第 36 卷摇 第 1 期

2014 年 1 月

北 京 林 业 大 学 学 报

JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITYVol. 36, No. 1Jan. , 2014

白桦 BpMADS3 基因的功能分析

郑唐春摇 臧丽娜摇 丁摇 浩摇 曲冠证(东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室)

摘要:利用 RT鄄鄄PCR 技术,揭示了 BpMADS3 基因在白桦不同组织中的差异表达模式:BpMADS3 基因仅在花器官中

强烈表达,在茎、叶组织中不表达。 采用染色体步移法克隆 BpMADS3 基因上游启动子,获得 1 426 bp 长度启动子序

列,构建 BpMADS3 基因启动子驱动 GUS 基因植物表达载体,在拟南芥转基因植株中 GUS 染色表明,GUS 活性集中

在萼片和心皮中。 在拟南芥 ap1 突变体中过量表达 BpMADS3 基因,能恢复拟南芥 ap1 突变体花器官的正常发育。BpMADS3 基因转化烟草发现,转基因植株出现早花表型,且转基因烟草植株中相关开花基因表达水平均上调。关键词:白桦; BpMADS3; 突变体; 早花; 启动子

中图分类号:S792郾 153; Q786摇 摇 文献标志码:A摇 摇 文章编号:1000鄄鄄1522(2014)01鄄鄄0001鄄鄄07

ZHENG Tang鄄chun; ZANG Li鄄na; DING Hao; QU Guan鄄zheng. Functional characterization ofBpMADS3 gene from Betula platyphylla. Journal of Beijing Forestry University (2014)36(1)1鄄鄄7 [Ch,22 ref. ] State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin,150040, P. R. China.

In this study, we performed RT鄄PCR to compare expression level of BpMADS3 gene in differenttissues of Betula platyphylla. The results showed that BpMADS3 was strongly expressed in inflorescencesbut not stem and leaves. A 1 426 bp sequence upstream of BpMADS3 gene was cloned from the genomicDNA of B. platyphylla by PCR based on the genome walking method. Transgenic Arabidopsis linescontaining a BpMADS3 promoter: GUS construct were obtained, which only exhibited strong GUS stainingin sepal and carpel. Overexpressed BpMADS3 in Arabidopsis ap1 mutant, the results showed thephenotype of ap1 was recovered. Ectopic expression of BpMADS3 significantly enhanced the flowering oftransgenic tobacco, and the expression level of some flowering鄄related genes was significantly up鄄regulatedin transgenic tobacco compared with the wild鄄type.Key words摇 Betula platyphylla; BpMADS3; mutant; early blossoming; promoter

摇 摇 收稿日期: 2013鄄鄄05鄄鄄28摇 修回日期: 2013鄄鄄09鄄鄄17基金项目: 国家自然科学基金项目(31070595)。第一作者: 郑唐春,博士生。 主要研究方向:林木遗传改良。 Email:zhengtangchun@ hotmail. com摇 地址:150040 黑龙江省哈尔滨市和兴路

26 号东北林业大学林学院。责任作者: 曲冠证,副教授。 主要研究方向:林木遗传改良及育种。 Email: quguanzheng@ hotmail. com摇 地址:同上。本刊网址: http:蛐蛐journal. bjfu. edu. cn

摇 摇 MADS鄄box 基因是一类序列相似且特异的转录

因子家族,其通过激活或抑制其他相关基因的转录

反应来发 挥 自 身 的 生 物 学 功 能[1]。 植 物 中 的

MADS鄄box 基因一般包括 6 个内含子和 7 个外显子,其中的位于外显子 1 内的 MADS 盒结构域和位于

3 ~ 5 外显子处的 K 盒结构域高度保守,在不同物种

间具有较高的同源性[2]。 高等植物经历一定时间

的营养生长后,在外界环境和内在基因的双重调控

下,植物会向生殖生长转换,这一重要的转折点被称

为成花过程。 大量研究表明,MADS鄄box 基因在成

花 的 发 育 过 程 中 起 着 重 要 的 作 用。 拟 南 芥

(Arabidopsis thaliana ) APETALA1 (AP1) 基因属于

MADS鄄box 家族成员,研究表明 AP1 基因不仅在花

分生组织形成初期起调节作用,而且也参与后期的

花器官的形态发育过程。 在拟南芥花分生组织发育

中, AP1 与 FT ( FLOWERING LOCUS T )、 LFY(LEAFY) 及 TFL1 (TERMINAL FLOWER 1) 等基因

的相互作用,共同调控花分生组织的形成[3鄄鄄4]。 在

北摇 京摇 林摇 业摇 大摇 学摇 学摇 报 第 36 卷

拟南芥中,原位杂交数据显示 AP1 基因仅在花中有

强烈信号,而在根、茎、叶中未检测到。 进一步研究

发现,AP1 杂交信号最初在花原基中出现,伴随花原

基的慢慢膨大,AP1 的检测信号增强;在接下来的花

器官分化阶段,AP1 杂交信号仅在萼片和花瓣中检

测到[2,5鄄鄄6]。 大量转基因研究发现,许多 AP1 同源基

因在内源或异源植物中过量表达后均能提前进入生

殖生长阶段,缩短植物的营养生长期[2鄄鄄6]。白桦(Betula platyphylla)是我国东北地区重要

的经济树种之一。 具有生长迅速、易于栽培和用途

广泛等特点[7鄄鄄8]。 因为 MADS 基因家族在控制花的

形成中起关键作用,所以为促进白桦育种实验进程,克隆并分析 MADS 成花基因在白桦体内的表达机

制 及 生 理 功 能 具 有 重 要 的 实 际 意 义。 白 桦

BpMADS3 基因 (GenBank No. JX565468) 与拟南芥

AP1 基因同源性高达 73% ,属于 MADS鄄box 家族成

员,编 码 1 个 转 录 激 活 因 子, BpMADS3 包 含 的

MADS鄄box、K鄄box 相对比较保守,而 C鄄末端与其他

物种差异较大[9]。 本研究将 BpMADS3 基因在拟南

芥 ap1 突变体和烟草(Nicotiana tabacum)中异源表

达,来探讨白桦 BpMADS3 基因的表达原理,希望能

为探明林木成花反应机理及利用基因工程改造白桦

育种周期提供理论数据。

1摇 材料与方法

1郾 1摇 材摇 料

白桦实验材料于 2012 年 5—6 月采自东北林业

大学白桦强化育种园,取样前用黑袋遮盖植株进行

6 h 黑暗处理,分别采集正常采光和黑暗处理的雄花

序、茎尖、幼叶、成熟叶和老叶材料,所有样品液氮速

冻后于 - 80 益保存。转 BpMADS3 基因烟草为本实验室保存,以野生

型烟草为对照,分别采集生长 30 d 幼苗的茎尖和幼

叶混合样,液氮速冻后于 - 80 益保存。拟南芥 ap1鄄10 突变体(编号为 CS6230)购自拟

南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological ResourceCentre,ABRC),以野生型(Col鄄0)为对照。 在培养

室(22 ~ 23 益) 中生长,相对湿度 60% ~ 80% ,每天

16 h 光照 / 8 h 黑暗,光强约 150 滋mol / (m2·s)。1郾 2摇 方摇 法

1郾 2郾 1摇 RNA 提取

将 - 80 益 冻存的材料在液氮中研磨成粉,利用

改良的 CTAB 法[10] 对白桦和烟草总 RNA 进行提

取,利用超微量紫外分光光度计 (NanoDrop襆 RND鄄1000) 测定纯度和浓度后,取 0郾 5 滋g 总 RNA 样品为

模板,采用反转录试剂盒 (TaKaRa) 进行 cDNA 合

成。 将获得的 cDNA 样品稀释 10 倍后,用于后续

RT鄄PCR 模板。1郾 2郾 2摇 RT鄄PCR

为验证 BpMADS3 基因在白桦不同组织的表达

特异性和转 BpMADS3 基因烟草中相关开花基因的

表达水平,进行 RT鄄PCR 检验。 扩增体系为:10 滋L2 伊 PCR Mix、上游引物 Primer鄄F (10 滋mol / L)、下游

引物 Primer鄄R(10 滋mol / L) 各 1、2 滋L 稀释的各样品

的模板,加去离子水补足 20 滋L。 反应条件为:94 益预变性 3 min;94 益 变性 30 s;60 益 退火 30 s;72 益延伸 30 s;72 益再延伸 7 min,28 次循环。 用 18S 基

因作为内参,相关引物序列见表 1。

1郾 2郾 3摇 启动子克隆及 GUS 染色

利用 CTAB 法提取白桦 DNA,以白桦 BpMADS3基因的碱基序列设计 3 条间隔 50 bp 左右的特异性

引物:SP1 / SP2 / SP3 (见表 1)。 按照 Genome walkingkit (TaKaRa) 操作说明,以新提取的白桦基因组

DNA 为模板,以低退火温度的随机引物 AP1 / AP2 /AP3 / AP4 为上游引物,以 BpMADS3 基因的特异性

引物为下游引物,经过 3 轮 PCR。 将第 3 轮 PCR 中

的单一亮带纯化后连接 pEASY鄄T1 载体,送上海英

骏公司测序。 根据测序结果设计启动子特异性引

物 BpMADS3鄄P鄄F / R (见表 1 ),在限制性内切酶

Nco I 和 Hind III 的 处 理 下, 将 目 的 条 带 连 入

pCAMBIA鄄1301 植物表达载体中。 利用液氮冻融

法将构建好的重组子 ( p1301鄄PBpMADS3鄄GUS) 转

化农杆菌 EHA105,将农 杆 菌 EHA105 ( p1301鄄PBpMADS3鄄GUS) 侵染野生型拟南芥,利用潮霉素

筛选转基因植株。 将拟南芥播种后,在植株的整

个生长周期内取材,将材料浸入 GUS 染色液[11]

中,抽真空处理 10 min 后,再 37 益 染色 6 h,拟南

芥材料的后续固定、脱色及透明处理参考曲冠证

等的实验方法[12] 。

1郾 2郾 4摇 拟南芥突变体回补实验

将构建好 proKII鄄BpMADS3 载体,转入农杆菌

EHA105 菌中,采用浸花法侵染拟南芥突变株 (ap1鄄10),获得拟南芥突变体转基因植株。 播种 T2 代转

基因突变株,待莲座叶富集后,摘取几片莲座叶用

CTAB 法[13]提取拟南芥总 DNA。 利用 BpMADS3 基

因引物 (见表 1),检测抗性植株。 PCR 反应体系如

下:94 益 预变性 3 min;94 益 变性 30 s;60 益 退火

30 s;72 益 延伸 40 s;72益 再延伸 7 min,28 次循环。PCR 产物取 5 滋L,进行电泳分析。

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摇 第 1 期 郑唐春等: 白桦 BpMADS3 基因的功能分析

表 1摇 PCR 引物的名称及序列

Tab. 1摇 Name and sequence of PCR primers

引物名称 引物序列 用途

BpMADS35忆鄄ATGGGGAGGGGTAGGGTTCAGCT鄄3忆5忆鄄TCACGTGGCAAAGCATCCAAGGT鄄3忆 BpMADS3 基因克隆 / 检测

SP1SP2SP3

5忆鄄CTCATAGCGTTCAAGTATTTTCTC鄄3忆5忆鄄GCAACCTCAGCATCACACAGAAC鄄3忆5忆鄄CGTAACCTGGCGGTTGATCTTA鄄3

染色体步移法克隆启动子

BpMADS3鄄P 5忆鄄ATCAAGCTTCGTAACCTGGCGGTTG鄄3忆5忆鄄ATCCCATGGCTCTCTTTCTCAAAGGAGAAA鄄3忆 启动子植物表载体构建

Bp18S 5忆鄄ATCTTGGGTTGGGCAGATCG鄄3忆5忆鄄CATTACTCCGATCCCGAAGG鄄3忆 白桦 RT鄄PCR

BpMADS3鄄RT 5忆鄄CTAGTTGCAGCTGATTCTGAAGG鄄3忆5忆鄄CCTTTCTCTGAAGCTGCGAG鄄3忆

Nt18S 5忆鄄TGTGTTGGACTCTGGTGATG鄄3忆5忆鄄CGCTCGGTAAGGATCTTCATC鄄3忆 烟草 RT鄄PCR

NtMADS4 5忆鄄GGAAGACTCAAAACATGCTGG鄄3忆5忆鄄TGACAATCGAAGTGGAACTCG鄄3忆

NtMADS11 5忆鄄AAGAAAGGGAGAAAGAGCTGG鄄3忆5忆鄄GGGCTGTGACAAAACGAATG鄄3忆

NtFUL 5忆鄄GCTCTTAAACACATTCGCTCAAG鄄3忆5忆鄄CAACTCTTTCTCCCTCTCCTTC鄄3忆

NtSOC1 5忆鄄TGGCCTTCAACAGAGACAAG鄄3忆5忆鄄ACGCCTTATTCTGCACTCG鄄3忆

NFL2 5忆鄄AATCAGGTGTTCAGGTACGC鄄3忆5忆鄄TCGCTCCTTGAAAGCTCTTC鄄3忆

2摇 结果与分析

图 1摇 BpMADS3 基因在白桦不同组织的表达模式分析

Fig. 1摇 Expression pattern of BpMADS3 in differenttissues of B. platyphylla

2郾 1摇 白桦 BpMADS3 基因的组织特异性表达

采用定量 RT鄄PCR 分析 BpMADS3 基因在白桦

不同组织中的表达水平,结果显示 BpMADS3 基因只

在白桦雄花序中检测出来,在茎尖、叶片等部位未检

测到,且黑暗处理的雄花芽表达量稍微低一些 (图1),这和拟南芥中 AP1 基因的表达特征是一致的。结合该基因为拟南芥 AP1 的同源基因,推测该基因

可能在控制白桦花分生组织特性与花器官的形成过

程中起着重要的作用。2郾 2摇 白桦 BpMADS3 基因启动子的克隆

根据染色体步移法对白桦总 DNA 进行未知序

列扩增后,PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测,在

第 3 轮 PCR 中获得 1 条长度约 1 500 bp 的片段 (图2)。 目的条带测序后利用 Bioedit 软件比对分析,发现未知序列能够与已知的 BpMADS3 基因部分碱基

序列重合,说明 BpMADS3 基因的上游启动子步移成

功(图 3)。 通过在 PLACE 公共数据库进行功能元

件预测,结果显示,BpMADS3 启动子包含多种作用

元件:1) TATA鄄box,是启动子的核心元件,控制转录

的起始位置及频率;2) CAAT鄄box,具有增强基因转

录的作用;3) HSE 元件:HSE(heat stress element)元件,参与热激反应;4) 光学元件:序列中含有大量光

作用的顺式元件,如 SP1、LAMP、I鄄box、GT1、G鄄box、GATA 等,说明该启动子可能受光调控;5) 植物激

素作用元件:序列还含有多个植物激素应答元件,如生长激素应答元件 TGA、脱落酸应答元件 ABRE、乙烯应答元件 ERE。2郾 3摇 白桦 BpMADS3 基因启动子在拟南芥中的表

达模式

利用白桦 BpMADS3 基因启动子替代 p1301 载

体中的 CaMV 35S 启动子来驱动 GUS 报告基因。 转

基因拟南芥 GUS 染色表明:在拟南芥的营养生长阶

段未检测到 GUS 表达,当植株进入生殖阶段后在幼

嫩的花器官、萼片和心皮中检测到较高的 GUS 表达

(图 4)。 然而其他研究者证明[2,6],拟南芥花器官分

3

北摇 京摇 林摇 业摇 大摇 学摇 学摇 报 第 36 卷

M. DNA Marker DL5 000; 1 ~ 4. 第 1 轮 PCR 产物电泳结果; 5 ~ 8. 第 2 轮 PCR 产物电泳结果; 9 ~ 12. 第 3 轮 PCR 产物电泳结果。图 2摇 染色体步移法克隆白桦 BpMADS3 基因启动子

Fig. 2摇 Cloning of promoter of BpMADS3 for B. platyphylla by genome walking

黑三角标注为起始密码子,加粗标注为 TATA鄄box 元件,不同下划线标注为预测的功能元件。图 3摇 白桦 BpMADS3 基因启动子序列

Fig. 3摇 Promoter sequence of BpMADS3 gene for B. platyphylla

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摇 第 1 期 郑唐春等: 白桦 BpMADS3 基因的功能分析

摇 摇

图 4摇 白桦 BpMADS3 基因启动子转拟南芥

植株的 GUS 染色检测

Fig. 4摇 Analysis of GUS staining under control of promoterof BpMADS3 for B. platyphylla in transgenic Arabidopsis

摇

化后,拟南芥 AP1 基因仅会在萼片和花瓣中表达,这可能因为不同物种中,AP1 同源基因的表达存在

一定差异。2郾 4摇 拟南芥突变体的表型恢复

将构建好 proKII鄄BpMADS3 载体采用浸花法对

拟南芥 ap1 突变体进行回补实验,共获得 11 株抗性

苗,T2 代幼苗经 PCR 检测都为转基因植株 (图 5)。通过对回补 BpMADS3 基因的 ap1 突变体植株的性

状观察发现,回补突变株基本与野生型植株无明显

差别,主要表现在花序及花器官趋于正常 (图 6 A),花瓣出现,2 萼片恢复为正常的 4 萼片 (图 6 B ~ D),角果发育也恢复正常 (图 6 E)。

M. DNA Marker DL5 000; 1. proKII鄄BpMADS3 阳性质粒 PCR 产物电泳结果; 2 ~ 12. 转基因拟南芥 DNA PCR 产物电

泳结果; 13. 阴性对照。图 5摇 转基因拟南芥的 PCR 检测

Fig. 5摇 PCR test of transgenic Arabidopsis

A. 拟南芥 ap1 突变体与 BpMADS3 基因回补 ap1 突变体转基因植株;B. 野生型拟南芥花序;C. 拟南芥 ap1 突变体花序;D. BpMADS3 基因

回补 ap1 突变体转基因植株花序;E. 不同植株长角果的表型;WT. 野生型拟南芥;ap1鄄10. 拟南芥 ap1鄄10 突变体; 35S::BpMADS3. 白桦

BpMADS3 基因回补拟南芥 ap1鄄10 突变体植株。图 6摇 白桦 BpMADS3 基因在拟南芥 ap1 突变体中的功能分析

Fig. 6摇 Functional analysis of BpMADS3 for B. platyphylla in ap1 mutants of Arabidopsis摇

2郾 5摇 白桦 BpMADS3 基因在烟草中的异源表达

将已获得的转 BpMADS3 基因烟草 T3 代种子播

种后在培养室中培养,3 周后,转基因烟草幼苗先于

野生型开始抽茎,4 周左右,转基因幼苗开始转为生

殖生长,出现花器官 (图 7 A ~ B);通过与野生型比

较发现,转基因植株的叶片相对较小,颜色为深绿色

(图 7 C);一般 2 个月左右开花的野生型,通过白桦

BpMADS3 基因在烟草中异源表达后,开花时间提早

了近 1 个月 (图 7 D)。2郾 6摇 转 BpMADS3 基因对烟草植株中相关开花基

因的调控

为了研究转基因烟草植株早开花的原因,对烟

5

北摇 京摇 林摇 业摇 大摇 学摇 学摇 报 第 36 卷

A. 4 周大的野生型烟草; B. 4 周大的转基因烟草; C. 转基因与野生型烟草的叶片对比; D.转基因与野生型烟草开花时间对比(T. 转基因烟草;WT. 野生型烟草)。

图 7摇 转基因烟草的表型分析

Fig. 7摇 Phenotype analysis of transgenic tobacco摇

草中 的 5 个 调 控 开 花 的 基 因 NtMADS4 ( No.AF068723 )、 NtMADS11 ( No. AF385746 )、 NFL2( Nicotiana FLO / LFY, No. U16174 )、 NtFUL( FRUITFULL, No. DQ534202 )、 NtSOC1( SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OFCONSTANS 1, No. X76188)进行定量分析。 结果表

明,上述 5 个开花基因在转基因烟草中的表达量都

图 8摇 转基因烟草中开花相关基因的表达分析

Fig. 8摇 Expression analysis of flowering鄄relatedgenes in transgenic tobacco

高于野生型,且早花基因 NtMADS4、NtMADS11 表达

量远远高于野生型(图 8)。 推测白桦 BpMADS3 基

因在烟草中的异源表达调控了烟草中上述开花相关

基因的表达,导致烟草提前进入生殖生长。

3摇 结论与讨论

植物花的形成经历了一系列组织分化的调控过

程,由营养生长阶段向生殖生长阶段的转变过程是

受复杂的基因调控网络控制的[14鄄鄄15]。 高等植物开

花基因 AP1 在花发育过程中,AP1 基因不仅在花原

基发育早期对花分生组织起决定作用,还影响花器

官的起始和发育,在成花中起关键调节作用[2鄄鄄4]。以 AP1 为中心的成花调控网络的研究已取得可喜

的进展,在模式植物拟南芥中,AP1 这种双重功能主

要反映在 AP1 表达模式上[5鄄鄄6]。 本研究表明,白桦

BpMADS3 基因主要进入生殖生长阶段的组织中表

达,而在早期的营养生长阶段的组织中不表达 (图1),这说明白桦 BpMADS3 基因对花分生组织和花

器官的形成可能有重要的调控作用。 ap1 突变体的

表型也说明了 AP1 对成花和花器官发育的双重作

用:在 ap1 突变体中 AP1 基因表达受阻会导致外轮

的萼片组织转变为叶片状器官,并导致部分花瓣缺

失,同时在叶片状器官向内长出第 2 轮花瓣时,这种

异常模式可重复多次[16鄄鄄17]。 本研究表明,白桦

BpMADS3 基因在回补 ap1 突变体后,突变体原有的

花萼、花瓣等表型均恢复为野生型 (图 6 B ~ D),这也从另一个方面说明白桦 BpMADS3 基因与拟南芥

AP1 基因在蛋白水平同源性较高,具有相似的生物

学功能。研究结果表明,BpMADS3 基因的过表达显著促

进了转基因烟草的开花,转基因植株在播种后 1 个

月开始出现花芽,而野生型植株在播种后 2 个月左

6

摇 第 1 期 郑唐春等: 白桦 BpMADS3 基因的功能分析

右才出现第 1 个花芽 (图 7 D),这与 Elo 等人[18]的

研究结果一致。 转基因烟草的长 /宽比率更高一些

(图 7 C),这些特性是野生型烟草由营养生长向生

殖生长转变的指标,我们认为转基因烟草的表型改

变是早花的表现。 已有研究证实在转基因烟草中,一些 MADS鄄box 基因的异位表达导致早花,增加了

与开花相关的内源基因的表达[19鄄鄄20]。 在本研究中,转基 因 植 株 中 内 源 基 因 NtMADS4、 NtMADS11、NFL2、 NtSOC1、 NtFUL 都有表达。 之前的研究表

明,NtSOC1、 NtFUL、 NtMADS4 基因的异位表达能

够加 速 烟 草 花 期 的 转 变, 在 ap1鄄1 突 变 体 中,NtMADS11 的异位表达能够恢复花器官正常表

型[19, 21鄄鄄22]。 上述基因在转基因烟草中的加速表达,在烟草花期转变中起到重要的作用,我们认为这可

能是因为 BpMADS3 基因的过表达在烟草花期转变

的初期阶段起到重要的作用。 然而,花期的转变是

由很多因素共同调控的,每个开花相关基因都表现

出不同的表达情况,故而单个基因的研究不能脱离

整体,如何架构以 AP1 基因为中心的多方向的成花

调控体系,阐明成花机理将是今后的重点研究方向。参 考 文 献

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(责任编辑摇 赵摇 勃)

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