DOI:10.3724/SP.J.1096.2012.20201

伏马菌素B1单克隆抗体制备及化学发光免疫检测方法的建立

许 杨1 邹 龙1 刘师文2 刘 京1 陈 波1

1(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室,中德联合研究院,南昌 330047)2(江西省疾病预防控制中心,南昌 330029)

摘 要 制备了高亲和力的伏马菌素 B1(FB1)单克隆抗体,进而建立了谷物中 FB1 的直接竞争化学发光酶

联免疫检测方法(dc-CLEIA)。采用碳化二亚胺法成功合成了 FB1 人工抗原,经杂交瘤技术获得分泌 FB1 特

异性抗体的细胞株,高碘酸钠法酶标单克隆抗体后,建立了 FB1 的 dc-CLEIA,本方法的 IC50 值为 1.43 mg/L,线性范围为 0.32~8.40 mg/L,检出限为 0.13 mg/L,竞争反应时间仅需 20 min。玉米样品加标回收率为 100.2%~115.4%,相对标准偏差小于 8.7%,谷物样品的检测结果与高效液相色谱法及商业化 ELISA 试剂盒检测结果

相符。

关键词 伏马菌素 B1;单克隆抗体;化学发光酶联免疫分析;谷物

2012-02-29 收稿;2012-06-04 接受本文系国家“863”计划资助项目(No. 2007AA10Z427)

* E-mail:xuyang1951@ 163.com

1 引 言

伏马菌素主要是由镰刀菌属产生的一类结构类似的真菌毒素,常污染玉米等谷物,其中伏马菌素

B1(Fumonisin B1 , FB1)是主要组成成分,也是毒性最强的成分 [1]。伏马菌素不仅能引起马脑白质软化

症、猪肺水肿综合症和大鼠肝癌,而且与人类食管癌和肝癌的发生有关,国际癌症研究中心已将伏马菌

素列为 2B 类致癌物质 [2~4]。欧盟规定人食用玉米中伏马菌素的限量为 1 mg/kg[5]。目前,用于谷物及其制品中伏马菌素的检测方法主要有仪器分析(高效液相色谱、质谱分析等)[6,7]

和免疫学检测法 [8,9]。基于抗原抗体反应建立的免疫学检测法具有样品处理简单、灵敏度高、特异性强

等优点,能实现高通量样品的同时快速检测。免疫学检测法的灵敏度在很大程度上取决于特异性抗体

的亲和力和检测信号的放大倍数,而对于真菌毒素等半抗原,获得高亲和力抗体的关键取决于合成的全

抗原的质量。化学发光反应信号放大可以提高免疫分析法灵敏度,化学发光免疫分析技术已广泛用于

生物化学分析、临床诊断和环境监测 [10~12]。本实验采用简便的碳化二亚胺法成功合成了 FB1 人工抗原,并制备了高亲和力和特异性的 FB1 单

克隆抗体,进而建立了谷物中 FB1 的直接竞争化学发光酶联免疫检测法(Direct competitive chemilumi-nescence enzyme immunoassay, dc-CLEIA)。本方法灵敏度高,检测时间短,有望用于开发适用于谷物中

FB1 常规检测的商业化试剂盒。

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

伏马菌素 B1 酶联免疫测定试剂盒(天津生物芯片技术有限责任公司);96 孔可拆化学发光板/酶标

板(深圳金灿华实业有限公司);小鼠抗体分型试剂盒(Hycult biotechnology;Waters 公司);Thermo MK3 酶

标仪、化学发光仪(Thermo 公司)。伏马菌素 B1、伏马菌素 B2、黄曲霉毒素 B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇

(DON)、赭曲霉毒素 A(OTA)、辣根过氧化物酶(HRP)、鲁米诺、对碘苯酚、过氧化脲、匙孔血蓝蛋白

(KLH)、弗氏完全佐剂和不完全佐剂,均购自 Sigma 公司;卵清白蛋白(OVA)、碳化亚二胺盐酸盐(EDC

·HCl),均购自上海生工生物工程公司;其它试剂纯度均为国产分析纯。

第 40 卷

2012 年月

分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究

Chinese Journal of Analytical Chemistry

第期

~

BALB/c 小鼠(雌性,4~6 周龄)购自南昌大学医学院实验动物科学部。

2.2 人工抗原的合成

采用碳化二亚胺法合成人工抗原,参考文献[9]并做适当修改,具体如下:1 mg FB1 溶解于 1 mL PBS

(0.01 mol/L, pH 7.4)中,5 mg 血蓝蛋白(KLH)溶解于 1 mL PBS 中,两者混匀后加入 0.2 mL 10 g/L 新鲜

配制的 EDC 溶液;在室温下缓慢搅拌反应 2 h,静置 30 min;在 4 ℃于 PBS 中透析后,-20 ℃ 冻存备用,即为免疫抗原(FB1-KLH)。

检测抗原(FB1-OVA)合成方法同上,以 OVA 替换 KLH。

2.3 单克隆抗体的制备

将免疫抗原按 50 mg/只的剂量与等体积弗氏佐剂充分乳化后腹部皮下多点注射免疫 4 只 6~8 周

龄雌性 BALB/c 小鼠,免疫后第 7~10 d,尾静脉采血,间接 ELISA 检测血清效价。杂交瘤技术和腹水制

备参考文献[14],将免疫效果较好的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞 SP2/0 通过 PEG 介导融合,间接 ELISA

筛选阳性克隆;阳性克隆经有限稀释亚克隆后获得遗传稳定的单克隆细胞株,细胞株扩大培养后,接种

经降植烷致敏的 BALB/c 小鼠腹腔内诱导生产单克隆抗体。Hycult biotechnology 小鼠抗体分型试剂盒

测试细胞株培养液,鉴定单克隆抗体的类别和亚型。

2.4 酶标抗体的制备

采用改良的过碘酸钠法 [13,14],将辣根过氧化物酶与 Protein G 琼脂糖凝胶纯化的单克隆抗体偶联,制备酶标抗体 IgG-HRP 复合物。

2.5 化学发光底物液的制备

以 HRP-羊抗鼠抗体(1∶1000 倍稀释度,100 mL/孔)包被的化学发光板为基质,单因素实验分别考察

鲁米诺、增强剂和过氧化物 3 种组分浓度对底物液发光强度和稳定性的影响。采用 BOX-Behnken 响应

面法设计,分析上述 3 种组分(因素)的作用及其交互作用,选择合理的模型模拟最佳的底物配方,具体

方法及数据分析参考文献 [15]。

2.6 直接竞争化学发光酶联免疫检测方法(dc-CLEIA)的建立

2.6.1 dc-CLEIA 步骤 用 PBS 稀释检测抗原至工作浓度,每孔 100 mL,于 4 ℃ 过夜包被化学发光

板,用 PBST 洗涤 3 次,每孔加入 300 mL 5% 脱脂牛奶,在 37 ℃ 温育封闭 1 h,倾去封闭液,PBST 洗涤 3

次。FB1 标准品或稀释的样品提取液(50 mL/孔)和酶标抗体稀释液(50 mL/孔)加入到抗原包被好的板孔

中,混匀,37 ℃ 温育 20 min,PBST 洗涤 4 次,每孔加发光底物液 100 mL,用化学发光检测仪测量相对发

光强度单位(Relative light units, RLU)。

2.6.2 dc-CLEIA 参数的优化 参考文献 [10],以 RLUmax /IC50 比值作为各影响因素优化的指标,选择

RLUmax /IC50比值较高时的条件作为最佳参数。按照 2.6.1 节操作步骤分别对检测抗原包被浓度、酶标抗

体工作稀释度和竞争反应时间等参数进行优化。

2.6.3 玉米样品加标回收率及谷物样品分析 将 FB1 标准品加到 1 g 粉碎的玉米样品(HPLC 检测

为 FB1 阴性),添加浓度为 50、200 和 500 mg/kg,每个加标质量浓度重复 3 次。样品提取方法参照文献

[9],取上清液进行 dc-CLEIA 测定,计算平均加标回收率。

3 结果与讨论

3.1 单克隆抗体的制备与鉴定

细胞融合后筛选到 1 株能稳定分泌抗 FB1 抗体的杂交瘤细胞(8A6)。单克隆抗体经小鼠抗体分型

试纸条鉴定为 IgG1 ,κ型。间接 ELISA 测定原始腹水中抗体的效价高达 1.28× 106。通过间接竞争

ELISA,绘制了 FB1 及常见真菌毒素抑制曲线并计算交叉反应率(图 1),此抗体与 FB1 与 FB2 交叉反应率

分别为 100% 和 9.7%,不能识别其它常见真菌毒素。结果表明,此单克隆抗体亲和力高,且特异性强。

3.2 化学发光底物液的配制

单因素实验确定鲁米诺、对碘苯酚和过氧化脲较佳浓度范围分别为 3.75~5.00 mmol/L, 0.3 mmol/L,

2.5~3.0 mmol/L。采用 Box-Behnken 响应面法分析表明,对碘苯酚与鲁米诺和过氧化脲的交互作用不

分 析 化 学 第 40 卷

图 1 anti-FB1 单克隆抗体与常见真菌毒素的竞争抑

制曲线

Fig.1 Inhibitive curves of anti-fumonisinB1 (FB1 ) mono-clonal antibody (McAb) with common mycotoxin

显著;鲁米诺与过氧化脲的交互作用显著。模拟并

验证得 到 最 佳 底 物 配 方 为:鲁 米 诺 浓 度 为 5. 625

mmol/L、过氧化脲浓度为 3.0 mmol/L、对碘苯酚浓度

为 0.4 mmol/L。

3.3 dc-CLEIA参数的优化

为建立 FB1 的 dc-CLEIA 检测方法,本实验优化

了检测抗原(FB1-OVA)包被浓度、酶标抗体稀释度以

及竞争反应时间等参数。RLUmax /IC50 比值是评价某

个特定参数对 DC-CLEIA 反应体系影响的重要指

标,比值越高,表明此参数对检测体系的 影 响 越

大 [10]。此外,IC50值通常也是评价检测体系的重要指

标。因此,在进行条件优化时需综合考虑两者,以获

得最佳条件。图 2 表明,最佳 FB1-OVA 包被浓度为

0.4 mg/L,最佳酶标抗体的稀释度为 1∶3000,最佳竞

争反应时间为 20 min。

图 2 dc-CLEIA 参数优化:(a) FB1-OVA 抗原包被浓度,(b) 酶标抗体稀释度,(c) 竞争反应时间

Fig.2 Optimization of dc-CLEIA parameters: (a) concentration of FB1-ovalbumin (OVA), (b) dilution factor of HRP-antibody,

(c) competitive reaction time

图 3 dc-ELISA 和 dc-CLEIA 的标准抑制曲线

Fig. 3 Standard inhibitive curves of dc-ELISA and

dc-CLEIA

3.4 直接竞争酶联免疫(dc-ELISA)和 dc-CLEIA的标准曲线

在优 化 条 件 下,分 别 建 立 了 检 测 FB1 的

dc-ELISA 和 dc-CLEIA 方法,绘制标准曲线,结果见

图 3。两种检测方法的实验条件与结果对比见表 1。相对于 dc-ELISA,dc-CLEIA 表现出对 FB1 更高的灵

敏度和更短的反应时间。dc-ELISA 检测抗原包被浓

度为 dc-CLEIA 的 3 倍,提示检测信号的放大导致检

测抗原包被浓度降低,有利于提高检测体系的灵敏

度。以 IC50 值相对标准偏差(n= 6)计算得到 dc-CLEIA 的批内与批间平均相对标准偏差分别为 2.

4% 和 9.2%。

3.5 玉米样品加标回收率与谷物样品检测

将 FB1标准品加入 1 g 阴性玉米样品,dc-CLEIA 检测的回收率为 100.2%~115.4%,相对标准偏差

小于 8.7%。分别采用 dc-CLEIA 和 HPLC 法,以及商业化 ELISA 试剂盒,分别对 40 份谷物样品进行检测,结果

见表 2。结果表明,采用 dc-CLEIA 时,40 份样品中 FB1 的检出率明显高于 HPLC 法和商业试剂盒;对于同一样品,dc-ELISA 检测结果偏高,可能与样品提取方法的回收率、样品基质干扰和方法的检出限有

关。dc-CLEIA检测结果与 HPLC 和商业化 ELISA 试剂盒的检测结果拟合相关系数分别为 0.961 和 0.979。

第期 许 杨等:伏马菌素 B1 单克隆抗体制备及化学发光免疫检测方法的建立

表 1 dc-ELISA 与 dc-CLEIA 的参数对比Table 1 Parameters comparison of direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (dc-ELISA)and direct competitive

chemiluminescence enzyme-linked immunosorbent assay(dc-CLEIA)

方法Method

FB1-OVA 浓度Concentration of

FB1-OVA(mg/L)

HRP-antibody稀释度

Dilution factor ofIgG-antibody

反应时间Reaction

time(min)

IC50

(mg/L)

线性范围(IC20~IC80)Iinear concentration

range (mg/L)

检出限(IC10)Limit of detection

(mg/L)

dc-ELISA 1.2 6000 45 3.60 0.7~18.7 0.40

dc-CLEIA 0.4 3000 20 1.43 0.3~8.4 0.13

表 2 40 份谷物样品中 FB1 含量检测结果(n=3)Table 2 Detection result of FB1 concentration in 40 cereal samples (n=3)

样品Sample

本方法dc-CLEIA

(mg/kg)

高效液相色谱法HPLC[9]

(mg/kg)

商业试剂盒Commercial kit(mg/kg)

样品Sample

本方法dc-CLEIA

(mg/kg)

高效液相色谱法HPLC[9]

(mg/kg)

商业试剂盒Commercial kit(mg/kg)

1 382.5 413.8 369.2 21 725.6 532.1 686.1

2 261.7 148.1 166.7 22 48.6 - -3 177.1 124.3 136.3 23 4970.0 3081.0 4828.0

4 85.5 68.7 - 24 105.5 58.0 -5 211.6 196.2 206.1 25 285.8 167.1 325.9

6 493.7 329.5 340.9 26 142.1 24.9 -7 208.0 163.1 168.9 27 4.2 - -8 210.6 211.9 253.6 28 2181.0 1231.0 2196.0

9 4191.0 3232.0 3424.0 29 2081.0 1761.0 2974.0

10 775.3 573.4 670.3 30 3410.0 3266.0 3548.0

11 2125.0 1916.0 2075.0 31 9.3 - -12 734.1 691.1 708.7 32 - - -13 760.2 728.7 675.9 33 2.1 - -14 72.0 - - 34 15.6 - -15 308.7 206.3 138.7 35 15.1 - -16 5750.0 4698.0 5516.0 36 22.9 - -17 151.5 158.2 185.7 37 - - -18 1530.0 729.1 1440 38 5.3 - -19 295.5 110.9 - 39 - - -20 66.9 - - 40 - - -

注:“—”表示阴性;dc-CLEIA、HPLC、商业化 ELISA 剂盒检出限分别为 0.13,16.6 和 12.0 mg/kg。 Note:“—”represents negative result; the detection limits of dc-ELISA, HPLC and commercial ELISA kit were 0.13, 16.6 and 12.0 mg/kg.

实验表明,制备的 FB1 单克隆抗体亲和力高、特异性强,基于其建立的直接竞争化学发光免疫检测

方法灵敏度好,检测时间短,适用于谷物中 FB1 的高通量快速筛查。

References1 ThomasSW,AbbasHK,Abou-Karam M.J.Toxicol.Toxin.Rev.,2003,22(4):591-6162 IARC,InternationalAgencyforResearchonCancer.FumonisinB1.IARC,Lyon,France,2002,82:301-3663 VossKA,SmithGW,HaschekW M.Anim.Feed.Sci.Technol.,2007,137(3-4):299-3254 DomijanAM,AbramovAY.Int.J.BiochemCellBiol.,2011,43(6):897-9045 EUCommissionRegulation(EC)No.1126/2007of28September2007Amendingregulation(EC)No.1881/20066 NdubeN,WesthuizenLvd,ShephardGS.Mycotox.Res.,2009,25(4):225-2287 ArcoG,Fern췍ndez-FranzónM,FontG,DamianiP,MañesJ.J.Chromatogr.A,2008,1209(1-2):188-1948 WangS,QuanY,LeeNanju,KennedlvanR.J.Agric.FoodChem.,2006,54(7):2491-24959 LIUShi-Wen,HEQing-Hua,ZOULong,XUYang.ChineseFoodSci.,2010,31(18):350-354

刘师文,何庆华,邹 龙,许 杨.食品科学,2010,31(18):350-35410 QuanY,ZhangY,WangS,LeeNanju,KennedlvanR.Anal.Chim.Acta,2006,580(1):1-811 G췍miz-GraciaL,García-CampañaAM,Huertas-PérezJF,LaraFJ.Anal.Chim.Acta,2009,640(1-2):7-2812 ZongC,WuJ,WangC,JuHG,YanF.Anal.Chem.,2012,84(5):2410-241513 MarquetteCA,CouletPR,BlumLJ.Anal.Chim.Acta,1999,398(2-3):173-182

分 析 化 学 第 40 卷

14 SassolasA,CwaratananteG,HayatA,StewartLD,ElliottCT,MartyJL.FoodControl,2012,DOI:10.1016/

j.foodcont.2012.05.02815 YANGJi-Yan,HULei,XUYang.ChineseFoodSci.,2009,30(06):29-33

杨冀艳,胡 磊,许 杨.食品科学,2009,30(06):29-33

ProductionofMonoclonalAntibodiesforDetectionofFumonisionB1byChemiluminescenceEnzyme-linkedImmunosorbentAssaay

XUYang*1,ZOULong1,LIUShi-wen2,LIUJing1,CHENBo11(StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,Sino-GermanyJointResearchInstitute,

NanchangUniversity,Nanchang330047,China)2(JiangXiProvinceCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanchang330029,China)

Abstract Basedon monoclonalantibodies with highaffinityagainstfumonisin B1,adirectcompetitivechemiluminescenceenzyme-linkedimmunosorbentassay(dc-CLEIA)fordetectionofFB1incerealwasdeveloped.FB1artificialantigensweresynthesizedbythecarbodiimidecrosslinkingmethods,andthenahybridomacellthatsecretedtheantibodyselectivelyidentifiesFB1wasselectedthroughcellfusion.Themonoclonalantibodytiterwasfoundashigheras1.28×106,whichwaslabeledwithhorseradishperoxidase(HRP)throughsodiumperiodateactivationfordevelopmentofdc-CELIA.Agoodlinearitywasachievedoveraconcentrationrangeof0.32-8.40 mg/L,theIC50valueandthelimitofdetectionwere1.43 mg/Land0.13 mg/L,respectively.Meanwhile,thecompetitivereactiontimewasonly20min.TherecoveriesofFB1inalltissueswerebetween100.2%-115.4%andtherelativestandarddeviationwaslessthan8.7%.Thedc-CLEIAwasappliedinquantificationofFB1eliminationincereal,theresultsshowedgoodcorrelationsoftheresultsobtainedbyHPLCandacommercialELISAkit.Keywords FumonisinB1;Monoclonalantibody;Chemiluminescenceenzymeimmunoassay;Cereal

(Received29February2012;accepted4June2012)

第期 许 杨等:伏马菌素 B1 单克隆抗体制备及化学发光免疫检测方法的建立