Enzimi Za Kloniranje

GMGM20052005

Kolegij Genetičko inženjerstvo

Program

enzimi, vektori, domaćini dobivanje, modifikacija, obilježavanje DNAstrategije kloniranja proizvodnja rekombinantnih proteinagenske knjižnice mutageneza inaktivacija gena

transgenične životinje i biljke, GMO kloniranje čitavih organizamagenetičko inženjerstvo u biotehnološkoj proizvodnji bioterapeutikatransgenska tehnologija u funkcijskoj genomici

GMGM20052005


Literatura

G. Maravić. CD s predavanjima.Desmond S. T. Nicholl, An introduction to genetic engineering, 2nd ed., Cambridge Univeristy Press, 2003. ISBN: 0-521-00471-3. (Algoritam – 220 kn)S. B. Primrose, R. M. Twyman, R. W. Old, Principles of gene manipulation, 6th ed., Blackwell Science, ISBN: 0-632-05954-0.(Algoritam - 360 kn)

GMGM20052005


Enzimi za molekularno kloniranjedoc. dr. sc. Gordana Maravić

Zavod za biokemiju i molekularnu biologijuFarmaceutsko-biokemijskog fakulteta

GMGM20052005

Genetičko inženjerstvoje poznato i kao

tehnologija

koja uključuje

kidanje, mijenjanje i združivanje

molekula DNA

pomoću

enzima

kao što su

Restrikcijske endonukleaze

DNA ligaza

jest zahtijeva četiri osnovna koraka

stvaranje fragmenata DNA

združivanje s molekulom

nosačem (vektor)

• kloniranje gena• tehnologija

rekombinantne DNA• molekularno kloniranje

primjenjuje se u

znanosti

biotehnologiji

medicini i farmaciji

proizašlo je iz

mikrobne i molekularne

genetike

1972. na sveučilištu Stanford

pravna i etička pitanja

ali postavlja i neka

prvi je put ostvareno

može se koristiti za

koristi se za

unošenje u stanicu domaćina

odabir željenog slijeda

GMGM20052005

Razvoj genetičkog inženjerstva

MENDELOVA ILI KLASIČNA GENETIKA 1958.1962.1965.1968.1969.1975.1978.1980.1993.

1900

1910

1920

1930

1940

1950

1960

1970

1980

1990

2000

Genetičko Mapiranje

Transformacija

MIKROBNA GENETIKA

Molekularna genetika

GENSKA MANIPULACIJA

Razvoj tehnika

Primjene

GMGM20052005

Temeljna otkrića – Nobelove nagrade

1958. J. Lederberg, G. W. Beadle, E. Tatum genska rekombinacija u bakerija, djelovanje gena

1962. F. H. C. Crick, J. D. Watson, M. H. F. Wilkins3D struktura DNA

1965. F. Jacob, A. M. Lwoff, J. L. Monodoperonska teorija za gensku ekspresiju u bakterija

1968. H. G. Khorana, R. W. Holleyotkriće genetičkog koda i njegova uloga u sintezi proteina

1969. M. Delbrück, A. D. Hershey, S. E. Luriastruktura i replikacija virusa

1975. D. Baltimore, R. Dulbecco, H. M. Teminreverzna transkriptaza i tumorski virusi

1980. P. Berg, W. Gilbert, F. Sangertehnologija rekombinantne DNA, sekvenciranje DNA

1993. K. B. Mullis, M. SMithPCR, ciljana mutageneza

GMGM20052005

Primjena genetičkog inženjerstva u farmaciji i medicini

FARMACIJA I MEDICINA

farmakogenomikadijagnostičke n.k.

terapeutske n.k.

vakcineterapeutski proteinidijagnostički

proteini

male terapeutske

molekule

životinjski modeli bolesti

profiliranje klonirani P450 genetičke bolesti

infektivne bolesti

popravak gena

protusmislene n.k.

DNA vakcine

mikrobibiljke

mikrobi životinje

biljke

mikrobigenska terapija

GMGM20052005

Razlike u genskoj ekspresiji između prokariota i eukariota

Prokariotitranskripcija i translacija odvijaju se u citosolu i usko su povezanemRNA je policistronska - kodira za nekoliko polipeptida

Eukariotigeni sadrže introne i eksonetranskripcija se odvija u jezgri, a translacija u citoplazminezrele molekule RNA podliježu sazrijevanjumRNA je monocistronska - kodira za jedan polipeptid

GMGM20052005

Kontrola transkripcije kod

prokariota

represija iliindukcijalac operon

GMGM20052005

Enzimi za molekularno kloniranje

Restrikcijske endonukleazeDruge nukleaze Metil-transferazePolimerazeEnzimi koji modificiraju krajeve DNADNA ligaza

GMGM20052005


Dio restrikcijsko-modifikacijskog sustava bakterijaendonukleaza i metilaza dijele isto mjesto prepoznavanjametilaza metilira vlastitu DNA za zaštitu od djelovanja RE koja kida nemodificiranu stranu DNA

enzimi koji prepoznaju točno određeni slijed nukleotidaod 4 do 8 baza u dvolančanoj DNA i kidaju oba lancadvostruke uzvojnice

TIP I - kidaju DNA >1000 pb dalje od mjesta prepoznavanjaTIP III - kidaju DNA 24 do 26 pb nizvodno od mjestaprepoznavanjaTIP II - kidaju DNA unutar samog mjesta prepoznavanjakoje ima dvostruku rotacijsku simetriju (palindrom)

GMGM20052005


do sada je otkriveno oko 3000 RE koji prepoznaju preko 200 različitih sljedova (IZOSHIZOMERI – prepoznaju isti slijed)nomenklatura: EcoRI: Escherichia coli RYI3; I - prva izolirana RE

EcoRVEcoRI

GMGM20052005

Mjesta prepoznavanja RE

HaeIII PstI EcoRI5’-GGCC-3’ 5’-CTGCAG-3’ 5’-GAATTC-3’

GGCCCCGG

CTGCAGGACGTC

GAATTCCTTAAG

tupi krajevi ljepljivi krajevi

3’- izbočeni 5’- izbočeni

GMGM20052005

Varijacije restrikcijskih mjesta

mnogi različiti RE proizvode kompatibilne ljepljive krajeve

AgeI (A/CCGGT) i AvaI (C/CCGGG) proizvode kompatibilne 5’ krajeve

ljepljivi krajevi mogu se spojiti ligazom –dobiveni hibridni slijed često mogu kidati RE koji prepoznaju 4 pb:

hibridni slijed ACCGGG prepoznaju:HpaII (C/CGG), NciI (CC/GGG), ScrFI (CC/NGG)

GMGM20052005

Kreiranje novih restrikcijskih mjesta

GAATTCCTTAAG

G AATTCCTTAA G

GAATT AATTCCTTAA TTAAG

EcoRI

DNA polimeraza

GAATTAATTCCTTAATTAAG

GAATT AATTCCTTAA TTAAG

GAAT TAATTCCTTAAT TAAG

G AATTCCTTAA G

XmnI (GAANN/NNTTC)

Tsp09I (/AATT)

AseI (AT/TAAT)

ili MseI (T/TAA)

isto kao i EcoRIDNA

ligaza

GAATTAATTCCTTAATTAAG

GMGM20052005

Aktivnost restrikcijskih enzima

ovisi o:pH (7.2- 8.5)Mg2+ ionima (5-30 mM)koncentraciji soli (mnoge RE 50-150 mM NaCl ili KCl)BSA – stabilizira RE, štiti od razgradnje proteazama, nespecifične adsorpcije ili štetnih faktora okoliša (toplina, površinska napetost)glicerolu – zaštita od smrzavanja na -20ºC; do 5-10%temperaturi – većina RE ima optimalnu aktivnost na 37ºC, neki na 25ºCvolumenu reakcijske smjese

viskozna otopina DNA inhibira difuziju RE i smanjuje aktivnostrazrijeđene otopine s koncentracijom DNA ispod Km smanjuju aktivnost REpreporuča se volumen 10- 50 µL po µg DNA

GMGM20052005

Aktivnost restrikcijskih enzima

“Star activity” – neželjeno kidanje DNA na mjestima koja su slična mjestu prepoznavanja u uvjetima koji nisu optimalni za aktivnost RE:

neprikladan pH ili ionska jakostneprikladan tip iona kofaktora (Mn2 + naspram Mg2+)povećana koncentracija glicerola, etilen-glikola

izražava se u jedinicama1U je količina RE koja će potpuno razgraditi 1 µg DNA za 1 h na optimalnoj temperaturi

GMGM20052005

Izrada restrikcijske karte

određivanje položaja restrikcijskih mjesta unutar fragmenta DNA kidanjem različitim restrikcijskim enzimima pojedinačno i u kombinaciji

Zadatak:Razgradnja fragmenta DNA veličine 15 kb trima restrikcijskim enzimima daje fragmente veličina navedenih u tablici. Odredite položaj restrikcijskih mjesta u fragmentu DNA!

BamHI EcoRI PstI BamHIEcoRI

BamHIPstI

EcoRIPstI

BamHIEcoRIPstI

14 12 8 11 8 7 6

1 3 7 3 6 5 5

1 1 3 3

1

GMGM20052005

Izrada restrikcijske karte0 3 6 9 12 15 kb

14 kb 1 kbBamHI

3 kb 12 kb

12 kb 3 kb

EcoRI

BamHIEcoRI

3 kb 11 kb 1 kbEcoRI + BamHI

BamHIEcoRI

3 kb 5 kb 6kb 1 kbEcoRI + BamHI + PstI

PstI

GMGM20052005

Izrada restrikcijske karte

Zadatak: Linearni fragment DNA veličine 100 kb obrađen je polinukleotid-kinazom uz dodatak radioaktivnog ATP. Razgradnja s EcoRI daje fragmente veličina: 8*, 10, 15, 23 i 44* kb. Razgradnja s BamHI daje fragmente veličina: 11*, 14, 16, 24.5 i 34.5* kb. Razgradnja istovjetnog neradioaktivnog fragmenta s oba enzima daje fragmente veličina 3, 4.5, 5.5, 7, 8, 9.5, 10.5, 17.5 i 34.5 kb. Odredite položaj restrikcijskih mjesta u fragmentu DNA!

EcoRI23108 15 44

8 7 4.510.55.517.53 9.5 34.5

16 34.524.511 14

BamHI

GMGM20052005

Druge nukleazeNukleaza Bal 31• 3’- egzonukleaza +

endonukleaza• prisutna u višoj

koncentraciji skraćuje DNA s oba kraja

5’

5’Egzonukleaza III• stvara 5’ istaknute

krajeve

3’

3’Egzonukleaza λ• stvara 3’ istaknute

krajeve

DNaza I• nasumično kida jl ili dl

DNA

Nukleaza S1• kida isključivo jl DNA ili

RNA

RNaza - kida RNA

GMGM20052005

Metil-transferaze

mnogi laboratorijski sojevi E. coli sadrže metil-transferaze Dam (GA*TC) i Dcm (CC*AGG i CC*TGG

ako je DNA izolirana iz takvog soja, bit će otporna na djelovanje nekih RE jer mjesta prepoznavanja sadrže metilirane nukleotide

MboI i Sau3A prepoznaju isti slijed GATC, no MboI ne kida DNA izDam+ i Dcm+ soja

metilacija utječe na učinkovitost transformacijeDNA iz Dam+ soja teže će transformirati Dam- bakteriju

inicijacija replikacije ihibirana je kad je plazmid metiliran na Dam mjestima

Dam-modificirani plazmid može se replicirati samo jednom u Dam-

soju i nakon toga replikacija prestaje

GMGM20052005

DNA ligaza

popravlja jednolančani lom u okosnici šećer-fosfat između dviju susjednih nukleotida u molekuli DNA

T4 DNA ligaza

ATP

PPi

Enzim-AMP Enzim AMP

P P OH P PP

P P P P P

B B B B B B

B B B B B B

P P P P P

P P OH P PP

P

A

B B B B B B

B B B B B B

P P P P P

P P P PP

B B B B B B

B B B B B B

GMGM20052005

DNA ligaza

u molekularnom kloniranju najčešće se koristi DNA ligaza iz bakteriofaga T4 (T4 DNA ligaza)povezivanje krajeva DNA nastalih razgradnjom restrikcijskim enzimimatupi krajevi teže se povezuju od ljepljivih krajevaoptimalna temperatura reakcije je 37ºC, no pri toj su temperaturi vodikove veze između ljepljivih krajeva nestabilne

ljepljivi krajevi – 3 h na 22ºC ili 16 h na 16ºC (moderna varijanta – 5 min. na sobnoj temperaturi u posebnom puferu)tupi krajevi – 4-16 h na 22ºC

GMGM20052005

Tvorba rekombinantne molekule DNA

EcoRI EcoRI

5’-AATTCG

GCTTAA-5’

5’-AATTCG

GCTTAA-5’

GAATTC

CTTAAGGAAT

TCCT

TAAG

DNA ligaza

GMGM20052005

Polimeraze

DNA-polimeraza Ipolimerazna, 3’ 5’ i 5’ 3’ egzonukleazna aktivnost

“Nick” translacijalom jednog lanca dl DNA nastaje spontano ili djelovanjem niskih koncentracija DNaze u reakcijskoj smjesiDNA polimeraza I dodaje nove dNTP i razgrađuje lanac 5’ 3’ egzonukleaznom aktivnošću – jl lom (“nick”) tako se pomiče uzduž molekule DNAvisoko obilježena molekula DNA nastaje dodatkom jednog radioaktivno obilježenog dNTP (obično dATP obilježen radioaktivnim fosforom – 32P ili 33P)

GMGM20052005

Obilježavanje DNA “nick” translacijom

jednolančani lom (nick)

Ako je jedan od dNTP u reakcijskoj smjesi radioaktivno obilježen, djelovanjem DNA-polimeraze I nastaje visoko obilježena molekula DNA

DNA-polimeraza I

mjesto jl loma

GMGM20052005

Polimeraze

Klenowljev fragment

dio DNA-polimeraze I kojem nedostaje 5’ 3’egzonukleazna aktivnostu reakcijskim uvjetima 3’ 5’ egzonukleazna aktivnost je suprimiranauporaba pri sekvenciranju Sangerovom dideoksi metodom i za obilježavanje DNA metodom produljenja ishodnice (primer extension, oligolabelling)

GMGM20052005

Obilježavanje DNA metodom produljenja ishodnice

• denaturacija —jednolančana DNA 3’5’

• dodatak ishodnice —slobodan 3’-OH kraj

3’

HO5’

ishodnica5’

• Klenowljev fragment DNA-polimeraze I nastavlja sintezu komplementarnog lanca produžujući ishodnicu –ugradnja radioaktivnog dATP daje obilježenu molekulu s vrlo visokom specifičnom aktivnošću

DNA-polimeraza I (Klenow)

ishodnica

GMGM20052005

Polimeraze

Reverzna transkriptazaRNA-ovisna DNA-polimerazanema egzonukleazne aktivnostikoristi se za dobivanje cDNA iz mRNA

GMGM20052005

Enzimi koji modificiraju krajeve DNA

Alkalna fosfatazabakterijska alkalna fosfataza (BAP)AP iz goveđeg crijeva (CIP – calf intestinal phosphatase)uklanja fosfatnu skupinu s 5’-kraja DNAsprečavanje neželjene ligacije (recirkularizacija plazmida razgrađenog jednim restrikcijskim enzimom)koristi se i prije uporabe polinukleotid kinaze prilikom obilježavanja DNA

GMGM20052005


Polinukleotid-kinaza (PNK)prenosi terminalnu fosfatnu skupinu ATP-a na slobodnu OH skupinu na 5’-kraju DNA (DNA se prethodno defosforilira uporabom AP)služi za radioaktivno obilježavanje krajeva DNA (i RNA)

HO OH

OHHO

HO OH

OHHO

ATP

PNK

GMGM20052005


Terminalna transferaza (TT)(terminalna deoksinukleotidil-transferaza)

opetovano dodaje nukleotide na slobodan 3’-krajnajbolje radi na istaknutim 3’-krajevima, no reakcijski uvjeti mogu se prilagoditi i za tupe i 3’-uvučene krajeveuglavnom se koristi za dodatak homopolimera na kraj molekule DNA

GMGM20052005

Za kidanje, modifikaciju i združivanje DNA

potrebni su

i


specifičnim mjestima

Stvaranje fragmenata

DNA Izradu restrikcijskih

karata

kidaju DNA na

i koriste se za

Nukleaze

DNA pol I Klenow

RT

Polimeraze

Endo- Egzo-

RE DNAza I

S1Bal 31 Exo III Exo λ

Enzimi koji djeluju na krajevima

AP PNK TT

DNA ligaza

tvori rekombinantnu

DNA

Fosfodiesterskih veza

spaja molekule DNA

tvorbom

enzimi koji modificiraju DNA

katalitičke proteinske molekule

različitih tipova stanica

komercijalno dostupni

enzimipročišćeni

izi

3 glavne skupine

GMGM20052005

Spajanje dvaju fragmenata DNA pomoću homopolimernih repova5’

5’3’3’

5’3’5’ 3’

5’3’A(A)nA5’ A(A)nA3’

5’5’3’3’

5’3’5’ 3’

5’5’ T(T)nT3’

3’T(T)nTA(A)

n A

T(T)n TT(

T) nT

A(A) n

A

Egzonukleaza λ Egzonukleaza λ

Terminalna transferaza + dATP

Terminalna transferaza + dTTP

GMGM20052005

Linkeri (poveznice)

Ukoliko fragment DNA nema prikladnih restrikcijskih mjesta, na krajeve DNA mogu se dodati kratki odsječci DNA sa željenim mjestima koje prepoznaju RE:Linkeri (poveznice)

komplementarni oligomeri tupih krajeva dobiveni kemijskom sintezom

CCGAATTCGGGGCTTAAGCC



DNA ligaza

EcoRI

CCGGGCTTAA-5’

5’-AATTCGGGCC

GMGM20052005

Adaptori

Adaptorisintetički oligomeri koji s jedne strane imaju tupi kraj kojim se adaptor veže na željenu molekulu DNA, a s druge ljepljivi kraj koji omogućava izravno povezivanje s kompatibilnim ljepljivim krajem vektora (ili neke druge DNA)

CCCGGGGGGCCCCTAG-5’

5’-GATCCCCGGGGGGCCC

DNA ligaza

BamHI adaptor5’-GATCCCCGGGGGGCCC

GMGM20052005

Načini dobivanja fragmenata DNA

mehaničkim kidanjem (soniciranjem)razgradnjom restrikcijskim enzimima (potpuna i djelomična)sintetičkim putem (oligonukleotidi)prevođenjem mRNA u cDNA pomoću reverzne transkriptaze umnažanjem lančanom reakcijom polimeraze

GMGM20052005

PCR u kloniranju: dizajn posebnih ishodnica

dodavanje kratkih odsječaka nekomplementarnih kalupu na 5’-kraj ishodnice

mjesta prepoznavanja REsljedovi za lakše pročišćavanje proteina (6x-His tag)

5’5’ 3’3’

GCGCAAGCTT5’

5’3’

CTTAAGCCGG 5’

3’5’

CTTAAGCCGGGAATTCGGCCGCGCAAGCTT

CGCGTTCGAA

EcoRIHindIII5’3’

GMGM20052005


ako je poznat samo dio a.k. slijeda proteina, a želimo izolirati gen:

za degenerirani kodon sintetizira se miješana ishodnica sa svim kombinacijama nukleotida na 3. mjestu

Phe-Leu-Pro-Ser-Ala-Lys-Trp-Ala-Tyr-Asp-Proa.k. slijed

broj kodona po a.k. 2 6 4 6 4 2 1 4 2 2 4

Sinteza miješane ishodnice Ala Lys Trp Ala Tyr Asp Pro

GCA AAA TGG GCA TAC GAC CCGCT

G GCT

T T

4 X 2 X 1 X 4 X 2 X 2 X 1 = 128broj kombinacija

GMGM20052005


ako je poznat samo dio a.k. slijeda proteina, a želimo izolirati gen:

umjesto 3. mjesta u ishodnicu se ugrađuje inozin koji se jednako dobro sparuje sa svim nukleotidima

Phe-Leu-Pro-Ser-Ala-Lys-Trp-Ala-Tyr-Asp-Proa.k. slijed

broj kodona po a.k. 2 6 4 6 4 2 1 4 2 2 4

Uporaba inozina kao degenerirane baze

Ala Lys Trp Ala Tyr Asp Pro

GCI AAA TGG GCI TAC GAC CCG T T

1 X 2 X 1 X 1 X 2 X 2 X 1 = 8broj kombinacija

GMGM20052005

Polimeraze s mogućnošću popravka ugradnje krive baze

Taq polimeraza nema 3’ 5’ egzonukleaznu aktivnost – ugradnja pogrešnog nukleotida zaustavlja sintezu

standardni PCR ne može učinkovito umnožiti odsječke puno dulje od 3 kbdodatkom “proofreading” polimeraze omogućava se vjerna i učinkovita sinteza duljih fragmenata

Tma (Thermotoga maritima)Deep VentTM (Pyrococcus sp.)Tli (Thermococcus litoralis)Pfu (Pyrococcus furiosus)Pwo (Pyrococcus woesi)

Documents

Enzimi Za Kloniranje