第36卷第2期 西 南 大 学 学 报 (自然科学版) 2014年2月

Vol.36 No.2 JournalofSouthwestUniversity(NaturalScienceEdition) Feb. 2014

文章编号:1673 9868(2014)2 0048 08

蜡梅水通道蛋白基因CpAQP1转录水平变化及其启动子克隆①

刘 祥, 赵志新, 王 斐, 秦 朝, 眭顺照, 李名扬

西南大学 园艺园林学院,南方山地园艺学 教育部重点实验室,重庆市花卉工程技术研究中心,重庆400716

摘要:利用荧光定量PCR技术对蜡梅花发育的不同组织、不同花期和不同胁迫下的水通道蛋白基因CpAQP1的表

达量进行分析.结果表明:CpAQP1在盛开期中瓣的表达量明显高于其他组织器官,在高温、高盐、ABA胁迫下表

达量变化明显,说明该基因具有组织表达差异性及能够对环境胁迫做出响应.同时利用hi-TAILPCR方法克隆获

得蜡梅水通道蛋白基因CpAQP1上游启动子1082bp,命名为CpAQP1pro(GenBank登录号为:JQ952563).该序列

具有典型的基本元件TATA-box、CAAT-box及与胁迫相关的元件和光应答元件.将克隆的启动子CpAQP1pro替

换pBI121中的CaMV35s启动子,构建植物表达载体pBI121-CpAQP1pro,通过农杆菌转化烟草,稳定表达结果说

明该启动子具有驱动GUS报告基因表达的活性.关 键 词:蜡梅;水通道蛋白;实时荧光定量PCR;启动子克隆;hi-TAILPCR中图分类号:Q785;S685.17 文献标志码:A

水通道蛋白(aquaporin,AQP)是细胞膜上选择性高效转运水分子的特异孔道蛋白[1],广泛分布于植物

各种组织和器官及发育的各个时期,其在水分的跨膜转运及逆境胁迫过程中起重要的作用.蜡梅较耐寒、耐旱,有“旱不死的腊梅”之说.其在逆境胁迫下的防御机制涉及大量抗逆基因的协同作用,而水通道蛋白

是否参与其中并发挥一些关键作用是值得研究的课题.张迷等从蜡梅cDNA文库中克隆到蜡梅水通道蛋白

基因CpAQP1,通过构建植物表达载体转化烟草,对转基因烟草进行干旱、高盐、高温处理,从表型上发

现转基因烟草的耐受性比非转基因烟草有显著提高,初步证明蜡梅水通道蛋白与植物抗逆性有关[2].本研究

利用荧光定量PCR技术对CpAQP1转录水平进行表达分析,以期说明该基因的表达量与植物抗逆性的关系.植物基因工程在性状改良、增加抗性等方面备受重视[3-4].近些年业界多以植物自身的启动子为目标,

研究其表达调控机理.冰叶日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)水通道蛋白的启动子[5]和胡萝卜

(Daucuscarrot)根特异表达水通道蛋白的启动子[6]相继克隆,而未见蜡梅水通道蛋白基因启动子克隆的报

道.本研究利用hiTAIL-PCR技术克隆CpAQP1的上游调控序列并分析其功能和活性,以期为研究启动子

在植物抗逆性调控中所起作用奠定基础.

1 材料和方法

1.1 材 料

供试蜡梅品种为磬口蜡梅(Chimonanthuspraecoxvor.grandiflora),采摘于西南大学.蜡梅花cDNA文库由重庆市花卉工程技术中心构建及保存[7].蜡梅四叶期幼苗用种子繁殖,种子催芽后在人工气候箱中

培养(温度:昼25℃/夜20℃,湿度:85%,光周期:昼16h/夜8h,光照强度:20000lx).

① 收稿日期:2012 11 07基金项目:国家自然科学基金项目(31070622和30872063)基金资助.作者简介:刘 祥(1984 ),男,山西大同人,硕士研究生,主要从事植物细胞工程研究.通信作者:李名扬,教授,博士生导师;眭顺照,研究员,硕士生导师.

1.2 菌株和载体

根癌农杆菌GV3101,植物表达载体pBI121均由本实验室保存,大肠杆菌DH5α购自天根生化科技

(北京)有限公司,克隆载体pMD19-T购自大连宝生物有限责任公司.1.3 试 剂

DNAmaker、DNA胶回收试剂盒和质粒提取盒购于BioFlux公司,ExTaq酶、T4DNA连接酶、各种

限制性内切酶、反转录试剂盒PrimeScriptTMRTreagentKit均购于大连宝生物有限责任公司.RNA提

取试剂盒为TIANGEN公司生产的RNApreppurePlantKit试剂盒.SsoFastTEEvaGreenSupermix试剂盒

购于Bio-Rad公司.PCR引物合成和DNA测序由北京六合华大基因有限公司完成,氨苄青霉素和羧苄青

霉素购自上海生物工程有限公司.1.4 蜡梅DNA、RNA的提取与cDNA第一链的合成

采用CTAB法提取蜡梅叶片总DNA,获得的DNA于-20°保存备用.取同一植株上的根、茎、嫩叶

和子叶;挑选处于花期无病虫害的蜡梅,采集成熟叶和萌动期、蕾期、露瓣期、初开期、盛开期、落花

期[8]花芽及盛开期花的外瓣、中瓣、内瓣、雄蕊、雌蕊;挑选长势一致的蜡梅幼苗分别进行高温(42℃)、低温(4℃)、ABA(50μmol/L)、高盐(1mol/LNaCl)、重金属(1mmol/LCuSO4)胁迫处理,在处理0,0.25,1,6,12h时取3株幼苗相同部位的嫩叶.

用RNApreppure植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司),分别提取上述材料的总RNA,然后以1uL总RNA为模板,按照PrimeScriptRTMasterMixPerfectRealTime(大连宝生物有限责任公

司)试剂盒说明书合成cDNA第一链.1.5 CpAQP1表达分析

使用SYBRGreenI荧光染料法,蜡梅Actin-b 和Tublin 基因作为CpAQP1基因定量表达的双内参基因

(表1),根据SsoFastTMEvaGreen®Supermix试剂盒说明书配制反应体系,每个样品重复3次PCR.反应体系

中含有5μLSsoFastEvaGreenSupermix,上下游引物(10μmol/L)各0.5μL,模板(50ng/μL)0.5μL,ddH2O3.5μL,总体积10μL.反应程序:98℃预变性30s;95℃变性5s,59℃退火/延伸5s(每次循环后采集

荧光),40个循环;95℃变性10s,65~95℃做熔解曲线分析,每个温度以每步0.5℃上升,停留5s.试验数据通过Bio-RadManagerTMSoftware(Version1.1)进行分析,用2-ΔΔCT法[9]获得CpAQP1基因的

相对表达量.表1 实时荧光定量PCR引物序列

基因名称 上游引物 (5’-3’) 下游引物 (5’-3’)

Actin-b AGGCTAAGATTCAAGACAAGG TTGGTCGCAGCTGATTGCTGTG

Tublin GTGCATCTCTATCCACATCG CAAGCTTCCTTATGCGATCC

CpAQP1 AAGAAGGGTAGCGTCGGCACCATCG AGGTCCAAAGGAGACTGCTGGGTTC

1.6 hi-TAILPCR法获取CpAQP1基因5’端上游序列

参照Liu等改良的hi-TAILPCR 的实验原理及操作程序[10],以已克隆的蜡梅水通道蛋白基因

CpAQP1(GenBank登录号为GU433105)5’端序列为基础,设计3条特异的巢式引物RB0、RB1、RB2,结

合兼并引物LAD和AC0、AC1,分别进行3轮扩增.LAD1:5’ ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAA 3’LAD2:5’ ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT 3’LAD3:5’ ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNCCAC 3’LAD4:5’ ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCCAA 3’LAD5:5’ ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCGGT 3’AC0:5’ GGACGATGGACTCCAG 3’AC1:5’ ACGATGGACTCCAGAG 3’RB0:5’ ACTTGAGAAGCAAACAGGCTACGGT 3’RB1:5’ ACGATGGACTCCAGTCCGACAAAGGCTCCAAATGTGACGGC 3’RB2:5’ GCAGGTGTGTTGGGTGCATCGTTTG 3’以50ng的蜡梅基因组DNA为模板,LAD1~5、AC0、RB0为引物进行预扩增;以预扩增的产物稀释

2 西南大学学报(自然科学版) http://xbbjb.swu.cn 第36卷

50倍后为模板,AC1、RB1为引物进行第一轮扩增;再以第一轮扩增产物稀释20倍后为模板,AC1、RB2为引物进行第二轮扩增.用1%的琼脂糖凝胶电泳对预扩增、第一轮、第二轮的PCR产物进行检测.通常

预扩增产物电泳检测为涂抹状,将第一轮和第二轮均出现的片段大小相近的特异条带胶回,连接载体

pMD19-T,鉴定后将阳性克隆测序.1.7 CpAQP1启动子的扩增

运用SeqMan将测序结果与CpAQP1比对确定为5’侧翼序列.为了构建载体,根据所获序列全长和

载体酶位点设计合成上游引物CpAQP1Pro-F:5’ CAAGCTTGACGCAGTGATTAGACTCGGTAC 3’,引 入 HindIII 酶 切 位 点,下 游 引 物 CpAQP1Pro-R:5’ CTCTAGAGATTTCTTCCTCTTCTCT-TCTCTAACT 3’,引入XbaI酶切位点.反应条件为:95℃预变性5min;94℃变性45s,55℃退火

45s,72℃延伸1min,28个循环;72℃延伸10min.将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,回收大小与目

标片段一致的条带(约1100bp)连到测序载体pMD19-T,鉴定后将阳性克隆进行测序.1.8 植物表达载体构建及启动子活性检测

植物表达载体pBI121内含有CaMV35s-GUS融合系统,将本研究中克隆的启动子代替其35s启动子.用 HindIII和XbaI限制性内切酶双酶切克隆质粒PMD-CpAQP1pro载体和pBI121载体,将回收的启动

子片段与pBI121载体,在T4DNA连接酶作用下连接.将连接产物转化大肠杆菌,挑选菌落进行PCR和

双酶切验证,获得阳性克隆,命名为pBI121-CpAQP1pro.将阳性克隆质粒通过电转化法转入农杆菌

GV3101,PCR鉴定阳性克隆后,提取其质粒反转到大肠杆菌中,再提取大肠杆菌的质粒进行酶切验证.利

用农杆菌介导的叶盘法[11]将携带有目的片段的植物表达载体转入到野生烟草的基因组中,通过对转基因

植株的幼嫩叶片进行GUS组织化学染色[12],检测该启动子是否具有驱动下游报告基因的活性.

2 结果与分析

2.1 CpAQP1的表达分析

CpAQP1的实时荧光定量分析表明:在蜡梅不同组织中CpAQP1均表达,但表达量差异较大,中瓣中

的表达量最高,明显高于其他组织器官,其次是雄蕊、内瓣、外瓣、茎等,表达量最低的是雌蕊中(图1);3轮花器官中也有表达差异,花瓣中的表达量高于雄蕊和雌蕊.

CpAQP1在蜡梅不同开花时期的表达量分析表明:衰败期的表达量最高,萌动期中基本不表达,花

蕾、露瓣、初开、盛开中表达量呈总体上升趋势(图2).

G:根;J:茎;Y:叶;WB:外瓣;ZB:中瓣;NB:内瓣;XR:雄蕊;CR:雌蕊.图1 CpAQP1在不同组织中的表达分析

CpAQP1基因在不同胁迫处理的幼苗嫩叶中都表达,但其变化趋势各不相同(图3).高温处理15min后表达量有少量的增加,随着处理时间的延长,表达量逐步升高,处理12h后表达量达到最高;脱落酸处

理15min后表达量有明显降低,处理1h的表达量变化不显著,6h后再次下降,12h后达到最低表达量;高盐胁迫处理15min表达量上升,1h后表达量下降,12h后表达量最低;在CuSO4 胁迫下,表达量变化

不明显;低温处理15min后表达量明显升高,1h后下降,6h后又有升高趋势,12h后降到最低.

3第2期 刘 祥,等:蜡梅水通道蛋白基因CpAQP1转录水平变化及其启动子克隆

MD:萌动期;HL:花蕾;LB:露瓣期;CK:初开期;SK:盛开期;SB:衰败期

图2 CpAQP1在不同花期的表达分析

图3 CpAQP1在不同胁迫下的表达分析

4 西南大学学报(自然科学版) http://xbbjb.swu.cn 第36卷

以上结果表明:高温、低温、高盐胁迫会诱导CpAQP1表达,ABA则会抑制CpAQP1在幼叶中的表

达,说明CpAQP1能够对环境胁迫做出响应.2.2 蜡梅水通道蛋白基因CpAQP1启动子克隆

用1%的琼脂糖凝胶电泳对第一轮和第二轮PCR产物进行检测,所选的不同引物组合得到的产物在大

小和丰度上存在差异.预扩增PCR产物中LAD1~LAD5与AC0,RB0组成的引物均检测到有大小不同的

扩增产物,并呈现涂抹状.第一轮、第二轮的产物分别点入相邻泳道检测(图4),结果显示第一轮和第二轮

产物中均出现特异条带,切胶回收图5泳道LAD3 2中1300bp左右的片段,连接pMD19 T后测序,对

产物序列和CpAQP1基因进行同源比对,确定为CpAQP1基因5’端侧翼序列,最终获得的CpAQP1基因

启动子序列长度为1082bp,将其命名为CpAQP1pro(GenBank登录号为:JQ952563).

M:DNAMarker(DL2000);LAD1-1和LAD1-2分别代表特异引物和兼并随机引物

LAD1组合的第一轮和第二轮PCR产物,LAD2-1,LAD2-2;LAD3-1,LAD3-2;

LAD4-1,LAD4-2;LAD5-1,LAD5-2与LAD1-1,LAD1-2类似.图4 hi-TAILPCR第一轮和第二轮扩增

2.3 启动子CpAQP1pro的序列分析

通过PLANTCARE对获得的启动子CpAQP1pro进行分析,结果表明其转录位点较多,调控特性比

较复杂(表2),该启动子具有30个TATA-box,TATA-box是RNA聚合酶II结合位点,保证转录的精确

起始,是启动子的核心元件;同时还具有21个CAAT-box,CAAT-box主要控制转录起始频率,并且增强

转录,是启动子和增强子区域普通作用元件;还包括胁迫相关应答元件TC-richrepeats及一些顺式作用元

件,提高转录水平顺式作用元件5UTRPy-richstretch,胚乳表达必须的顺式作用元件Skn-1_motif和光应

答元件ACE、G-box、motif、I-box等.表2 启动子调控区元件分析

编号 位点名称 数量 序列 位点功能

1 5UTRPy-richstretch 3 TTTCTTCTCT 提高转录水平顺式作用元件

2 ACE 1 GCGACGTACC 光应答元件

3 ATCT-motif 1 AATCTAATCC 部分光应答元件

4 CAAT-BOX 21CAAT或CAAAT或CCAAT或

CCCAATTT启动子、增强子区域普通顺式作用

5 CGTCA-motif 2 CGTCA 茉莉酸甲酯应答顺式调控元件

6 G-BOX 1 GCCTTGTGTAG 光应答元件

7 GAG-motif 1 AGAGATG 部分光应答元件

8 GATA-motif 1 AAGATAAGATT 部分光应答元件

9 GT1-motif 1 AATCCACA 光应答元件

10 I-box 3AAGATAAGGCT或GGATAAGGTG或

GATATGG部分光应答元件

11 OBP-1site 1 TACACTTTTGG 顺式作用元件

12 OCT 1 CGCGGATC与分生组织特异激活相关的顺式

作用元件

13 Skn-1_motif 3 GTCAT 胚乳表达必须的顺式作用元件

14 Sp1 1 CC(G/A)或CCC 光应答元件

5第2期 刘 祥,等:蜡梅水通道蛋白基因CpAQP1转录水平变化及其启动子克隆

续表2编号 位点名称 数量 序列 位点功能

15 TATA-box 30 核心序列TATA 转录起始处是启动子核心元件

16 TC-richrepeats 2 ATTTTCTCCA或ATTCTCTAAC 胁迫相关应答元件

17 TCA-element 1 GAGAAGAATA 水杨酸应答元件

18 TCCACCT-motif 1 TCCACCT19 TCT-motif 1 TCTTAC 部分光应答元件

20 TGACG-motif 2 TGACG 茉莉酸甲酯应答顺式调控元件

21 TGG-motif 1 GGTTGCCA 部分光应答元件

22 Circadian 2 CAANNNNATC 昼夜节律顺式调控元件

2.4 CpAQP1pro植物表达载体构建

已构建植物表达载体pBI121-CpAQP1pro,用 HindIII和XbaI对重组质粒双酶切验证(图5,图6),1%琼脂糖凝胶电泳检测获得大小约1100bp的目的片段,表明成功构建植物表达载体.

M:DNAMarker(DL2000).图5 CpAQP1pro和载体pBI121酶切

M:DNAMarker(DL2000).图6 重组载体酶切验证

2.5 稳定表达技术检测启动子活性

将重组载体和作为阳性对照的pBI121空载通过电转化法转入农杆菌中,利用农杆菌介导的叶盘法转

化野生烟草,共培养3d后开始出现膨大,7d开始分化出愈伤组织,20d左右开始长苗,长至2~3cm时

切下不带愈伤的幼苗,移至生根培养基中,待长出3~4片叶子,根、茎粗壮时,炼苗3d,移栽至花盆中.对生根的烟草,切下幼嫩叶片进行GUS染色.结果表明:转基因烟草和空载植株染色成功,而野生型烟草

没有染色(图7).说明CpAQP1pro具有启动子功能,能够驱动下游GUS报告基因表达.

图7 CpAQP1pro启动子稳定表达活性检测

6 西南大学学报(自然科学版) http://xbbjb.swu.cn 第36卷

3 讨 论

一般来说,大量的AQP存在于参与水分、离子集流的细胞中,主要是正在分裂和伸长的细胞及幼嫩部

位,如表皮细胞、雄蕊、正在发育的根等[13].CpAQP1在盛开期的花瓣中大量表达,可能参与花瓣的生长

发育,表明该基因具有发育阶段的表达特异性.Shiota等发现西红柿的7个PIPs基因在种子发育早期与后

期的表达量存在明显差异,说明植物水通道蛋白在种子生长中具有生长发育阶段的特异性[14].衰败期细胞

开始衰老,细胞膜液晶相发生改变,磷脂不能自由移动,选择透过性受损,此时细胞内有害物质的积累促

使机体增强细胞膜的通透性,CpAQP1大量表达,可能有利于运输这些物质.在高温处理下,植物体内水分大量蒸发,该基因的表达量逐渐升高,可能有利于增加细胞膜的通透性,

吸收水分从而调节细胞内水分平衡;用脱落酸进行胁迫处理,结果类似于Hose等发现ABA可增加离体玉

米根质膜的水分通透性,认为ABA与质膜上的蛋白发生相互作用,增强了质膜的水分通透性,基因表达量

逐渐降低[15].在高盐胁迫下,表达量呈现前期上升后期下降的趋势,这与Suleyman等用0.5mol/LNaCl渗透胁迫处理聚球藻AQPs的结果一致,其认为前期Na+向胞内流动而水分向胞外流动,大量水通道蛋白

表达,胞内Na+和K+,可能还有Cl+浓度升高,后期胞内渗透压增加引起内聚力改变从而使蛋白质构象发

生变化,最终引起通道关闭[16].在低温胁迫下,表达量呈现连续波动模式,这与陈儒钢等发现辣椒水通道

蛋白CaAQP在低温胁迫下表达量逐渐降低的结果不同[17],初步分析是本研究的水通道蛋白是一种液泡膜

内在蛋白,而其研究的水通道蛋白是一种质膜内在蛋白,两种类型的水通道蛋白可能在同一生理功能中的

作用存在差异.hiTAIL-PCR技术是用于克隆未知片段的一种有效、简便的方法,本研究利用它成功克隆了蜡梅水通

道蛋白CpAQP1基因的上游启动子,序列分析表明:该序列除具有典型的TATA-box、CAAT-box,还有

与胁迫相关的元件TC-richrepeats,转录顺式作用元件5UTRPy-richstretch及大量光应答元件ACE、G-box、motif、I-box等.同时构建植物表达载体pBI121-CpAQP1pro,通过筛选对生根的转基因烟草嫩叶进

行GUS组织化学染色分析,结果表明该启动子能驱动报告基因在转基因植物中稳定表达.后期提取移栽转基因烟草中的GUS蛋白与4-MU底物反应生成荧光物质,荧光分光光度计检测分析

其表达量,更准确的检测该启动子的活性.同时可继续构建该启动子大小不同的5’缺失载体,转入烟草

中,通过稳定表达GUS分析启动子上的哪些区段对该启动子的活性起着关键作用,从而继续探索启动子

在蜡梅抗寒抗旱等方面的调控机制.

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ChangesinTranscriptionLeveloftheAquaporinGeneCpAQP1fromChimonanthuspraecox

andtheCloningofItsPromoter

LIU Xiang, ZHAOZhi-xin, WANG Fei,QIN Zhao, SUIShun-zhao, LIMing-yang

SchoolofHorticultureandLandscapeArchitecture,SouthwestUniversity,

KeyLaboratoryofHorticultureScienceforSouthernMountainousRegionsofMinistryofEducation,

ChongqingEngineeringResearchCenterforFloriculture,Chongqing400716,China

Abstract:InordertoexploretherelationshipbetweenCpAQP1expressionlevelandstressinplants,theRT-PCRmethodwasusedtoanalyzetheexpressionofCpAQP1indifferentorgansofChimonanthusprae-coxatdifferentdevelopmentalstagesandunderdifferentstressconditionsinthisresearch.TheresultsshowedthatCpAQP1wasexpressedatahigherlevelinthepetalthaninotherorgansduringthefullbloomingstageoftheplant,anditshowednosignificantchangesunderabioticstresses(hightempera-ture,salinityandABA),indicatingthatCpAQP1mayhavetheorganizationaldifferencesinitsexpressionandmakeresponsestoabioticstresses.Meanwhile,apromoterfragmentof1082bpupstreamfromthe5’upperofCpAQP1wasclonedfromthegenomicDNAofC.praecoxbyhiTAIL-PCR.ThissequencewasthereafterdesignatedasCpAQP1pro(GenBankaccessionNo.JQ952563).Bioinformaticsanalysisrevealedthatthesequencecontainedthebasiccis-elements,suchasTATA-boxandCAAT-box,andsomeelementsinvolvedintheplantabioticstressandlightresponses.ThepromoterCaMV35sofpBI121wasreplacedbytheclonedpromoterCpAQP1pro,andthentheplantexpressionvectorpBI121-CpAQP1prowassuccess-fullyestablished.TheresultofstableexpressionbytheAgrobacteriumtumefaciens-mediatedmethodindi-catedthatthepromoterfragmenthadthefunctiontodrivetheexpressionoftheGUS(b-glucuronidase)reportergene.Keywords:Chimonanthuspraecox;AQPs(aquaporins);real-timePCR;promotercloning;hiTAIL-PCR

责任编辑 欧 宾

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