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Escherichia coli O157:H7 et les Escherichia producteurs de Shigatoxines (STEC) dans la viande: Quelles sont les dernières découvertes ?. 25 Oct. 2005. Seize enfants ont été hospitalisés pour une « intoxication alimentaire grave » après avoir consommé des steaks - PowerPoint PPT Presentation
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Escherichia coliEscherichia coli O157:H7 O157:H7 et les et les EscherichiaEscherichia producteurs de producteurs de
Shigatoxines (STEC)Shigatoxines (STEC)dans la viande: Quelles dans la viande: Quelles
sont les dernières sont les dernières découvertes ?découvertes ?
2
Intoxication au steak hachéSeize enfants ont été
hospitalisés pour une
« intoxication alimentaire
grave » après avoir
consommé des steaks
hachés surgelés distribués
par Leclerc, dans 19
départements du Sud Ouest.
25 Oct. 2005
3
Alerte à la viande avariée en France
(24/03/08)
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DOSES INFECTIEUSESDOSES INFECTIEUSES
TRES BASSESTRES BASSES
QUELQUES BACTERIES /25 gQUELQUES BACTERIES /25 gMultiplication bactérienne Multiplication bactérienne
non nécessaire, contamination suffisante!!!non nécessaire, contamination suffisante!!!Acidoresistance !!Acidoresistance !!
5
La coupable !!
6
Comment faire ?????
7
Vers une nouvelle classification Vers une nouvelle classification des souches pathogènes ?des souches pathogènes ?
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gène eae ( LEE sur îlot de pathogénicité PAI III)
(nombreux variants !!)
Production de verotoxines = shigatoxines ( gène stx)
(Knutton et al, Infect. Immun. 1987)
Lésions d ’attachement et d’effacement
9
Ancienne dénomination Nouvelle dénomination
gène protéine
Toxine de Shiga stx Stx
Toxine Shiga-like de type I ou(SLT-I) ou vérotoxine 1(VT1) stx1 Stx1
SLT-II ou VT2 stx2 Stx2
SLT-IIc/d ou VT2c/d stx2c/d
SLT-II/f ou VT2e/f stx 2e/f
99 % d'homologie
55 % d'homologie
90% d'homologie
Verotoxine ou shigatoxine
Stx2c/dStx2e/f
Autres variants décrits très récemment : stx2 g, . stx2-NV206
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Sérotype O157:H7Sérotype O157:H7 Autres sérotypes..mais liste non Autres sérotypes..mais liste non
exhaustiveexhaustive Stx2 et eae et SHU : Stx2 et eae et SHU : (Ethelberg et (Ethelberg et al.al. 2004 2004
(Danemark), Tarr et (Danemark), Tarr et al.al. 2005, Karmali 2004 2005, Karmali 2004
Marqueur de virulence des STEC ?Marqueur de virulence des STEC ?Acidoresistance ???Acidoresistance ???
11
SOUCHE STEC PATHOGENEDéfinition actuelle de l’AFSSA
•Appartient aux sérogroupes O157:H7, O26, O103, O111 ou O145
•ET
•Stx+ et eae+
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Approche MRA molecular risk Approche MRA molecular risk assessment (Coombs et al 2008)assessment (Coombs et al 2008)
CCongrés du PEN 4-5 mars 2008 à Romeongrés du PEN 4-5 mars 2008 à Rome
Îlots de pathogénicité,Îlots de pathogénicité, O-IslandO-Island SéropathotypeSéropathotype Variants Variants eae eae , , stx stx
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17
18
19
20
21
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DETERMINATION DES DETERMINATION DES FACTEURS DE VIRULENCEFACTEURS DE VIRULENCE
- O26O26- flagelle H11flagelle H11- eae (variants)eae (variants)- stxstx commun, commun, stx stx 1 et 1 et stx stx 2 et variants 2 et variants stx2stx2- Îlot O122: Z4321, Z4326, Z4332, Z4333Îlot O122: Z4321, Z4326, Z4332, Z4333
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Z4332Z4332
Z4333Z4333
Z4321Z4321
Z4326Z4326
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Les « EHEC typiques »Les « EHEC typiques »
EHEC O157:H7EHEC O157:H7 = = rfbEO157rfbEO157, , flicH7flicH7, , stx1stx1 et/ou et/ou stx2stx2, , eaeeae-gamma, O#122.-gamma, O#122.
EHEC O26:H11EHEC O26:H11 = = wzxO26wzxO26, , flicH11flicH11, , stx1stx1 et/ou et/ou stx2stx2, , eaeeae-beta, O#122.-beta, O#122.
EHEC O145:H28EHEC O145:H28 = = ihp1O145ihp1O145, , flicH28flicH28, , stx1stx1 et/ou et/ou stx2stx2, , eaeeae-gamma, O#122-gamma, O#122..
EHEC O103:H2EHEC O103:H2 = = wzxO103wzxO103, , flicH2flicH2, , stx1stx1 et/ou et/ou stx2stx2, , eaeeae-epsilon, O#122.-epsilon, O#122.
EHEC O111:H8EHEC O111:H8 = = wbd1O111wbd1O111, , flicH8flicH8, , stx1stx1 et/ou et/ou stx2stx2, , eaeeae-theta, O#122-theta, O#122..
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SOUCHE STEC PATHOGENEDéfinition de l’AFSSA
•Appartient aux sérogroupes O157:H7, O26, O103, O111 ou O145
•ET
•Stx+ et eae+
Mais définition en cours de révision par l’AFSSA (AST de la DGAL transmise début mai 2008)
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Quels sont les Quels sont les E. coliE. coli que les que les industriels doivent prendre en industriels doivent prendre en considération dans leur plan considération dans leur plan
HACCP, pourquoi ?HACCP, pourquoi ?
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E. coli O157:H7stx+ et eae+
Séropathotype A
E. coli O26, O111, O103, O145stx+, eae+
Séropathotype B
STEC (autres sérotypes)
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Quelles sont les méthodes de Quelles sont les méthodes de détection actuellement détection actuellement
reconnues ? Quel est le rôle du reconnues ? Quel est le rôle du laboratoire national de laboratoire national de
référence dans la validation référence dans la validation des méthodes de détection ?des méthodes de détection ?
30
E. coliE. coli O157:H7 O157:H7
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Deux méthodes validées Deux méthodes validées AFNOR en France et une AFNOR en France et une
norme ISO norme ISO
Séparation Séparation Immunomagnétique Immunomagnétique (Dynabeads. Dynal) (Dynabeads. Dynal)
Norme ISO EN 16654Norme ISO EN 16654 Méthode VIDASMéthode VIDASTM TM (bioMérieux)(bioMérieux) Méthode Bax (Oxoid)Méthode Bax (Oxoid)
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Bactéries E. coli O157et billes magnétiques
(microscopie électronique)
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VIDAS biomérieux
34
VIDAS: Sample preparationVIDAS: Sample preparation
SampleSample
Heating stepHeating step
TestTest
15 min 95°C15 min 95°C
45min45min
35
)
BAX Oxoid
36
REAL TIME PCR: Sample preparationREAL TIME PCR: Sample preparation
SampleSample
Bacterial lysisBacterial lysis
PCRPCR
Lysis bufferLysis buffer
20min 37°C 20min 37°C 10min 95°C 10min 95°C 5 min 4°C 5 min 4°C
mix PCRmix PCR
37
Real Time PCR: Sample preparationReal Time PCR: Sample preparation
SampleSample
Bacterial lysisBacterial lysis
PCRPCR
45 min45 min
3h 30min3h 30min
38
Enrichissement Enrichissement 8H8H pour les 2 pour les 2 méthodesméthodes
Taux de non isolement du pathogène Taux de non isolement du pathogène après message présomptif (2à 5 pour après message présomptif (2à 5 pour 1000) pour le VIDAS, pas de recul en 1000) pour le VIDAS, pas de recul en France pour le BaxFrance pour le Bax
Attention phase Attention phase d’immunoconcentration nécessaire d’immunoconcentration nécessaire avant isolement !!! Prévoir IMS après avant isolement !!! Prévoir IMS après le BAXle BAX
Boites avec colonies suspectes à Boites avec colonies suspectes à confirmer par le LNRconfirmer par le LNR
Utilisation des caractéristiques Utilisation des caractéristiques biochimiques de biochimiques de E. coliE. coli O157:H7 O157:H7 (Mutants!)(Mutants!)
sorbitol sorbitol – -glucuronidase-glucuronidase – rhamnose –Résistance intermédiaire au céfixime
et au tellurite
40
Milieu CT-SMAC Milieu CHROM agar
Milieu O157:H7
41
Méthodes nouvelles.. Méthodes nouvelles.. Délai d’analyse <8hDélai d’analyse <8h Echantillon composite (375g)Echantillon composite (375g)
METHODES DE DETECTION METHODES DE DETECTION DES STEC non O157DES STEC non O157
AUCUNE CARACTERISTIQUE AUCUNE CARACTERISTIQUE BIOCHIMIQUE BIOCHIMIQUE COMMUNE !!!!!COMMUNE !!!!!
43
eae +
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46
eae +
47
InconvénientsInconvénients PCR (même en temps réel) signification PCR (même en temps réel) signification
d’un message positif. Genesystem d’un message positif. Genesystem Quid de l’enrichissement commun de Quid de l’enrichissement commun de
l’ensemble des 5 sérogroupes de l’ensemble des 5 sérogroupes de STECSTEC ?? ?? Non optimisé à ce jourNon optimisé à ce jour
Quid de l’isolement des souches STEC? Quid de l’isolement des souches STEC? (taux de confirmation??) (taux de confirmation??)
Outil validé pour screening en PCR sur Outil validé pour screening en PCR sur souches STEC pures souches STEC pures mais validation mais validation nécessaire sur matrices nécessaire sur matrices
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Résultats du Plan de Résultats du Plan de surveillance VH surgelées surveillance VH surgelées
20072007
49
50
3,7%
Taux de confirmation= 9%
51
3354 échantillons analysés: 3354 échantillons analysés: - 964 PCR stx +- 964 PCR stx +- 172 PCR eae +- 172 PCR eae +- 121 PCR + pour les 5 sérogroupes - 121 PCR + pour les 5 sérogroupes d'intérêt parmi lesquels : d'intérêt parmi lesquels : * 62 O103 : seulement 13 souches d‘E. * 62 O103 : seulement 13 souches d‘E. coliO103 isolées dont 3 STEC pathogènes coliO103 isolées dont 3 STEC pathogènes * 21 O157 : 5 souches d‘ E. coliO157:H7 * 21 O157 : 5 souches d‘ E. coliO157:H7 isolées (pas d'autres O157 a priori)isolées (pas d'autres O157 a priori)* 16 O26 : 6 souches d‘E. coliO26 isolées * 16 O26 : 6 souches d‘E. coliO26 isolées dont 2 STEC pathogènes (et 4 EPEC)dont 2 STEC pathogènes (et 4 EPEC)* 14 O145 : 1 souche d‘ E. coliO145 * 14 O145 : 1 souche d‘ E. coliO145 isolées(EPEC mais non STEC pathogènes)isolées(EPEC mais non STEC pathogènes)* 8 O111 : 1 souche d‘ E. coli O111 * 8 O111 : 1 souche d‘ E. coli O111 isolées pathogènes.isolées pathogènes.
52
A ce jour, il n’existe pas A ce jour, il n’existe pas de méthode validée pour de méthode validée pour
la détection et l’isolement la détection et l’isolement des STEC pathogènedes STEC pathogène
Role du LNR =validation , Role du LNR =validation , existence de lignes existence de lignes
directrices directrices
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Maîtrise du danger STEC Maîtrise du danger STEC par les professionnelspar les professionnels
54
Où le gestionnaire du risque Où le gestionnaire du risque place t’il le curseur de la place t’il le curseur de la
maîtrise du danger STEC dans maîtrise du danger STEC dans la filière VH ?la filière VH ?
Risque épidémique (SHU) ?Risque épidémique (SHU) ?
Risque sporadique (SHU) ?Risque sporadique (SHU) ?
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Maîtriser le risque épidémique de SHUMaîtriser le risque épidémique de SHU
– Contrôler individuellement chaque mêléeContrôler individuellement chaque mêléeEt Et – Lors de résultats d’autocontrôles positifs, Lors de résultats d’autocontrôles positifs,
établir la concentration du pathogène établir la concentration du pathogène dans la mélée contaminée pour une dans la mélée contaminée pour une maîtrise adaptée et plus pertinentemaîtrise adaptée et plus pertinente
59
Gestion des résultats positifs Gestion des résultats positifs
par l’estimation de la par l’estimation de la concentration du pathogèneconcentration du pathogène
60
Un plan d’échantillonnage de 30 fois 25 grammes permet de Un plan d’échantillonnage de 30 fois 25 grammes permet de quantifier la concentration dans la mêlée dans une gamme quantifier la concentration dans la mêlée dans une gamme allant environ de 0,001 à 0,1 cellule par gramme. allant environ de 0,001 à 0,1 cellule par gramme.
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30 échantillons de 25 g chacun puis regrouper (« pooler ») par 3 les échantillons de 25 g pour constituer des échantillons composites de 75 g soumis à l’analyse. On réduit ainsi par 3 le nombre d’analyses. La limite de détection de l’analyse est identique (Vimont A. et al. 2006)
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Mêlée contaminée (un autocontrôle positif)29 autres analyses sur 25 g ou 9 analyses sur 75gsur cette mêlée contaminée (total 30 ou 10)
Si tous positifs
Contrôle mêlées aval + amontet cascade d’analyses si positif (arrêt quand négatif ou nettoyage désinfection)Contrôle mêlées issues de la même matière première (+ cascades)Plan d’échantillonnage 10 ou 30
Si au moins un négatif
Contrôle mêlées aval + amontet cascade d’analyses si positif (arrêt quand négatif ou nettoyage désinfection)Plan d’échantillonnage 10 ou 30
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PerspectivesPerspectives Optimisation des méthodes de détection Optimisation des méthodes de détection
(rapidité , possibilité de tester des (rapidité , possibilité de tester des échantillons composites…)échantillons composites…)
Attention !! La détection ne serait se Attention !! La détection ne serait se substituer à la maîtrise de la substituer à la maîtrise de la contamination fécale lors de l’abattage-contamination fécale lors de l’abattage-habillage des animaux habillage des animaux – Limitation du portage animal, Limitation du portage animal, – animaux animaux PROPRESPROPRES à l’arrivée à l’abattoir, à l’arrivée à l’abattoir,
Hygiènes des opérations d’abattage, Hygiènes des opérations d’abattage, – hygiène des hachoirs…) hygiène des hachoirs…)
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Selon la distribution de Poisson et en supposant une contamination homogène de la totalité de la mêlée :
P= 1-e-(C*M) C, niveau de contamination et M, masse de steak haché
Niveau de contamination
de la mêlée(UFC E. coli O157:H7.g-1)
Probabilité de détection de E. coli O157:H7
selon la prise d’essai réalisée (%)
25g 75g 125g 375g 750g
4.10-3 (0,1 UFC/25g) 10 26 39 78 95
0,04 (1 UFC/25g) 63 95 99 99,99 1000,1 92 99,9 99,99 100 1001 100 100 100 100 100
1.2 Calcul théorique de la probabilité de détecter E. coli O157:H7 en fonction de la prise d’essai effectuée