben Patienten-proben und sieben Kontrollproben wurden innerhalb der diagnostischen Gruppen (7 xje 20ml = 140ml) vereinigt, je 400µl Na-Desoxycholat-Lösung (0,015%) hinzugefügt,gemischt und 15 min auf Eis inkubiert. Das Volumen wurde auf mehrere Zentrifugen-röhrchen aufgeteilt. Je 17,5ml Probe wurden dann mit 4,38ml 50%-iger Trichlores-sigsäurelösung (Endkonzentration = 10%) versetzt. Nach kurzem Vermischen erfolg-te eine einstündige Inkubation auf Eis. Anschließend wurden die Röhrchen in einerHochgeschwindigkeitszentrifuge 40min lang bei 4 ◦C und 40.000 x g zentrifugiert. DerÜberstand wurde verworfen. Das Präzipitat wurde in eiskalter Aceton-HCl-Lösung(Verhältnis 200:1) gewaschen und erneut für 40min bei 4 ◦C und 40.000 g zentrifu-giert und bei Raumtemperatur getrocknet.

Die Fraktionen aus der Anionenaustausch-Chromatographie (siehe Kapitel 5.7)wurden während der Eltablierungsphase ebenfalls nach der oben beschriebenen Me-thode gefällt.

5.5 Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Proteinkonzentration wurde mit einem modifizierten Amido-Schwarz-Färbever-fahren nach Henkel und Bieger [40] bestimmt. Dieser Test kann in Gegenwart vonDetergenzien wie z.B. CHAPS, das im Markierungspuffer enthaltenen ist, ablaufen.Daher war dieses Verfahren unter den gegebenen Versuchsbedingungen sehr gut ge-eignet.

Die gefällten Proteinniederschläge wurden zunächst mit Markierungspuffer (sieheTab. 5.5) auf die vom Hersteller empfohlene Proteinkonzentration von 4-10mg/mleingestellt. Für den Proteinbestimmungstest wurden die Proben 10-fach verdünnt.Eine Standardverdünnungsreihe im Markierungspuffer mit unterschiedlichen Albu-minkonzentrationen wurde zur Kalibrierung hergestellt, siehe Tabelle 5.3. Je 2µl derKalibrationslösungen und je 2µl der zu messenden Proben wurden auf eine Nitrozel-

24 5. Methoden

Tabelle 5.3 – Pipettierschema der Eichreihe des Amido-Schwarz-Tests. Die BSA-Konzentration der Stammlösung betrug 10mg/ml.

Eichreihe

Stammlösung Markierungs- Konzentrationin µl puffer in µl in µg/ml

1 99 1002 98 2004 96 4006 94 6008 92 80010 90 100020 80 2000

lulosemembran getropft und 10min trocknen gelassen. Die fixierten Proteine wurdenin 100ml Färbelösung (siehe Tabelle 5.4) für 10 min unter leichtem Schwenken inku-biert. Die Färbelösung wurde danach dekantiert, die Membran mit Reinstwasser kurzgespült und anschließend mehrfach für jeweils 3min in Reinstwasser gewaschen.

Tabelle 5.4 – Komponenten des Amido-Schwarz-Tests. Er basiert auf einer Bindungvon Amidoschwarz an Proteine und ist mit verschiedenen Detergenzien kompatibel.

Gebrauchslösungen des Amido-Schwarz-Tests

Färbelösung: 500 mg Amidoschwarz 0,1% w/v Amidoschwarz50ml Essigsäure 10% v/v Essigsäure225ml Methanol 45% v/v Methanol225ml Reinstwasser

500mlEntfärbelösung: 180ml Methanol 90% v/v Methanol

4ml Essigsäure 2% v/v Essigsäure16ml Reinstwasser

200ml

Um den Hintergrund vollständig zu entfärben, erfolgte eine weitere Inkubationin 100ml Entfärbelösung. Es folgte ein 5 minütiger Waschschritt mit Reinstwasser.Die Membran wurde im feuchten Zustand digitalisiert und die Proteinkonzentra-

5.6. Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen 25

tionen wurden mit dem Programm QuantityOne (BioRad) anhand der Albumin-Verdünnungsreihe berechnet.

5.6 Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen

Die Plasmaproben wurden nun mit CyDye-Fluoreszenzfarbstoffen nach den Angabendes Herstellers markiert.

Zunächst wurden dazu die gefällten Proteinniederschläge in Markierungspuffer ge-löst und die Proteinkonzentration auf 4mg/ml eingestellt. Die Konzentration wurdemit dem Amido-Schwarz-Test ermittelt (siehe Kapitel 5.5). Um optimale Markie-

Tabelle 5.5 – Komponenten des Markierungspuffers. Die 1M Trislösung wurde aus 6 gTris in 50ml Reinstwasser hergestellt.

Markierungspuffer

1,5 ml 1 M Tris 30 mM Tris7,6 g Thioharnstoff 2 M Thioharnstoff21 g Harnstoff 7 M Harnstoff20 ml Reinstwasser

mit 1 M HCl auf pH 8,62 g CHAPS

auf 50 ml mit Reinstwasser

rungsbedingungen zu schaffen, wurde der pH-Wert der Proteinlösung zwischen 8,6und 10 eingestellt. Die Stammlösung (25 nmol CyDye in 25µl DMF = 1mM) wurdeum das 1,5-fache mit N,N-Dimethylformamid (DMF) verdünnt. Diese „Arbeitslösung”wurde dann direkt der Proteinlösung zugegeben. Laut Herstellerempfehlung wurden50µg Protein mit 400 pmol CyDye markiert. Demnach wurde der Proteinmenge von836µg in einem Volumen von 209µl, 16,7µl Arbeitslösung zugegeben (siehe Pipettier-schema in Tabelle 5.6). Das Protein-CyDye-Gemisch wurde 30min auf Eis im Dun-keln inkubiert. Die Kopplungsreaktion wurde durch Zugabe von 10µl Lysinlösung(10mM) und nach einer Inkubationzeit von 10min auf Eis beendet. Diese Prozedurwurde mit allen CyDye-Farbstoffen und den korrespondierenden Proben wiederholt.

Dabei wurde das Plasma der Alzheimer-Patienten zunächst mit Cy3 und das dernicht-Alzheimer-Patienten mit Cy5 markiert. Nach drei Versuchsdurchläufen wurdendie Farben ausgetauscht. Dieser Austausch war wichtig, um gegebenenfalls vorhande-ne unterschiedliche Affinitäten der einzelnen Farbstoffe zum möglichen Zielprotein beider quantitativen Auswertung zu neutralisieren. Das Plasma der Alzheimer-Patientenerhielt also bei den folgenden Versuchswiederholungen den Cy5-Farbstoff und dasder nicht-Alzheimer-Patienten den Cy3-Farbstoff. Als interner Standard diente eine

26 5. Methoden

Tabelle 5.6 – Pipettierschema der CyDye-Markierungsreaktion.

Pipettierschema je Farbstoff

Markierungsansatz CyDye-Lösungen

Volumen Konzentration Menge mind. Stammlsg DMF Arbeits-Volumen 1 mM lösung

ml µg/ml µg µl davon in µl µl µl

0,209 4000 836 16,7 6,7 10 16,7

dritte Probenmischung, bestehend aus Aliquots aus allen verwendeten Proben, undwurde mit Cy2 markiert. Nach dem Stoppen der Markierungsreaktion mit 10mM Ly-sin, wurden die unterschiedlich markierten Proben gemischt und konnten gemeinsamweiteren Analysen unterzogen werden.

5.7 Anionenaustausch-Chromatographie

Es wurden die Äkta- und die Ettan-LC-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-anlagen verwendet. Für sämtliche Anionenaustausch-Chromatographien in der vor-liegenden Arbeit wurde ausschließlich eine MonoQ 4.6/100 PE-Säule eingesetzt. Nach

Tabelle 5.7 – Optimiertes Puffersystem der Anionenaustausch-Chromatographie.

Puffersystem der MonoQ

Puffer A Puffer B

50 mM Tris 50 mM Tris4 M Harnstoff 4 M HarnstoffpH 8,6 mit HCl pH 8,6 mit HCl

1 M NaCl

500 ml 500 ml

einer längeren Etablierungsphase (siehe Ergebnisteil, Tab. 6.2) wurde das Puffersy-stem bestehend aus 50mM Tris und 4M Harnstoff bei einem pH-Wert von 8 (PufferA) und einem Puffer B mit zusätzlich 1M NaCl festgelegt und für sämtliche Ver-suche mit humanem Plasma verwendet (siehe Tabelle 5.7). Die injizierten Probenenthielten zusätzlich weitere 8M Harnstoff. Eine drei-Stufen-Elution erwies sich als

5.8. Umkehrphasenchromatographie 27

optimal, die aus einem 180mM, 260mM und einem 1M NaCl-Schritt bestand. Dieerste und zweite Stufe wurde manuell und empirisch ermittelt (siehe Tab. 5.8). Nachjeder Separation in drei Fraktionen erfolgte eine Konzentrationsbestimmung (sieheKapitel 5.5). Die Elutionsstufen wurden so festgelegt, dass drei Fraktionen von derSäule eluiert wurden, die annähernd eine gleich große Proteinmenge enthielten.

Tabelle 5.8 – Experimentelle Details zur Anionenaustausch-Chromatographie.

Säule: MonoQ 4.6/100 PEFlussrate: 0,6ml/minProbenschleife: 1mlDetektion: λ1 =633 nm, λ2 =532 nm und λ2 =488 nmPuffersystem: A: MonoQ-Puffer-A

B: MonoQ-Puffer-BStufen: Zeit [min] A [%] B [%]

0 100 014 82 1828 74 2641 0 10066 100 0

5.8 Umkehrphasenchromatographie

Es wurden die Äkta- und die Ettan-LC-Anlagen verwendet. Zunächst wurden un-terschiedliche RPC-(reversed phase chromatography)-Säulen getestet: eine Vorsäule,sowie die beiden Hauptsäulen BioBasic-4 100 x 2,1mm und Chromolith Performance,eine 4,6mm monolithische Säule. Die Trennkapazitäten der Umkehrphasenchromato-graphiesäulen wichen sehr stark voneinander ab. Diese Tatsache machte umfangreicheVorversuche notwendig (siehe Ergebnisteil, Kapitel 6.2.3). Hierfür wurden kontinu-ierliche Gradienten verwendet. Die resultierenden Fraktionen wurden für 1-2 Stundenlyophilisiert. Anschließend wurden diese durch eindimensionale Polyacrylamidgelelek-trophoresen mit anschließender Silberfärbung analysiert und die Auftrennung vergli-chen.

Aufgrund der Befunde aus den Vorversuchen wurden für die Auftrennungen derüber Anionenaustausch-Chromatographie vorfraktionierten und markierten Plasma-proben schließlich Stufenelutionen für die RPC gewählt, bei dem die Konzentrationdes organischen Lösungsmittels Acetonitril schrittweise erhöht wurde. Die Umkehr-phasenchromatographien wurden mit den in Tabelle 5.9 dargestellten Parameterndurchgeführt. Die Stufen wurden für jede injizierte Anionenaustausch-Fraktion un-

28 5. Methoden

Tabelle 5.9 – HPLC-Einstellungen der 3-Stufen-Elution während der Umkehrphasen-chromatographie.

Säule: ChromolithPerformance RP-8e 100-4.6mmFlussrate: Waschen: 2 ml/min, Injektion: 1ml/minProbenschleife: Superloop max. 50ml, Fraktionsgröße: 8mlDetektion: UV-Detektion: λ1 =532 nm, λ2 =633 nm und λ2 =488 nmLösungsmittel: A: RPC-Lösung-A

B: RPC-Lösung-BStufen: Anionenaustausch- Anionenaustausch-

Fraktion A2 Fraktion A3 und A4Zeit [min] A [%] B [%] Zeit [min] A [%] B [%]

0 100 0 0 100 019 57 43 19 54 4631 54 46 31 51 4943 0 100 43 0 10055 100 0 55 100 0

abhängig bestimmt. Somit gab es schließlich für jede Fraktion der Anionenaustausch-chromatographie-3-Stufen-Elution eine wiederum individuell angepasste RPC-Elution.

Tabelle 5.10 – Laufmittel der Umkehrphasenchromatographie. Dieses war für sämtlicheRPC-Säulen geeignet.

Mobile Phase der RPC

Lösung A Lösung B

0,065% TFA 0,05% TFA und 84% ACN

650 µm TFA 840 ml Acetonitril999,4 ml Reinstwasser 500 µm TFA

159,5 ml Reinstwasser

Σ 1L Σ 1L

Die RPC-Säule benötigte einen pH-Bereich von 2 bis 7,5. Daher wurde vor der La-dung auf die RPC-Säule, die Fraktion der Anionenaustausch-Chromatographie mit1M Salzsäure entsprechend eingestellt. Fraktionen mit einem Volumen von 8ml wur-den mit einem hydraulischen Injektionssystem (superloop) auf die Säule injiziert.Die Durchflussfraktion, die nur eine geringe Proteinmenge enthielt, wurde verworfen.

5.9. Proteintrennung mittels 1D-Gelelektrophorese 29

Nach der RPC wurden die resultierenden Fraktionen von je 12ml für 48 bis 60 Stundenlyophilisiert. Dafür wurden die Fraktionen zunächst bei -80 ◦C tiefgefroren. Vor je-der neuen Beladung wurde die Säule einer speziellen Waschprozedur unterzogen: Mitjeweils 100% der folgenden Lösungsmittel Puffer B, Acetonitril, Isopropanol, Ace-tonitril, Puffer B, wurde bei einer Flussrate von 1,5ml/min 5min lang gespült, umProtein- und Fluoreszenzrückstände vollständig zu entfernen.

5.9 Proteintrennung mittels 1D-Gelelektrophorese

5.9.1 Probenvorbereitung

Die gefällten Fraktionen aus der Anionenaustausch-Chromatographie wurden folgen-dermaßen für die 1D-Gelelektrophorese vorbereitet: Die Pellets wurden in je 50µlProbenpuffer aufgenommen und 5min bei 98 ◦C erhitzt. Der Probenpuffer bestandaus 63mM Tris/HCl pH-Wert 6,8, 2% SDS, 10% (v/v) Glycerol, 100mM DTT und0,05% Bromphenolblau (Pipettierschema siehe Tabelle 5.11). Nach dem Abkühlenwurde 10µl Jodoacetamid (JAA, 230mg/ml) zugegeben.

Tabelle 5.11 – Komponenten des Gelelektrophorese-Probenpuffers.

2-fach Probenpuffer

Sammelgelpuffer 2,5 ml87% Glycerol 2,3 ml

SDS 0,4 gDTT 0,3 g

1% Bromphenolblau 100 µl

mit Reinstwasser auf 10ml auffüllen

Die Proben der RPC-Vorversuche wurden analog behandelt: Die lyophilisiertenProben wurden mit 50µl bzw. 25µl Probenpuffer versetzt, 5min bei 98 ◦C gekochtund nach dem Abkühlen 20min mit 10µl bzw. 5µl Jodoacetamid inkubiert, bevor5µl davon auf das Gel aufgetragen wurde.

5.9.2 Durchführung der Gelelektrophorese

12%ige-Polyacrylamidgele wurden nach der Methode von Laemmli [60] hergestellt.Die verwendeten Glasplatten hatten die Maße 8,5 x 6 cm bei einer Geldicke von0,75mm. Die Zusammensetzung des verwendeten Trenngels ist in Tabelle 5.12 angege-ben. Der 4-fach konzentrierte Trenngelpuffer bestand aus 1,5M Tris/HCl, pH 8,8. Am-moniumperoxodisulfat (APS) und N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamin (TEMED)

30 5. Methoden

wurden erst unmittelbar vor dem Gießen des Gels hinzugegeben. Diese Komponentensorgten für die Quervernetzung der einzelnen Acrylamid- und Bisacrylamidmolekü-le. Zuerst wurde ein Trenngel bis ca. 2 cm unter den Rand gegossen und mit einer20% Isopropanollösung aufgefüllt. Diese luftdichte Abtrennung schafft zusätzlich ei-ne glatte Oberfläche für das anschließende Kammgel. Nach der Polymerisierung desTrenngels wurde die Isopropanollösung abgegossen. Ein 12-zähniger Kamm wurde

Tabelle 5.12 – Komponenten des Trenngels für zwei 0,75mm Minigele (ca. 8,5 x 6 cm)mit einem Gesamtvolumen von 10ml.

Trenngel 12% T

4-fach Trenngelpuffer 2,5mlAcrylamid 30%T/2,6%C 4ml10% SDS 0,1mlReinstwasser 3,35ml

10% APS 100µlTEMED 10µl

Σ Volumen 10ml

zwischen die Glasplatten gesteckt und mit der Sammelgelmischung (s. Tab. 5.13)aufgefüllt. Die polymerisierten Gele wurden in Elektrophoresekammern gestellt undmit Laufpuffer geflutet, die Kämme vorsichtig entfernt und die vorbereiteten Probenin die entstandenen Taschen appliziert.

Tabelle 5.13 – Komponenten des Gelelektrophorese-Sammelgels mit 5ml Gesamtvo-lumen. Der 4-fache Sammelgelpuffer bestand aus 0,5M Tris/HCl, pH6,8.

Sammelgel 4% T

4-fach Sammelgelpuffer 1,25 mlAcrylamid 30%T/2,6%C 667 µl10% SDS 50 µlReinstwasser 2,973 ml

10% APS 400 µlTEMED 10 µl

Σ Volumen 5 ml

5.10. Färbungen der 1D-Polyacrylamidgele 31

Die Elektrophoresedauer betrug bei konstant angelegter Spannung von 200V ca.55min in Laufpuffer (0,025M Tris, 0,192M Glycin, 0,1% SDS, pH-Wert ca. 8,3). Umdiesen Puffer anzusetzen, wurden 3 g Tris, 14,4 g Gylcin, 1 g SDS benötigt und in 1LReinstwasser gelöst.

5.10 Färbungen der 1D-Polyacrylamidgele

5.10.1 Coomassie-Färbung

Die Colloidale-Coomassie-Färbung wurde nach dem Protokoll von Neuhoff et al. [82]durchgeführt. Eine 5% w/v CBB G-250-Stammlösung wurde aus 5 g CBB G-250 und100ml Reinstwasser hergestellt. In einem nächsten Schritt wurde die Stammlösungder Färbelösung hergestellt. Die Coomassie Fixier- und Färbelösung wurde erst kurz

Tabelle 5.14 – Die Stammlösung der Färbelösung ist bei Raumtemperatur etwa dreiMonate haltbar.

Stammlösung der Färbelösung10% w/v (NH4)2SO4, 0,1% CBB G-250

20 g 85% H3PO4 abwiegenmit 800 ml Reinstwasser verrühren

100 g Ammoniumsulfat in Lösung bringen20 ml 5% CBB G-250

auf 1000 ml mit Reinstwasser auffüllen,lösen und zwei Stunden rühren lassen

vor Gebrauch hergestellt und enthielt 20ml Methanol, zu dem 80ml Stammlösung(s. Tab. 5.14) gemischt und auf 100ml mit Reinstwasser aufgefüllt wurde. Für einGel mit dem Format 8,5 x 6 cm wurden 100ml Coomassie Fixier- und Färbelösung ineine Glas-Petrischale mit dem Durchmesser von 150mm x 25mm Höhe gegeben, mitParafilm abgedichtet und über Nacht oder mindestens vier Stunden bei Raumtem-peratur leicht schütteln gelassen. 100ml Waschlösung (20% v/v Methanol) wurdenin eine neue Petrischale gefüllt und das Gel umgesetzt. Mit der Waschlösung solltenlediglich überschüssige Farbpartikel entfernt werden.

5.10.2 Silberfärbung

Die Silberfärbung wurde nach einem modifizierten Protokoll von Heukeshoven et al.durchgeführt (siehe Tabelle 5.15) [42]. Die angegebenen Puffer wurden stets frischangesetzt. Wichtig war, das Reinstwasser vor dem Waschvorgang auf 4◦C zu kühlen.

32 5. Methoden

Tabelle 5.15 – Silberfärbung nach Heukeshoven modifiziert. Dieses Protokoll wurdeauf 8,5 x 6 cm Gele angepasst. Für ein Gel des Maßstabs 25,5 x 20,5 cm wurde das10-fache Volumen der Puffer eingesetzt.

Schritt Zutat Zeit

1. Fixierung 30 ml Ethanol über Nacht bei 4 ◦C10 ml Essigsäure oder 60 min bei RT60 ml auf 100 ml mit Reinstwasser

2. Fixierung 0,32 g Na2S2O3 60 min bei RT4,10 g Na-Acetat30 ml Ethanol (vergällt, 100%)2 ml 25 % Glutardialdehyd68 ml auf 100 ml mit Reinstwasser

3. Waschen 100 ml Reinstwasser 4 ◦C 3 x 15 min bei RT

4. Färbung 0,1 g Silbernitrat 60 min bei RT54 µl 37 % Formaldehyd100 ml mit Reinstwasser

5. Entwicklung 2,5 g Na-Carbonat je nach Färbewunsch54 µl 37 % Formaldehyd100 ml mit Reinstwasser

6. Stoppen 3,75 g Glycin mind. 30 min bei RT1 L mit Reinstwasser

5.11 Proteintrennung mittels 2D-Gelelektrophorese

5.11.1 Probenpräparation und isoelektrische Fokussierung(IEF)

Die gefriergetrockneten Plasmaproben wurden in je 500µl Rehydrierungspuffer auf-genommen (siehe Tabelle 5.16), unter starker Verwirbelung solubilisert und jeweils ineinen 24 cm langen IEF-Trog pipettiert.Ein ebenfalls 24 cm langer immobilisierter Trockengelstreifen mit einer Trennkapa-

zität im pH-Bereich von 3-10 wurde mit der Gelseite nach unten luftblasenfrei in denTrog direkt auf die Proteinlösung gelegt. Abschließend wurde der IEF-Streifenhaltermit einem speziellen Öl (Coverfluid) überschichtet, um die Probe während der Fo-kussierung vor dem Austrocknen zu bewahren.Als Nächstes fand eine 14-stündige Rehydrierung statt, während dieser Phase quoll

der Trockengelstreifen. Das Fokussierungsgerät (IPGphor) baute anschließend eine

5.11. Proteintrennung mittels 2D-Gelelektrophorese 33

Tabelle 5.16 – Zusammensetzung des Rehydrierungspuffers für die Aufbereitung dergefriergetrockneten Proben.

Stammlösung und Gebrauchslösung

Stammlösung: 10,5 g Harnstoff 7 M Harnstoff3,8 g Thioharnstoff 2 M Thioharnstoff12,5 ml Reinstwasser1,0 g CHAPS 4 % (w/v) CHAPS

ad 25 ml ReinstwasserGebrauchlösung: 2,5 ml Stammlösung

50 µl Pharmalyte 2 % (v/v) Pharmalyte50 mg DTT 2 % (w/v) DTT

Spannung von 150V für 6 Stunden auf und erhöhte sie dann auf 300V für 3 Stunden.Dem folgte ein kontinuierlicher Gradient, der während 6 Stunden auf 1000V stieg.Ein letzter Gradient stieg innerhalb einer Stunde auf 8000V. Diese Spannung wurdemindestens bis 45.000VhS gehalten, erst dann wurde die Fokussierung nach insgesamtca. 36 Stunden gestoppt. Der Stromfluss lag zwischen 18 und 30µA.

Tabelle 5.17 – Parameter der isoelektrischen Fokussierung. Die Temperatur lag kon-stant bei 20 ◦C.

Isoelektrische Fokussierung75 µA/Streifen

Rehydrierung 14:00 Stunden

S1 Stufe-und-Halten 150 V 6:00 StundenS2 Stufe-und-Halten 300 V 3:00 StundenS3 Gradient 1000 V 6:00 StundenS4 Gradient 8000 V 1:00 StundeS5 Stufe-und-Halten 8000 V 6:00 Stunden

Σ Zeit ca. 36:00 Stunden

34 5. Methoden

5.11.2 Zweite Dimension: Gelelektrophorese

Herstellung des Trenngels

Die zweite Dimension der 2D-Gelelektrophorese wurde nach dem Protokoll von Wilt-fang et al. [121] durchgeführt mit einem Stufengradient von 8% T in der oberenund 14% T in der unteren Hälfte. Der Vorteil dieses Gelsystems besteht im Gegen-satz zum konventionellen 12%-Laemmli-Gel [60] in der breiteren Trennkapazität imBereich zwischen 2.000-50.000Da.

Tabelle 5.18 – Schema zum Ansetzten der Acrylamidstammlösungen.

Acrylamid-Stammlösung60% T, 3% C

Acrylamid 99,9% 58,2 gBIS-Acrylamid 1,8 gReinstwasser 40,0 ml

nach dem Auflösen bzw. Volumenver-größerung auffüllen mit Reinstwasser auf 100 ml

Tabelle 5.19 – Die Zusammensetzung der Bicin/Tris-Gradientengele, die mit demEttan-DALT-zwölf-System hergestellt wurden.

Gradientengele Bicin/Tris5% C und 0,1% SDS

8% T 14% T

Trenngelpuffer 112,5 ml 137,5 ml60% T/5% C 59,85 ml 128,15 ml10% SDS 4,5 ml 5,5 ml87% Glycerol / 55 mlReinstwasser 269,10 ml 223,85 ml

10% APS 2,70 ml 3,30 mlTEMED 0,34 ml 0,41 ml

Volumen 445,95 ml 550 ml

Die Gele wurden in einem speziellen Plexiglastank (Ettan DALT zwölf System) ge-gossen. Der Vorteil bestand darin, dass bis zu vierzehn Gele parallel hergestellt werden

5.11. Proteintrennung mittels 2D-Gelelektrophorese 35

konnten. Zudem wurden fluoreszenzarme Glasplatten verwendet, um unerwünschteFluoreszenzen während des abschließenden Scanvorgangs zu vermeiden. Das Formatder Glasplatten betrug 25,5 x 20,5 cm mit einem fixierten Abstandshalter von 1 mm.

Der Trenngelpuffer (1,6M Tris, 0,4M Schwefelsäure, pH 8,1) wurde für beide Kom-partimente des Stufengels verwendet und aus 48,45 g Tris und 200ml 0,5M Schwefel-säure hergestellt. Die Lösung wurde mit Reinstwasser auf 250 ml aufgefüllt. Zunächstwurde die in Tabelle 5.19 angegebene 14% T-Acrylamid-Gellösung in die untere Hälf-te des Tanks, die 8% T-Gelmischung direkt darüber bis 1 cm unter den Rand gegos-sen und sogleich mit einer 20%-igen Isopropanollösung überschichtet, um eine glatteOberfläche für die zweite Dimension zu erreichen. Wegen des Glycerols in der 14%T-Gelmischung sank dies in die untere Hälfte, eine Vermischung beider Gellösungenwurde dadurch verhindert. Zunächst wurde die Polymerisation des Gels für 2-3 Stun-den bei Raumtemperatur abgewartet. Dann wurden die Gele bei 4 ◦C über Nachtgelagert. In Tabelle 5.20 wurden alle benötigten Puffer aufgelistet.

Tabelle 5.20 – Die Zusammensetzung der verwendeten 2D-Acrylamid- und Laufpuffer.

Pufferlösungen und Laufpuffer der 2D-SDS-PAGE

Trenngelpuffer pH 8,1: Tris-Base 58,15 g 1,6 M Tris0,5 M H2SO4 240,00 ml 0,4 M H2SO4

mit Reinstwasser auf 300 ml

Sammelgelpuffer pH 6,7: Bistris 8,37 g 0,8 M Bistris0,5 M H2SO4 20,00 ml 0,2 M H2SO4

mit Reinstwasser auf 50 ml

Anodenpuffer pH 8,1: Tris 121,15 g 200 mM Tris0,5 M H2SO4 500,00 ml 50 mM H2SO4

mit Reinstwasser auf 5 L

Kathodenpuffer pH 8.2: Bicine 163,15 g 200 mM Bicine1 M NaOH 500,00 ml 100 mM NaOH10 % SDS 100,00 ml 0,1 % SDS

mit Reinstwasser auf 5 L

Probenvorbereitung

Nach der Fokussierung wurden die Gelstreifen in je 20ml Equilibrierungspuffer (s.Tab. 5.21) mit 1 g DTT pro 100ml für 15min auf einem Schüttler vorsichtig ge-schwenkt. Weitere 15min Equilibrierung erfolgten in einem Equilibrierungspuffer mit

36 5. Methoden

Zusatz von Jodoacetamid (9,6 g/200ml). Verunreinigungen wurden durch kurzes Ab-waschen in Kathodenpuffer entfernt. Anschließend wurden die Streifen in Kamm-gelpuffer abgespült, auf das Trenngel aufgebracht und mit einem Bromphenolblaugefärbten Agarosegel (siehe Tab. 5.22) fixiert. Nach ca. 20min war das Agarosegelabgekühlt und die Elektrophorese wurde gestartet.

Tabelle 5.21 – Zusammensetzung des Equilibrierungspuffers nach der isoelektrischenFokussierung.

Equilibrierungspuffer

144 g Harnstoff 6M Harnstoff200 ml Kammgelpuffer8 g SDS 2% w/v SDS80 g Glycerol 2% w/v Glycerol

400 ml mit Reinstwasser auffüllen

Tabelle 5.22 – Agarose zur Fixierung des IPG-Streifens auf dem SDS-Gel.

Agarosegel zur Fixierung

0,50 g Agarose 1% w/v Harnstoff25,00 ml Kammgelpuffer

Mischung erwärmen, bis Agarose gelöst ist.

1,25 ml 10% SDS 0,25% SDS1,00 ml Bromphenolblau 0,1% Bromphenolblau50,00 ml mit Reinstwasser auffüllen

Erwärmen und sofort verwenden.

Elektrophorese

Der untere Tank der Elektrophoreseinheit wurde mit ca. 9 L Anodenpuffer gefüllt. Dievorbereiteten Gele wurden in die entsprechenden Halterungen zwischen Gummidich-tungen platziert. Maximal 12 Gele hatten dort Platz. Bei einer geringeren Anzahlvon Gelen, wurden statt dessen Plexiglasplatten eingesetzt. Nach der Abdichtungwurden ca. 2,5 L Kathodenpuffer in den oberen Tank gegossen. Die Elektrophorese

5.12. Scan und Bildauswertung 37

dauerte 17,5 Stunden, wobei zunächst für 3 Stunden 1W pro Gel eingestellt wurde,bis die Probe und die blaugefärbte Lauffront den IEF-Streifen verlassen hatten. Dieübrige Zeit lief die Gelelektrophorese bei 3W pro Gel. Während dieser Zeit wurdedie Temperatur auf max. 25 ◦C terminiert.

5.12 Scan und Bildauswertung

Das Digitalisieren der Polyacrylamidgele für die Bildauswertung erfolgte mit einem3-Laser-Scanner (Typhoon). Jedes Gel wurde 3 mal bei Wellenlängen von 488 nm(=Cy2), 532 nm (=Cy3) und 633 nm (=Cy5) aufgenommen.

Da die verschiedenen Cy-Farbstoffe leicht unterschiedliche Fluoreszenz-Quanten-Effizienz haben, wurde der dynamische Helligkeitsbereich jeweils individuell ange-passt. Die Spannung des Photomultipliers lag zwischen 450 und 550V.

Um reproduzierbare, digitale Bilder der Gele zu erhalten, die eine quantitative Aus-wertung mit dem verwendeten Bildauswertungsprogramm (ImageQuant 5.2) ermögli-chen, wurden identische Scan-Parameter gewählt: Neben der bereits oben genanntenEinstellung des Photomultipliers erfolgte der Scanvorgang standardisiert mit einerAuflösung von 200µm in einer Tiefe von 3mm. Die Gele waren zwischen fluores-zenzarmen Glasplatten druckfixiert. Die Bilder wurden in einem mit dem DeCyder-Programm kompatiblem *Gel-Format, ähnlich dem *Tif-Format, gespeichert.

Die Bildauswertung der digitalisierten 2D-Gelbilder erfolgte mit Hilfe des DIGE-Analyseprogramm-Pakets DeCyder 2D 6.5 nach Angaben des Herstellers. Sämtliche,

Proteinfiltereinstellungen:

Steigung < 2

Fläche > 20 rE

Volumen > 2.500 rE

Höhe 50 - 100.000 rE

A B

Abbildung 5.1 – Einstellungen des Proteinfilters des DeCyder-Auswertungs-programms. Nach den in (A) aufgelisteten Kriterien wurden die Proteine ausgewählt,um eine Vorauswahl und Abgrenzung zu Staubpartikeln sowie Artefakten zu schaffen. In(B) ist ein typisches 3D-Profil eines Proteins zu sehen. Die Fläche wurde eingezeichnet.Die Werte wurden in relativen Einheiten (rE) angegeben.

hierfür notwendigen Arbeitsschritte (Protein-Detektion, -Quantifizierung, -Zuordnung,und Normalisierung) wurden mit diesem Programm in teilweise automatisierten Pro-

38 5. Methoden

zessen durchgeführt. Weitere spezifische Filtereinstellungen veranschaulicht Abbil-dung 5.1.Dabei wurden nur Differenzen zwischen Proteinen aus den beiden diagnostischen

Gruppen berücksichtigt, die mindestens um den Faktor 2,0 variierten. Weitere stati-stische Signifikanzanalysen wurden mit dem integrierten, zweiseitigen t-Test durch-geführt, wobei ein 5% Konfidenz-Intervall als Signifikanzniveau definiert wurde.

5.13 Visualisierung der Proteine auf den2D-Polyacrylamidgelen

Die mit dem oben beschriebenen Computerprogramm DeCyder detektierten Proteinesollten aus dem Gel ausgestochen werden. Hierfür war es notwendig, die gewünsch-ten Proteine sichtbar zu machen. Dies erfolgte nach einer weiteren Modifikation desProtokolls von Heukeshoven (siehe Kapitel 5.10.2)[42]. Hier wurde eine massenspek-trometriekompatible Silberfärbung angewendet:

Tabelle 5.23 – Modifiziertes Protokoll der Massenspektrometrie-kompatiblen Silber-färbung nach Heukeshoven.

Lösung Zusammensetzung Konz. Zeit

Fixierlösung 500ml Ethanol 50% über Nacht100ml Essigsäure 10%auf 1 L mit Reinstwasser

Inkubationslösung 68,4 g Na-Acetat (+ 3H2O) 0,5M 2Stunden2 g Na-Thiosulfat 0,2%300ml Ethanol 30%auf 1 L mit Reinstwasser

Wässerung 3 x 1L Reinstwasser 4 ◦C 3 x 20min

Silberlösung 1 g Silbernitrat 0,1% 30min288µl Formaldehyd 0,029%auf 1 L mit Reinstwasser

Spülung 25 gNa-Carbonat 2,5% 1minauf 1 L mit Reinstwasser

Entwicklungslösung 25 g Na-Carbonat 2,5% 5-10min288µl Formaldehyd 0,029%

Stopplösung 18,6 g EDTA 0,05M mind. 20minauf 1 L mit Reinstwasser

5.14. Massenspektrometrische Analyse (MS) 39

Direkt nach dem Scan-Vorgang wurden je 2 Gele in einer Wanne in einem Vo-lumen von 1L über Nacht bei 4 ◦C fixiert (s. Tab. 5.23). Am nächsten Tag folgteeine Inkubation der Gele im gleichen Volumen der zugehörigen Lösung für 2 Stunden.Im Anschluss wurden die Gele drei Mal für 20min in 4 ◦C kaltem Reinstwasser ge-waschen und 30min lang in einer Silberlösung gefärbt. Im nächsten Schritt wurdendie Gele kurz mit Reinstwasser und Entwicklungslösung abgespült um die Gele vonüberschüssigen Silberpartikeln zu reinigen. Danach wurden die proteingebundenenSilberionen mit einer Entwicklungslösung reduziert. Die Reaktion wurde durch Zu-gabe einer EDTA-Lösung abgestoppt.

5.14 Massenspektrometrische Analyse (MS)

5.14.1 Probenvorbereitung für die MS

Aus den silbergefärbten 2D-Gelen wurden die Proteinspots mit einer 1ml-Pipetten-spitze ausgestochen. Die Öffnung der Spitze wurde zuvor abgeschnitten um eine Kreis-fläche von ca. 2mm Durchmesser zu erhalten. Als Orientierungshilfe dienten maß-stabsgetreue Computer-Ausdrucke der Proteinlandkarten des DeCyder-Programms,auf welchen die Lage der detektierten Proteinen optimal nachvollzogen werden konn-te.

Anschließend wurden die Proteinspots einzeln in Verdauröhrchen verstaut. Die wei-tere Probenvorbereitung übernahm der Kooperationspartner Dr. Thorsten Müller desMedizinischen Proteom Centers der Universität Bochum: Die silbergefärbten Protein-spots wurden zunächst entfärbt. Dafür wurde aus einer 30mM Na2S2O3-Lösung undeiner 100mM K3Fe(CN)6-Lösung eine Arbeitslösung im Verhältnis 1:1 hergestellt.15µl dieser Lösung wurden auf ein Gelstück gegeben und bis zur Entfärbung ab-gegewartet. Im Anschluss wurde es nach dem folgenden Protokoll gewaschen (sieheArbeitsschema in Tabelle 5.24): Jedes Gelstück wurde in ein Verdaugefäß transfe-riert. Dort wurde es 3 mal für je 10min bei Raumtemperatur ohne zu schütteln mitabwechselnd 20µl Verdaupuffer A und B gewaschen. Danach erfolgte ein kurzer Zen-trifugationsschritt. Dann wurde der Überstand entnommen und wieder neuer Pufferzugegeben. Die Waschprozedur endete mit Verdaupuffer B. In der Gefriertrocknungs-anlage wurde das Gelstück bis zu einem bestimmten Trocknungszustand geschrumpftund erschien weiß. Im Anschluss wurde in Verdaupuffer A 2µl Trypsin (Endkonzen-tration 0,03µg/µl) zugegeben. Das gleiche Volumen von Puffer A wurde zugegeben,das Gelstück 15min lang quellen gelassen und gelegentlich eine entsprechende Mengedes Verdaupuffers A zugegeben, bis das Gelstück wieder klar wurde. Die tryptischeProteinspaltung erfolgte schließlich mit einer Inkubation über Nacht im Brutschrankbei 37 ◦C.

40 5. Methoden

Tabelle 5.24 – Protokoll des Proteaseverdaus von Proteinen aus Gelstücken.

Schritt Zusammensetzung

1 Transfer des ausgestochene Gelstücks in ein Verdaugefäß.2 Zugabe von jeweils 20 µl Lösungen bei Raumtemperatur.3 Waschen des Gelstücks mit Verdaupuffer A und B.4 Zentrifugation und Entnahme des Überstands.

Letzter Waschschritt erfolgte immer in Verdaupuffer B.5 Trocknung des Gelstücks in der Gefriertrocknungsanlage.6 Zugabe von 2 µl Protease zu dem Verdaupuffer A

(Endkonzentration 0,03 µg/µl).7 Quellen für 15 min. Zugabe einer entsprechenden Menge

Verdaupuffer A, bis das Gelstück klar wurde.8 Inkubation bei 37 ◦C über Nacht oder mind. 15 Stunden lang.

VP A 10 mM Ammoniumhydrogencarbonat (0,08 g/100 ml)

VP B Verdaupuffer A und Acetonitril im Verhältnis von 1:1

5.14.2 Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie (ESI-MS)

Die Durchführung der massenspektrometrischen Analysen wurden freundlicherweisevon Herrn Dr. Thorsten Müller vom Medizinischen Proteom Center der Universi-tät Bochum übernommen. Die ESI-massenspektrometrischen Untersuchungen wur-den mit einem HCTultra-EDT II Massenspektrometer im CID Modus durchgeführt.Das Gerät enthielt eine nicht-lineare Quadrupol Ionenfalle ID (collision-induced dis-sociation). Das Massenspektrometer war zudem mittels online-Kopplung mit einernanoHPLC verbunden. Zum Einsatz kam die HCTultra zur Identifizierung von Pep-tiden und Proteinen aus Blutplasma.

5.15 Auswertung der Peptidmassen

Die Auswertung der aufgenommenen ESI-MS-Spektren erfolgte mit einem speziellenComputerprogramm. Auch diese Auswertung wurde freundlicherweise von Dr. Mül-ler in Bochum durchgeführt. Die gemessenen Peptidmassen wurden mit den theo-retischen Peptidmassen eines Verdaus der Proteine aus der Datenbank verglichen.Das Ergebnis der Datenbanksuche mit der Suchmaschine Mascot war eine Liste vonProteinen, deren theoretische Peptidmassen nach Trypsinspaltung mit ausreichenderGenauigkeit mit den gemessenen Daten übereinstimmten (siehe Ergebnisteil, Kapitel6.5). Die Auswertung erfolgte wie in der Publikation von Dr. Müller et al. 2008 [76]beschrieben, mit dem Unterschied, dass hier die Proteine zuvor mit einer ESI-MS

5.15. Auswertung der Peptidmassen 41

untersucht wurden. Darüber hinaus wurden zur Verifikation der über MS-Analysenidentifizierten Proteine aus der 2D-PAGE abgeschätzten gefundenen pI-Werte undMolekulargewichte mit den berechneten Werten verglichen.

6 Ergebnisse

Im Rahmen der hier vorgelegten Arbeit wurde ein mehrstufiges Trennverfahren ent-wickelt, bei dem mehrere flüssigkeitschromatographische Verfahren, Affinitäts-, An-ionenaustauscher- und Umkehrphasenchromatographie, mit der 2D-DIGE-Technologieund schließlich mit ESI-Massenspektrometrie kombiniert wurden.

Mit Hilfe dieses Verfahrens sollten erste Untersuchungen an vereinigten humanenBlutproben durchgeführt werden, mit dem langfristigen Ziel, neue potentielle Bio-marker für die Alzheimer-Krankheit zu finden.

Der Konzentrationsbereich aller hoch- und niedrigkonzentrierten Proteine im Blut-plasma umfasst ca. fünf Größenordungen. Die zwölf prominentesten Proteine, dieetwas mehr als 75% der Gesamtproteinmenge ausmachen, wurden entfernt um dierelative Konzentration der kleineren Proteine proportional zu erhöhen, die möglicher-weise Biomarker der Alzheimer’schen Erkrankung enthalten können. Daher wurde imFolgenden das oben bereits angesprochene multidimensionale Auftrennverfahren biszur ausgereiften Analysemethode entwickelt.

6.1 Statistische Auswertung der diagnostischenLiquoranalyse

Die in dieser Arbeit untersuchten vierzehn Blutplasmaproben stammten aus einemPatientenkollektiv der Psychiatrischen und Psychotherapeutischen UniversitätsklinikErlangen. Klinische Befunde sowie einzelne Ergebnisse der Liquoruntersuchungen zudiesen Patienten wurde bereits von Henkel et al. 2007 [41] veröffentlicht. Tabelle 6.1beschränkt sich auf die Zusammenfassung der vierzehn verwendeten Proben und stelltdie ermittelten Parameter der Alzheimer-Patientengruppe der nicht-Alzheimergruppegegenüber.

Für jede der beiden diagnostischen Gruppen, Alzheimer (AD) und nicht-AlzheimerDemenz (nAD), wurden jeweils in der Studie von Henkel et al. die Liquorkonzentra-tionen von Aβ1-40, Aβ1-42 und phospho-Tau bestimmt und sind als Mittelwerte mitStandardabweichung in Tabelle 6.1 aufgelistet. Weiterhin sind das mittlere Alter derPatienten, sowie der Quotient Aβ1-42/1-40 angegeben. Um zu testen, ob Unterschie-de zwischen den beiden diagnostischen Gruppen statistisch signifikant waren, wurdenT-Tests durchgeführt. Die p-Werte dieser T-Tests sind ebenfalls in der Tabelle auf-geführt.

44 6. Ergebnisse

Tabelle 6.1 – Klinisch-diagnostische Parameter des Patientenkollektivs. Bei der Fall-zahl von 7 handelte es sich jeweils um 4 männliche und 3 weibliche Patienten.

Neurochemische-diagnostische Liquor-Parameter

AD-Patienten nichtAD-Patienten

Parameter Mittelwert Stabw. n Mittelwert Stabw. n p-Wert

Aβ1-40 (pg/ml) 7720,4 2220,46 7 6762,7 1796,56 7 0,392Aβ1-42 (pg/ml) 316 126,36 7 453 186,42 7 0,067Aβ1-42/1-40 0,043 0,0172 7 0,070 0,0316 7 0,032pTau (pg/ml) 92,00 50,24 7 53,14 32,35 7 0,055Alter (Jahre) 71,3 6,60 7 71,1 6,20 7 0,967

6.2 Etablierung der mehrstufigen Analysemethode

Bevor die Plasmaproben multidimensional getrennt werden konnten, wurde zuvorjeder Schritt der Analysemethode einzeln etabliert.Bei der Affinitätschromatographie wurden zwölf hochkonzentrierte Blutproteine

abgereichert, die vermutlich diagnostisch keine Rolle spielten. Dazu zählen Albumin,Gesamt-IgG, Transferrin, Fibrinogen, IgA, α2-Makroglobulin, IgM, α1-Antitrypsin,Haptoglobin, α1-saures Glykoprotein, Apolipoprotein A-I und Apolipoprotein A-II.Dadurch war es möglich, die große Population niedrigkonzentrierter Proteine undPeptide zu detektieren, indem eine relativ große Proteinmenge auf die analytischen2D-Gele geladen werden konnte.

6.2.1 Affinitätschromatographie

Um niedrigkonzentierte Proteine anzuhäufen, wurde eine Affinitätschromatographiemit einer IgY 12LC10-Säule durchgeführt und die zwölf prominentesten Blutproteineabgereichert. In Abbildung 6.1 ist im oberen Teil A ein typisches Elutionsprofil derAffinitätschromatographie zu sehen. Die Durchflussfraktion zeigte ein drei-gipfeligesMaximum, das die niedrigkonzentrierten Proteine enthielt und wurde für weiterfüh-rende Experimente gesammelt.Mittels eindimensionaler Gelelektrophorese und Coomassie-Färbung (s. Abb. 6.1,

B) konnte nachgewiesen werden, dass die Kapazität der IgY-Antikörpersäule niedrigerwar, als vom Hersteller angegeben. Hierfür wurde jeweils die Duchflussfraktion unddie gebundene Fraktion, die die hochabundanten Proteine enthielt, gegenüber gestelltund verglichen. Dieses Ergebnis wurde in Kooperation mit Frau Stefanie Hempfling(Studentin in der Psychiatrischen und Psychotherapeutischen Klink Erlangen) erar-beitet.

6.2. Etablierung der mehrstufigen Analysemethode 45

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

280 nm

Leitfähigkeit

Zeit [Minuten]

Ab

sorp

tio

n [

mA

U]

Lei

tfäh

igk

eit

[mS

/cm

]

Durchflussfraktion gebundene Fraktion

250 kD150 kD100 kD

75 kD

50 kD

37 kD

25 kD20 kD

15 kD

10 kD

1 2 3 4 5 6 7 8 9

3 mg 4 mg 6,8 mg 8,5 mg

A

B

Abbildung 6.1 – Elutionsprofil und Bestimmung der Bindungskapazität der IgY-Säule.(A) Die Durchflussfraktion bestand aus einem drei-gipfeligen Maximum und enthieltdie niedrigkonzentrierten Proteine. Die hochkonzentrierte, gebundene Fraktion wur-de durch pH-Wert-Erniedrigung eluiert. (B) Proteinkonzentrationen von 3mg, 4mg,6,8mg, 8,5mg wurden auf der Säule aufgetrennt und jeweils die Durchfluss- und diegebundene Fraktion auf einer SDS-PAGE analysiert. Bei einer injizierten Proteinmengevon 8,5mg war eine exakte Abtrennung nicht mehr möglich: In der niedrigkonzentriertenProteinfraktion waren deutlich Banden von hochkonzentrierten Proteinen zu erkennen(s. Pfeile). (1) Marker All Blue; (2), (4), (6), (8) Maxima der Durchflussfraktion; (3),(5), (7), (9) Maxima der gebundenen Fraktion.

46 6. Ergebnisse

In allen nachfolgenden Experimenten wurde ein Volumen von 100µl Plasma aufdie Säule aufgetragen. Dieses Volumen enthielt eine durchschnittliche Proteinkonzen-tration von 6,8mg.Plasmaproben der vierzehn Patienten wurden nach dem oben beschriebenen Ver-

fahren (siehe Abb. 6.1) abgereichert. Eine doppelte Ladekapazität wurde mit derKopplung von zwei IgY-Säulen erreicht. Pro Plasmaprobe eines Patienten wurdeninsgesamt drei einzelne Durchgänge mit je 200µl Blutplasma (=13,4 g) durchgeführt.

6.2.2 Anionenaustausch-Chromatographie

Nach Abreicherung der hochkonzentrierten Proteine, Proteinfällung (s. Abb., 6.11, 1)und Markierung (s. Abb. 6.11, 3) lagen die niedrig-konzentrierten Plasmaproteine ineiner geeigneten Konzentration (von 2,5-4mg/µl) vor. Die Proben wurden anschlie-ßend mit Hilfe einer Anionenaustausch-Chromatographie in jeweils drei Fraktionenmit vergleichbarer Proteinkonzentration und -menge separiert, um die Detektion derunterschiedlich regulierten Proteine der AD- bzw. nAD-Patienten zu erleichtern.

Trennquantität

Eine MonoQ-Säule wurde für die nächste Separationsstufe, die Anionenaustausch-Chromatographie, verwendet. Die Trennleistung der Säule wurde durch die Wahleines geeigneten Puffersystems optimiert. Hierfür wurden sechs Variationen getestet,die in Tabelle 6.2 aufgelistet sind. Da es sich dabei um Vorexperimente handelte und

Tabelle 6.2 – Übersicht über die getesteten Puffersysteme zur Optimierung der Trenn-leistung der MonoQ-Säule.

Puffer A Puffer B

Nr. Puffer pH Harnstoff Probe + Harnstoffgehalt NaCl-Konz.

1 50 mM Tris 8,0 2M Liquor mit 8M Harnstoff 1M2 50 mM Tris 8,0 4M Liquor mit 8M Harnstoff 1M3 50 mM Tris 8,0 ohne Liquor mit 8M Harnstoff 1M4 50 mM Tris 8,0 ohne Liquor ohne Harnstoff 1M5 50 mM K2HPO4 8,0 ohne Liquor mit 8M Harnstoff 1M6 50 mM Tris 8,0 ohne Liquor mit 8M Harnstoff 1M

+ 46mg/ml JAA

die letztendlich zu untersuchende Körperflüssigkeit noch nicht festgelegt war, wurdendiese zunächst mit Liquorproben einer Testperson durchgeführt und anschließend aufPlasmaproben übertragen, siehe Abbildung 6.2.

6.2. Etablierung der mehrstufigen Analysemethode 47

Die Puffersubstanz, der pH-Wert und der Harnstoffgehalt sowohl in der Probe, alsauch im Laufpuffer wurden variiert (siehe Tab. 6.2). Der Puffer B hatte jeweils diegleiche Zusammensetzung wie der dazugehörige Puffer A und enthielt zusätzlich 1MNaCl. Puffersystem 2 und 3 unterstützten eine optimale Verteilung der Proteinprobeauf viele Fraktionen. Die Ergebnisse wurden in Kooperation mit Frau Stefanie Hempf-ling erarbeitet. Die Experimente wurden mit Vollplasma und Vollliquor durchgeführt.

0,0 6,0 12,0 18,0 24,0 ml

0

40

80

120

160

25 kD

100 kD

50 kD

37 kD

150 kD250 kD

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29

20,0

40,0

60,0

Lei

tfäh

igkei

t [m

S/c

m]

0,0

Abso

rpti

on [

mA

U]

A

B

80,0

200

75 kD

280 nmLeitfähigkeit

Abbildung 6.2 – Gelelektrophoretische Darstellung der Trennkapazität der MonoQ-Säule. Die Darstellungen A und B sind Ergebnisse eines Laufes mit dem Puffer-system 2 (Tab. 6.2). (A) Elutions- und Leitfähigkeitsprofil der Anionenaustausch-Chromatographie. (B) Maximumfraktionen des Elutionsdiagramms von (A). MittelsCoomassie-Färbung wurden die Proteine sichtbar gemacht. Das Gel zeigt die Frak-tionen der Anionenaustausch-Chromatographie bei welcher 5mg Plasmaprotein einerTestperson in die Säule injiziert worden waren. Der Proteinstandard All-Blue wurde inLaufspur (1) aufgetragen. Die Auftrennung erstreckte sich auf den Bereich von Fraktion15 bis 29.

Beide Körperflüssigkeiten enthielten in diesen Vorversuchen alle Proteine, da keineAbreicherung während der Etablierungsphase vorgeschaltet war. Als Beispiel wurde5mg humanes Plasma mit einem kontinuierlichen Salzgradienten (0 bis 1M NaCl,siehe Abb. 6.2, A) aufgetrennt. Vor jedem Test wurde die Säule gründlich gewaschen

48 6. Ergebnisse

und auf das neue Puffersystem eingestellt. Alle eluierten Fraktionen wurden nachProteinfällung und unter reduzierenden Bedingungen auf 1D-Gele geladen. Anschlie-ßend wurden die Proteinbanden mittels Coomassiefärbung (s. Abb. 6.2, B) sichtbargemacht.Dabei wurde auf das Vorkommen von identischen Banden in benachbarten Fraktio-

nen geachtet, ein wichtiges Indiz zur Beurteilung der Trennkapazität der Säule. Das

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 1314 1516 1718 19 20 21 22 23 24

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 151617 18 19 2021 222324

A

B

250 kD

150 kD

100 kD75 kD

50 kD

37 kD

Abbildung 6.3 – Eine Gegenüberstellung der Anionenaustausch-Chromatographien,die mit den unterschiedlichen Puffersystemen (s. Tab. 6.2) durchgeführt wurden. (A)Der Puffer Nr. 4 mit einem pH-Wert von 8, ohne Urea unterstützte die Trennleistung derSäule in 12 Fraktionen. (B) Die Zugabe von 4M Urea im Puffer 2 und in der geladenenProbe sorgte dafür, dass die Proteine der Durchflussfraktion (A, Spur 3 und 4) in denTrennbereich der Säule verschoben werden konnten (B, Spur 6, 7 und 8). Es wurdenjeweils 300µl Liquor (= 180µg) mit 8M Harnstoff versetzt und auf die Säule geladen.

Puffersystem 2 unterstützte die Auftrennung der Proteinprobe in viele unterschiedli-che Fraktionen wie in Abbildung 6.2, B zu sehen ist.Nach diesem Verfahren wurden alle sechs, in Tabelle 6.2 aufgelisteten Puffersyste-

me an Liquorproben getestet. Als Beispiel wurden zwei Puffersysteme in Abbildung6.3 dargestellt: Ein pH-Wert des Puffers von 8 funktionierte gut, es waren jedoch vieleProteine im Durchflussvolumen zu finden (Abb. 6.3, A). Abhilfe verschaffte die Zuga-be von Harnstoff. Die Puffersysteme 2 und 3 (Abb. 6.3, B) unterstützten die Trennungder Proteine in möglichst viele Fraktionen mit unterschiedlichem Bandenmuster. DaHarnstoff zusätzlich das Gesamtergebnis verbesserte, indem die Chemikalie intermo-lekulare Protein-Bindungen trennte, wurde das harnstoffhaltige Puffersystem 2 für

6.2. Etablierung der mehrstufigen Analysemethode 49

alle weiteren Plasmaauftrennungen ausgewählt.Anschließend wurde die Bindungskapazität der MonoQ-Säule experimentell be-

stimmt und mittels Gelelektrophorese und Coomassie-Färbung analysiert. Hierfürwurde einer gesunden Testperson Blut entnommen, daraus Plasma gewonnen undin unterschiedlichen Verdünnungen auf die Säule aufgetragen. Die Bindungskapazi-tät wurde ermittelt, indem der Proteingehalt der Durchflussfraktion mit dem dereluierten Hauptfraktion verglichen wurde. Proteinproben unterschiedlicher Konzen-tration von 1, 5, 10, 15, 20, 25 und 30mg wurden in die Säule injiziert. Die maximaleKapazität der Säule war mit 30mg schon überschritten, da eine weitere Proteinban-de (Albumin) mit ca. 70 kD in der Durchflussfraktion auftauchte, die sonst nur inder Elutionsfraktion zu finden war. Damit lag die maximale Trennkapazität bei ca.25mg Protein (Abb. 6.4). Das Experiment wurde in Kooperation mit Frau StefanieHempfling durchgeführt.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

250 kD150 kD

25 kD

37 kD

50 kD

75 kD100 kD

15 mg 20 mg 25 mg 30 mg

Abbildung 6.4 – Bestimmung der Kapazität der MonoQ-Säule. Es wurden unterschied-liche Proteinmengen geladen. (1) Marker All Blue; (2), (4), (6), (8) Durchflussfraktionder jeweiligen Poteinkonzentration; (3), (5), (7), (9) Elutionsmaximum der jeweiligenPoteinkonzentration; Wurden 30 mg geladen (8), tauchte eine Albumin-Bande in derDurchflussfraktion auf (schwarzes Rechteck).

Trennqualität

Der kontinuierliche Gradient war aufgrund der Vielzahl der zu analysierenden Frak-tionen aus technischen Gründen nicht praktikabel. Daher wurden Elutionen mit zweioder drei unterschiedlichen Stufen der Salzkonzentration getestet. Die Elutionsstufenwurden empirisch so eingestellt, dass die Proteinkonzentration in den Fraktionen un-gefähr gleich war. Hierfür wurde die Methode der Fluoreszenzmarkierung eingesetzt.Die Fluoreszenz entsprach bei der jeweiligen Wellenlänge proportional der Protein-menge.

50 6. Ergebnisse

a 1 2 3

633 nm

532 nm

488 nm

B

CAa 1 2 3

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3

n = 3

D

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1 2 3

n = 3

18 28 100

18 26 100

Abbildung 6.5 – Darstellung der durchgeführten Quantifizierung der 3-Stufenelutionbei 180mM (1), 280mM (2) und 1M NaCl (1) mittels 1D-Gelelektrophorese (A) undTüpfeltest (B) der Fluoreszenzfraktionen des Separationstests. Die Fluoreszenzstärkewurde ermittelt und als Säulendiagramm dargestellt (C). (D) Säulendiagramm nachder Reduktion der zweiten Stufe auf 26% B, bzw. 260mM NaCl. Die starke Fluores-zenz der Durchflussfraktion (a) beim Tüpfeltest lässt sich mit der Auswaschung vonüberschüssigem Farbstoff erklären.

Die Einstellung der drei optimalen Salzstufen der Anionenaustausch-Chromato-graphie wurde qualitativ überprüft, indem eine mit Cy2, Cy3 und Cy5 fluoreszenz-markierte Probe, 1mg abgereichertes Plasma einer Testperson aufgetrennt und unter-schiedlich untersucht wurde: Die Durchfluss- und die Elutionsfraktionen wurden aufein 1D-SDS-Gel aufgetragen und digitalisiert. Die Fluorenszenzaufnahme (s. Abb. 6.5,A) zeigte, dass bei den eingestellten Stufen von 18%, 28% und 100% Puffer B dieProteinmuster in den drei Fraktionen weitgehend unterschiedlich waren, dennoch wardie Proteinmenge nicht gleichmäßig verteilt. Fraktion (2) enthielt offensichtlich mehrProtein. Diese Beobachtung wurde mit einem quantitativen Tüpfeltest auf einer Ni-trozellulosemembran bestätigt (s. Abb. 6.5, B). Dabei wurde pro Fraktion ein Volu-men von 2µl auf eine Membran aufgetragen und mit einem 3-Laser-Scanner digitali-siert. Die relative Helligkeit der Proteinpunkte war in Fraktion (2) am stärksten. DasSäulendiagramm in Abbildung 6.5, C stellt dessen Quantifizierung dar. Aufgetragenwurden jeweils die Mittelwerte der Fluoreszenzstärken und die Standardabweichung.Es veranschaulichte die ungleichmäßige Verteilung der Proteine zwischen Fraktion 2und 3. Als Konsequenz wurde die zweite Salzstufe auf 26% erniedrigt, so dass die

6.2. Etablierung der mehrstufigen Analysemethode 51

Fluoreszenz und die damit verbundene Proteinverteilung in allen Fraktionen ungefährgleich war, bzw. sich statistisch nicht signifikant unterschied (Abb. 6.5,D).

A B

C D

Abbildung 6.6 – Darstellung der Trennschärfe des 3-Stufen-Gradienten. Die eluier-ten Fraktionen wurden separat auf 2D-Gelen aufgetrennt: (A) Die Durchflussfraktionenthielt eine vernachlässigbare Proteinmenge und wurde in weiteren Experimenten ver-worfen. (B) Fraktion 1 bei der Salzstufe 180mM NaCl; (C) Fraktion 2 bei 260mMNaCl; (D) Fraktion 3 der Elutionsstufe 1M NaCl. Die geladene Proteinmenge wurdeannähernd gleichmäßig in drei Fraktionen aufgeteilt.

Die erfolgreiche Separation in drei Fraktionen mit vergleichbarer Proteinkonzentra-tion wurde mit 2D-Gelauftrennungen überprüft, siehe Abbildung 6.6. Die Versuchs-durchführung verlief analog zu dem oben beschriebenen Experiment. 1mg Plasmawurde mit drei CyDyes markiert und mit der Anionenaustausch-Chromatographie se-pariert. Jede eluierte Fraktion der Stufen 18%-26%-100% und die Durchflussfraktionwurden auf ein separates 2D-Gel aufgetragen und verglichen. Abbildung 6.6, A zeigt,dass die Durchflussfraktion der 3-Stufen-Elution eine vernachlässigbare Proteinmen-ge enthielt, welche daher in weiteren Experimenten verworfen wurde. Die qualitativeAuswertung nach der Digitalisierung der 2D-Gelbilder der drei Elutionsfraktionenlieferte jeweils einen Wert von 33,33% ± 3,39%, damit waren die Fraktionen (1-3)in (B), (C), (D) gleichmäßig verteilt.

52 6. Ergebnisse

Um die Auftrennung des Ausgangsmaterials in Fraktionen mit unterschiedlicherProteinzusammensetzung zu überprüfen, wurde nach der Anionenaustausch-Chroma-tographie jede der drei Fraktionen individuell mit einem Cy-Farbstoff markiert, ver-einigt und die Mischung auf einem 2D-DIGE-Gel analysiert. Da jeder Farbstoff ei-ner Fraktion aus der Anionenaustausch-Chromatographie entsprach, konnte so dieTrennqualität untersucht werden. Zur Veranschaulichung wurde im Folgenden die

pH 3-10 pH 3-10

A B

C D

0,0 5,0 10,0 15,0 ml 0,0 5,0 10,0 15,0 25,0 ml

0

50

100

150

200

250

nm

0

50

100

150

200

nm

20,0

250

20,0

2-1 2-32-2 3-1 3-2 3-3Durchfluss

Abbildung 6.7 – Beurteilung der Trennqualität der MonoQ-Säule mit dem 2D-DIGE-System. Die drei resultierenden Fraktionen der Anionenaustausch-Chromatographiewurden jeweils mit einem CyDye-Fluoreszenzfarbstoff markiert, vereinigt und das Ge-misch auf einem 2D-DIGE-Gel mit einer Breite von 14 cm (C) und 20,5 cm (D) aufge-tragen. Das Gel in (C) stellte die Trennqualität eines 2-Stufen-Gradienten dar (A): DieDurchflussfraktion (2-1) wurde mit Cy2 markiert. Die Fraktion der ersten Stufe (2-2)wurde mit Cy3 markiert, die der zweiten Stufe mit Cy5 (2-3). Auf dem Gel (D) wurdendie Fraktionen des 3-Stufen-Gradienten (B) aufgetrennt. Fraktion 3-1 wurde mit Cy3,3-2 mit Cy2 und 3-3 wurde mit Cy5 markiert.

2-Stufen-Elution der 3-Stufen-Elution gegenübergestellt: Vor der Gelelektrophore-se wurden die Fraktionen der 2-Stufen-Elution (Abb. 6.7, A) folgendermaßen denFluoreszenzfarbstoffen zugeordnet: Grüne Proteinpunkte repräsentierten die mit Cy3markierte Fraktion, blau stand für die mit Cy2 markierte Fraktion und rot für die

6.2. Etablierung der mehrstufigen Analysemethode 53

Cy5-Fraktion (Abb. 6.7, C). Die verschiedenen Farben sollten sich idealerweise nichtüberlagern. Die Abtrennung der drei Fraktionen voneinander war zufriedenstellend;Proteinspots in allen drei Fluoreszenzfarben waren zu erkennen. Die blaue Farbe lagunterrepräsentiert vor, das bedeutet, dass die Durchflussfraktion eine sehr geringeProteinmenge enthielt. Die übrigen Fraktionen wiesen eine sehr große Überlagerungan Proteinen auf (siehe Abbildung 6.7, C). Daher war eine 2-Stufenelution (Stufen bei24% (240mM NaCl) und 100% (1M NaCl)) für die weiteren Untersuchungen nichtgeeignet. Die bereits besprochene 3-Stufen-Elution ist in Abb. 6.7, B dargestellt.

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

-20

0

20

40

60

80

100

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54

633 nm

532 nm

488 nm

Leitfähigkeit

Abso

rpti

on [

mA

U]

Lei

tfäh

igkei

t [m

S/c

m]

Zeit [min]

Fraktion 1 Fraktion 2 Fraktion 3

Abbildung 6.8 – Profil einer standardisierten 3-Stufen-Elution der Anionenaustausch-Chromatographie. Die Separation resultierte in drei Fraktionen mit annähernd gleicherProteinkonzentration. Die drei dargestellten Wellenlängen stellen die verwendeten Fluo-reszenzfarbstoffe dar. Die Stufen wurden auf 180mM, 260mM und 1M NaCl eingestellt.Die starke Fluoreszenz im Bereich der Durchflussfraktion korrespondierte mit freiem,nicht-proteingebundenem Farbstoff.

Die Auftrennung bei der Verwendung eines 3-Stufen-Elutionsgradienten war deut-lich besser im Vergleich zu der 2-Stufen-Elution (Abbildung 6.7,D), da alle drei Farb-stoffe präsent und annähernd gleichmäßig vorhanden waren. Die in Abbildung 6.7erkennbaren weißen Punkte entstanden durch Überlagerung von allen Farben. DieseProteine waren in allen Fraktionen vorhanden und konnten mit diesem Chromato-graphiesystem nicht aufgetrennt werden.

Die 3-Stufen-Elution mit 18%, 26% und 100% Puffer B, die einem Natriumchlorid-Gehalt von 180mM, 260mM und 1M entsprach, führte zur gewünschten Auftren-

54 6. Ergebnisse

nung in drei Fraktionen mit einer annähernd gleichen Proteinkonzentration (sieheAbb. 6.8).

6.2.3 Umkehrphasenchromatographie

Für eine weitere Fraktionierung wurde eine Umkehrphasenchromatographie (RPC =reversed-phase chromatography) gewählt, da einige Proteine mittels Anionenaustausch-Chromatographie nicht separiert werden konnten.Unterschiedliche Fraktionen aus der Anionenaustausch-Chromatographie-Etablier-

ung wurden einzeln auf die RPC-Säule geladen, wobei darauf geachtet wurde, dass beieiner wiederholten Injektion die gleiche Fraktion einer Anionenaustausch-Chromato-graphie verwendet wurde. Beispielsweise wurde zwei Mal die Fraktion 15 gesammeltund einzeln mit der RPC separiert (s. Abb. 6.2). Zunächst wurde mit diesem Verfah-ren eine geeignete Säule bestimmt und anschließend passende Elutionstufen ermittelt.Es standen unterschiedliche Säulen zur Wahl: Ein Vorsäule/Hauptsäule System Bio-Basic4 (Thermo) und eine weitere, einzeln einsetzbare Säule Chromolith-Performance(Merck).

Tabelle 6.3 – Getestete RPC-Säulen.

RPC-Säule Vorteile Nachteile

Vorsäule mit gute Trennleistung Proteinverlust 72-88%Hauptsäule BioBasic-4

Chromolith- sehr gute Abtrennung, keine erkennbarenPerformance höhere Flussraten durch Nachteile

monolithisches Säulen-material möglich

Zunächst wurde die Kombination einer Vorsäule mit der Hauptsäule BioBasic-4getestet. In einer Bilanz wurden Verluste der Proteinmenge als Verhältnis der gela-denen zur eluierten Fraktion gegenübergestellt und verglichen. Bei der Auftrennungmit beiden Säulen in Kombination waren erhebliche Verluste des injizierten Proteinszu verzeichnen, diese lagen zwischen 72 und 88%. Die Ergebnisse zeigten deutlich,dass die Auftrennung mit diesem Vorsäulen-Hauptsäulen-System für diese Arbeit un-geeignet war (s. Tab. 6.3).Eine weitere Umkehrphasenchromatographie-Säule wurde getestet, die ohne Vor-

säule funktionierte und für Proteintrennungen entwickelt wurde: Chromolith Per-formance; eine monolithische Säule mit einem Durchmesser von 4,6mm. Von derChromolith-Säule konnte die geladene Proteinmenge wieder vollständig abgelöst wer-den.

6.2. Etablierung der mehrstufigen Analysemethode 55

Tabelle 6.4 – Verteilung der Gesamtproteinmenge als prozentualer Anteil in den Frak-tionen bzw. auf den neun 2D-Gelen. Der Proteingehalt verhielt sich analog zur ermit-telten Fluoreszenz, bedingt durch die Eigenschaft der CyDye-Protein-Kopplung.

Fraktion Cy2-Gesamtfluoreszenz, Verteilungauf hintergrundkorrigiert in%

2D-Gel (rel. Einheiten)

1a 17,02 10,501b 18,6 11,481c 16,92 10,44

2a 15,3 9,442b 20,9 12,902c 16,1 9,94

3a 15,6 9,633b 23,6 14,563c 18,0 11,11

Σ 100,00

RPC

AA

C

1a 1b 1c

2a 2b 2c

3a 3b 3c

Abbildung 6.9 – Quantifizierung der Gelbilder. Die Anionenaustausch-Fraktionen 1,2 und 3 wurden mit Cy2 markiert und einzeln mittels RPC aufgetrennt in Fraktionena, b und c. Anschließend wurden diese separat auf 2D-Gele aufgetragen und bei derentsprechenden Wellenlänge von 488 nm digitalisiert (Quantifizierung, s. Tab. 6.4).

56 6. Ergebnisse

Die Bilanzen waren mit 116,44%± 2,46 (n=2) ausgewogen. Somit war die Chromo-lith-Säule für die Fragestellung am besten geeignet und wurde exklusiv für alle wei-teren Experimente verwendet.Das Prinzip der 3-Stufen-Elution wurde analog zur Anionenaustausch-Chromato-

graphie (siehe Elutionsprofil in Abb. 6.8) auch auf die RPC übertragen. Die Bestim-mung der Elutionsstufen wurde mit Hilfe von Cy2-markierten Proteinproben durch-geführt. Hierfür wurden alle drei Fraktionen der Anionenaustausch-Chromatographieeinzeln mit Cy2 markiert und nacheinander auf der Chromolith-Säule aufgetrennt.Die Stufen wurden empirisch ermittelt. Das Elutionsprofil der Cy2-Fluoreszenz (Ex-zitation 488 nm, Emission 535 nm) wurde aufgezeichnet und ausgewertet.

Tabelle 6.5 – Elutionsstufen der Umkehrphasenchromatographie. Für jede geladeneFraktion der Anionenaustausch-Chromatographie wurden die drei Elutionsstufen indi-viduell angepasst.

Fraktion 1 Fraktion 2 Fraktion 3Elutionsstufe Lösung B [%] Lösung B [%] Lösung B [%]

Stufe 1 43 46 46Stufe 2 46 49 49Stufe 3 100 100 100

Die optimalen Elutionsstufen, die für die jeweilige Fraktion individuell eingestelltwurden, sind in Tabelle 6.5 dargestellt. Aufgrund der mangelnden Sensitivität desFluoreszenzdetektors der HPLC-Anlage, wurden die Fraktionen zusätzlich separatauf 2D-Gelen (s. Abb. 6.9) aufgetrennt, deren Fluoreszenz im Typhoon-Scanner quan-tifiziert (s. Tab. 6.4) und die Proteinverteilung bewertet. Tabelle 6.4 zeigt, dass dieProteinmenge, die sich aufgrund der Markierung proportional zu der gemessenenFluoreszenz verhält, ungefähr gleichmäßig auf alle neun Gele verteilt war.Nach der oben beschriebenen erfolgreichen Etablierungsphase wurden die mit den

Fluoreszenzfarbstoffen einzeln markierten niedrigkonzentrierten Blutproteine durch3-Stufen-Anionenaustausch-Chromatographie und anschließend einzeln durch eine 3-Stufen-Umkehrphasenchromatographie fraktioniert.

6.2.4 Optimierung der zwei-dimensionalen Gelelektrophorese

Das gängige Laemmli-Gelsystem mit einer Polyacrylamidlösung von 10% war für dieFragestellung dieser Arbeit nicht ausreichend. Das weite Molekulargewichtsspektrumder Proteine wurde nur unvollständig aufgetrennt. Daher fand ein auf Tris und Bicinbasierendes Gelsystem Anwendung [121]. Um eine größtmögliche Auftrennung zuerreichen, wurden Gele der Maße 25,5 x 20,5 cm verwendet. Erst durch die zusätzlicheEinführung eines zwei-Stufengradienten bestehend aus einem unteren Gelabschnitt

6.3. Arbeitsschema der mehrstufigen Trennmethode zur Identifizierungpotentieller Biomarker 57

mit 14% Acrylamid/Bisacrylamid und einem darüber polymerisierten Bereich mitnur 8% Acrylamid/Bisacrylamid wurde eine gute Auftrennung erreicht. Abbildung6.10 zeigt zweimal die gleiche Fraktion 3c (vgl. Abb. 6.9), die auf einem 10%-igenLaemmli-Gel (s. Abb. 6.10,A) und im Vergleich dazu auf einem 8%-14%-Tris/Bicin-Gel (s. Abb. 6.10, B), aufgetrennt wurde. Mit einer herkömmlichen Matrix von 10%

A B

8 %

14 %

Abbildung 6.10 – Vergleich zweier Gelmatrices auf 2D-DIGE-Gelen. Auf beiden Sy-stemen wurde jeweils die gleiche markierte Fraktion 3c aufgetragen und das Gel digitali-siert. (A) Gelmatrix eines 10%-igen Polyacrylamidgels. (B) Zwei Kompartimenten-Gel,je zur Hälfte bestehend aus 8% und 14% Polyacyrlamid, das nach dem Tris/Bicin-System hergestellt wurde. Die 10%-ige Polyacrylamidkonzentration war nicht geeignetum die großen Proteine aufzutrennen. Hingegen konnte mit Hilfe einer Matrix von 8%und 14% Polyacrylamid alle Proteine optimal getrennt werden.

Polyacrylamid (s. Abb. 6.10,A) konnten großen Proteine im oberen Drittel des Gelsschlecht aufgetrennt werden. Das zwei-Kompartimenten-System hingegen sorgte füreine Auftrennung über die gesamte Gelfläche hinweg (s. Abb. 6.10, B) und wurde fürdie weiteren Experimente als Gelsystem herangezogen.

Die Ladungskapazität der 2D-Gele stellte den limitierenden Faktor der gesamtenAnalysemethode dar. Die insgesamt zu analysierende Proteinmenge wurde letztend-lich auf neun 2D-Gele aufgeteilt, um die Gesamtladungskapazität zu erhöhen. Sokonnte für die vergleichende Analyse, nach Entfernung der zwölf hochkonzentriertenPlasmaproteine, eine Gesamtmenge von 2,5-4,5mg Protein auf neun Gele verteilt undparallel analysiert werden.

6.3 Arbeitsschema der mehrstufigen Trennmethodezur Identifizierung potentieller Biomarker

Vierzehn Patientenplasmaproben wurden in zwei diagnostische Gruppen eingeteiltund mehrdimensional aufgetrennt: Sieben Patienten mit der Diagnose Alzheimer-Demenz (AD) sowie sieben Patienten mit Demenzen vom nicht-Alzheimer-Typ (nAD).

58 6. Ergebnisse

Die Prozedur beinhaltete folgende Hauptschritte (vgl. Abb. 6.11):

1. Abreicherung von 12 hochkonzentrierten Plasmaproteinen

2. Bildung von zwei diagnostischen Gruppen

3. Proteinpräzipitation

4. Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen

5. Anionenaustausch-Chromatographie

6. Umkehrphasenchromatographie

7. 2D-DIGE-Gelelektrophorese

8. Silberfärbung und Proteindetektion

9. ESI-MS-Identifikation von potentiellen Biomarkern

10. Statistische Auswertung

Pro diagnostischer Gruppe wurden sieben Plasmaproben separat über Affinitäts-chromatographiesäulen (s. Abb. 6.11, 1.) abgereichert. Die Fraktionen, die die nied-rigkonzentrierten Proteine enthielten, wurden entsprechend der Patientengruppe ver-einigt, gefällt und in einem geringen Volumen Markierungspuffer rehydriert (s. Abb.6.11, 2.+ 3.). Die Proben der Alzheimer-Patienten wurden zunächst mit dem Fluo-reszenzfarbstoff Cy3 markiert, die nAD-Patienten mit Cy5 (s. Abb. 6.11, 4.). Derinterne Standard, der ein Drittel des Gesamtproteins umfasste, wurde mit Cy2 mar-kiert. Nach dem Abschluss der Farbreaktion wurden beide Gruppen und der interneStandard vermischt und gemeinsam weiteren Separationen unterzogen: Das Gemischwurde auf eine Anionenaustausch-Chromatographie-Säule geladen und mittels einer3-Stufen-Elution aufgetrennt (s. Abb. 6.11, 5.). Drei Fraktionen mit einer annäherndgleichen Proteinkonzentration wurden eluiert und direkt einer Umkehrphasenchro-matographie unterzogen (s. Abb. 6.11, 6.). Auch hier wurde eine 3-Stufen-Elutiongewählt, um Fraktionen mit einer annähernd gleichen Proteinkonzentration zu erhal-ten. Insgesamt resultierten die Chromatographien in neun Fraktionen. Jede Fraktionwurde separat auf ein 2-Stufen-2D-Gel der Größe 25,5 x 20,5 cm geladen (s. Abb.6.11, 7.). Nach der 2D-Elektrophorese wurden die Gele mit einem 3-Laser-Scanner inden jeweiligen Exzitationen der Fluoreszenzfarbstoffe (488 nm für Cy2, 532 nm fürCy3 und 633 nm für Cy5) digitalisiert und mit einem Computerprogramm statistischausgewertet (s. Abb. 6.11, 8.). Eine Silberfärbung der Gele erleichterte die Detektionder einzelnen Kandiatenproteine. Diese wurden aus dem Gel ausgestochen und dieIdentität wurde mittels Massenspektrometrie bestimmt, (s. Abb. 6.11, 9.+ 10.).Um die Reproduzierbarkeit des Verfahrens statistisch zu untermauern, wurden so-

wohl die Markierung als auch die Separationen sieben Mal wiederholt. So konnten

6.3. Arbeitsschema der mehrstufigen Trennmethode zur Identifizierungpotentieller Biomarker 59

Abreicherung

nADAD

Fällung undRehydrierung

Fällung undRehydrierung

Cy3 Cy5Cy2

1.

2.

Anionenaustausch-Chromatographie

MIX

RPC

1a 1b 1c 2a 2b 2c 3a 3b 3c

21 3

RPC RPC

3.

4.

5.

MS-Analyse und Statistik

6.

7.

Abreicherung

8.

9.

+

10.

Abbildung 6.11 – Übersicht über die einzelnen Stufen der multidimensionalen Ana-lysemethode.

60 6. Ergebnisse

schließlich die Kandidatenproteine als statistisch signifikant unterschiedlich definiertwerden. Diese wurden anschließend in zwei unabhängigen Runden massenspektrome-trisch identifiziert.

6.4 DIGE-Analyse der Patientenproben

Die aus den Anionenaustausch- und Umkehrphasenchromatographien erhaltenen ins-gesamt neun Fraktionen wurden einzeln auf 2D-Gelen aufgetrennt.

1a 1b 1c

2a 2b 2c

3a 3b 3c

1a 1b 1c

RPCA

AC

Abbildung 6.12 – Schematische Darstellung der Gel-Nummerierung nachAnionenaustausch- und Umkehrphasenchromatographie. Die Fraktionen der Um-kehrphasenchromatographie (RPC) sind in horizontaler, die der Anionenaustausch-Chromatographie (AAC) in vertikaler Richtung angeordnet.

In Abbildung 6.12 ist die Nummerierung der Gele als Schema zu erkennen. In ho-rizontaler Richtung wurde die Auftrennung der Umkehrphasenchromatographie dar-gestellt. Die Konzentration an organischem Lösungsmittel während der Chromato-graphie nimmt von links nach rechts zu. In vertikaler Richtung sind die Fraktionender Anionenaustausch-Chromatographie aufgereiht. Von oben nach unten nimmt dieSalzkonzentration während der Chromatographie zu.Die 2D-Gele wurden nach der Elektrophorese mit einem Laser-Scanner bei den

jeweiligen Wellenlängen der drei Fluoreszenzfarbstoffe digitalisiert. Das Experimentwurde sieben Mal wiederholt und es wurden 21 Gele pro Fraktion (1a-3c) bzw. insge-samt 189 digitalisierte Bilder analysiert. Die Bildauswertung wurde separat für jedeFraktion mit dem DeCyder-Programm durchgeführt, demnach pro Fraktion für 21digitalisierte Bilder. Das Programm detektierte insgesamt 16 Proteine, die in der ver-einigten Blutplasmaprobe aus der Alzheimer-Gruppe im Vergleich zu der vereinigtenProbe aus der Kontrollgruppe (nAD) mindestens um den Faktor zwei unterschiedlichexprimiert waren. Diese Proteinspots sind auf den 2D-Gelen in Abbildung 6.13 mitdurchlaufenden Zahlen markiert.In Tabelle 6.6 sind die detektieren Proteinspots der sieben Experimentwiederholun-

gen zusammengefasst. Zudem wurde die Detektionshäufigkeit als Prozentzahl berech-net, und gibt an wie oft jeder dieser genannten 16 Proteinspots bei sieben Wiederho-lungen als unterschiedlich exprimiert gefunden wurde. Zum Beispiel wurde Protein

6.4. DIGE-Analyse der Patientenproben 61

Nummer 1 (s. Tab. 6.6, 2. Spalte) auf Gel 1a (s. Tab. 6.6, 1. Spalte) bei sechs vonsieben Wiederholungen detektiert, also auf 18 von insgesamt 21 Bildern. Hingegenkonnte Spot Nummer 7 lediglich in zwei Experimenten auf Gel 2a detektiert werden,nur 6 von 21. Bei Spot 1 lag ein hochreguliertes Protein vor (s. Tab. 6.6 den nachoben gerichteten Pfeil), Spot 7 war ein herunterreguliertes Protein (s. Tab. 6.6 dennach unten gerichteten Pfeil in Spalte 3). Dass heißt, ein Protein wurde als hochregu-liert definiert, wenn der Quotient des mittleren Verhältnisses in der AD-Probe zumDurchschnittswert der nicht-AD-Probe positiv war, bei einem negativen Quotient wardie Proteinexpression erniedrigt. Proteine 5, 6, 7 und 13 waren herunterreguliert, alleübrigen Proteine waren in der Alzheimer Probe hochreguliert (s. Tab. 6.6, Regulationund s. Abb. 6.14).

Die Auswertung erfolgte für jede Fraktion separat. Mit der Angabe der Detekti-onshäufigkeit ist keine Aussage über die chromatographische Trennleitung gemeint,

RPC

AA

C

3a 3b 3c

1a 1b 1c

2a 2b 2c

3 pH 10

250 kD150 kD100 kD75 kD

50 kD

25 kD

1

23

4

5

9

10 12

11

6 7

8

13

14

15

16

Abbildung 6.13 – Die neun resultierenden Fraktionen nach 2D-Analyse. Zu sehensind die digitalisierten 2D-DIGE-Gele. Der lineare pH-Bereich lag zwischen 3 und 10.Die Kreise zeigen die 16 ermittelten, unterschiedlich exprimierten Proteine der AD-Patienten im Vergleich zu den nAD-Patienten an.

62 6. ErgebnisseTab

elle6.6

–Detektion

vonin

Alzheim

erDem

enzunterschiedlich

exprimierten

Proteinen

mit

demDeC

yder-Program

m.Das

Experim

entwurde

siebenMal

wiederholt

(E1-E

7).Die

Fraktionenund

Proteinspotnum

mern

wurden

analogzu

Abb.6.12

undAbb.6.13

verwendet.

Die

Pfeile

deutendie

Richtung

derRegulation

an.Ein

Pluszeichen

bedeutet,dass

einProtein

detektiertwerden

konnte;bei

einemMinuszeichen

konntekein

unterschiedlichexprim

iertesProtein

gefundenwerden.

Bei

demZeichen

inKlam

mern

war

eineDetektion

nichteindeutig

möglich.D

iereproduzierte

Detektion

wurde

abschließendim

Verhältnis

zurGesam

t-zahlder

erstelltenGele

inProzent

ausgedrückt.Die

Proteinspots

infetten

Zahlenkonnten

mitHilfe

derESI-M

assenspektrometrie

identifiziertwerden

(s.Kap.6.5).

Detektion

vonin

AD

untersch

iedlich

exprim

iertenProtein

en.

FraktionProteinnum

mer

Regulation

Häufigkeit

E1

E2

E3

E4

E5

E6

E7

%

1a1

⇑18(21)

++

-+

++

+86

2⇑

6(21)-

--

-+

+-

293

⇑9(21)

+-

-+

+-

-43

4⇑

9(21)+

-+

-+

-+

435

⇓6(21)

-+

--

+-

-29

2a6

⇓9(21)

-+

+-

-+

-43

7⇓

6(21)-

++

--

--

298

⇑12(21)

-+

--

++

-57

2b9

⇑15(21)

++

-+

-+

+71

10⇑

18(21)+

++

-+

++

862c

11⇑

18(21)+

++

-+

++

8612

⇑15(21)

++

--

++

+71

13⇓

6(21)+

+-

--

--

293a

14⇑

6(21)-

--

-+

-+

2915

⇑6(21)

--

-+

+-

(-)29

16⇑

12(21)-

--

++

++

57

Gesam

t8

105

512

98

in%

4759

2929

7053

47

6.5. ESI-MS-Identifizierung der unterschiedlich exprimierten Proteine63

sondern lediglich die reproduzierte Detektion eines Proteins innerhalb einer Fraktionund technischen Replikats. Die Proteine wurden jeweils auf mindestens 6, maximalauf 18 der 21 Gele detekiert. Proteine 1, 10 und 11 konnten mit einer Häufigkeit von18 aus 21 Gelen (entspricht 86%) beobachtet werden.

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

14

8

Proteineidenti-

fiziert

1 Protein

identi-fiziert

12 hoch-regulierteProteine

4 herunter-regulierteProteine

Anza

hl

der

hoch

- bzw

. her

unte

r-re

guli

erte

n P

rote

ine

Abbildung 6.14 – Darstellungen der Richtung der Regulation der 16 mit demDeCyder-Programm detektierten, unterschiedlich exprimierten Proteinen in einem Säu-lendiagramm. Von den insgesamt 12 hochregulierten Proteinen konnten 9 (rot markiert,linke Säule) massenspektrometrisch identifiziert werden. Nur ein Protein der 4 herun-terregulierten Proteine konnte mit der MS identifiziert werden (siehe Kap. 6.5).

6.5 ESI-MS-Identifizierung der unterschiedlichexprimierten Proteine

Nach der Auswertung von sieben Experimentwiederholungen wurden potentielle Bio-markerproteine nach dem oben beschriebenen Verfahren detektiert, und nach an-schließender Nachfärbung des Gels mit Silbernitrat, ausgestochen und massenspek-trometrisch identifiziert.

Die ESI-MS-Identifizierung wurde zwei Mal mit den jeweiligen Gelen der Frak-tionen 1a, 2a, 2b, 2c und 3a durchgeführt, siehe Tabellen 6.7 und 6.8. Proteinspotswurden für die Analyse einmal aus den Gelen des Experiments 6 und für die zweiteAnalyse aus den Gelen des Experiments 7 ausgestochen. Insgesamt neun Proteine,deren Expression sich in den beiden hier untersuchten diagnostischen Gruppen unter-schieden, konnten durch MS-Analyse eindeutig zugeordnet werden (siehe Tab. 6.7 und6.8). Die Identifikationsnummern der Proteinspots wurden von Kapitel 6.4 beibehal-ten. Die molekulare Identität der Proteine wurde mit Hilfe eines tryptischen Verdaus

64 6. Ergebnisse

bestimmt. Das theoretisch berechnete Molekulargewicht der Kandidatenproteine istin Spalte 3 dargestellt.Von den 16 detektierten Proteinen konnten jeweils 9 identifiziert werden. Bei ande-

ren war eine eindeutige Zuordnung nicht möglich, da verschiedene Proteine in einemSpot vorhanden waren. Daher stammten auch die Variationen in den Ergebnissender beiden MS-Analysen. Da teilweise die Zuordnung nicht eindeutig war, wurde dastheoretische Molekulargewicht angegeben, das demjenigen des Proteins auf dem Gelentsprach. Bei den identifizierten Proteine handelte es sich um:

1. Vitronectin Vorläufer (Molekulargewicht = 54,27 kD)

2. Lipocalin-1 Vorläufer (Molekulargewicht = 19,24 kD)

3. Hemopexin Vorläufer (Molekulargewicht = 51,64 kD)

4. ApoH β-Glykoprotein 1 Vorläufer

5. Komplementfaktor C1S

6. Komplementfaktor 6 Vorläufer C6

7. CFH Isoform 1 des Komplementfaktors H

8. Serpin G1 Serin/Cystein Protease Inhibitor

9. Serpin G1 Plasma Protease C1 Inhibitor Vorläufer

Der Serin/Cystein Proteinase Inhibitor konnte in beiden Identifizierungsrunden,sowohl in Proteinspot 5 als auch in 7 identifiziert werden. Wie bereits die Untersu-chungen von Figueiredo-Pereira et al. 1999 zeigten, könnte das Protein eine wichtigeRolle bei der Entstehung der Amyloid-β Formen Aβ1-40 und Aβ1-42 spielen [24].

6.5. ESI-MS-Identifizierung der unterschiedlich exprimierten Proteine65

Tab

elle

6.7

–Ergebnissederersten

MS-Identifik

ationsrund

e.Die

angegebe

nen

theoretische

nMolekulargewichteentspreche

ndenau

sgestochenen

Proteinen

aufde

n2D

-Gelen

.Der

vonde

rSu

chmaschineMascotau

sgegeb

eneWertgibt

an,in

wieweitda

sgemessene

MS-Sp

ektrum

mitdem

theoretische

nüb

ereinstimmt.Pep

tide

:Anz

ahld

ertryp

tische

nPep

tide

,die

identifiz

iert

werde

nkonn

ten.

SA:S

equenzab

deckun

g

Spot-

Nam

eMolekular-

Mascot-

Pep

tide

SA

[%]

nummer

gewicht

Wert

1VTN

Vitronectin

precursor

54,27

291,9

611

,715

2LA

CRT

Extracellu

larglycop

rotein

lacritin

precursor

14,237

126,03

316

,67

2LY

ZLy

sozymeC

precursor

16,53

188,96

424

,32

2VTN

Vitronectin

precursor

54,27

264,65

610

,67

2LC

N1Lipo

calin

-1precursor

19,24

289,45

729

,55

3SE

RPIN

A3Isoform

1of

Alpha

-1-antichy

motrypsin

47,62

95,31

14,26

precursor

3VTN

Vitronectin

precursor

54,27

230,44

611

,09

4C4B

PB

Isoform

2of

C4b

-binding

proteinbe

tachain

28,27

94,81

210

,36

precursor

5SERPIN

G1Serine/cysteineproteinaseinhibitor

37,26

407,33

828

,83

clad

eG

mem

ber1splicevarian

t2(Fragm

ent)

5PRR4;PRH1;PRH2;PRB4Prolin

e-rich

protein4

15,12

84,58

110

,45

precursor

5Ly

sozymeC

precursor

16,53

71,73

18,11

6SE

RPIN

G1Serine/cysteineproteina

seinhibitor

37,26

340,7

923

,42

clad

eG

mem

ber1splicevarian

t2(Fragm

ent)

7SERPIN

G1Serine/cysteineproteinaseinhibitor

37,26

188,29

412

,91

clad

eG

mem

ber

1splice

varian

t2(Fragm

ent)

9HIN

T1Histidine

triadnu

cleotide-binding

protein1

13,79

83,3

211

,11

66 6. Ergebnisse

Tab

elle6.8

–Ergebnisse

derzw

eitenMS-Identifikationsrunde.D

erSE

RPIN

G1Plasm

aProtease

C1Inhibitor

undder

SERPIN

G1

Serin/Cystein

Proteinase

Inhibitorkonnten

ebenfallsin

einerzw

eitenMS-A

nalyseidentifiziert

werden.

Tabellenlegende

sieheTabelle

6.7.

Spot-

Nam

eMoleku

lar-Mascot-

Pep

tide

SA

[%]

nummer

gewicht

Wert

1A1B

GPutative

uncharacterizedprotein

35,2570,22

15,21

DKFZp686F

09701

C6Com

plement

component

6precursor

105,68115,96

33,29

1HPX

Hem

opexinprecursor

51,64594,82

1530,52

1CFH

Isoform1ofC

omplem

entfactor

Hprecursor

139,00208,16

55,20

1GC

vitamin

D-binding

proteinprecursor

52,8873,29

14,64

1APOH

Beta-2-glycoprotein

1precursor

38,27185,78

518,55

5SERPIN

G1Plasm

aprotease

C1inhibitor

55,12153,91

310,8

precu

rsor7

SERPIN

G1Serin

e/cysteineprotein

aseinhibitor

37,26282,14

416,82

cladeG

mem

ber

1splice

variant2(Fragm

ent)8

AMBP

proteinprecursor

38,97110,16

26,53

8C1S

Uncharacterized

proteinC1S

75,86132,46

24,84

9HPX

Hem

opexinprecursor

51,6479,66

13,25

7 Diskussion

7.1 Patientenauswahl und Diagnose

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer mehrstufigen Analyseme-thode, die geeignet sein sollte, vereinigte Blutplasmaproben von zwei diagnostischenGruppen, Patienten mit der Diagnose Alzheimer (AD) und Patienten mit Demen-zen anderer Genese (nAD), zu vergleichen. Zur Verfügung standen insgesamt sie-ben Plasmaproben von AD-Patienten und sieben Proben von nAD-Patienten mitLewy-Körperchen-Demenz, Fronto-temporal-Demenz, vaskulärer Demenz, Demenzbei Morbus Parkinson und mit Demenzen unklarer Genese (s. Tab. 4.4). Die Pro-ben stammten aus der Psychiatrischen und Psychotherapeutischen UniversitätsklinikErlangen, die Diagnosen waren aufgrund von klinischen Untersuchungen, Bildgebungund Liquordiagnostik gestellt worden.

Die Liquor-Parameter der verwendeten vierzehn Patientenproben wurden stati-stisch erfasst und dargestellt (siehe Kapitel 6.1). Aufgrund der geringen Fallzahl vonje sieben Patienten war kein signifikanter Unterschied (p<0,05), insbesondere nachBonferroni-Korrektur (α-Faktor= 0.01), beim Verhältnis Aβ1-42/1-40 und Phospho-Tau (= pTau) vorhanden. Diese beiden Parameter gelten seit 2004 als unterstützendeBiomarker im Liquor für die Diagnosestellung einer Alzheimer Demenz [64]. DieseLiquor-Parameter wurden von Lewczuk et al. als signifikanter Unterschied zwischenPatienten mit der Diagnose Alzheimer und nicht-dementer Kontrollgruppe berechnet.

In dieser Arbeit wurden explizit AD-Patienten mit Patienten anderer Demenzer-krankungen verglichen, die aufgrund ihres Krankheitszustandes im Vergleich zu Kon-trollpersonen ebenfalls veränderte Werte aufwiesen. So war das Verhältnis Aβ1-42/1-40 bei den AD-Patienten lediglich um ein Drittel niedriger als bei den nAD-Patienten.Dies befindet sich dennoch in guter Übereinstimmung mit der Literatur [64]. Auchdie pTau-Werte waren bei Alzheimer-Demenz-Patienten deutlich erhöht im Vergleichzu den nicht-Alzheimer-Patienten. Die ermittelten Werte für Aβ1-42 und Aβ1-40besitzen für sich alleine keine ausschließliche diagnostische Aussagekraft [122]. Be-züglich der Alters- und Geschlechtsverteilung ergab sich bei den Patientengruppenkein Unterschied.

Die nicht-Alzheimer-Patienten wiesen einen erhöhten pTau181-Wert im Liquorauf, sowie ein erniedrigten Aβ1-42/1-40-Verhältnis im Vergleich zur nicht-dementenKontrollgruppe [64]. Dies stimmt mit den bereits bekannten krankheitsspezifischenSchwankungen der Parameter überein [77, 87, 106].

68 7. Diskussion

7.2 Potentielle Kandidatenproteine mitKrankheitsbezug

Im Liquor sind bereits folgende Gruppen als potentiell geeignete Demenzbiomarkerbekannt: Isoprostane, Cytokine, Neurofilamente, Aβ-Oligomere und Enzyme [19]. ImBlutplasma zeigen Aβ-Peptide und Tau-Proteine zwar statistisch signifikante Unter-schiede, sind aber nicht in der diagnostischen Praxis anwendbar [67]. Daher wurde inder vorliegenden Arbeit ein innovatives Verfahren gewählt um potentiell neue Biomar-ker für Alzheimer Demenz zu finden, die für zukünftige Blutanalysen genutzt werdenkönnen. Für folgende, in dieser Arbeit entdeckten Biomarker-Proteine wurde bereitsein Zusammenhang zur Alzheimer Demenz, anderen Demenzerkrankungen oder zumAmyloidstoffwechsel veröffentlicht.

7.2.1 Prolin-reiches Protein-1

Galoyan et al. untersuchten den Effekt des hypothalamischen Prolin-reichen Peptids(PRP)-1 in einem Ratten-Modell der Alzheimer’schen Erkrankung. Das Prolin-reicheProtein-1 würde sich als potentielles Therapeutikum spezifisch für neurodegenerativeErkrankungen eignen, da Aβ25-35 zu signifikanten Veränderungen im Niveau undMuster der neuronalen Aktivität im Hippokampus führte. Geringe Gaben von PRP-1für 4 Wochen führte zu einer Wiederherstellung der elektrophysiologischen Parameter.Systemische Gaben von PRP-1 besitzten neuroprotektive Effekte und können die vomAβ25-35-Protein induzierte Neurodegeneration im Hippokampus unterdrücken [26].Dieses Protein konnte in der vorliegender Arbeit in einer Überprüfung der ESI-MS-

Ergebnisse nicht mehr bestätigt werden, wäre jedoch ebenfalls ein guter Biomarker-Kandidat.

7.2.2 Vitronectin Vorläufer

Vitronectin wurde mit der ESI-MS-Anwendung identifiziert. Das Protein war in AD-Patienten hochreguliert.Es ist bereits bekannt, dass das multifunktionale Protein Vitronectin Amyloidfibril-

len bildet und in Amyloid-Plaques abgelagert wird [102]. Diese Ablagerungen sind un-ter anderem bei Patienten mit Alzheimer Demenz zu finden [102]. Plasma-gereinigtesund rekombinantes Vitronectin bildet zudem sphärische Oligomere zu den typischenAmyloidfibrillen und ist für Neuroblastoma Zellkulturen toxisch [102]. Die Ergebnissevon Shin et al. zeigten die Tendenz von Vitronectin sich wie ein Amyloid Protein zuverhalten und bieten das Potential, dass Anhäufungen von fehlerhaft gefaltetem Vi-tronectin bei der Entstehung von initialen Amyloid-Ablagerungen eine Rolle spielenkönnten, wie bei vielen altersbedingten Krankheiten beobachtet wurde.Vitronectin weist teilweise ähnliche Eigenschaften wie Aβ1-42 auf, das ebenfalls in

Amyloid-Plaques abgelagert wird. Der Unterschied besteht darin, dass es im Liquorund im Plasma von AD-Patienten reduziert vorliegt [25, 67].

7.2. Potentielle Kandidatenproteine mit Krankheitsbezug 69

In einer früheren Studien wurde ein kleinerer (Molekulargewicht = 10 kD) Vitro-nectin-Vorläufer beschrieben der im Serum von Alzheimer Patienten erhöht vorlag[129].

7.2.3 Lipocalin Vorläufer

Die Transformation von Amyloidβ-(Aβ)-Peptiden in die Krankheitsform ist ein wich-tiger Schritt bei der Auslösung und beim Verlauf der Alzheimer’schen Erkrankung [53,81, 91]. Das bedeutende Aβ-Monomer-bindende Chaperon Prostaglandin D Synthase/-β-Spur ist vom Lipocalin-Typ. Mittels ESI-MS-Analyse konnte in dieser Arbeit dasLipocalin-1 identifiziert werden und lag in Alzheimer Patienten erhöht vor. Das Prote-in verhindert die Konformationsänderung von Aβ-Peptiden in die toxische, oligomereForm [58].

Die Prostaglandin D Synthase/β-Spur vom Lipocalin-Typ ist ein wichtiges Amyloidβ-Chaperon im Liquor [51]: Aβ wird unter normalen Bedingungen über den Liquor imGehirn verteilt. Es wird scheinbar sehr effektiv von einem nicht-identifizierten extra-zellulären Chaperon kontrolliert und aggregiert daher nicht. Die Möglichkeit besteht,dass die Lipocalin-typ Prostaglandin D Synthase (L-PGDS) Aβ-Fehlbildungen undAnsammlungen verhindern kann. Kanekiyo et al. zeigten, das L-PGDS/β-trace einekritische Rolle als endogenes Aβ-Chaperon spielt und dabei sowohl Aβ1-40 und Aβ1-42 Ansammlung in vitro und in vivo hemmt [51]. Diese Aktivität wurde sowohl beiAD-Patienten, als auch im AD-Model mit Tg2576-Mäusen nachgewiesen [51]. Mög-licherweise deutet die erhöhte Expression von Lipocalin-1 Vorläufer im Plasma vonAD-Patienten auf einen Schutzmechanismus hin, der während des Krankheitsverlaufsanspringt und den Umbau der Aβ-Peptide in die pathologische Form verhindert.

7.2.4 Hemopexin Vorläufer

Hemopexin war in dieser Arbeit im Plasma von AD-Patienten erhöht exprimiert.Mehrere Funktionen des Hemopexins wurden bereits beschrieben: Das Protein elimi-niert überschüssiges Eisen [78] und arbeitet als wichtiges Antioxidanz indem es toxi-sches Häm neutralisiert, das in Gehirnen von Alzheimer-Patienten erhöht ist [111].Zwei unabhängige Studien konnten es stark erhöht im Liquor von AD-Patienten nach-weisen [17, 97]. Castaño et al. fanden mit einer vergleichenden Proteomanalyse imLiquor heraus, dass sich Hemopexin im Liquor als potentieller Biomarker eignet [17]:Fünf unterschiedlich exprimierte Proteine mit möglichen Funktionen im Amyloid-βMetabolismus wie Hemopexin wurden identifiziert. Hemopexin lag im AD-Liquor er-höht vor. Es kann jedoch nicht als Biomarker für die Differentialdiagnose von ADund nicht-AD im Blut eingesetzt werden [97], da das Protein aus der Leber stammtund seine Konzentration im Plasma signifikant höher ist als im Liquor.

Yu et al. wendeten einen proteomischen Ansatz an, um eine potentielle, unter-schiedliche Expression von natürlichem und oxidierten Glykoproteinen aufzuklären.Sie verwendeten einen Ansatz aus Plasmaproben, bestehend aus zehn Patienten mitAlzheimer Demenz und Plasma Proben von neun älteren Kontrollpatienten. Unter

70 7. Diskussion

den neun Proteinspots von Glycoproteinen befand sich eine Isoform des menschlichenHemopexins. Diese Glycoproteine lagen nach einer sequentiellen Affinitätschromato-graphiefraktionierung in den AD-Plasma-Eluaten 6,5-fach konzentriert vor. Eine spe-zifische Oxidation deutete darauf hin, dass die identifizierten Hemopexin-Isoformen inAD-Plasma 2,8-fach erhöht waren im Vergleich zu den Kontrollen. Die Daten von Yuet al. zeigten, dass unter anderem Isoformen von Hemopexin als mögliche Biomarkerbei diesen Bedingungen in Frage kommen [127].

7.2.5 ApoH β-Glykoprotein 1 Vorläufer

Die Apolipoproteine ApoE4 und ApoJ sind Risikofaktoren oder vielmehr regulierendeFaktoren für AD. Das wurde in großangelegten genetischen Studien mit großen Pa-tientenpopulationen festgestellt [8, 38]. Das verwandte ApoH β-Glykoprotein wurdein dieser Arbeit im Plasma von AD-Patienten erhöht exprimiert.ApoH β-Glykoprotein korreliert positiv mit dem Cholesterinspiegel im Plasma, was

mit der Alzheimer-Pathologie im Zusammenhang steht [16, 39].

7.2.6 Komplementfaktoren

In dieser Arbeit wurden drei Faktoren des Komplementsystems identifziert: C1S, C6und H. Alle drei waren in Alzheimer-Patienten hochreguliert.Komplementfaktoren sind die Immunantwort unterstützende Proteasen. Durch Op-

sonisierung wird die Oberfläche von Antigenen vergrößert und deren Phagozytierungerleichtert. C1s ist als Protease direkt an einem Signaltransduktionsweg beteiligt [11].Da das Proenzym oder Zymogen des Faktors C6 identifiziert wurde, könnte der FaktorC6 möglicherweise bei AD-Patienten inaktiviert sein. Faktor H ist ein Negativregu-lator des Systems. Vermutlich stuften ihn Hye et al. aus diesem Grund als nichtgeeigneten Biomarker für Alzheimer ein, obwohl Faktor H in Alzheimer und nicht-Alzheimer-Patienten unterschiedlich reguliert ist [45]. Außerdem wird Vitronectin alsnegativer Faktor gehandelt.

Komplementsystem

Viele Studien haben bereits gezeigt, dass das Immun- und Komplementsystem sowiedie Bildung von spezifischen Antikörpern gegen Aβ-Peptide die zentralen Faktoren inder Entstehung und Verlauf der AD darstellen [10, 41, 79, 100, 103, 114]. Komplement-faktoren sind Proteasen, die die Immunantwort unterstützen, und sind zugleich in dieAutoimmunantwort eingebunden [10, 31].Das Komplementsystem ist ein wichtiger Bestandteil der natürlichen Immunität

und ist gleichzeitig an der Antikörper-vermittelten adaptiven Immunabwehr beteiligt.Die wichtigsten, biologischen Funktionen bestehen aus der Beteiligung beim Kampfgegen Infektionen, Entfernung von unerwünschten Fremdkörpern, wie apoptotischeund nekrotische Zellen, zusätzlich zur Führung der angelernten Immunität [70]. Das

7.2. Potentielle Kandidatenproteine mit Krankheitsbezug 71

Komplementsystem ist ein System von Plasmaproteinen, das im Zuge der Immun-antwort auf zahlreichen Oberflächen von Mikroorganismen aktiviert werden kann.Ursprünglich wurde es als ergänzender, komplementierender Teil der Antikörperant-wort entdeckt, doch ist heute bekannt, dass es auch am angeborenen Immunsystembeteiligt ist. Die mehr als 30 Proteine des menschlichen Komplementsystems sind imBlutplasma gelöst oder zellgebunden und dienen der Abwehr von Mikroorganismen,haben jedoch auch stark zellzerstörende Eigenschaften und können, wenn sie unre-guliert wirken, im Verlauf vieler Krankheiten für Gewebeschäden verantwortlich sein[105].

Die Amyloid-Ablagerungen im Gehirn von Alzheimer Patienten sind mit den ent-zündungsauslösenden Komplementfaktoren assoziiert [117]. Die örtliche Entzündungund die Komplement-Bereitschaft kann im menschlichen AD-Gehirn bereits in frühenFormen der AD nachgewiesen werden, bevor sich die Mikroglia zusammenlagern unddie Neurodegeneration einsetzt.

Zu den verschiedenen Liganden der Komplementsystemerkennung des MolekülsC1q gehören auch Aβ-Peptide. Sie binden am C1q und am C4-bindenden Protein[108]. Fehlfunktionen des Komplementsystems könnten sich demnach auch auf ADauswirken.

7.2.7 C4-bindendes Protein (C4bP)

Da das C4-bindende Protein zum Komplementsytem gehört, ist keine strikte Abgren-zung zu Kapitel 7.2.6 möglich.

Die Immun-Hypothese von Fiala et al. besagt, dass eine mangelhafte natürlicheImmunreaktion von Aβ bei Makrophagen bei AD Patienten vorliegt [23, 41]. DieseThese wird von neuen Ergebnissen aus AD-Gehirnsektionenen gestützt: In diesenStudien wurden Monozyten entdeckt, die in Neurone eindringen und Aβ-Oligomerephagozytieren. Allerdings sind Monozyten bei AD nicht in der Lage Aβ abzubauen,sie machen Apoptose in der Gefäßwand und schütten Aβ-Oligomere in die Gefäße,was eine congophile amyloide Angiopathie mitverursacht [6, 128].In vitro bindet das C4b-Protein Amyloid-Ablagerungen zusätzlich zu apoptoti-

schen und nekrotischen Zellen, aber nicht lebensfähige Gehirnzellen, und begrenztdie Komplement-Aktivierung in toten Neuronen. Das C4b-Protein hemmt die Kom-plementaktivierung in dem es direkt an das Aβ1-42 bindet. Außerdem wurde dasC4bP ex-vivo in AD Gehirnen detektiert [105, 115].

Hye et al. stellten die Frage, ob Patienten bei einem höheren Risiko der Alzhei-mer Demenz einen Vorteil von einer frühen Behandlung haben. In der Regel habensie einen Vorteil, nur das Ausmaß ist unklar. Behandelt man Patienten mit einerfrühen Alzheimer Demenz, die zwar ein neurochemisches Alzheimer-Risikoprofil be-sitzen aber klinisch noch keine eindeutige Symptomatik besteht, wird eine Verbesse-rung in Kognition und globaler Mentalfunktion erreicht. In einigen Fällen könnte einFunktionsverlust hinausgezögert werden. Werden MCI-Patienten mit Cholinesterase-Inhibitoren behandelt, ergibt sich eine Verzögerung des Krankheitsverlaufs gegenübereiner Nicht-Behandlung. Werden die anticholinergischen Medikamente abgesetzt, mi-

72 7. Diskussion

nimieren sich die Nebenwirkungen, die Ausprägung der Alzheimer Demenz ist jedochnicht aufzuhalten [44].

7.2.8 Serpin G1

Bereits vor 20 Jahren war bekannt, dass Serin- und Cystein-Proteasen bei der Pa-thologie von AD eine Rolle spielen [24]. Beide Proteasen gehören zu der Klasse derγ-Sekretasen und sind dafür verantwortlich aus dem Amyloid-Vorläuferprotein dieFragmente Aβ1-40 und Aβ1-42 abzuspalten.Ein Hemmstoff dieser Proteasen wäre ein geeignetes Therapeutikum, um die Alzhei-

mer Demenz aufzuhalten. Wäre die Sekretaseaktivität gehemmt, entstünden wenigerAβ-Fragmente und damit weniger Amyloid-Plaques.In dieser Arbeit wurden sowohl der Serpin G1 Serin/Cystein Protease Inhibitor,

als auch der Serpin G1 Plasma Protease C1 Inhibitor Vorläufer identifiziert. BeideInhibitoren lagen in Alzheimer Patienten erniedrigt vor. Dies steht in Übereinstim-mung zu den erhöhten Komplementfaktoren, da die Inhibitoren die Aktivität undReduktion der Proteasen kontrollieren [18, 32, 80].

Neuroserpin

Neuroserpin ist ein Serin-Protease-Inhibitor der Serpin Familie und wurde ursprüng-lich als ein von Axonen gebildetes Glykoprotein in neuronalen Kulturen von Hühnernin Dorsal-Wurzel-Ganglien identifiziert [57].Die Analyse von endogenen Plasminogen-Aktivator-Inhibitoren von Fabbro et al.

zeigte, dass während die Niveaus der Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 und derProtease Nexin-1 unverändert blieben, war das Neuroserpin Niveau im Gehirn vonAlzheimer-Patienten signifikant erhöht. Darüber hinaus wurde eine erhöhte Mengevon einem gewebespezifischen Plasminogen-Aktivator-Neuroserpin-Komplex in Ge-hirnen von AD-Patienten festgestellt. Immunhistochemische Studien zeigten, dassPlasminogen Aktivator und Neuroserpin mit Amyloid-β-Plaques in Alzheimer-Gehirn-gewebe assoziiert waren. Daher führt eine Neuroserpin-Hemmung der Gewebe-Plasmi-nogen-Aktivator-Aktivität vermutlich zu reduziertem Plasmin und könnte verant-wortlich sein für eine geringere Entfernung von Amyloid-β im Gehirn von Alzheimer-Patienten. Darüber hinaus könnte eine sinkende Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Akti-vität im Gehirn von AD-Patienten einen direkten Einfluss auf die synaptische Akti-vitat und die gestörte kognitive Funktion haben [22].

7.2.9 Perspektive der Biomarker-Identifizierung undValidierung

Interessanterweise wurden vier der in dieser Arbeit vorgestellten unterschiedlich ex-primierten Proteine von Perrin et al. in einem ähnlichen proteomischen Ansatz imLiquor von AD-Patienten identifiziert und verifiziert: die Proteine Serpin, Vitronec-

7.3. Methodische Diskussion 73

tin, ApoH und Lipocalin (Poster von Perrin et al., Chicago 2009 [89]). Dieses Ergebnislässt auf eine erfolgreiche Verifizierung der Proteindaten dieser Arbeit hoffen.

7.3 Methodische Diskussion

Das Ziel der Arbeit war eine mehrstufige Analysemethode zu entwickeln und sie ineinem ersten Experiment anzuwenden, um potentielle Biomarker zu identifizieren, diedie Differentialdiagnostik von AD und nicht-AD unterstützen können.

Als Abreicherungsschritt wurde eine Affinitätschromatographie gewählt mit dereine Möglichkeit geschaffen wurde, eine ausreichende Menge an niedrigkonzentriertenBlutproteinen für ein Analyseverfahren zu gewinnen. Diese Feststellung wurde bereits2008 von Quian et al. sowie von Schlautman et al. und 2009 von Pernemalm publiziert[88, 93, 99]. Bei der Abreicherung kann man Verluste von an prominenten Proteinenassoziierte niedrigkonzentrierte Proteine aber nicht ganz ausschließen.

Als weitere Fraktionierungsschritte vor der 2D-Auftrennung wurden Anionenaus-tausch- und Umkehrphasenchromatographie mit optimierten 3-Stufen-Elutionen ein-gesetzt. Eine geeignete Trennleistung wurde durch Variation der Puffer- bzw. Lösungs-mittel-Stufen erreicht, was mit den jeweiligen Quantifizierungen gezeigt wurde (s.Abb. 6.5 und Tab. 6.4). In ähnlicher Weise haben bereits 2008 Tribl et al. eine pro-teomische Trennung durchgeführt [113].

Die Anwendung der DIGE-Technik, d.h. die Nutzung der Fluoreszenzfarbstoffeerleichtere den Vergleich der beiden diagnostischen Gruppen [71, 112]. Der Einsatzder 2-Stufen-Bis-Tris-Methode verbesserte zudem die Trennstärke der großen (25,5 x20,5 cm) 2D-Gele.

Nach erfolgreicher Etablierung eines mehrstufigen Verfahrens wurden schließlichzwei Probenmischungen einer vergleichenden Analyse unterzogen. Insgesamt 16 Pro-teinspots konnten identifiziert werden, die sich in ihren Mengen deutlich zwischen denbeiden zu vergleichenden Proben unterschieden. Zwei davon konnten in einem Wie-derholungsexperiment bestätigt werden. Mittels ESI-MS-Analyse und anschließenderLiteraturrecherche könnten neun identifizierte potentieller Biomarker zudem für dieAlzheimer Demenz kranksheitsrelevant sein [4, 69].

7.3.1 Abreicherung von hochkonzentrierten Proteinen

Die zehn prominentesten Proteine im menschlichen Plasma repräsentieren ungefähr90% des gesamten Proteinvorkommens und die 22 prominentesten Proteine verein-nahmen zusammen sogar 99% [50, 110]. Durch Abreicherung mehrerer dieser Pro-teine wurde das Augenmerk der Analyse auf die potentiell interessanteren, niedrig-konzentrierten Proteinen fokussiert. Das Verfahren wird als Abreicherung bezeichnet,da eine vollständige hundertprozentige Entfernung nicht gewährleistet werden kann.

Um die zwölf häufigsten Plasmaproteine abzureichern, wurde in dieser Arbeit ei-ne Immunoaffinitätschromatographie mit einer IgY 12LC10-Säule durchgeführt. Die

74 7. Diskussion

Überprüfung durch 1D-Gelelektrophorese zeigte deutlich, dass auf diese Weise nied-rigkonzentrierte Proteine sichtbar und damit detektiertbar wurden, die sonst vonhochkonzentrierten Proteinen auf dem Gel überdeckt waren (s. Abb. 6.1, B). Folgen-de wissenschaftliche Arbeitsgruppen nutzten bereits die IgY-Entfernung von hoch-konzentrierten Proteinen im Plasma: Martosella [72], Pernemalm [88], Quian [93],Stempfer [107] und Schlautman et al. [99].Die Entfernung von hochkonzentrierten Proteinen stellt jedoch ein potentielles

Risiko dar: Durch diese Vorbehandlung gehen andere möglicherweise interessanteProteine und Peptide verloren, die beispielsweise an Albumin oder Immunglobuli-ne G gebunden sind [126]. Wurden die hochkonzentrierten Proteine vor der Analy-se mit 2D-DIGE und LC-MS-MS nicht entfernt, so wurde wie von Hye et al. ge-zeigt, eine erheblich schlechtere Auftrennung erreicht und damit war nur eine sehreingeschränkte Proteindetektion von niedrigkonzentrierten Proteinen möglich [45].Echan et al. verglichen unterschiedliche Abreicherungstechniken und untersuchtendiese nach möglichst effektiver Abtrennung von der niedrigkonzentrierten Fraktion[21]. Die Affinitätschromatographie stellte im Vergleich die effektivste Methode dar.An anderer Stelle konnte gezeigt werden, dass ein Abreicherungsprozess wichtig undnotwendig für den Erfolg sein kann. So erhöhte eine Abreicherung die Menge anidentifizierbaren Proteinen im Urin um das 2,5-fache [59].Ein weiteres Argument für die Abreicherung war die begrenzte Ladungskapazität

der 2D-Gele bzw. des IEF-Streifens. Wurde eine Abreicherung durchgeführt, kann einegrößere Menge der sonst schwer zugänglichen niedrigkonzentrierten Proteinen unter-sucht werden. Aufgrund des großen dynamischen Bereichs der Proteinkonzentrationim Plasma ist die Kapazität der Methode 2D-DIGE und von Flüssigkeitschromatogra-phie-gekoppelten MS-Systemen ohne vorherige Abreicherung nicht ausreichend, umdas Proteom der niedrigkonzentrierten Proteine darzustellen [43].

7.3.2 Flüssigkeitschromatographie

Eine Strategie bei der Methodenentwicklung bestand in der Einführung von zwei auf-einanderfolgenden Flüssigkeitschromatographien, ähnlich wie bei Tribl et al. [113].Humane Plasmaproteine wurden vorfraktioniert um die Gesamtmenge der niedrig-konzentrierten Proteine für anschließende 2D-Gelanalysen zu erhöhen. Die Kombina-tion von Anionenaustausch- und Umkehrphasenchromatographie wurden bereits infrüheren Ansätzen verwendet, um den Zugang zu den niedrigkonzentrierten Proteinenzu erleichtern [71, 74, 75].Nach der Anionenaustausch-Chromatographie war eine weitere Separation notwen-

dig, da innerhalb der Fraktionen Bereiche zu sehen waren, die Überlagerungen vonProteinen darstellten (siehe weiße Protein-Punkte in Abb. 6.7). Das machte die zu-sätzliche Anwendung einer Umkehrphasenchromatographie notwendig.Mitulovic et al. postulierten, dass eine begrenzte Trennkapazität von 2D-Gelen

durch die Anwendung einer vorgeschalteten multidimensionalen Flüssigkeitschroma-tographie bestehend aus Ionenaustausch- und Umkehrphasenchromatographie ver-bessert werden kann [75]. Martosella et al. konnten im Jahr 2006 zeigen, dass eine

7.3. Methodische Diskussion 75

RPC-Vorfraktionierung die MS-Identifizierung von niedrigkonzentrierten Proteinenverbesserte und den Zugang zu ihnen erleichterte [72].

7.3.3 2D-Gelelektrophorese

Die in dieser Arbeit verwendete zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophoresestellte eine geeignete Trennmethode dar [29]. Ein großer Nachteil bestand in der ar-beitsintensiven Durchführung. Dabei wirken sich potentielle Fehler direkt auf dasErgebnis aus [120]. Um eine zuverlässige Auswertung gewährleisten zu können wurdedie 2D-Elektrophorese nach einem standardisierten Protokoll durchgeführt. Das galtfür die Gele ebenso wie für die Auswertung. Trotzdem konnten auch hierbei Fehlerauftreten. Zum Beispiel kamen horizontale Steifen auf den 2D-Gelen durch mangel-hafte Fokussierung von Proteinen zustande. Vermutlich lösten sich die Proteine nichtvollständig im verwendeten IEF-Puffer.

Der pH-Bereich von 3-10 während der zweiten Dimension wurde bewusst gewählt,um die Trennstärke des Gels möglichst gut auszunutzen. Die 2D-Gelelektrophoresekonnte trotz eines hohen Auflösungsvermögens nur einen Ausschnitt der Plasma-Proteine darstellen. Aufgrund der Komplexität des Proteingemisches ist es entgegender Theorie realistischerweise nicht möglich, das vollständige Plasmaproteom aufzu-trennen [120].

Langen et al. untersuchten bereits 1997 verschiedene Konzentrationsbereiche der2D-Gelelektrophorese [62]. Die Verwendung einen Stufengels erhöhte die Trennkapa-zität eines 2D-Gels und war damit für die Auftrennung von großen Proteinen undkleinen Peptiden auf einem 2D-Gel für die Anwendung in dieser Arbeit sehr gutgeeignet.

Die Ausbeute nach In-Gel-Verdau der ausgestochenen Proteine aus dem 2D-Gelist niedriger als bei gelfreien Methoden mit Flüssigkeitschromatographien [113]. Dasführte zu einer limitierenden Sensitivität der Massenspektrometrie. In der vorlie-genden Arbeit konnten einige detektierte Proteine beispielsweise auf Gel 3a (sieheAbb. 6.13) aufgrund der zu geringen Konzentration nicht identifiziert werden.

Weitere Nachteile der 2D-Gelelektrophorese bestehen darin, dass kleine, sehr große,sehr basische und sehr hydrophobe Proteine von der Analyse teilweise ausgeschlossensind [74, 120]. Wie in Kapitel 7.3.2 bereits angesprochen, wurde die eingeschränk-te Trennkapazität mit einer multidimensionalen Flüssigkeitschromatographie verbes-sert. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit die begrenzte maximale Ladungskapazitäteines IEF-Streifens von 500µg umgangen, indem die vorfraktionierte Gesamtprotein-menge gleichmäßig auf neun 2D-Gele verteilt und parallel analysiert wurde.

Im Gegensatz zur Proteinkonzentration erfolgte die Verteilung der potentiellenBiomarker-Proteine nicht gleichmäßig, sondern zufällig. Daher konnten auf den Gelen1b, 1c, 3b, 3b (siehe Abb. 6.13) keine unterschiedlich exprimierten Proteine detektiertwerden.

76 7. Diskussion

7.3.4 Mehrstufige Analysemethode

Multidimensionale Proteomanalysen sind geeignete Methoden um den aktuellen Zu-stand des Metabolismus beispielsweise des Plasmas darzustellen [118]. Das Proteomunterliegt ständigen Veränderungen des Stoffwechsels und ist stark von anderen Pa-rametern abhängig. Aber nicht alle genetisch kodierten Proteine sind zu jedem gege-benen Zeitpunkt exprimiert. Somit besitzt auch die multidimensionale Analyse desPlasmaproteoms einige Einschränkungen: Viele Proteine sind in geringen Kopien vor-handen und liegen daher unter der Nachweisgrenze vor [120]. Eine Anzahl von Protei-nen wird beispielsweise während oder nach der Translation unterschiedlich modifiziertoder befindet sich außerhalb des Auflösungsbereiches der 2D-Gelelektrophorese.Das Verfahren der mehrstufigen Analysemethode scheint auf den ersten Blick sehr

kompliziert und aufwendig zu sein. Einige bekannte Methoden, wie das Bicin-Tris-Gelystem oder die Affinitätschromatographie wurden bewusst eingesetzt und kom-biniert, um Proteine sichtbar zu machen, die unter anderen Gegebenheiten nichtdetektierbar gewesen wären. Auf der anderen Seite mussten eventuelle größere Pro-teinverluste oder unspezifische Modifikationen in Kauf genommen werden.Andere Screening-Methoden nutzen verstärkt die Massenspektrometrie um mög-

lichst viele Proteine zu identifizieren [7, 12, 27, 104, 113]. In diesem Projekt wurdedie Auswahl an möglichen Biomarkern während des längeren Separationsverfahrensstark eingeschränkt, ohne von vornherein Proteine auszuschließen (wie z.B. auch beiTribl et al. 2008) [113]. Ein derartiger, hypothesenfreier Ansatz diente hier zur un-eingeschränkten Detektion und Identifizierung weiterer potentieller Biomarker.

7.3.5 Auswertung der 2D-DIGE-Gele

Für die Auswertung der digitalisierten Gelbilder wurde das Bildauswertungspro-gramm DeCyder Version 6.5 eingesetzt. Die Proteinspotdetektion, -zuordnung und-quantifizierung verlief weitgehend automatisch [52]. Dabei wurden je sieben Geleje RPC-Fraktion miteinander verglichen und stets die Richtigkeit der Zuordnungdurch manuelle Nachbearbeitung überprüft. Somit stellten kleinere Unterschiede inder Laufdauer bzw. -länge der 2D-Gele kein Problem für eine reproduzierbare Zuord-nung und Auswertung dar. Diese Unterschiede waren entstanden, da neun Gele einesExperiments gleichzeitig in einer Gelapparatur elektrophoretisch aufgetrennt wurdenund sich die Dauer nach der schnellsten Lauffront gerichtet hatte. Eine möglichefalsche automatische Spotdetektion wurde mit geeigneten Parametern eines digitalenProteinfilters verhindert (s. Abb. 5.1).Eine weitere Sicherheitsmaßnahme war die Verwendung eines internen Standards

[1]. Dieser setzte sich aus kleinen Mengen jeder Patienten-Probe des gesamten Expe-riments zusammen, also aus Mischungen von AD- und nAD-Plasma. Zu Beginn derExperimente wurde ein entsprechender Vorrat der Cy2-markierten internen Standard-Gruppe hergestellt, der für sieben Experimente ausreichte. Bei der Auswertung wurdeeine quantitative Variabilität durch den Bezug auf den internen Standard algorith-misch von DeCyder ausgeglichen. Die biologische Variabiliät wurde zudem durch

7.4. Schlussfolgerung 77

sieben Experimentwiederholungen gemittelt und weitgehend minimiert.Nach dem dritten Versuchsdurchlauf wurde ein Austausch der Fluoreszenzfarb-

stoffe vorgenommen. Diese Prozedur war wichtig, um molekulare Unterschiede derCy-Farbstoffe aufzuheben, die potentiell eine unterschiedlich starke Affinität zu AD-Plasma gegenüber nAD-Plasma aufweisen könnten.

Auf einem 20,5 x 25,5 cm großen 2D-Gel konnten mit dem DeCyder-Programm2.500-3.000 Proteinspots detektiert werden. Nach strikteren Detektions- und Aus-schlusskriterien reduzierte sich die Zahl auf ca. 200-500. Mit Hilfe des DeCyder-Programms wurden 16 Proteine nach der Methode von Karp et al. detektiert, diemindestens um den Faktor zwei in Alzheimer Patienten unterschiedlich exprimiertwaren [52]. Dieser Unterschied um den Faktor 2,0 minimierte die Detektion von mög-lichen falsch-positiven Proteinspots.

7.3.6 MS-Analyse

In zwei separaten ESI-MS-Analysen wurden jeweils 10 und 12 der insgesamt 16 detek-tierten, differentiellen Proteinspots massenspektrometrisch identifiziert, was zu einerIdentifizierungsrate von 56% führte. Die Identifizierung der Proteine, die als poten-tielle Biomarker in Frage kommen, erfolgte durch Auswertung der Peptidmassen undDatenbankvergleich der ESI-MS-Peptidmassen, nach Rappsilber et al., Anderson etal., Marcus et al. und Müller et al. [4, 69, 76, 95].

Ein Problem der MS-Anayltik bestand darin, dass einige Proteine, aufgrund vonnahezu identischen pI-Werten und Molekulargewichten komigiert waren. Es war kei-ne eindeutige Identifizierung möglich, daher wurden sämtliche Proteine eines Spotsausgewertet. Es galt in erster Linie zu beweisen, dass die neue entwickelte mulitdimen-sionale Analysemethode in der Lage war, potentielle Marker zu detektieren. Es solltenweitere Identifizierungen mit Hilfe der Massenspektrometrie erfolgen, um zusätzlicheBiomarkerkandidaten zu identifizieren, da erfahrungsgemäß nicht alle der bisher ent-deckten Kandidaten auch die weiteren Testserien mit großen Pateintengruppen undmultiplexen immunologischen Diagnoseverfahren erfolgreich bestehen werden [66].

Die Untersuchung des Plasmas ist ein Beispiel für die breite Anwendbarkeit derProteomanalyse, obwohl die weite Konzentration der Plasmaproteine über fünf Grö-ßenordnungen hinweg eine prominente Herausforderung darstellt.

7.4 Schlussfolgerung

Stand in den Jahren der Proteomik-Euphorie immer das Problem der Reproduzier-barkeit mit unterschiedlichen Ansätzen im Raum, konnten in der vorliegenden Arbeitdie Proteinspots in sieben Experimentwiederholungen mit einer großen Prozentzahlvon 71-89% reproduziert und detektiert werden.

Irizarry et al. sind sogar der Ansicht, dass nur allgemeine und hypothesenfreieproteomische Versuchsansätze wie in der vorliegenden Arbeit angewendet, die Chancehaben, Krankheitsbiomarker für Alzheimer zu finden [49].

78 7. Diskussion

Anhand der identifizierten, in AD- und nicht-AD-Patienten unterschiedlich regu-lierten Proteine und den daraus abgeleiteten Kandidatenproteinen konnte gezeigtwerden, dass das in dieser Arbeit etablierte System zur Durchführung einer differen-tiellen Proteomanalyse für die Alzheimer Diagnose potentiell erfolgreich eingesetztwerden kann, auch wenn sich nur ein Teil der entdeckten Blut Biomarker Proteine inklinischen Studien verifizieren lassen.

7.5 Ausblick

Bemerkenswert ist die Tatsache, dass mit der hypothesenfreien Herangehensweisedas Problem der Biomarkeridentifizierung ebenso erfolgversprechend zu lösen ist, wiedurch herkömmliche Ansätze. Es wurden bereits charakterisierte, krankheitsrelevanteProteine erfolgreich identifiziert.Aufgrund der Analyse von Plasmagemischen mehrerer Patienten kann nicht der

Umkehrschluss gezogen werden, dass die unterschiedliche Expression der Proteinein allen Patienten mit der Diagnose Alzheimer gleichermaßen vorlag. Daher ist eineMessung von einzelnen Patientenproben unabdingbar für die Validierung der Daten.Die in der Diskussion besprochenen Kandiatenproteine mit Krankheitsbezug sollenin weiteren Versuchsreihen an großen Patientenblutkollektiven eingehend untersuchtwerden. Die Expressionsdaten der Kandidatenproteine werden in Kürze mit unabhän-gigen Methoden, zum Beispiel ELISA-Tests, verifiziert. Hierfür müssen entsprechendeAntikörper zur Verfügung stehen oder eigens dafür hergestellt werden. Da die meistenProteine bereits beschrieben wurden, wird ein schneller Bezug von entsprechendenAntikörpern erwartet.Der Serin/Cystein Proteinase Inhibitor oder ein anderer der neun Kandidaten könn-

te idealerweise in der Zukunft für die Entwicklung eines Blut-Tests eingesetzt werdenund somit die Differentialdiagnostik für Alzheimer Demenz unterstützen.Die in dieser Arbeit entwickelte multidimensionale Proteom-Analysemethode ist

nicht auf die Diagnostik der Alzheimer’schen Erkrankung beschränkt, sondern auchfür andere Gehirn- und Stoffwechsel-Erkrankungen einsetzbar. Damit stellt sie einenin ihrer Tragweite noch nicht vollständig voraussehbaren Durchbruch in der blutba-sierten Diagnostik gegenwärtig noch schwer bestimmbarer Krankheiten dar.

79

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93

Abkürzungen

1D Eindimensional2D ZweidimensionalA AmpereAbb. AbbildungAD Alzheimer DemenzALDES Alzheimer-Diagnose-Experten-SystemAPS AmmoniumperoxodisulfatBSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)◦C Grad Celciusca. circaCHAPS 3-[N-(Cholamidopropyl)-dimethyl-ammonio]-1-propansulfatCSF Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (Liquor Cerebrospinalis)Cy CyaninCy2 3-(4-carboxymethyl)phenylmethyl)-3’-ethylox-acarbocyanine

halide N-hydroxysuccinimidyl EsterCy3 1-(5-carboxypentyl)-1’-propylindo-carbocyanine halide

N-hydroxysuccinimidyl EsterCy5 1-(5-carboxypentyl)-1’-methylindodi-carbocyanine halide

N-hydroxysuccinimidyl EsterCy-Dye Cyanin-FluoreszenzfarbstoffDIGE Differentielle Gelelektrophorese

(differences in gel electrophoresis)DMF N,N-DimethylformamidDOC Desoxycholsäure-NatriumsalzDTT DithiothreitolEDTA EthylendiamintetraessigsäureELISA Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest

(Enzyme-linked Immunadsorpent Assay)et al. und andere (et alii)g GravitationsbeschleunigungHPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

(high performance liquid chromatography)ICD-10 Internationale Klassifikation der Krankheiten

(International classification of diseases)IEF Isoelektrische FokussierungIgA Immunglobulin A

94 Literaturverzeichnis

IgG Immunglobulin GIgM Immunglobulin Mk.A. keine AngabeKap. KapitelkD kilo Dalton, MasseeinheitKonz. KonzentrationL LiterLB Markierungspuffer (labeling buffer)M mol/LmAU milli Absorptionseinheiten (milli absorption units)MCI leichte kognitive Störungen (Mild-Cognitive Impairment)min Minutenmind. mindestensµm MirkrometerMRT/CT magnetische Resonanz-ComputertomographieMS MassenspektrometrieMW MolekulargewichtN NormalNaCl NatriumchloridNa2S2O3 Natriumthiosulfat-PentahydratnAD keine-Alzheimer Demenz (non-Alzheimer Demenz)PAGE Polyacrylamidgel ElektrophoresePMT Photovervielfacherröhre (photomultiplier tube)pI isoelektrischer Punktrcf relative Zentrifugenbeschleunigung (relative centrifugation force)rE relative EinheitenRPC Umkehrphasenchromatographie

(reversed-phase chromatography)rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)RT Raumtemperaturs. sieheSA SequenzabdeckungStd. StundenSDS Natriumdodecylsulfat (sodiumdodecylsulfate)Stabw. StandardabweichungSPECT Einzelphoton-Emissions-Computertomographie

(single photon emission computed tomography)Tab. TabelleTCA TrichloressigsäureTEMED N,N,N´,N´-TetramethylethylenediaminTFA TrifluoressigsäureTris Tris-(hydroxymethyl-)aminomethanV Volt

Literaturverzeichnis 95

vgl. vergleicheVP Verdaupufferv/v Volumen pro VolumenW Wattw/v Gewicht pro Volumenz. B. zum Beispiel

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Danksagung

Zuallererst möchte ich Prof. Jens Wiltfang für die sehr herausfordernde und sehr span-nende Themenstellung danken, sowie sein Vertrauen in mich das komplexe Themader Proteomik erfolgreich zu bewältigen.

Prof. Cord-Michael Becker gilt mein besonderer Dank für die Übernahme der Erst-betreuung und die Erstbegutachtung. Vielen Dank für die Unterstützung bei derWiedergewinnung meines Arbeitsplatzes.

Prof. Johannes Kornhuber möchte ich für die Verwendung der Erlanger Patienten-proben bedanken und für die Kooperation, so dass ich die Arbeit in den Büroräumender Klinik fertigschreiben konnte.

Vielen Dank Prof. Andreas Burkovski für die Übernahme des Zweitgutachtens.Meinem Laborbetreuer PD Dr. Andreas Henkel möchte ich für die sehr schöne

und freundschaftliche Zusammenarbeit in der Molekularen Neurobiologie danken. Fürdie Anleitung, Tipps, Ideen und v.a. vielen Diskussionen rund um die Proteomik.Besonders für die grenzenlose Untersützung ein herzliches Dankeschön!

Bei meinen netten Kolleginnen und Kollegen der Arbeitsgruppe Wiltfang möchteich mich für die lustige und lockere Arbeitsatmosphäre bedanken, zudem Dr. HansKlafki für die konstruktive Kritik und Anmerkungen zur Arbeit. Danke an Sabine,Heinke, Heike, Hermann, Philipp und Timo.

Allen Mitarbeitern der AG Kornhuber vielen Dank für die kollegiale Hilfsbereit-schaft und organisatorische Untersützung in den letzten Monaten meiner Laborarbeit.Vielen Dank an die Mitarbeiter der Molekularen Bildgebung für die netten, gemein-samen Mittagessen.

Ein herzliches Dankeschön den „Ärztefreunden”: Bernd, Andrea, Marc, Christinaund meiner Leidensgenossin Steffi. Allen Doktoranden, Mitarbeitern und Freunden,die mir ab und zu ein offenes Ohr liehen, mich unterstützt und mir Mut zugesprochenhaben, ein großes Dankeschön.

Für die Hilfe bei der Einarbeitung in LATEXvielen, lieben Dank meinem BruderMatthias und besonders Lothar. Auch Markus, Oliver und Timo (tolles LATEX-Buch!)vielen Dank für die nützlichen Tipps!

Meinen Freundinnen Sonja und Angelika lieben Dank für die vielen Gespräche unddie Unterstützung während des chaotischen letzten Sommers!

Allen Großeltern die ständig zur Verfügung standen um auf ihr Enkelkind aufzu-passen, bei Dienstreisen, Krankheit und längeren Arbeitsphasen tausend Mal Danke-schön! Ohne Eure permanente Untersützung wäre diese Arbeit zeitlich nicht machbargewesen!!! Ich Glückspilz habe wirklich die besten Eltern auf der ganzen Welt!