Espectrofotometria

Fernanda de Oliveira

Espectrofotometria

• Método de análise baseado em medidas de absorção de radiação eletromagnética.

• Espectrofotometria Óptica– Comprimento de onda corresponde a luz visível

ou ultra-violeta:

Fontes Luminosas• Luz UV Luz Visível : 400 e 800 nm• Lâmpada de gás hidrogênio Tungstênio • Mercúrio

faixa de 200 a 400 nm

Luz UV e Visível • A absorção na região da luz depende da estrutura

eletrônica da molécula.

• Produz modificações da energia eletrônica da molécula em consequência de transições dos elétrons de valência.

• Estas transições fazem com que o elétrons excitado passe do orbital molecular ocupado para o primeiro orbital de energia superior.

Requerimentos que devem ser observados para que uma determinada radiação possa ser absorvida por uma molécula:

A radiação incidente deve ser de frequência equivalente aquela rotacional ou vibracional, eletrônica ou nuclear da molécula,

Interação da radiação com a amostra

Absorção de Radiação

• Os comprimentos de onda que uma certa substância absorverão são característicos da sua estrutura, diferindo de substância para substância.– DNA e RNA = 260nm – Proteínas = 280nm– Células bacterianas= 600nm

Absorção de Radiação

• Fenômenos que podem ocorrer com a radiação luminosa: reflexão, refração, espalhamento ou ser absorvida pelo material.

Transmitância

• Transmitância é a fração da luz incidente em um comprimento de onda específico, que passa por uma amostra de matéria.

T = I / I0

Absorbância

• É a capacidade do material em absorver radiações em frequência específica.

A = - log10 T

Espectroscopia de Absorção• É preciso determinar a quantidade de luz que a amostra irá

absorver, sendo descrito pela Lei de Beer-Lambert que é a relação entre a intensidade da luz incidida na solução (I0) e a intensidade da luz saindo da solução (I).

-log (I/Io) = A = cl

A = absorbância = absorvidade molecular ou coeficiente de extinçãoc = concentração do material absorvedorl = espessura da amostra através da qual a luz passa

Leis de absorção

Io I1

Transmitânica = It/ Io T% = It/Io x 100

Io = 100 I1 = 50

Io = 100 I1 = 50 I2 = 25

Lei de Lambert-Beer

• Intensidades da radiação incidente e emergente podem ser relacionadas com as concentrações do material presente na solução.

– Efeitos de reflexão, refração e espalhamento não são considerados nessa lei.

– A radiação incidente deve ser monocromática

Lei de Lambert-Beer

• I0 = intensidade da radiação incidente • I = intensidade transmitida pela amostra

I = I0 10-Ɛlc

= absorvidade molecular ou coeficiente de extinção

l = espessura da amostra através da qual a luz passa

c = concentração do material absorvedor

Fenômenos envolvidos quando um feixe (monocromático) de radiação incide sobre uma cubeta contendo uma solução.

Io = Ir + Ie + Ia + It Io = Ia + It

Io = Intensidade do feixe incidente, Ir = Intensidade do feixe refletido, resultado das diferenças do índice de refração entre o absorvedor e o ambiente, Ie = Intensidade do feixe espalhado, resultado de um meio não homogêneo (suspensão) e/ou de flutuações térmicas, Ia = Intensidade do feixe absorvido pelo meio It = Intensidade do feixe transmitido.

Lei de Lambert-Beer

• Transmitância:

• Na lei de Lambert-Beer

T = I / I0

T = 10-Ɛlc

Lei de Lambert-Beer

• Absorbância

• Na lei de Lambert-Beer

A = - log10 T

A = - log10 T = log10(1/T ) = log10(10-Ɛlc)

Representação gráfica da Lei de Beer, para soluções de KMnO4 em l = 545 nm e um caminho óptico de 1 cm.

a) Em %Transmitância %T versus c

b) Em Absorbância A versus c 

a/ε = absortividade/absortividade molarb= caminho ópticoc= concentração

Espectro de absorção do permanganato de potássio

A amostra (1) tem 66mg/L de concentração.

As demais (2),(3),(4) e (5) foram diluídas para (0.8), (0.6), (0.4) e (0.2) da concentração da primeira amostra, respectivamente.

a- Espectro de uma lâmpada de luz branca

b- Espectro de uma solução aquosa de azul de bromotimol 10-5 mol L-1 (laranja)

c - Espectro de uma solução etanólica de fluoresceína 10-5 mol L-1 (amarela)

Figura 1 - a. conjunto dos comprimentos de onda correspondentes ao espectro de emissão de uma lâmpada de tungstênio-halogênio (luz branca); b. região espectral transmitida por uma solução de azul de bromotimol e o respectivo espectro de absorção; c. região espectral transmitida por uma solução de solução amarela de fluoresceína e o respectivo espectro de absorção.

Desvios da Lei de Beer-Lambert

• Desvios Químicos:• Deslocamento do equilíbrio: quando uma amostra

se dissocia, associa ou reage com um solvente para formar um produto que tem espectro de absorção diferente da amostra.

• Dissociação de complexos: excesso ou insuficiência de agente complexante.

Desvios da Lei de Beer-Lambert

• Desvios Instrumentais: em soluções muito concentradas, as moléculas do soluto influenciam umas às outras devido às suas proximidades, pois quando ficam muito perto umas das outras, a absortividade pode mudar um pouco.

Espectrofotômetro

• É um instrumento que serve para medir a intensidade da luz em função de um comprimento de onda específico .

Esquema dos principais componentes de um espectrofotômetro

• A amostra deve estar em um recipiente (cubeta) de quartzo quando a radiação for na região espectral do ultravioleta.

• Quando for na região da luz visível usa-se os de vidro por ter uma melhor dispersão.

• Os detectores devem ser altamente sensíveis.• Os dados obtidos pelo detector são enviados para um dispositivo de

processamento de dados.

Cubetas

• Espectrofotometria de Luz Visível– Cubeta de Vidro ou Plástico

• Espectrofotometria de Luz Ultra- Violeta– Cubeta de Quartzo

• Etapas: 1º) Coloca-se o solvente (branco) no caminho ótico e mede-

se a intensidade da energia radiante,que atinge o detector;

2º) Substitui-se o recipiente com o solvente (branco) pelo recipiente com a amostra e faz- se a determinação propriamente dita da absorbância.

(a) lâmpada de deutério/tungstênio; (b) lente da fonte; (c) obturador; (d) amostra; (e) lente espectrográfica; (f) fenda; (g) rede de difração; (h) arranjo de detectores

Diagrama de um espectrofotômetro

Esquema óptico de um espectrofotômetro com detector de arranjo de diodos

Há duas fontes de radiação, as lâmpadas de deutério e de tungstênio, cujas emissões são focalizadas através de uma lente sobre a amostra.

A radiação incidente será, em parte, absorvida. Esta radiação que atravessou a amostra (transmitida ou emergente) irá incidir sobre uma lente que focaliza o feixe sobre uma fenda, e desta sobre uma grade de difração.

Esta grade irá difratar a radiação, separando os seus diferentes comprimentos de onda, sendo que cada um deles irá incidir sobre um diodo do arranjo. Este diodo, ao ser irradiado, produz uma corrente elétrica cuja magnitude depende da intensidade da emissão (novamente aqui se aplica o efeito fotoelétrico).

Através de um circuito de calibração adequado, esta corrente será transformada em absorbância nos diferentes comprimentos de onda, resultando no que se convenciona chamar de espectro de absorção.

Exemplos de Fontes de Exemplos de Fontes de Radiação

• Lâmpada de filamento de tungstênio;• Lâmpada de quartzo-iodo;• Lâmpada de descarga de hidrogênio ou de

deutério;• Lâmpada de cátodo oco • Laser

* Normalmente usa-se a lâmpada de deutério para comprimentos de onda entre 180 a 370nm.

Monocromadores• Função: seleção do comprimento de onda em que se tem interesse para a

análise.• Constituição: fenda de entrada de um elemento de dispersão de radiação fenda de saída• Tipos: prismático reticuladores

Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por um prisma:(a) esquema e (b) fotografia.

Exemplo de difração de luz produzida na natureza.

Monocromador Prismático

• A radiação policromática vinda da fonte de radiação passa pela fenda de entrada e incide sobre a face de um prisma, sofrendo um desvio.

• Os vários comprimentos de onda terão diferentes direções após a incidência no prisma. Se for realizado um ajuste rigorosamente controlado da fenda de saída, pode-se selecionar o comprimento de onda desejado.

Monocromador Prismático

• Espectrofotômetros mono-feixe

- Não são cômodos pois a amostra e o branco tem que ser colocados alternadamente no único feixe de radiação;

- Não é adequado para medir absorbâncias em função do

tempo.

Monocromador Reticular• O principal elemento dispersante é a rede de difração. Essa

rede consiste em uma placa transparente ou refletora com muitas ranhuras paralelas e equidistantes.

• Dispersão resultante desta rede é linear. Os vários comprimentos de onda dispersos são igualmente espaçados, por isso a fenda de saída isolará uma banda de radiação de largura constante.

• A resolução é muito mais elevado que os prismas.

Monocromador Reticular

Espectrofotômetro mono-feixe

• Espectrofotômetros mono-feixe: - Não são cômodos pois a amostra e o branco

tem que ser colocados alternadamente no único feixe de radiação;

- Não é adequado para medir absorbâncias

em função do tempo;

Espectrofotômetro duplo-feixe• Dois feixes de radiação são formados no espaço por um espelho.

• Um feixe passa através da solução referencia (branco) até o transdutor e outro, ao mesmo tempo, passa através da amostra até o segundo transdutor.

• As duas correntes serão determinadas, calcula-se a diferença de transmitância entre os dois feixes.

Espectrofotômetro duplo-feixe

Espectrofotômetro duplo-feixe

Esquema (a) e fotografia (b) do tubo fotomultiplicador HAMAMATSU - R928

Fotografias de arranjos de diodo com 1024 elementos (detectores de diodo):

a.vista de topo;

b.vista de perfil.

Detectores

Procedimentos Analíticos em Espectrofotometria Visível em

Ultravioleta

• Análise Qualitativa: dependendo de quanto de luz que a amostra absorver vai determinar qual é a espécie, pois o espectro é característico daquela determinada espécie química.

Procedimentos Analíticos em Espectrofotometria Visível em Ultravioleta

• Análise Quantitativa: dependendo da absorbância irá determinar a concentração da amostra.

• A condição especial para qualquer determinação quantitativa é a observação à Lei de Beer-Lambert, mas o controle do pH, as técnicas de extração por solventes, o ajuste do estado de oxidação, entre outras também são muito importantes.

Espectro de Proteínas• Espectro é bastante

característico.• São influenciados pelo meio

local: dependem de fenômenos elétricos.

• Mostra a quantidade de hélice- e folha-

• Caso a proteína seja desnaturada, a espectroscopia será diferente.

Infravermelho• IV – maior que 780 nm

• Utilizada em grande escala para identificação de compostos, sendo um método sensível e rápido.

• Fornece informação sobre grupos funcionais de moléculas.

• É o registro da energia envolvida no processo de vibração molecular.

• Ocorre um estiramento das ligações, que se esticam e relaxam, devido as vibrações provocadas aos átomos.

Fluorescência e Fosforescência• Fluorescência é a emissão de luz associada com elétrons que

se movem de um estado excitado para o estado fundamental.

• Fosforescência é a capacidade que uma espécie química tem de emitir luz.

• Importante porque algumas substâncias quando sujeitas às radiações ultravioleta emitem luz visível.

• As duas são frequentemente muito mais úteis para se estudar processos biológicos do que a absorbância, por serem consideravelmente mais sensíveis, podendo, então, detectar concentrações bastante baixas.

Espectro de Massas

• Fornece informações a respeito do peso molecular da substância, baseado na fragmentação da molécula após um bombardeio de feixe de elétrons.

• Desvantagem de não diferenciar moléculas isômeras.