Microbiologia Industrial Experimental

Espectrofotometria

Gustavo Naame

João Almeida

Matheus Rosestolato

1. Objetivo

Este relatório consiste em um experimento que visa: familiarização dos alunos

com a utilização de técnicas espectrofotométricas, elaboração de uma curva padrão

de concentração x absorbância para soluções aquosas de fermento biológico

prensado, além da determinação da concentração de leveduras em soluções

desconhecidas de acordo com suas absorbâncias.

2. Introdução

A espectrofotometria é a técnica analítica que utiliza a absorção de luz pela

matéria e a forma mais usual de identificar e determinar quantitativamente a

concentração de compostos presentes em solução. Isto é feito pelo

espectrofotômetro, onde uma intensidade de radiação transmitida por uma solução

amostra pode ser medida em comparação com uma solução de referência (branco)

[1].

Os espectrofotômetros, em geral, contêm cinco componentes principais:

fontes de radiação, monocromador, recipientes para conter as soluções (cubetas),

detectores (espectrofotômetro) e indicadores de sinal [1].

A espectrofotometria é amplamente utilizada em laboratórios de área básica,

bem como em análises clínicas. A maioria dos métodos utilizados em bioquímica

clínica envolve a determinação espectrofotométrica de compostos corados

(cromóforo) obtidos pela reação entre o composto a ser analisado e o reagente

Figura 1: Esquema dos componentes principais de um espectrofotômetro

Dispositivo de processamentos de

dadosSistema detector

Compartimento

Amostra/padrão

MonocromadorFontes de radiação

2

(reagente cromogênico), originando um produto colorido. Os métodos que se

baseiam nesse princípio são denominados métodos colorimétricos, os quais

geralmente são específicos e muito sensíveis [2].

A grande vantagem em utilizar compostos coloridos deve-se ao fato de eles

absorverem luz visível (região visível do espectro eletromagnético). Por meio da

espectrofotometria, componentes desconhecidos de uma solução podem ser

identificados e quantificados por seus espectros característicos ao ultravioleta,

visível, ou infravermelho, funcionando da seguinte forma:

• Espectrômetro UV (ultravioleta): utiliza a luz na faixa ultravioleta (185 - 400

nm) do espectro de radiação eletromagnética [3].

• Espectrômetro visível RGB (red-green-blue): utiliza a luz na faixa do visível

(400 – 700 nm) do espectro de radiação eletromagnética [3].

• Espectrômetro IR (infravermelho): utiliza a luz na faixa do infravermelho (700

- 15000 nm) do espectro de radiação eletromagnética [3].

O mecanismo de funcionamento dos espectrofotômetros ocorre em etapas

para se obter os dados. É constituída: por uma fonte de luz, um colimador, um

monocromador, um seletor de comprimento de onda, um recipiente contendo a

solução de amostra, um detector fotoelétrico, e um mostrador digital, que é

representada pela figura 2 abaixo [2]:

Primeiramente espectrofotômetro produz através de uma lâmpada uma gama

desejada de comprimento de onda de luz. Depois um colimador (lente) transmite um

feixe reto de luz (fótons) que passa por um monocromador (prisma ou grade de

Figura 2: Representação básica da estrutura de um espectrômetro [4].

3

difração) para dividi-lo em comprimentos de onda componentes diversos (espectro).

Em seguida, um seletor de comprimento de onda (fenda) permite que seja

transmitida apenas os comprimentos de onda desejada, que é dirigido para a

solução contida em um recipiente transparente (cubeta). Parte da luz é absorvida e

parte é transmitida. A redução da intensidade luminosa é medida pelo detector

depende da intensidade da luz que incidiu sobre ele. O sinal elétrico amplificado e

visualizado no galvanômetro em números é lido como uma absorbância e é

proporcional à concentração da substância absorvente existente na cubeta [4].

Desta forma, consegue-se obter os dados e assim com a espectrofotometria

utiliza-se uma quantidade denominada Absorbância (A ou Abs), relacionada à

intensidade de radiação absorvida pela solução e que é definida pela relação [1]:

, sendo denominado transmitância (T) [1].

A absorbância (Abs) de uma solução é proporcional à concentração da

solução (C) e a distância (d) percorrida pelo feixe luminoso através da solução

segundo a lei de Lambert-Beer, no qual é o fundamento da espectrofotometria [1].

Abs = Kcd, onde K é o coeficiente de extinção, absorção ou absortividade e

corresponde à absorbância de uma solução de concentração unitária, por unidade

de distância percorrida [1].

A lei de Lambert afirma que "A intensidade da luz emitida decresce

exponencialmente à medida que a espessura do meio absorvente aumenta

aritmeticamente". Ou seja, quando um feixe de luz monocromático, atravessa um

meio transparente homogêneo, cada camada deste meio absorvia igual à fração de

luz que atravessa, independentemente da intensidade da luz que incidia [5].

Já a lei de Beer afirma que “A intensidade de um feixe de luz monocromático

decresce exponencialmente à medida que a concentração da substância absorvente

aumenta aritmeticamente". Ou seja, uma solução absorve a luz proporcionalmente à

concentração molecular do soluto que nela encontra [5].

4

Então essas duas leis são tratadas simultaneamente, processo no qual a

quantidade de luz absorvida ou transmitida por uma determinada solução depende

da concentração do soluto e da espessura da solução [5].

Porém, nem todas as reações colorimétricas seguem a lei de Lambert-Beer,

sendo esta válida para condições restritas, em que [2]:

•  A luz utilizada é aproximadamente monocromática;

•  As soluções a serem analisadas estejam diluídas (baixas concentrações);

•  Não devem estar presentes na mesma solução mais de uma substância

absorvente de luz.

Realizando a técnica espectrofotométrica pode-se obter a curva-padrão, que

corresponde à relação gráfica entre os valores de absorbância (A) e os de

concentração. Com base na análise gráfica é possível verificar a linearidade da

reação e calcular um fator de conversão de valores de absorbância em

concentração. Quando se quer saber a concentração de uma solução é encontrada

a densidade ótica, levando este mesmo dado a curva, encontrando de imediato a

sua concentração [2].

Devido à alta sensibilidade desta técnica e do alto grau de precisão em suas

medidas, possuindo uma larga aplicação na indústria química onde envolvem

análises de água: potável, caldeiras, resfriamento, e na preparação de água

desmineralizada, onde se tem a determinação de ferro, sulfatos, fosfatos e outros.

Esta técnica é muito usada também em laboratórios de controle de qualidade,

pesquisa e desenvolvimento de análises clínicas e toxicológicas, também usada na

identificação do princípio ativo de fármacos entre outras aplicações. Na

microbiologia utiliza-se também a espectrofotometria para traçar a curva de

crescimento de uma população microbiana, calcular a taxa específica de

crescimento e o tempo de geração ou de duplicação dos microorganismos, que pode

ser feito pelo método indireto [6].

3. Materiais e Reagentes

5

Balão volumétrico de 50 mL; 100 mL; 250 mL; 500mL; 1000mL;

Béquer 50 mL;

Cubetas retangulares de 1 cm de largura;

Pipeta de 1 mL;

Bastão de vidro;

Balança analítica;

Espátula;

Água da torneira;

Espectrofotômetro;

Fermento biológico fresco Fleischmann;

Software Scydavis;

4. Procedimentos

Experimento: Espectrofotometria

Auxiliado por uma balança analítica pesou-se 15,01 g de Fermento biológico

fresco Fleischmann em um vidro de relógio, logo após transferiu-se o fermento para

um béquer de 50 mL com ajuda de um bastão de vidro. Em seguida, preparou-se

uma suspensão no béquer com os 15,01 g de fermento e 10 mL de água da torneira.

Coletou-se 5 quantidades de 1mL da suspensão preparada e diluiu-se em balões

volumétricos de 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL e 1000 mL.

Na primeira cubeta utilizou-se a água da torneira como branco para termos

comparativos com as outras cubetas contendo as soluções diluídas. Programou-se o

espectrofotômetro para comprimentos de onda de 570 nm e anotou-se a

absorbância para cada solução obtida. Logo após, fez-se os mesmos procedimentos

para as duas suspensões de concentrações desconhecidas A e B. Em seguida, com

os dados obtidos, plotou-se a curva padrão pelo software Scydavis.

6

5. Resultados e Discussões

Partindo de uma suspensão de 15g de fermento biológico em 10 ml de água,

podemos calcular a concentração da suspensão:

C = 15/0,01= 1500 g/L

Desta suspensão foram retiradas 5 alíquotas de 1 ml cada para fazer as

diluições desejadas de 1/50, 1/100, 1/250, 1/500 e 1/1000.

Fazendo uma regra de três simples podemos saber a quantidade de fermento

biológico de cada alíquota:

15g – 10ml

x – 1ml x=1,5g

Com isso calculamos os valores das concentrações de cada amostra diluída a

partir da fórmula:

C=massa de fermento em g/L de água

Aplicando os valores de cada diluição foram encontrados os valores das

concentrações de acordo com a tabela 1 abaixo:

Tabela 1: Concentração de cada amostra analisada.

Amostra Concentração (g/L)

1 (1ml/50ml)

2 (1ml/100ml)

3 (1ml/250ml)

4 (1ml/500ml)

5 (1ml/1000ml)

6 (desconhecida A)

7 (desconhecida B)

30

15

6

3

1,5

A

B

Com as diluições prontas, estas foram levadas ao espectrofotômetro para

análise da absorbância de cada uma a 570 nm. A absorbância de cad diluição foi

anotada de acordo com a tabela 2 abaixo.

7

Tabela 2: Absorbâncias relativas à cada concentração.

Concentração (g/L) Absorbância

30 2,447

15 2,052

6 1,441

3 0,990

1,5 0,626

A 1,741

B 1,997

Com os valores da tabela 2, foi possível construir o gráfico 1: Absorbância x

Concentração, no comprimento de 570 nm.

0 5 10 15 20 25 30 350

0.5

1

1.5

2

2.5

3

f(x) = 0.0591035598705502 x + 0.855150485436893R² = 0.871919241980428

Series2Linear (Series2)

Gráfico 1: Absorbância x Concentração a 570 nm utilizando 5 pontos.

Analisando o gráfico 1, os dados mostram que quanto maior a concentração,

maior é a absorbância, sendo assim possível a equação Abs = K.C.d, sendo d o

tamanho da cubeta que é igual a 1 cm.

Porém, devido a um erro experimental o gráfico 1 que foi gerado não foi de

boa confiança, pois possui um valor de r² ruim de 0,8719.

8

Desta forma, comparando esta equação com a equação da reta gerada pelo

gráfico 1:

Abs = K.C + 0 e y = ax + b, onde Abs = y e K = a (coeficiente angular da reta).

Sendo y = 0,0591x + 0,8552 a equação da reta encontrada, chegou-se então

ao valor de K = a = 0,0591 L/g.cm.

Tendo conhecimento da equação da reta, podem-se calcular as

concentrações das suspensões desconhecidas:

A → Abs = 0,0591CA + 0,8552

1,741 = 0,0591CA + 0,8552

CA = 14,99 g/L

B → Abs = 0,0591CB + 0,8552

1,997 = 0,0591CB + 0,8552

CB = 19,32 g/L

Percebendo que os 2 pontos referentes às maiores concentrações são os que

destoam mais da tendência dos 3 pontos das menores concentrações, foi feito um

outro gráfico (Gráfico 2) desconsiderando estes pontos das maiores concentrações.

1 2 3 4 5 6 70

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

f(x) = 0.176714285714286 x + 0.4005R² = 0.983560077099165

Series2Linear (Series2)

Gráfico 2: Absorbância x Concentração a 570 nm utilizando os 3 pontos de

menor concentração.

9

Analisando este gráfico 2, podemos verificar que a equação da reta gerada é

de melhor confiança comparada ao gráfico 1, pois possui um valor de r² melhor de

0,9836.

Desta forma, refazendo os cálculos para esta nova equação:

Sendo y = 0,1767x + 0,4005 a equação da reta encontrada, chegou-se então

ao valor de K = a = 0,1767 L/g.cm.

Usando esta segunda equação, as concentrações das suspensões

desconhecidas ficam:

A → Abs = 0,1767CA + 0,4005

1,741 = 0,1767CA + 0,4005

CA = 7,59 g/L

B → Abs = 0,1767CB + 0,4005

1,997 = 0,1767CB + 0,4005

CB = 9,04 g/L

Ao fazer um novo gráfico com as três maiores concentricões, obtemos o

gáfico abaixo:

Gráfico 3: Absorbância x Concentração a 570 nm utilizando os 3 pontos de

maior concentração.

10

Analisando este gráfico 3, podemos verificar que a equação da reta gerada é

de melhor confiança comparada ao gráfico 1, pois possui um valor de r² de 0,93055,

melhor que a do gráfico 1 e inferior a do gráfico 2 0,9836.

Desta forma, refazendo os cálculos para esta nova equação:

Sendo y = 0,0403x + 1,2944 a equação da reta encontrada, chegou-se então ao valor de K = a = 0,0403 L/g.cm.

Usando esta terceira equação, as concentrações das suspensões

desconhecidas ficam:

A → Abs = 0,0403 CA + 1,2944

1,741 = 0,0403 CA + 1,2944

CA = 11,08 g/L

B → 1,997 = 0,0403 CB + 1,2944

CB = 17,43 g/L

Ao tentar ajustar o gráfico com diferentes funcões, obteve-se o gráfico abaixo:

Gráfico 4: Absorbância x Concentração a 570 nm utilizando diferentes tipos

de ajustes.

11

Os valores de r² encontrados estão dispostos na tabela abaixo:

Tabela 3: valores de r² para cada ajuste dos dados.

Ajuste r²

Linear 0,8719

Polinomial 0,9841

Decaimento Exponencial 1ª Ordem 0,9966

Decaimento Exponencial 2ª Ordem 1

6. Conclusões

Com este experimento pode-se observar na prática os conhecimentos

teóricos sobre as técnicas espectrofotométricas.

Viu-se como a absorbância aumenta proporcionalmente à concentração de

fermento da solução e a partir da posse dos valores da absorbância de 5 amostras

de concentrações diferentes obteve-se a equação da reta da absorbância em função

da concentração. Abs = K.C.d que no caso é mostrada como y = ax + b, sendo a

relativo a absortividade (K), x relativo a concentração (C) e d o comprimento do

caminho percorrido pela luz, que nada mais é que o tamanho da cubeta, no caso 1

cm, além disso foi encontrado um valor para b nesta equação da reta, teoricamente

este valor deveria ser igual a 0, mas na prática isto não foi observado, b apresentou

um valor significativo quando correlacionado aos valores de K.C das diferentes

concentrações, essa inconsistência pode ter sido gerada por fatores que influenciam

na absorbância por erro de técnica ou por desvios da lei de Lambert-Beer, como [5,

6]: uso de água não destilada como solvente, presença de substancias que possam

interferir na uniformidade da absorbância do espectro de luz, erros de técnica de

pipetagem e limpeza de vidrarias e cubetas, mas é provável que a principal fonte de

erro seja o Limite de linearidade, que representa o limite de concentração para a

qual a lei de Lambert-Beer é válida. Para concentrações superiores ao limite de

linearidade observado no desvio da lei de Lambert-Beer, deixa de existir a

proporcionalidade linear entre concentração e absorbância, a literatura e os os

principais fabricantes de espectrofotômetros citam uma menor faixa de concentração

12

para resultados dentro do intervalo de confiança [7, 8]. Talvez por conta do que foi

acima citado obteve-se um valor de r² = 0,8719, que é aceitável apenas pelo caráter

didático do experimento, não sendo válido para consenso científico.

Após encontrar a equação da reta oriunda da curva concentração X

absorbância, pode-se estipular a concentração de quaisquer soluções

desconhecidas apenas aplicando o valor da absorbância da solução medida pelo

espectrofotômetro, mas isto deve ser utilizado com cautela, de acordo com a

literatura esta só deve ser aplicada para valores de absorbância entre o mínimo e o

máximo medido nas amostras padrão para resultados mais fidedignos.

Ao utilizar as menores concentrações para traçar o gráfico e fazer o ajuste

linear, o valor de r² = 0,8719 foi mais próximo do aceitável e o valor de a ficou na

mesma grandeza de b, mas ainda inferior a ele.

Já com as três maiores concentrações o r² foi igual a 0,8719, mesmo sendo

maior que o do ajuste com todos os pontos, ele não deve ser considerado, já que é

esperado um valor maior pelo uso de menos pontos, o que deve ser levado em

consideração é o aumento do valor de b em relação ao valor de a.

Outros ajustes foram feitos a fim de obter um melhor valor de r², ao fazer o

ajuste por decaimento exponencial de 2ª ordem obteve-se o r² = 1, o que é bastante

satisfatório do ponto de vista experimental, mas talvez seja inadequado precisar que

este é o ajuste que corresponde ao ponto onde a não obedece a linearidade.

Por fim, concluímos que os objetivos do experimento foram alcançados com

êxito, sugerindo para experimentos futuros uma maior diluição do fermento biológico

em água, conforme visto experimentos similares, foi utilizada uma diluição 10 vezes

maior apresentando valores de r² mais próximos do aceitável [9]. Este experimento

pode servir de base para o entendimento dos métodos espectrofotométricos, que

são extremamente importante e utilizada na analise quantitativa em diversas áreas,

incluindo o foco da pesquisa, que é a microbiologia.

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7. Referências Bibliográficas

1. PIMENTA, Flávia Duta, 2016, Microbiologia Industrial Experimental - Espectrofotometria, Roteiro Experimental. SENAI CETIQT.

2. <http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/> Acesso em 18/02/2016

3. LOPES, Lincoln, 2015, Colorimetria, Apostila de Aula. SENAI CETIQT.

4. <http://www.ebah.com.br/content/ABAAAfIGEAK/espectrometros-

espectrofotometros> Acesso em 18/02/2016.

5. VOGEL, A. I., & MENDHAM, J.Vogel's textbook of quantitative chemical analysis. (5th ed.), Harlow, Prentice Hall 1989. New York.

6. HARRIS, Daniel C. Quantitative Chemical Analysis. (8th ed.), W.H. Freeman

and Co, 2007. New York.

7. PAVIA, D.L.; LAMPMAN, G.N.; KRIZ, G.S. e VYVYAN, K.J. Introdução à Espectroscopia, 1a ed. Editora Cengage Learning, - Tradução da Quarta

Edição Americana, 2010.

8. Manual espectrofotômetro Konica- Minolta.

<http://sensing.konicaminolta.com.br/products/lcs111/support/LCS_IV_Manual_E

nglish%20.pdf> acessado em 18/02/2016.

9. GONÇALVES, Marcia Monteiro Machado. Prática 1 – Espectofotometria. Biotecnologia Experimental. Roteiro Experimental. UERJ.

<https://docs.google.com/viewer?

a=v&pid=sites&srcid=bWFudWFsZG9wZXF1ZW5vZW5nZW5oZWlyby5jby5jY3xt

YW51YWx8Z3g6NzNjMGM2YzhhNThiZjM4OA> acessado em 18/02/2016.

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5. Objetivo

Este relatório consiste em um experimento que visa: familiarização dos alunos

com a utilização de técnicas espectrofotométricas, elaboração de uma curva padrão

de concentração x absorbância para soluções aquosas de fermento biológico

prensado, além da determinação da concentração de leveduras em soluções

desconhecidas de acordo com suas absorbâncias.

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