ESTABLECIMIENTO DE PROTOCOLOS DE

MICROPROPAGACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE BIOPRODUCTOS EN ESPECIES NATIVAS

DE ALTO VALOR ECOLÓGICO DEL NORTE

CHICO

Este proyecto fue financiado por el Fondo de Investigación del Bosque Nativo, proyecto n° 037/2011

Investigador responsable

Dr. Cristian Ibáñez, Departamento de Biología, Universidad de La Serena

Investigador asociado

MSc. Fabiola Jamett, Departamento de Química, Universidad de La Serena

Octubre 2013

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ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN 6

1.1 Chile, hábitat natural de una gran biodiversidad vegetal 6

1.2 Biodiversidad en las zonas áridas y semiáridas de Chile 6

1.3 Especies de interés 7

1.3.1 Garra de León (Leontochir ovallei) 7

1.3.2 Lucumillo (Myrcianthes coquimbensis) 8

1.3.3 Algarrobo dulce (Prosopis flexuosa) 8

1.3.4 Algarrobo (Prosopis chilensis) 8

1.4 Propagación vegetativa: una alternativa para resguardar el patrimonio

genético nativo 8

1.5 Biosprospección de compuestos metabólicos: potenciando un uso alternativo de la biodiversidad nativa 10

1.6 Perfiles metabolómicos 11

1.7 Propósito de la investigación 12

2. OBJETIVOS 14

3. METODOLOGÍA 16

3.1 Propagación in vitro de tipo organizado 16

3.2 Propagación vegetativa por esquejes en cama de propagación 17

3.3 Propagación por semillas 17

3.4 Tratamiento Preliminar de las Muestras 19

3.5 Análisis de Humedad total y remanente después del secado inicial

antes de la molienda 19

3.6 Análisis de Cenizas 19

3.7 Determinación Analítica del extracto etéreo (EE) 19

3

3.8 Análisis de la proteina bruta 19

3.9 Determinación de azúcares totales, azúcares reductores y no reductores 19

3.10 Análisis de Fibra. 21

3.11 Análisis de los componeetes minerales 21

3.12 Determinación de Boro 21

3.13 Determinación de Fósforo 22

3.14 Polifenoles Totales 22

3.15 Perfil de Ácidos Grasos 22

3.16 Identificación de metabolitos secundarios por TLC. 23

3.17 Preparación del infuso agua 23

3.18 Prueba de susceptibilidad antimicrobiana en los extractos de hojas. 25

3.19 Análisis Estadísticos. 25

4. RESULTADOS 26

4.1 Parte Propagación

4.1.1 Garra de León (Leontochir ovallei) 26

4.1.2 Lucumillo (Myrcianthes coquimbensis) 26

4.1.3 Algarrobo dulce (Prosopis flexuosa) 26

4.1.3 Algarrobo (Prosopis chilensis) 26

4.2 Parte Fitoquímica

4.2.1 Garra de León (L. ovallei) 27

4.2.2 Lucumillo (M. coquimbensis) 29

4.2.3 Algarrobo dulce (P. flexuosa) 30

4.2.4 Algarrobo (P. chilensis) 32

5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 33

6. PRODUCTOS OBTENIDOS 37

4

6.1 Actividades de difusión 37

7. BIBLIOGRAFÍA 38

8. ANEXOS 42

ANEXO n° 1. Colecta de semillas de Garra de León (L. ovallei) 42

ANEXO n° 2. Protocolo de Germinación in vitro de Garra de León (L. ovallei) 46

ANEXO n° 3: Protocolo de multiplicación de rizomas de Garra de León (L. ovallei) 50

ANEXO n° 4: Protocolo de germinación semillas de Lucumillo (M. coquimbensis) 52

ANEXO n° 5: Protocolo de propagación ex vitro por esquejes en Lucumillo (M. coquimbensis) 56

ANEXO n° 6: Protocolo de propagación in vitro de Lucumillo (M. coquimbensis) 62

ANEXO n° 7: Protocolo de germinación semillas de Algarrobo dulce (P. flexuosa) 67

ANEXO n° 8: Protocolo de propagación ex vitro por esquejes de Algarrobo dulce (P. flexuosa) 70

ANEXO n° 9: Protocolo de propagación in vitro de Algarrobo dulce (P. flexuosa) 71

ANEXO n° 10: Protocolo de germinación semillas de Algarrobo (P. chilensis) 75

ANEXO n° 11: Protocolo de propagación ex vitro por esquejes de Algarrobo (P. chilensis) 77

ANEXO n° 12: Protocolo de propagación in vitro de Algarrobo (P. chilensis) 80

ANEXO n° 13: Materiales usados en investigación 82

ANEXO n° 14: Poster 1 presentado en la VII Reunión de Biología Vegetal. Pucón

2012. 84

ANEXO n° 15: Poster 2 presentado en la VII Reunión de Biología Vegetal. Pucón 2012. 85

ANEXO n° 16: Poster 3 presentado en la VII Reunión de Biología Vegetal. Pucón 2012. 86

ANEXO n° 17: Programa II Encuentro temático del FIBN, Iquique 2013. 87

ANEXO n° 18: Certificado de aceptación trabajo oral Cristian Ibáñez. Tercer Congreso de Flora Nativa. Santiago 2013. 88

5

ANEXO n° 19: Certificado de aceptación trabajo oral Fabiola Jamett. Tercer

Congreso de Flora Nativa. Santiago 2013. 89

ANEXO n° 20: Certificado Poster 4 presentado al Tercer Congreso de Flora Nativa. Santiago 2013. 90

ANEXO n° 21: Poster 5 presentado en la VIIU Reunión de Biología Vegetal. Pucón 2013. 91

9. ANEXOS - TABLAS 92

ANEXO Tabla 1. Esquema y posterior detalle de los tratamientos de germinación de semillas de L. ovallei probados durante esta investigación. 92

6

1. INTRODUCCIÓN

1.1 Chile, hábitat natural de una gran biodiversidad vegetal. La sorprendente

variabilidad genética de las plantas, ha posibilitado que éstas conquisten hábitat de la

más diversa índole y complejidad, capaces de adoptar y adaptar formas de vida en

ecosistemas dinámicos, demandantes y a veces, muy limitantes. Como resultado, se ha

generado una flora que desconoce fronteras y que está constituida por especies con

características únicas y diferenciadoras (CBD, 2006; Taiz & Zeiger, 2007). Chile, por su

gran variedad de climas y suelos, está constituido por una flora nativa, que si bien no es

tan abundante en cantidad comparado a sus países vecinos, sí es fértil en endemismos

de particular interés ecológico que la hacen única (Squeo et al, 2001; Lazo et al, 2008;

Santibáñez et al, 2008). Además, la interacción entre la herencia genética de esta flora

nativa con su entorno ambiental ha dado origen a versiones fenotípicas que han llamado

la atención de la sociedad tanto por su valor ornamental como por sus características

aromáticas, sus propiedades medicinales o simplemente por su cualidades nutritivas o

funciones ecológicas. Lamentablemente, muchas de estas especies se encuentran

fuertemente amenazadas por las actividades humanas, por el dinamismo secular propio

del medioambiente o por el escaso conocimiento que tenemos de ellas.

En 1992 se creó la Convención Internacional para la Diversidad Biológica (CBD) que

reúne a 193 países de todo el orbe (CBD, 2011). Su principal objetivo es trabajar

conjuntamente para evitar la pérdida de hábitat, de especies y de genes, contribuyendo

así a mitigar la pobreza y mejorar la calidad de vida de todas las formas de vida que

habitan la tierra (CBD, 2006). Dentro de sus programas de protección de la biodiversidad

mundial, la CBD señala a las zonas áridas y semiáridas del mundo como zonas

prioritarias de conservación debido a la fragilidad de sus ecosistemas, su riqueza natural

y cultural (CBD, 2011). Los principales factores que amenazan las zonas áridas son el

pastoreo desmesurado, el agotamiento del suelo por el uso excesivo de fertilizantes, el

consumo excesivo del siempre escaso recurso hídrico, la pérdida de la estructura del

suelo, la pérdida de especies leñosas para producir leña o carbón, y sobre todo, la

deforestación a la que son sometidos los terrenos para habilitar zonas agrícolas (CBD,

2006). Recientemente, un estudio realizado por el Centro de Información de Recursos

Naturales (CIREN) determinó que el 49.1% (36.8 millones de hectáreas) del territorio

nacional se encuentra con algún grado de erosión (CIREN, 2011). Entre éstas, la Región

de Coquimbo presenta un alarmante 84% de sus suelos erosionados, de los cuales un

65.3% se encuentra en la categoría de erosión “severa” y “muy severa” (CIREN, 2011).

1.2 Biodiversidad en las zonas áridas y semiáridas de Chile. En Chile, las zonas

áridas y semiáridas están situadas aproximadamente entre los 18º y 33º Latitud Sur

(Astaburuaga, 2004) y corresponden al tipo macro-bioclimático tropical que incluye las

variantes bioclimáticas tropical pluviestacional, antitropical, xérico, desértico e

hiperdesértico (Amigo & Ramírez, 1998). Por lo general, las zonas áridas y semiáridas se

caracterizan por tener veranos largos y calurosos, poseer suelos con bajo contenido en

materia orgánica, pedregosos y fácilmente erosionables por lluvias que, aunque

esporádicas, suelen dañar bastante la estructura del suelo (Luebert & Priscoff, 2006). A

pesar de tener una escasez importante de agua, la disponibilidad de ésta en la zonas

áridas y semiáridas es posible caracterizarla en componentes espaciales y temporales

(Stoll et al, 2011). Existen dos gradientes: a) latitudinal, que influyen en la cantidad de

agua (van Husen 1967; Luebert & Pliscoff 2006) y b) altitudinal, que diversifica las

fuentes de agua (neblina, lluvia, agua subterránea, nieve y glaciares (Favier et al, 2009).

Además de esta excepcional heterogeneidad espacial, el ciclo hidrológico también es muy

variable en el tiempo: a) ciclos diurnos de evaporación y evapotranspiración (Kalthoff et

al, 2006), b) ciclos estacionales de precipitación (vientos alisios – lluvias de verano en el

altiplano entre 13º y 27º S, vientos del oeste – lluvias de invierno entre 27º y 38ºS)

(Garreaud et al, 2009), c) neblina costera con ciclos diurnos y anuales (maximo en

primavera) (Garreaud et al, 2008), d) ciclos interanuales como El Niño - Southern

7

Oscillation (ENSO) (Gutiérrez et al, 2007; Garreaud et al, 2009; Gutiérrez et al, 2010).

Probablemente sea esta excepcional heterogeneidad temporal y espacial del recurso

hídrico lo que ha posibilitado la presencia de un interesante conjunto de especies

xerofíticas y otras de tipo esclerófilo que han logrado exitosamente adaptarse a las duras

condiciones áridas (Donoso et al, 1993; Squeo et al, 2001; Luebert & Priscoff, 2006).

El Norte Chico de Chile (Regiones de Atacama y Coquimbo) es una zona de extrema

riqueza en plantas vasculares y con un elevado porcentaje de endemismos tanto

regionales como nacionales (Squeo et al, 2001, 2008). Entre las especies que dominan

los paisajes áridos del Norte Chico figuran especies leñosas del género Porlieria spp.,

Caesalpinia spp., Cordia decandra, Monttea spp., Vasconcellea spp., Prosopis spp., varios

tipos de cactáceas como Erioscyse spp., Eulychnia spp., Opuntia spp., Copiapoa spp., y

herbáceas como Fabiana spp., Leucocoryne spp., Calceolaria spp. y Adesmia spp. (Squeo

et al, 2001, 2008). Muchas de estas plantas cumplen un importante rol para las

comunidades que habitan las zonas áridas pues tienden a ser fuente de alimento para

ellas, su ganado y la fauna silvestre del lugar. Pueden además actuar como contenedoras

de la erosión, protegiendo contra la desertificación y contribuyendo a contrarrestar la

sequedad característica del desierto y las zonas áridas (Pardos, 1984). No obstante

aquello, la biodiversidad de las zonas áridas y semiáridas se está viendo muy afectada

por la creciente intervención humana (Squeo et al, 2001). La sobreexplotación de

recursos naturales, alteración y destrucción de los hábitat son unos de los factores mas

importantes. Contribuye también la escasa conciencia sobre la conservación del ambiente

y los beneficios que ello trae (por ejemplo, los servicios ecosistémicos) a las

comunidades, lo cual genera un manejo poco sustentable de los recursos naturales,

provocando así la degradación de la diversidad biótica y abiótica. La degradación y/o

pérdida de biodiversidad puede tener serias consecuencias en la producción de alimentos

y sustentabilidad medioambiental, además de tener efectos globales a nivel ecosistémico

y la continuación de prácticas no sustentables (Sala et al, 2000; Chapin III et al, 2000).

La propuesta presentada tuvo como objetivo enfrentar este problema global en una

escala regional, considerando tres aspectos importantes de la conservación de

biodiversidad:

(1) generación de conocimiento científico,

(2) sensibilización y capacitación de la población local, y

(3) manejo y usos alternativos de la biodiversidad.

1.3 Especies de interés

Para abordar estos objetivos, se eligió un grupo de cuatro especies nativas del Norte

Chico, que, a pesar de su innegable valor ecológico e interesante potencial económico, se

encuentran pobremente estudiadas en nuestro país. Estas especies son:

1.3.1 Garra de León (Leontochir ovallei)

Descripción: Planta rizomatosa con tallos herbáceos, rastreros, rodeados de hojas

oblongo-lanceoladas (hasta 8 cm de largo y 4,5 cm de ancho). Inflorescencia con flores

rojas o raro amarillas, agrupadas de 18-20 flores en una gran cabezuela globosa de 8-10

cm de diámetro. Cada flor tiene 6 tépalos, espatulados en dos series. El fruto es una

cápsula de 3-4 lados, con los tépalos persistentes. En el año 2000 se describe la variedad

L. ovallei var. luteus M. Muñoz, de flores amarillas, que es muy rara entre la población de

flores rojas (Muñoz, 2000).

Área de distribución: Región de Atacama, endémica en la costa e interior entre Carrizal

Bajo (28° 05’ -71° 09’ W) y Totoral (27° 54’ S/ 70° 57’ W) (Muñoz, 1966).

Estado de conservación: En Peligro (Ravenna et al, 1998), Amenazada (Squeo et al,

2008).

Amenazas: Falta de regeneración natural (colecta de las flores por los lugareños y

turistas durante los períodos de desierto Florido), baja productividad de semillas, planta

8

consumida por guanacos y cabras, destrucción de hábitat, extracción intensiva para

comercialización interna y exportación (Ravenna et al, 1998).

Comentarios: Su reproducción con métodos de micropropagación puede disminuir

considerablemente la presión de colecta sobre sus poblaciones naturales.

1.3.2 Lucumillo (Myrcianthes coquimbensis)

Descripción: Arbusto de copa globosa y densa, que presenta alturas de 1 hasta 1,5 m,

las hojas perennes, simples, enteras y aromáticas. Las flores son hermafroditas y

blancas, compuestas en pequeños grupos. El fruto es una baya carnosa, de un color

intenso rojo en la madurez.

Área de distribución: Región de Coquimbo, entre Barrancones (limite norte) y Las Tacas

(límite sur). La extensión es una delgada franja de aprox. 83 km de largo en la costa y

aprox. 3 km hacia el interior (García et al, 2011).

Estado de conservación: En Peligro (Hechenleitner et al, 2005), Amenazada (Squeo et al,

2001).

Amenazas: Falta de regeneración natural (baja productividad de semillas, depredación de

semillas), destrucción de hábitat y extracción de hojarasca.

Comentarios: La especie presenta problemas de conservación en bancos de semilla,

donde ésta no puede ser mantenida viable (información verbal. Pedro León, Banco de

Germoplasma-INIA Intihuasi).

1.3.3 Algarrobo dulce (Prosopis flexuosa)

Descripción: Árbol o arbusto, con máx. 8 m de altura. Hojas compuestas, flores en

espigas de 20 a 30 cm de largo y de un color amarillo-verdoso, melífera. Los frutos son

vainas de color oscuro, planas, cinturadas parecido a un rosario y largas (aprox. 12 cm).

Área de distribución: Región de Atacama y Coquimbo, muy escasa, muy pocas

poblaciones conocidas. Además, varias lugares de colectas históricas han desaparecido

por actividad humana (cultivos de vid) y movimiento de dunas (cercanía de Copiapó).

También habita en Argentina y Bolivia (Zuloaga et al, 2008).

Estado de conservación: En Peligro (Squeo et al, 2001, 2008).

Amenazas: Falta de regeneración natural (depredación de semillas por cabras y

brúquidos), destrucción de hábitat, extracción de para producción de leña y carbón.

Comentarios: Taxonómicamente su distinción de P. flexuosa es muy complicada y sólo se

puede realizar con certeza en los frutos. Además, ambas especies forman híbridos de

manera natural, lo que dificulta aún más su identificación.

1.3.4 Algarrobo (Prosopis chilensis)

Descripción: Árbol caducifolio en su límite sur de distribución y siempreverde hacia el

límite norte, con aprox. 10 m de altura. Hojas compuestas, flores en espigas de 20 a 30

cm de largo y de un color amarillo-verdoso, melífera. Los frutos son vainas de color

claro, planas, de borde recto y largas (aprox. 12 cm).

Área de distribución: Región de Atacama hasta Región del Libertador O´Higgins,

preferentemente en suelos arenosos en el interior y la pre-cordillera. Acompaña la

vegetación local, en ocasiones forma bosquetes. También se encuentra en Argentina,

Perú, Bolivia y Paraguay (Zuloaga et al, 2008).

Estado de conservación: En Peligro (Squeo et al, 2001, 2008).

Amenazas: Falta de regeneración natural (depredación de semillas por cabras y

brúquidos), destrucción de hábitat, extracción para producir leña y carbón.

Comentarios: Taxonómicamente su distinción de P. flexuosa es muy complicada y sólo se

puede realizar con certeza con los frutos. Además, ambas especies forman híbridos de

manera natural, lo que dificulta aún más su identificación.

1.4 Propagación vegetativa: una alternativa para resguardar el patrimonio

genético nativo. No cabe duda que el método mas extendido para preservar la

existencia de una especie son sus semillas (Taiz & Zeiger, 2007). En ellas no solo se

transporta una parte importante de la información genética de la especie sino también se

adosan una serie de mecanismos que mantienen viable la semilla por un largo periodo de

9

tiempo y mecanismos que permiten sincronizar el proceso de germinación con las

condiciones mas favorables para que aquello ocurra (Engelman, 1997; Razdan &

Cocking, 1997; Taiz & Zeiger, 2007). En algunas plantas, sin embargo, la germinación

por semillas puede no ser un proceso sencillo e incluso llegar a ser inviable. Existen

especies cuyas semillas son incapaces de ser almacenadas puesto que pierden

rápidamente su humedad interna o porque no toleran las condiciones frías de

almacenamiento (Barbedo & Cicero, 2000). Estas semillas, conocidas como

recalcitrantes, son típicas de zonas tropicales y subtropicales (como el Lucumillo)

(Pammenter et al, 1994; Barbedo & Cicero, 2000). Existen también otro grupo de plantas

que carecen de semillas o éstas de encuentras atrofiadas o sufren de germinación

precoz, generando patrones anormales en el desarrollo. Bananas y algunos tipos de uvas

se encuentran dentro de este grupo de plantas (Finkelstein & Crouch, 1984). Cuando se

presenta alguna de las situaciones anteriores, la reproducción vegetativa por esquejes o

a través de injertación, ha sido la forma tradicional de propagación utilizada (Matthews,

1999). Sin embargo, no siempre es factible desarrollar este tipo de propagación, ya sea

por factores endógenos de las plantas, por requerimientos de asociación con

microorganismos específicos o porque fito-sanitariamente no son un material vegetal

adecuado de propagar (Jain & Häggman, 2007). Afortunadamente, la biotecnología de

plantas y sus áreas afines, han contribuido con una serie de métodos que permiten

resguardar los acervos genéticos nativos mediante la propagación masiva de una planta

a partir de una muestra muy pequeña de ella en un medio estéril que contiene todo lo

necesario para el crecimiento de la planta. A este tipo de micropropagación se le ha

llamado cultivo in vitro y ha sido amplia y exitosamente utilizado en especies herbáceas

y leñosas (Conger 1981; Caro et al, 2002; Gomes & Canhoto, 2003; Sabja et al, 2008).

Entre las ventajas del cultivo in vitro está la producción de plantas libre de virus y otras

enfermedades, la propagación clonal de individuos de características superiores (árboles

elite), la aceleración de los programas de mejoramiento al permitir una rápida

regeneración de las plantas, eliminación de factores de inhibición endógena de ciertas

semillas, lo cual aumenta las posibilidades de regeneración exitosamente. Entre las

desventajas está la posibilidad latente de contaminación del cultivo causada por hongos,

bacterias u otros microorganismos. Afortunadamente, la utilización de campanas de flujo

laminar que expulsan aire desde la campana al exterior reducen notablemente que

esporas u otros agentes patógenos contaminen los cultivos al interior de ellas. La

vitrificación o endurecimiento de ciertas partes de la planta es otra de las desventajas. La

solución a este problema se realiza tomando las partes de la plántula no vitrificadas y

que son nuevamente propagadas (Dodds, 1991).

En general los protocolos de micropropagación in vitro incluyen seis etapas principales

(Dodds, 1991):

1) Obtención del explante o muestra a micropropagar (hoja, tallo, raíz, ápice, etc).

2) Establecimiento del cultivo en un medio semi-sólido rico en nutrientes.

3) Multiplicación de explantes establecidos y almacenamiento del cultivo en condiciones

controladas.

4) Recuperación de cultivo viables.

5) Regeneración de las plantas a través de sucesivas multiplicaciones.

6) Fases de aclimatación in vitro y ex vitro (invernaderos).

En plantas superiores, el cultivo in vitro se puede desarrollar a través de un cultivo

organizado y a través de un cultivo no organizado (De Fossard, 1977). En el tipo

organizado, se cultivan plantas completas o casi completas por medio de embriones o

semillas. Este tipo de cultivo in vitro es similar al cultivo vegetativo pues incluye la

propagación de especies vegetales vía esquejes, estolones o yemas, conduciendo a una

descendencia idéntica al material vegetal original. El tipo no organizado, por su parte,

involucra el cultivo de células o tejidos que se aíslan desde una zona organizada de la

planta (por ejemplo, un trozo de hoja), la cual es desdiferenciada con el uso de

hormonas vegetales. Esta acción da origen a un masa embriogénica o callo, el cual es

10

dividido en múltiples fragmentos, los cuales mediante una combinación de hormonas de

crecimiento permiten la transformación del callo en plantas completas, idéntica a la

original.

Algunos ejemplos del uso de técnicas de micropropagación in vitro lo tenemos en nuestro

país. Iniciativas del Núcleo Milenio lideradas por científicos de la Pontificia Universidad

Católica de Chile, han realizado con éxito la micropropagación del Toromiro (Shopora

toromiro), un árbol nativo de la Isla de Pascua y que lamentablemente había sido

declarado como extinto en 1978.

(http://www.iniciativamilenio.cl/centros/actividades_det.php?id=1109). Según lo

informado por este grupo de investigadores, la propagación clonal de Toromiros ya

habría alcanzado las 700 plantas y se espera contar con 5 mil ejemplares dentro de los

próximos años. Estas árboles serán reinsertados en su hábitat natural de forma paulatina

contribuyendo a rescatar el patrimonio genético propio de la Isla y aportará a

reestablecer el equilibrio ecológico de la misma. Otros ejemplos de micropropagación de

especies leñosas con problemas de conservación o de interés productivo incluye la Palma

Chilena (Jubaea chilensis), Lingue (Persea lingue), Queule (Gomortega Keule), Luma del

Norte (Legrandia concinna) y Raulí (Nothofagus alpina (Infante, 1989; Calderón-Baltierra

et al, 1993; Sánchez-Olate et al, 2004; Uribe-Moraga & Cifuentes, 2004; Cob et al,

2010). Esto demuestra que aunque no ausente de complejidades, la propagación in vitro

de especies leñosas es posible de realizar.

Como previamente se indicó, el cultivo in vitro se utiliza preferentemente en especies

donde la propagación organizada es ineficiente o prácticamente nula. Sin embargo, la

propagación in vitro no carece de complejidades y varios son los factores que interceden

para lograr una exitosa propagación. Su estandarización es crucial para lograrlo (Conger,

1981). Entre ellos, el genotipo de la planta parece ser clave. Plantas dicotiledóneas

suelen presentar una mejor regeneración in vitro que plantas monocotiledóneas (Zhao et

al, 2009). Idéntica situación se ha observado cuando se comparan angiospermas con

gimnospermas, pues éstas últimas suelen presentar menor capacidad de regeneración in

vitro que las primeras (Deb & Tandom, 2004). La edad de la planta y su estadio de

desarrollo también parecen constituir un factor importante al momento de implementar

esta técnica. Los tejidos jóvenes, no lignificados, por lo general son más apropiados para

el cultivo in vitro, sin embargo, la capacidad regenerativa de algunas especies,

independiente de la edad de éstas, aumenta considerablemente en etapas posteriores de

desarrollo, por ejemplo, durante el periodo de floración (Pierik & Steegmans, 1986).

Otros factores a considerar cuando se desea regenerar un planta de manera in vitro son

el estado fisiológico de la planta, el cual tiene un fuerte efecto sobre la división celular y

la regeneración (Zhao et al, 2009); el estado sanitario de la planta también es

importante pues incide en la vigorosidad de la misma (Morini, 2000); la concentración de

reguladores de crecimiento, sacarosa y minerales; y las condiciones usadas de

temperatura, luz, humedad, potencial osmótico, pH son otros aspectos a evaluar (Wang

& Charles, 1991).

Considerando lo anteriormente expuesto, una de las líneas de trabajo que se realizó en

esta propuesta fue estandarizar métodos de cultivos in vitro para las cuatro especies

nativas de alto interés ecológico y que son consideradas prioritarias en los programas

actuales de conservación (Squeo et al, 2001; 2008). El interés responde a la acción

imperante de contar con sistemas eficientes para estudiar, mantener y resguardar el

patrimonio nativo, lo cual a su vez podría generar nuevas estrategias coactivas en pro de

su protección y desarrollo.

1.5 Biosprospección de compuestos metabólicos: potenciando un uso

alternativo de la biodiversidad nativa. El desciframiento de la estructura del ADN en

la década del 50 (Watson & Crick, 1953), supuso un avance cualitativo y cuantitativo- sin

precedentes en la historia de la humanidad- en lo que se refiere a la compresión del

funcionamiento biológico de los organismos (Machuka, 2004). Desde una perspectiva

11

genética, estos avances tuvieron un punto de inflexión importante en el año 2000 cuando

se anunció la secuenciación completa del primer genoma vegetal de una planta. El honor

correspondió a la planta Arabidopsis thaliana (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000).

Una año mas tarde, la ciencia dio otro paso gigantesco y anunció la secuenciación del

genoma Humano (Venter Craig et al, 2001). A partir de ese momento, las técnicas y

metodologías no han parado de perfeccionarse y la secuenciación de genomas vegetales,

de animales, de peces, de insectos, de bacterias, de levaduras, prácticamente se ha

vuelto algo rutinario. Actualmente, la base datos pública que reúne la información

genómica ya cuenta con 1000 genomas secuenciados de organismos procarióticos y

aproximadamente 12 genomas vegetales (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome).

Esta explosiva disponibilidad de información ha dado origen a una nueva era dentro la

genética bautizada como la era “Post-Genómica”. Áreas como la genómica estructural,

genómica evolutiva, epigenómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica,

metagenómica, y otras en permanente desarrollo, comparten el objetivo común de

aprovechar y procesar los grandes volúmenes de información genética que hoy es posible

generar, estableciendo correlaciones intra e inter-genoma inimaginables hace un par de

años atrás (Brenner, 2001; Montpetit, 2003). Entre estas nuevas áreas de investigación,

el estudio de los perfiles bioquímicos o metabólicos de las plantas se presenta como una

de las ramas más atractivas e influyentes dentro del actual siglo 21 (Oliver, 2002).

Históricamente, los estudios metabolómicos se centraron en el diagnóstico de patologías

o en la caracterización de cepas bacterianas (Shiloach et al, 2010). Con el correr del

tiempo, su utilización se amplió para describir los perfiles metabólicos de hongos y

plantas aunque su desarrollo se consideraba limitado (Kehr, 2001). Esta situación cambió

radicalmente con el avance tecnológico notable de técnicas y tecnologías destinadas a la

caracterización bioquímica de las plantas como son la Cromatografía de Gases (GC),

Cromatografía liquida (LC), Espectrofotometría de Masas (MS), Electroforesis de

Capilaridad (CE) y Resonancia Magnética Nuclear (NMR). Si a este avance técnico le

unimos el mencionado aumento de la secuenciación de genomas y una asociación

estratégica con poderosas herramientas bioinformáticas, podemos señalar que hoy en día

contamos con herramientas biotecnológicas que nos permiten identificar y caracterizar

masivamente un grupo total de metabolitos presentes en un organismo expuesto a una

condición dada, de una manera mucho más precisa y en un rango de tiempo mucho

menor que hace tan solo 10 años atrás (Moco et al, 2007).

El reto de la metabolómica reside, por lo tanto, en encontrar cambios en las cantidades

de metabolitos que se puedan correlacionar con el estado fisiológico y desarrollo de una

célula, tejido u organismo adaptado a sus condiciones de hábitat particular. Lo es

también, el interés y la capacidad de las Universidades y Centros de Investigación por

adquirir prontamente estas nuevas tecnologías e instrumentación disponible. Como

primer paso para desarrollar la metabolómica en plenitud, es requisito fundamental

contar con perfiles metabolómicos “básicos” que orienten hacia donde debería ser

dirigida la secuenciación de su metaboloma en un sentido amplio y preciso (Schwab,

2003). Una vez conocida la cantidad y calidad de sus componentes bioquímicos, la

naturaleza propia de las plantas hará que se generen nuevas oportunidades excitantes

para aplicar y aprovechar sus bio-productos.

1.6 Perfiles metabolómicos. Los metabolitos se definen como el producto final de un

proceso celular y corresponden a la última respuesta que los sistemas biológicos hacen

de acuerdo a su constitución genética o influencia medioambiental (Oliver, 2002). Los

perfiles metabólicos corresponden a una “radiografía” de lo que está contenido en el

metaboloma de esa planta, es decir, el conjunto de metabolitos totales presentes en un

organismo bajo un cierto tipo de condición biológica, de tiempo o de espacio y la ciencia

encargada de estudiarlos se conoce como metabolómica (Montpetit, 2003).

Los metabolitos se dividen en metabolitos primarios (azúcares, aminoácidos, ácidos

orgánicos, lípidos) y metabolitos secundarios (terpenos, compuestos fenólicos y

12

compuestos que contienen Nitrógeno) (Taiz & Zeiger, 2007). En el caso de las plantas,

los metabolitos tanto primarios comos secundarios son muy importantes pues actúan en

respuestas al ataque de patógenos, colaboran a contrarrestar condiciones de estrés

abiótico, contribuyen a mantener el color, sabor y olor tanto de flores como de frutos,

potencian o arruinan la calidad de algunos productos y finalmente, son los constituyentes

básicos de muchas de las propiedades químicas que hacen que una planta sea o no de

interés popular (Oliver, 2002). En papa (Solanum tuberosum), se ha logrado caracterizar

los perfiles metabólicos específicos de seis fases particulares del desarrollo de esta planta

(Shephard et al, 2010). La información generada ha permitido no sólo entender el ciclo

de vida de Solanum sino también ha impulsado el diseño de nuevas estrategias para su

mejoramiento nutricional. Otro ejemplo notable ocurre con el aceite de oliva. Desde hace

un tiempo que es conocida la presencia del oleocanthal, un metabolito secundario con

efecto antiinflamatorio presente exclusivamente en el aceite de oliva “extra virgen” y que

inhibe la actividad de las enzimas de la ciclooxigenasa (COX), causante de la inflamación

y cuya actividad es similar a la realizada por el ibuprofeno (Beauchamp et al, 2005). Las

tremendas propiedades de los ácidos grasos del aceite de oliva no terminan ahí.

Recientemente, se ha comprobado que el oleocanthal también ayudaría a contrarrestar la

enfermedad de Alzheimer (Pitt et al, 2010). Otro enfoque acerca de cómo los perfiles

metabolómicos pueden contribuir al conocimientos de las especies, ocurre en estudios

metabólicos comparativos realizados en leguminosas. Aquí, comunidades que contenían

plantas altas-leguminosas (AL), plantas altas-no leguminosas (ANL), plantas bajas-

leguminosas (BL) y plantas bajas-no leguminosas (BNL), encontraron que la carencia de

nutrientes necesarios para sintetizar ciertos compuestos primarios podría actuar como un

estimulador de la diversidad de las plantas (Scherling, 2010). Así también, existen

innumerables ejemplos que demuestran que los metabolitos o compuestos naturales

presentes en una planta específica, pueden verse potenciados por las características

particulares de su hábitat. Es así como el déficit hídrico en vides aumenta el contenido de

fenoles y antocianinas, los cuales tienen un impacto positivo sobre la calidad final del

vino (Ferreyra & Sellés, 1997). Idéntico tratamiento hídrico se traduce en un incremento

de los azúcares contenido en las bayas de vides de mesa, mejorando su apreciación final

por el consumidor (Peacock & Dokoozlian, 1997). La sequía también se ha visto que

aumenta el contenido final de polifenoles y tocoferoles en el aceite de oliva, lo cual

incrementa el picor y el ardor que son dos de las características que mas contribuyen a

incrementar la calidad final de él (Troncoso et al, 2006). Por su parte, caracterizaciones

realizadas en plantas medicinales demuestran la existencia de altas cantidades de

metabolitos primarios y secundarios que pueden tener efectos gastroprotectores

(antocianinas), antitumorales (diterpenos) y nutricionales (aminoácidos esenciales)

(Schmeda-Hirschmann et al, 1992; Schmeda-Hirschmann et al, 1993; Shirley et al, 2007;

Theoduloz et al, 2009). Todos estos antecedentes refuerzan la idea que los compuestos

metabólicos de las plantas pueden impactar significativamente tanto la industria

alimenticia como aquella con fines fármaco-ecológicos. Sin embargo, a pesar de los

esfuerzos por conocer la estructura química que les constituye, su alcance es aún

insuficiente, limitado a ciertas especies, o como en la mayoría de los casos, inexistente.

Si a esto le sumamos que hay especies ecológicamente importantes cuyas propiedades

químicas se desconocen, entonces nuestra labor y políticas de conservación deberían

verse potenciadas con el fin de preservar un material que ecológica y genéticamente

podría ser relevante para el desarrollo del país.

1.7 Propósito de la investigación. Las regiones de Atacama y Coquimbo pertenecen al

llamado “Hot spot” chileno de biodiversidad mundial (Arroyo et al, 2004). En ellas

conviven un número importante de especies nativas de excepcional belleza e incalculable

valor ecológico. No obstante aquello, las escasas precipitaciones, suelos pobre en

nutrientes, procesos severos de desertificación, elevada intervención antropogénica y

presencia de ciclos climáticos (ENSO) que alteran la biodinámica de sus ecosistemas, ha

puesto en peligro de conservación un número importante de especies nativas (Luebert &

Priscoff, 2006). Con el fin de contribuir a su protección e identificación de nuevos usos

biotecnológicos, esta propuesta consideró la aplicación de técnicas de micropropagación

13

in vitro y caracterización bioquímica de cuatro especies nativas de alto valor ecológico

adaptadas a las zonas áridas y semiáridas de Chile. Estas especies fueron Garra de Léon

(Leontochir ovallei), Lucumillo (Myrcianthes coquimbensis), Algarrobo Dulce (Prosopis

flexuosa) y Algarrobo (Prosopis chilensis). Para lograr la conservación de este material la

propuesta consideró la estandarización de protocolos de propagación sexual (por

semillas) y propagación clonal in vitro de tipo organizado (a partir de tejidos completos

como puede ser yemas, hojas, tallos), ambos con el fin de sustentar posibles programas

de forestación y reforestación con éstas cuatro especies nativas. Esto último de gran

importancia y necesarios de implementar luego de conocer los preocupantes niveles de

erosión de los suelos de Chile y en especial, los de la Región de Coquimbo (CIREN,

2011).

14

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo General

Evaluar y resguardar el patrimonio genético de plantas nativas de zonas áridas y

semiáridas mediante el establecimiento de protocolos de propagación vegetativa

de tipo in vitro y determinación de compuestos naturales presentes en el

metaboloma de hojas, frutos o raíces.

2.2 Objetivos Específicos

1. Estandarizar protocolos de propagación por semillas, por esquejes y de tipo in

Vitro para Garra de Léon (Leontochir ovallei), Lucumillo (Myrcianthes

coquimbensis), Algarrobo dulce (Prosopis flexuosa) y Algarrobo (Prosopis

chilensis).

2. Estandarizar protocolos para identificar y cuantificar -mediante herramientas

metabolómicas- compuestos metabólicos naturales presentes en hojas, frutos o

raíces de Garra de Léon (Leontochir ovallei), Lucumillo (Myrcianthes

coquimbensis), Algarrobo dulce (Prosopis flexuosa) y Algarrobo (Prosopis

chilensis).

3. Generar un registro de los metabolitos presentes en Garra de Léon (Leontochir

ovallei), Lucumillo (Myrcianthes coquimbensis), Algarrobo dulce (Prosopis

flexuosa), Algarrobo (Prosopis chilensis) y cuyo potencial bioquímico podría ser

usado en la industria agroalimentaria y/o biomédica nacional.

15

3. METODOLOGÍA

Estandarización de protocolos de propagación clonal in vitro, por esquejes y por

semillas para Garra de Léon (L. ovallei), Lucumillo (M. coquimbensis), Algarrobo

dulce (P. flexuosa) y Algarrobo (P. chilensis).

Con el objetivo de aumentar las posibilidades de micropropagar exitosamente las cuatro

especies, se optimizaron protocolos de propagación sexual y asexual. El Cuadro 1

muestra el diseño experimental, el Cuadro 2 indica el número de metodologías probadas,

y el Cuadro 3 se muestra el tiempo requerido para optimizar cada protocolo.

Cuadro 1. Metodología de trabajo

Cuadro 2. Cantidad de metodologías probadas.

Propagación Prosopis

flexuosa

Leontochir

ovallei

Myrcianthes.

coquimbensis

Prosopis

chilensis

Semillas 2 3 (108) 6 2

Ex vitro 24 2 24 24

In vitro 6 2 27 6

Cuadro 3. Tiempo requerido para optimizar protocolos de propagación.

Propagación Prosopis

flexuosa

Leontochir

ovallei

Myrcianthes.

coquimbensis

Prosopis

chilensis

Semillas 3 días 17 meses 6 meses 3 días

Ex vitro 2 meses 8 meses 2 meses 2 meses

In vitro 4 meses 2 meses 17 meses 4 meses

16

3.1. Propagación in vitro de tipo organizado.

3.1.1 Colecta de material: Se utilizaron explantes (o esquejes) de plantas jóvenes. Si

bien se intentó utilizar explantes desde plantas adultas colectadas en terreno, la elevada

carga de hongos, virus y bacterias que arrastraban hizo inviable su utilización. Las

plantas jóvenes se obtuvieron a partir de la germinación de semillas de cada especie.

3.1.2 Esterilización de explantes: El material colectado fue lavado con agua potable

para eliminar el exceso de polvo, y luego sumergido en una solución fungicida (2,5 g

CAPTAN+0,6 g BENLATE /1 litro de agua destilada esterilizada (H20 dE) y agitación

durante 15-20 minutos. Luego, los esquejes fueron profusamente enguajados con H20dE

y dos gotas de Tween-20 y mantenidos en agitación por 10 minutos. Luego, los

explantes fueron sumergidos en una solución de hipoclorito de sodio 1.5% + 2 gotas de

Tween-20 durante 10 minutos en agitación. A continuación se realizaron tres lavados con

H2O destilada estéril en agitación por 5 minutos cada uno.

3.1.3 Cultivo de explantes: Los explantes estériles fueron transferidos a un medio de

crecimiento básico de Murashige & Skoog rico en macro y micro nutrientes,

suplementado con vitaminas, fitohormonas (auxinas), azúcar y agar-agar. Para cada

especie se desarrolló un medio básico específico. Los segmentos uninodales se cultivaron

en condiciones de asepsia por 30 días a 21°C, fotoperíodo largo (16 h luz y 8 h

oscuridad), 135 µmol m-2 s-1, 70% de humedad relativa.

3.1.4 Multiplicación nuevos explantes: Las plantas establecidas in vitro fueron

usadas como nuevos explantes. Así, los vástagos de estos explantes fueron segmentados

en pequeños trozos de una longitud mínima de 0,5 cm. Su cultivo se hizo como se

describió en el punto 1.3.

3.1.5 Enraizamiento: Posterior al establecimiento de los plantines (plántula sin raíz), se

inició el enraizamiento de los mismos. Para ello, los plantines fueron crecidos sobre un

medio de crecimiento básico de Murashige & Skoog rico en macro y micro nutrientes,

suplementado con vitaminas, una combinación de auxinas (Ácido Indol Butírico) y

citoquininas (Kinetina), azúcar, agar-agar y Carbón activado. Nuevamente, los

segmentos uninodales se cultivaron en condiciones de asepsia por 30 días a 21°C,

fotoperíodo largo (16 h luz y 8 h oscuridad), 135 µmol m-2 s-1, 70% de humedad relativa.

3.1.6 Aclimatación: Una vez que las plántulas (plantines con raíz) lograron un buen

desarrollado de raíces, se inició su aclimatación para ser transferidas a un invernadero.

Este proceso se realizó en una cámara de crecimiento a 21°C, fotoperíodo largo (16 h luz

y 8 h oscuridad), 70% de humedad relativa. El proceso se inició sacando las plantas de

los frascos cuidando no romper las raíces y lavándolas con agua potable eliminado los

restos de agar. Luego, las plantas fueron trasplantadas en vasos de plástico que

contenían una mezcla esterilizada de arena: vermiculita (2:1). El sustrato fue

humedecido con agua destilada y fertilizado levemente con un abono granulado

previamente diluido. Para evitar la deshidratación de las plántulas, cada vaso de plástico

fue cubierto con otro vaso de plástico invertido para generar un mini invernadero, en el

cual ambos vasos fueron agujereados en sus extremos para permitir la absorción de

agua (vaso inferior) e intercambio gaseoso (vaso superior). Luego, y con el fin de

aclimatar a la planta a las condiciones de la cámara de crecimiento, los vasos fueron

paulatinamente abiertos cada 7 días, proceso que terminó al cabo de 1 mes. Durante

todo este período, las plantas fueron permanente regadas. Una vez completado el mes

de aclimatación, las plantas fueron trasladadas a un invernadero a 21°C ± 5°C, donde la

luz natural fue complementado con luz artificial desde las 18:00h a las 24:00h mediante

la utilización de luces halógenas de sodio (150W) que permitían generar una intensidad

lumínica de 250-350 µmol m-2 s-1 y establecer así un fotoperíodo largo (18 h luz y 6 h

oscuridad). Las plantas se mantuvieron en estas condiciones durante 2 meses, con riegos

diarios durante las dos primeras semanas, luego tres por semana, y finalizar con dos

riegos por semana. Una vez cumplido los dos meses, las plantas se transfirieron a un

sombreadero dispuesto especialmente para este proyecto y expuesto a condiciones

climáticas naturales de La Serena 29°54’53” (S), 71°14’31” (O), con el fin de ir

reforzando su aclimatación y adaptación a las condiciones áridas.

3.1.7 Análisis estadísticos: La significancia estadística entre tratamientos o entre las

distintas pruebas que se hicieron a lo largo del estudio, se realizaron mediante análisis de

17

varianza (ANOVA) y Test de Tukey, ambos con un 95% de confianza (p<0.05) usando el

programa estadístico R (R, 2005).

3.2. Propagación vegetativa por esquejes en cama de propagación

3.2.1. Colecta de material: Al igual que en A.1, se utilizaron esquejes de plantas

jóvenes previamente germinadas por nosotros mismos pues los esquejes provenientes de

plantas adultas colectadas en terreno traían la ya mencionada elevada carga de

microorganismos que imposibilitaban su utilización. En cada esqueje se mantuvieron al

menos 6 yemas laterales, y todas sus hojas.

3.2.2 Esterilización de esquejes: Idem punto A.2

3.2.3 Enraizamiento de esquejes: Una vez desinfectados los esquejes, estos fueron

nuevamente cortados dejando solo dos yemas laterales, manteniendo la yema superior y

cortando las hojas de la yema inferior. Luego, los explantes fueron sumergidos por 5

segundos en Ácido Indol Butírico (auxina) en concentraciones que variaron entre 5000 y

7500 mg/L según cada especie. Luego, los explantes fueron puestos en una cama de

propagación (o cama caliente) mantenida a 21°C constante y con cuatro sustratos

distintos (arena, vermiculita, tierra de hojas, y una mezcla de todas ellas). La cama

caliente se encontraba al interior de un invernadero con condiciones ya indicadas en A.6

El enraizamiento de los esquejes de las plantas se evaluó después de 60 días.

3.2.4 Aclimatación: Aquellos esquejes enraizados fueron traspasados cuidadosamente

desde la cama caliente a bolsas de vivero. El sustrato elegido para este proceso de

aclimatación fue tierra de hoja comercial. Las plántulas fueron mantenidas en el

invernadero por 1 mes después del cual fueron trasladadas hasta un sombreadero (ver

A.6).

3.2.5 Análisis estadísticos: La significancia estadística entre tratamientos o entre las

distintas pruebas que se hicieron a lo largo del estudio, se realizaron mediante análisis de

varianza (ANOVA) y Test de Tukey, ambos con un 95% de confianza (p<0.05) usando el

programa estadístico R (R, 2005).

3.3. Propagación por semillas

3.3.1 Colecta de material: Para L. ovallei se tuvo la suerte que la especie floreció en el

año 2011, lo que permitió obtener semillas para conducir el estudio en esta planta. Si

bien se consiguió un permiso especial para colectar las semillas en el Parque Nacional

Llanos de Challe (28°11’07” S, 71°09’25” O) hasta el año 2014, solo hubo floración el

año indicado por lo que se desconoce si podremos volver a colectar semillas dentro del

Parque Nacional, que es donde se concentra la mayor población de L. ovallei. Para

colectar sus semillas se utilizó un método simple pero muy eficiente. Este consistió en

poner bolsas de papel adosadas en cada inflorescencia de la cual se quiso obtener

semillas. Esto no solo logró evitar la depredación de las semillas por parte de la fauna

local sino además permitió controlar la indehiscencia explosiva que presenta esta

inflorescencia. Un total de 120 inflorescencias fueron seleccionadas, lo que equivale a

tener aproximadamente 21.000 semillas. Para M. coquimbensis, un total de 5000

semillas fueron colectadas a lo largo de su rango de distribución (Punta de Choros hasta

el Norte de Tongoy), concentrando la colecta en la zona del Arrayán (29°42’48” S,

71°18’02” O), que es el lugar donde se concentra la población más numerosa de la

especie. Para Prosopis chilensis se colectaron 300 vainas (1200 semillas) colectadas a lo

largo de su distribución en la Región de Coquimbo (Valle del Elqui hasta Valle del

Choapa). Se evaluaron dos tratamientos de escarificación, con ácido sulfúrico y sin él,

siendo tan robustos los resultados que no fue necesario seguir probando nuevos

tratamientos. Para P. flexuosa, se colectaron 600 (2400 semillas) colectadas en la Región

de Atacama, mayoritariamente en unos bosquetes ubicados al costado de la carretera

que une Caldera con Copiapó (27°21’22” S, 70°39’59” S). Al igual que en P. chilensis,

aquí no fue necesario evaluar más que los dos tratamientos de escarificación ácida.

3.3.1 Tratamientos germinativos: L. ovallei se probaron 108 tratamientos (ver ANEXO

Tabla 1). Para M. coquimbensis se evaluaron tratamientos de germinación con y sin

pericarpio. Para P. chilensis y P. flexuosa se evaluaron tratamientos de escarificación, con

ácido sulfúrico y sin él.

18

3.3.2 Análisis estadísticos: La significancia estadística entre tratamientos o entre las

distintas pruebas que se hicieron a lo largo del estudio, se realizaron mediante análisis de

varianza (ANOVA) y Test de Tukey, ambos con un 95% de confianza (p<0.05) usando el

programa estadístico R (R, 2005).

Estandarización de protocolos para identificar y cuantificar -mediante

herramientas metabolómicas- compuestos biológicos naturales presentes en

hojas, frutos o raíces de las cuatro especies nativas seleccionadas.

Se aplicaron protocolos de análisis químicos para evaluar los principios inmediatos

(grupos nutritivos del metabolismo primario) e identificación/cuantificación de algunos

metabolitos secundarios en hojas y semillas de L. ovallei, hojas, frutos y semillas en M.

coquimbensis, hojas y vainas de P. chilensis, y en hojas y vainas de P. flexuosa. Los

grupos nutritivos del metabolismo primario (análisis proximal, centecimal o de weende)

aplicados al estudio de las especies vegetales mencionadas y los análisis de metabolitos

secundarios aplicados se resumen en el Cuadro 4.

Cuadro 4: Resumen de las Técnicas analíticas (Protocolos de análisis) empleados aplicados al estudio de las cuatro especies vegetales.

3.4 Tratamiento Preliminar de las Muestras (Preparación de la muestra

ingresada a Laboratorio para ser transformada en muestra analítica): Las

muestras de hojas de las especies en estudio, se recogieron al azar y se guardaron en

bolsas de papel para posteriormente ser llevadas a Laboratorio. Una vez en éste, se

procedió a separar las hojas de los tallos. La hojas se lavaron con detergente no iónico, y

enjuagues sucesivos con agua destilada y se secaron en estufa de aire forzado, marca

memmert, a 60º C hasta alcanzar peso constante, por un periodo de 48 a 72 horas. Una

vez secas se molieron en molino de cuchillas, se pasaron por un tamiz de 40 mallas y se

almacenaron en un tubo falcón a -80ºC para su conservación y posterior análisis. En el

Humedad (Técnica gravimetría: Secado en estufa convencional) Proximal

Cenizas (Técnica gravimetría: método calcinación en mufla)

Extracto Etéreo (Técnica Gravimetría: método extracción Soxhlet)

Azúcares Totales/Reductores (Técnica EAM: método Dubois/ Somogyi-Nelson)

Proteínas (Técnica volumetría: método Kjeldahl)

Mineral Cenizas

Macronutrientes: Ca, Mg : Técnica Espectroscopía de Absorción Atómica

Na y K : Técnica Espectroscopía de Emisión Atómica

N: Técnica Volumétrica; método de Kjeldahl P: Técnica EAM; método del fosfovanadomolibdato.

Micronutrientes

(Fe, Cu, Mn, Zn): Técnica EAA; método digestión ácida

B: Técnica EAM; método Azometina H.

Polifenoles Espectroscopía de Absorción Molecular: método de Folin Ciocalteau

Perfil ácidos Grasos Cromatografía de Gases- Detector FID

Otros metabolitos secundarios

Cromatografía en capa final (TLC) y HPLC

19

caso de las vainas de Prosopis chilensis y Prosopis flexuosa se sometieron al mismo

proceso de secado de las hojas, una vez secas las vainas se molieron. Para la especie

Myrcianthes coquimbensis se retiró la semilla del fruto y ambos fueron analizados por

separado bajo los mismos procedimientos previos de secado y molienda. Los análisis de

las muestras analíticas de las especies de interés se describen en los párrafos sguientes.

3.5 Análisis de Humedad total y remanente después del secado inicial antes de

la molienda.

Para la determinación de la humedad se emplearon cápsulas de petri, taradas después de

someterlas a secado en estufa a 60° por 24 horas. Luego se masaron 10 g de muestra

con sensibilidad de 0,1 mg en balanza analítica y se dejaron en estufa a 60º C

(aproximadamente 24 horas) hasta obtener peso constante. El porcentaje de humedad

en la muestra se calculó por diferencia de pérdida de masa, expresada en porcentaje. A

partir de este valor de humedad se determinó la materia Seca. Sobre la materia seca se

realizaron los análisis químicos correspondientes.

3.6 Análisis de Cenizas.

Para el análisis de cenizas, que corresponden a la fracción Total del componente mineral

del vegetal, se empleó una porción de la muestra previamente seca, la cual fue masada y

luego combustionada en una mufla a 550°. Toda la materia orgánica se incineró y sólo

quedó el residuo inorgánico. Para la determinación se emplearon crisoles de porcelana

tarados, los cuales fueron previamente puesto en una mufla por 3 horas a 550 0C. Luego

se masaron 0,5 g de muestra con sensibilidad de 0,1 mg en balanza analítica. Se calcinó

la muestra empleando un mechero, y posteriormente se sometió a 550°C en mufla por 3

horas. El residuo mineral obtenido que representó el contenido de cenizas en las

muestras se expresó en porcentaje.

3.7 Determinación Analítica del extracto etéreo (EE).

La fracción denominada extracto etéreo, que corresponde a la destilación de una muestra

con un solvente apolar, y que incluye, además de los lípidos, ceras, pigmentos, alcoholes

y ácidos grasos orgánicos, se analizó empleando el método Soxhlet, empleando como

extractante hexano. Para ello se masaron 5 g de muestra anhidra, con precisión de 0,1

mg, la que se colocó en un cartuchohecho con papel filtro previamente masado, de tal

forma de que no se pudiese perder muestra durante la extracción. El sobre se colocó

dentro de la cámara de extracción del extractor soxhlet y se agregó el hexano hasta el

primer sifón. Bajo calentamiento regulado y constante, la muestra se sometió a

extracciones continuas por un lapso de 3 horas. Una vez terminado este tiempo, se retiró

el cartucho y se dejó secar en estufa hasta eliminación completa del hexano remanente,

se enfrió en desecador y se masó. El contenido, expresado en porcentaje de extracto

etéreo, se calculó mediante la pérdida de peso de la muestra seca en función de la

muestra desgrasada, en porcentaje.

3.8 Análisis de la proteina bruta.

El método empleado para el análisis de proteína bruta fue el método de Kjeldahl por

medio de un sistema digestor y destilador Kjeldahl semi automático Büchi. Para ello se

masaron 0.5 gramos, con precisión de 0,1 mg de muestra seca y se llevaron a tubos

Kjeldahl a los cuales se le agregaron 10 mL de H2SO4 (96%, 18 mol/L, d= 1.84 kg/L) con

acelerador de selenio y 5 mL de H2O2, dejándose en digestión por 1 hora a 420 oC. Una

vez terminado el tiempo de digestión, para realizar el destilado del amonio formado, se

adicionó al tubo de digestión NaOH 40% p/v, hasta reacción alcalina, la cual se verificó

por aparición de un tono rosado del indicador fenolftaleína. El amoníaco destilado se

recogió en un matraz erlenmeyer conteniendo 25 mL de H3BO3 al 4%, al cual se le

adicionó previamente indicador mixto Tashiro. Posteriormente el amoníaco recogido en

ácido bórico, como borato amónico, se tituló con una solución estándarizada de H2SO4

0.1 N hasta nuevo viraje del indicador. Se expresó el nitrógeno en % y se aplicó el factor

5,7 para conversión del nitrógeno en % de proteina.

20

3.9 Determinación de azúcares totales, azúcares reductores y no reductores.

Para la determinación de azúcares totales y reductores se procedió a masar 0.1 g de

muestra en balanza analítica con precisión de 0,1 mg en un vaso precipitado de 50 mL.

Se adicionó 5 mL de etanol al 80% y se cubrió con vidrio de reloj, para luego ser

sometido a ebullición por un periodo de 15 minutos en plancha calefactora a 150 oC. Una

vez cumplido el tiempo de ebullición y frias las muestras, se filtró empleando papel

whatman 41, recogiéndose el filtrado directamente en un matraz de aforo de 10,0 mL.

Los lavados y enrase a volumen se efectuaron empleando etanol al 80%. Se rotuló como

extracto 1. Luego del extracto 1, bien homogeneizado, en un tubo de ensayos, se colocó

una alícuota de 1,0 mL, para ser llevada a sequedad por calentamiento a baño maría.

Una vez eliminado completamente el solvente, el residuo seco se disolvió en 3 mL de

agua destilada, con agitación intensa de un minuto por medio de un vortex. Se filtró

empleando papel whatman 41, recibiéndose el filtrado directamente en matraz de aforo

de 10,0 mL. Los lavados y enrase a volumen se efectuaron empleando agua destilada. Se

rotuló como extracto 2.

a) Determinación de azúcares reductores: Método de Somonyi-Nelson

Se realizó empleando una alícuota de 2 mL del extracto 2 a la cual se le adicionó 1 mL de

reactivo de Somonyi. Se llevó a ebullición en baño maría por 10 a 15 minutos, se enfrió

en baño de hielo y se agregó 1 mL de reactivo de Nelson con agitación continua. Una vez

desarrollado el color, se midió la absorbancia a 620 nm en un Espectrofotométro de

Absorción Molecular UV-VIS, Marca Jasco, modelo V530. El contenido de azúcares

reductores se obtuvo frente a una curva de calibración externa de glucosa en un rango

de 0 a 100 mg glucosa/L, expresándose el resultado en porcentaje.

Reactivo de Nelson: Se disolvieron 25 g de molibdato de amonio en 450 mL de agua

destilada, luego se agregaron 21 mL de H2SO4 (96%, 18 mol/L, d= 1.84 kg/L), después

de mezclar se agregaron 3 g de Na2HAsO4.7H2O disueltos en 25 mL de agua destilada. Se

homogenizó bien y se incubó a 37° por 48 horas. La solución se guardó en frasco color

topacio.

Reactivo de Somogyi: Se disolvieron 28 g de Na2HPO4 anhidro y 4 g de tartrato de

sodio y potasio en aproximadamente 700 mL de agua destilada. Se agregaron luego 100

mL de NaOH 1N agitando, y luego 80 mL de CuSO4 10% (p/v). Una vez disuelto todo se

gregaron 180 g de Na2SO4 anhidro y se diluyó a 1 litro con agua destilada. La solución se

dejó en reposo durante un día y se decantó el sobrenadante clarificado. Este reactivo es

estable indefinidamente.

b) Determinación de azúcares totales (Método de Dubois)

Se tomó una alícuota de 1,0 mL de muestra del extracto 2 en tubo de ensayos

introducido en un baño de hielo y se adicionó 1 mL de fenol al 5% más 5 mL de H2SO4

(96% , 18 mol/L , d= 1.84 kg/L). La solución enfriada se agitó posteriormente en un

vortex, para ser llevada luego a baño maría por 10-15 minutos. Una vez fría la solución

se midió la absorbancia a 422 nm en un Espectrofotométro de Absorción Molecular UV-

VIS, Marca Jasco, modelo V530. El contenido de azúcares totales se obtuvo frente a una

curva de calibración externa de glucosa en un rango de 0 a 100 mg glucosa/L,

expresándose el resultado en porcentaje de glucosa.

c) Azúcares No- Reductores.

Se obtienen por diferencia entre los azúcares totales y los no- reductores.

3.10 Análisis de Fibra.

Para la determinación de fibra se masaron, con precisión de 0,1 mg, 2 g de muestra seca

y desgrasada, residuo proveniente de la extracción soxhlet, muestra la cual se colocó

dentro de un vaso pp de 500 mL al cual se le adicionó 250 mL de solución de H2SO4 1.25

% (0,255N) más 0.5 mL de alcohol amílico, para evitar formación de espumas. Se

agregaron perlas de ebullición, el sistema se cerró mediante un sistema de refrigeración

redondo sobre el vaso y se sometió a reflujo por 30 minutos, controlando la temperatura

de la ebullición. Una vez completado el tiempo de reflujo, en caliente, se filtró a presión

reducida la solución, empleando lino como material filtrante. El residuo se lavó con agua

caliente hasta cese de la reacción ácida del filtrado, ayudándose para ello con papel

21

indicador universal de pH. Al vaso en el cual se realizó la primera hidrólisis se traspasó el

residuo del medio filtrante, utlizando 250 mL de solución alcalina de NaOH 1.25%

(0,313N) más 0.5 mL de alcohol amílico y perlas de ebullición. Se sometió a reflujo de la

misma manera que la señalada anteriormente para la hidrólisis ácida. Finalizado el

tiempo de reflujo, se filtró en caliente, empleando como medio filtrante un papel de filtro

de poro grueso, previamente tarado. El papel, conteniendo el residuo, correspondiente a

la fibra bruta, se llevó a estufa, a 60 oC, hasta total sequedad y se masó. Expresándose

el residuo en porcentaje respecto a la muestra inicial.

3.11 Análisis de los componentes minerales.

La preparación de la muestra para el análisis de los componentes minerales se realizó

por mineralización vía húmeda, para lo cual se masó, con sensibilidad de 0.1 mg, 0.5 g

de muestra seca y finamente pulverizada que se colocó en un vaso de precipitados de

borosilicato de 250 mL. Se adicionó 8.0 mL de HNO3 (d= 1.40 g/mL 65 % p/p) y 3.0 mL

de HClO4 (d= 1.67 g/mL 72% p/p), se cubrió con un vidrio de reloj y se llevó a digestión

en placa calefactora (300oC), hasta aparición de humos blancos, etapa que duró

aproximadamente 10 minutos. Pasado este lapso de tiempo se retiró el vaso de la placa,

se dejó enfriar y se adicionó 15.0 mL de agua destilada. Se llevó a ebullición para

disolución de las sales formadas. Una vez retirado el vaso del calor y enfriado se procedió

a filtrar cuantitativamente con papel filtro Whatman 40 recogiéndose el filtrado en

matraces de aforo de 100,0 mL. El lavado y enrase se realizó empleando agua destilada.

Se rotuló como solución 1. En esta solución se analizaron por Espectroscopía de

absorción atómica (EAA) en un equipo Varian, modelo SpectrAA 220, los elementos

minoritarios presentes en las hojas: Fe, Cu, Mn y Zn, bajo las condiciones estándares

establecidas por el fabricante del equipo. Para el análisis de Na, K, Ca y Mg, elementos

mayoritarios se procedió a tomar una alícuota de 10.0 mL de la solución 1, la cual se

llevó a un matraz de aforo de 100.0 mL, agregándose como amortiguador de

interferencias y supresor de ionización una alícuota de 10.0 mL de solución de La 2% y

Cs 1%. En esta solución se analizaron por Espectroscopía de absorción atómica (EAA) en

un equipo Varian, modelo SpectrAA 220, los elementos mayoritarios: Na, K, Ca y Mg,

bajo las condiciones estándares establecidas por el fabricante del equipo. Los patrones

empleados en la preparación de las curvas de calibración para cada elemento fueron

obtenidos de titrisoles de 1,00 g/L marca Merck. Las diluciones para las curvas se

realizaron empleando como solución de enrase HCl 2% y agregando en las mismas

proporciones la solución de La 2% y Cs 1%.

3.12 Determinación de Boro.

La determinación Boro se realizó a partir de las cenizas obtenidas luego de la calcinación

en mufla. Para el análisis se procedió a untar las cenizas con gotas de agua destilada,

para luego adicionar 10,0 mL de HCl 2 M. y calentar en plancha calefactora hasta

ebullición. Luego de enfriar la solución se filtró utilizando papel filtro whatman 40 y

recogiéndose el filtrado en un matraz de 100 mL, enrasándose con agua destilada. Se

llevó a cabo mediante el método espectrofotométrico empleando el agente acomplejante

azometina-H. Para ello se procedió a tomar una alícuota de 1 mL del filtrado en un tubo

de ensayos, se agregó 4 mL de solución tampón, una vez mezclado se adicionó 2 mL de

solución de azometina-H. Se dejó en reposo por 30 a 60 minutos pero no más de 90

minutos y se procedió a leer a 430 nm en un Espectrofotométro de Absorción Molecular

UV-VIS, Marca Jasco, modelo V530, aplicando el método de calibración externa con un

patrón de Boro, calidad Patrón Primario. Para la preparación de la Solución Tampón se

disolvió 100 g de acetato de amonio, (CH3COONH4), en 160 mL de agua destilada,

solución a la cual se le agregó posteriormente 50 mL de ácido acético glacial, se

homogeneizó bien y se agregó, hasta disolución, 2.68 g de sal di sódica de ácido

etilendiamino-tetraacético (Na2EDTA ∙2H2O). Enseguida se agregó 2.4 mL de ácido

tioglicólico (ácido mercaptoacético, C2H4O2S, d= 1.32 Kg/L) y se homogeneizó

correctamente, para dejar la solución en reposo durante la noche, almacenándose

posteriormente en frascos de polietileno. (La solución es estable sólo una semana). Para

la preparación de la solución de Azometina-H/ácido ascórbico, reactivo colorimétrico, se

22

masaron 0,9 g de azometina-H, (C17H12NNaO8S2) más 2 g de ácido ascórbico (C6H8O6)

disueltos en 100 mL de agua destilada. (Nota: la solución guardada en frasco de

polietileno, refrigerada, dura 15 días).

3.13 Determinacion de Fósforo.

La determinación Fósforo se realizó a partir de las cenizas obtenidas luego de la

calcinación en mufla, en la determinación de cenizas señaladas en párrafos anteriores.

Para el análisis se procedió a untar las cenizas con gotas de agua destilada, para luego

adicionar 10,0 mL de HCl 2 M. y calentar en plancha calefactora hasta ebullición. Luego

de enfriar la solución se filtró utilizando papel filtro whatman 40 y recogiéndose el filtrado

en un matraz de 100 mL, enrasándose con agua destilada. Se aplicó el método

espectrofotométrico del fosfo-vanadomolibdato, para ello se tomó una alícuota de 1,0 mL

del filtrado, se agregó 4 mL de la solución de nitro-vanadomolibdato, se mezcló y se dejó

en reposo por 1 hora, al cabo de la cual se midió la absorbancia a 450 nm en un

Espectrofotométro de Absorción Molecular UV-VIS, Marca Jasco, modelo V530. Para la

cuantificación del fósforo se aplicó el método de calibración externa por medio de una

serie de patrones de fósforo en un rango de concentraciones entre 0 y 200 mg/L de P.

Para la preparación de la solución de nitro-vanado-molibdato, se mezclaron en partes

iguales las siguientes soluciones: Solución de vanadato de amonio 0,9 g/L, preparada por

disolución de 0,9 g de vanadato de amonio NH4VO3 en alrededor de 500 mL de agua

hirviendo, adicionada una vez fría de 24 mL de ácido nítrico concentrado y diluida con

agua destilada a 1L. Solución de molibdato de amonio 19 g/L, preparada por disolución

de 19,0 g de molibdato de amonio (NH4)6Mo7O24 ∙4 H2O en agua a 50 oC, enfriada y

diluida a 1 L con agua destilada y Ácido nítrico 1,5 mol/L, preparado por disolución en

agua de 105 mL de HNO3 (65%, 14 mol/L, d= 1.39 Kg/L) enrasado a 1L.

3.14 Polifenoles Totales. Método de Folin Ciocalteau.

La determinación de polifenoles se realizó en tres etapas. La primera fue una extracción

con solvente para la cual se pesaron 0,100 g de muestra seca en tubos de centrífuga y

se le adicionaron 2 mL de metanol al 80%. Esta muestra se agitó en vortex por 1 minuto

y se centrifugó a 3000 rpm por 5 minutos. Luego se separó el sobrenadante y se guardó

en un frasco ámbar. En el residuo se repitió el proceso de extracción hasta completar

tres veces que juntos constituyeron el total de polifenoles extraídos. La segunda etapa

consistió en el desarrollo del color. En matraces de aforo de 10,0 mL se adicionaron 200

uL de extracto (resultado de la primera etapa), 1 mL de metanol (p.a) y 500uL de

reactivo de folin. Esta mezcla fue agitada por 3 minutos y luego se le adicionó 1 mL de

Na2CO3 al 36%. Luego la solución se aforó con agua destilada y se dejó por 1 hora en

oscuridad, para luego proceder a su centrifugación por 5 minutos a 3000 rpm. La tercera

etapa fue la medición de las muestras en un espectrofotómetro a 725 nm junto con los

patrones de calibración, en un rango de concentraciones de 0 a 20,0 ug de ácido

cafeico/mL tratados de la misma forma mencionada en la segunda etapa.

3.15 Perfil de ácidos grasos.

Los ácidos grasos, salvo contadas excepciones, son los componentes fundamentales de

un aceite o grasa. No se encuentran normalmente como ácidos grasos libres, cuando lo

están es tan sólo en pequeñas cantidades, comunicando a la grasa cierta acidez.

Normalmente los ácidos grasos están formando ésteres, habitualmente con la glicerina,

para dar lugar a los glicéridos (mono, di y triaciglicerol) y fosfátidos. También pueden

formar ésteres con alcoholes grasos de estructura lineal (ceras) o terpénica (ésteres de

terpenos y ésteres se esteroles). Los ácidos grasos pueden ser saturados y no saturados.

Ejemplos de ácidos grasos insaturados son el ácido oleico y el linoleico, ambos presentes

en los aceites vegetales. El perfil de ácidos grasos, que caracteriza la ocurrencia de

ácidos grasos de origen vegetal en los triglicéridos, se analizó empleando un

cromatógrafo de gases marca Agilent Technologies modelo 6890N con detector FID,

empleando una columna capilar de 60 metros, aplicando la metodología International

Standard ISO 5508 Animal and vegetable fats and oils_ Analysis by gas chomatografhy

23

of methyl esters of fatty acids, e ISO 5509 Preparation of methyl esters of fatty acids.

Los ácidos grasos mayoritarios suelen ser los saturados palmítico (C16:0) y esteárico

(C18:0); monoinsaturados oleico (C18:1); y poliinsaturados linoleico (C18:2) y linolénico

(C18:3), variando estos contenidos y con aparición de otros ácidos grasos según el

origen de la semilla o especie vegetal.

3.16 Identificación de metabolitos secundarios por cromatografía en capa fina

(TLC).

El procedimiento llevado a cabo fue una adaptación del trabajo realizado por Pedrasa, M

(2004) en los estudios químicos y cromatográficos en Lophopappus tarapacanus. El

trabajo se realizó en dos etapas. La primera fue una extracción y preparación de un

infuso y la segunda una cromatografía en capa fina. Todos los reactivos utilizados fueron

de la marca Merck grado p.a.; como equipamiento se empleó un rotavapor Buchi modelo

R-200, agitador magnético marca Fisotom y equipamiento para cromatografía en capa

fina constituido por dos tanques de vidrio de 4L con tapa, sistema de pulverización y

micropipetas de sembrado de 1 uL y un sistema revelador-lámpara Spectroline modelo

ENF-260C/FE en una cabina de la misma marca modelo CM-10. En los diagramas

presentados en las figuras 2 y 3 se detallan los procedimientos seguidos para las

extracciones de las muestras e identificación de metabolitos secundarios.

3.17 Preparación del infuso en agua.

Se pesaron 16 g de muestra fresca en un vaso de precipitados de 250 mL y se adicionó

150 mL de agua hirviente. Se dejó macerar por 30 minutos para luego ser filtrada. El

filtrado se guardó en el congelador para su posterior uso en el análisis cromatográfico.

3.17.1 Análisis Cromatográfico.

Mediante cromatografía en capa fina se realizó un análisis de los diferentes extractos y

del infuso con el fin de investigar la presencia o liberación de metabolitos secundarios de

esta infusión. En este proceso se empleó como fase estacionaria cromatoláminas de

silicagel tipo 60 F 254 (Merck). El sembrado de los extractos metanólico de los exudados

fue realizado en el siguiente orden: EXDCM; EXHEX; EXDCM; EXMET de planta seca,

EXDCM; EXHEX; EXDCM; EXMET de planta fresca e Infuso metanólico en planta fresca.

Además se utilizaron dos fases móviles, que correspondieron a mezclas de disolventes

que permitían una mejor separación de los constituyentes de la infusión, resinas y

extractos metanólicos. Las cromatografías fueron analizadas con luz UV, δ de 254 y 366

nm con una lámpara Spectroline modelo ENF-260C/FE en una cabina de la misma marca

modelo CM-10 y por aspersión de reactivos químicos reveladores específicos, usando las

siguientes soluciones:

a. Reactivo de Dragendorff. Identificación de alcaloides Constituido por yoduro doble

de bismuto y potasio, solución lista para usar marca Merck.

b. Reactivo de Lieberman-Burchard: Utilizada para identificar triterpenos y esteroles,

los primeros dan coloración violeta, mientras que los esteroles dan coloraciones que

varían del rosado al verde y en algunas ocasiones pardas. En su preparación se

mezclan con cuidado y en frío 5 mL de anhídrido acético con 5 mL de ácido sulfúrico

concentrado, se le adicionan 50 mL de etanol absoluto, debe ser utilizado fresco, esta

solución es vaporizada directamente sobre la placa y luego es sometida a 105°C por 5

minutos.

c. Reactivo de Borntrager: Identificación de grupos antraquinónicos. Consistente en

una solución de KOH al 5% la cual generará una coloración rojiza.

d. Reactivo de p-Anisaldehido sulfúrico: Este reactivo que permite identificar

terpenos, se utiliza aplicándolo directamente sobre la placa, y luego aplicando

temperatura para una mejor revelación, 105°C por 5 minutos. La reacción positiva

corresponde a coloraciones que va desde el azul al violeta. Se prepara mezclando 1

mL de ácido sulfúrico concentrado. Sobre una solución que contiene 0.5 mL de p-

Anisaldehido en 50 mL de ácido acético glacial se debe utilizar fresco.

e. Reactivo de AlCl3 al 2% en metanol: Empleada para la identificación de flavonoides

y cumarinas, ambos presentan fluorescencia a la luz UV, a longitudes de onda de 254

24

y 366 nm. En el caso de los flavonoides cambian o intensifican su coloración, mientras

que en presencia del reactivo revelador, las cumarinas presentan coloración celeste.

f. Reactivo de FeCl3: Utilizado para identificar flavonoides los cuales presentan

coloraciones verdes cuando la reacción es positiva, posee una concentración de 1-5%

de FeCl3 en HCl 0.5 N.

g. Vapores de NH3: Empleada para identificar flavonoides. Las placas cromatográficas

expuestas a los vapores de NH3 generan una coloración amarilla en presencia de

flavonoides.

Figura 2: Procedimiento de Extracción de metabolitos secundarios por sucesivas extracciones con los solventes mencionados anteriormente.

Se Pesaron 16 g de

muestra con precisión

de 0.1 mg en un vaso

de pp de 250 mL.

Se Adicionaron

50 ml de DCM

Se Agitó por 15

minutos en

agitador

magnético

Filtración simple

en filtro tarado.

Filtro + residuo

Filtrado

1EXDCM por 3

veces

Pesar y registrar

Secado a T°

ambiente

Traspaso del

residuo al vaso

Repetir

3 veces

Extracto a

sequedad en un

rotavapor a

40°C.

Redisolución del

residuo en

metanol (10 a 20

ml)

Almacenamiento a

-5°C

Realizadas las 3

extracciones con

DCM repetición del

procedimiento con

Hexano, DCM y

metanol.

Hexano: 2EXHEX

DCM: 3EXDCM

Metanol: 4EXMET

(Figura N° 9)

Si la muestra es fresca se

debe moler previo a la

extracción con Hexano.

25

Fase móvil

DCM:EtAc

(1:1)

Flavonoides

Cumarinas

MetabolitoReactivo

revelador

Vapores de NH3

AlCl3 al 2%

metanol

FeCl3

Observar bajo luz UV a

254 y 366 nm para

intensificar los colores

Figura 3: Diagrama resumen de identificación de metabolitos secundarios, fase móvil y revelador

correspondiente y Diagrama de procedimiento de identificación de flavonoides y cumarinas.

3.18. Prueba de susceptibilidad antimicrobiana de metabolitos secundarios en

diferentes extractos de hojas.

Las pruebas se realizaron sobre 8 extractos de hojas frescas, 4 obtenidos de extracciones

sucesivas de 16 g de hojas, con cuatro distintos solventes, en orden con diclorometano

(1-EXDCM), seguido de hexano (2-EXHEX), diclorometano (3-EXDCM), y, finalmente

metanol (4-EXMET). Los 4 restantes extractos, se obtuvieron directamente sobre 16 g de

hojas con los siguientes solventes: agua (5-INF.H20), macerado con etanol (6M-ETOH),

macerado con hexano(7M.HEX) y por último el extracto obtenido del macerado con agua

(8-M.H2O). Los solventes de extracción se eliminaron a presión reducida a baja

temperatura, empleando el sistema rotavapor mencionado en párrafos anteriores, para

evitar destrucción de metabolitos secundarios. Los 8 extractos obtenidos se emplearon

en la evaluación de actividad antimicrobiana. El procedimiento o prueba de

susceptibilidad antimicrobiana se realizó por difusión en agar según ISP Chile (2005).

3.19 Análisis estadísticos: Para establecer diferencias significativas entre tratamientos

(hojas, tallos, semillas y frutos) se realizará una prueba de separación de medias

(ANDEVA) y prueba de medias de Tukey, además, para establecer posibles correlaciones

entre diferentes variables (componentes químicos) se realizará análisis de regresión

(PLS) y un análisis estadístico multivariante a través de análisis de componentes

principales (PCA).

Fase móvil

DCM:EtAc

(9:1)

Alcaloides

Tr iterpenos –

Esteroles

Terpenos

Antraquinonas

MetabolitoReactivo

revelador

Reactivo de

Dragendorf

Reactivo de

Liebermann-

Burchard

Reactivo

p-Anisaldehido

Reactivo de

Borntrager

26

4. RESULTADOS y DISCUSIÓN

4.1. PARTE DE PROPAGACIÓN (Ver mayores detalles en ANEXOS-propagación y

Difusión)

4.1.1 Garra de León (Leontochir ovallei): Se optimizaron protocolos de germinación

in vitro de semillas, propagación de rizomas y propagación in vitro de plántulas, cada uno

de los cuales se entregan con detalles en los ANEXOS n° 1, 2, 3 y 4, respectivamente. La

colecta de semillas se realizó entre Diciembre de 2010 y Febrero de 2011. Utilizando

bolsas de papel adosadas a la inflorescencia se logró contener la indehescencia explosiva

y recuperar el 100% de semillas (ANEXO n° 1). Una vez desinfectadas con Captan (u

otro antifúngico similar), las semillas fueron secadas hasta alcanzar peso constante y

luego almacenadas en frío (4°C) sin que ello afectara su viabilidad. En términos

generales, podemos indicar que las semillas de L. ovallei son muy difíciles de germinar. A

lo largo del proyecto se probaron 108 metodologías distintas. Entre otros, se probó la

germinación sobre distintos sustratos (arena, vermiculita, agar), varios tipos de

desinfecciones (con etanol, hipoclorito de sodio), varios medios de cultivo (MS, Gambord,

Hoagland), escarificación química (ácido sulfúrico, ác. clorhídrico), mecánica (rayado y

corte de testas) y térmica (remojo en agua caliente); diferentes tipos de hormonas

(auxinas, citoquininas, giberelinas), oxigenación de semillas, germinación con y sin luz,

medios con y sin sacarosa, a 21°C y 30°C. Finalmente, la combinación que mejor

germinación dio (13%) fue la desinfección de semillas con Hipoclorito de sodio, seguida

por cortes superficiales sobre las semillas y siembra en agar con medio MS suplementado

con sacarosa (2%), ácido giberélico (5mg/L), 6-Bencilaminopurina (0,5 mg/L), Cloruro

de Sodio (20 uM) y agar (8 g/L). Ver ANEXO n° 2. Si bien este % no es tan alto, es

bastante mejor que el 2% obtenido al inicio del proyecto. Al ser traspasadas a sustrato

de arena:vermiculita (2:1) estéril y después de 8 meses de crecimiento, se logró obtener

en promedio, cinco rizomas por planta (ANEXO n°3). En total, al término de este

proyecto se lograron tener 98 plantas de L. ovallei en proceso de aclimatación, que a su

vez suponen un total aproximado de 490 rizomas, y sumando.

4.1.2 Lucumillo (Myrcianthes coquimbensis): Se han optimizado protocolos de

germinación de semillas (Anexo n° 4), propagación ex vitro por esquejes (Anexo n° 5) y

propagación in vitro (Anexo n° 6). La germinación de semillas no es difícil aunque es

fundamental usar semillas maduras y eliminar el mesocarpio (ANEXO n° 4). En

promedio, se obtuvo 80% de germinación (ANEXO n° 5). En cuanto a la propagación ex

vitro por esquejes, el protocolo que logro el más alto porcentaje de enraizamiento (85%)

fue la combinación de vermiculita o tierra de hojas, ambas con AIB a 10000 ppm (ANEXO

n° 5). En cuanto a la propagación in vitro, se logró optimizar un protocolo formado por

Polivinilpirrolidona (PVP, 1mg/L), 6-bencilaminopurina (BAP, 14,1 µM) y enraizamiento de

explantes con Ácido Indolbutírico (AIB, 5000ppm). Con este protocolo (ANEXO n° 6), se

obtuvo una propagación del 80%.

4.1.3. Algarrobo dulce (Prosopis flexuosa): Se han optimizado protocolos de

germinación de semillas (Anexo n° 7), propagación ex vitro por esquejes (Anexo n° 8) y

propagación in vitro (Anexo n° 9). La germinación de semillas utilizó ácido sulfúrico, que

permitió obtener un 95% de germinación (ANEXO n° 7). En cuanto a la propagación ex

vitro por esquejes, éstos enraizaron sin necesidad de agregar enraizante aunque el

sistema de cama caliente a 21 ± 4 °C fue relevante (ANEXO n° 8). Con estas condiciones

se obtuvo un 70% de enraizamiento. Finalmente, la propagación in vitro utilizó un

protocolo con 6-bencilaminopurina (4,4 µM) y enraizamiento con Ácido Indolbutírico

(AIB, 10.000 mg/L) como productos relevantes (ANEXO n° 10). Se logró un 70% de

propagación.

27

4.1.4. Algarrobo (Prosopis chilensis): Se han optimizado protocolos de germinación

de semillas (Anexo n° 10), propagación ex vitro por esquejes (Anexo n° 11) y

propagación in vitro (Anexo n° 12). La germinación también se basó en ácido sulfúrico

con 95% de germinación (ANEXO n° 10). La propagación ex vitro por esquejes utilizó AIB

a 7500ppm como concentración óptima para enraizamiento y tierra de hojas como mejor

sustrato (ANEXO n° 11). Con estas condiciones se obtuvo un 70% de enraizamiento.

Finalmente, la propagación in vitro de esta planta fue posible utilizando casi el mismo

protocolo in vitro desarrollado en P. flexuosa, siendo diferente solo la menor

concentración de AIB (5000 mg/L) que se requirió para enraizar los esquejes de P.

chilensis (ANEXO n° 12). Con este protocolo, se obtuvo un 30% de propagación.

4.2 PARTE FITOQUÍMICA

4.2.1. Garra de León (L. ovallei): En la tabla 1 se resumen los valores obtenidos de

los análisis llevado a cabo en las hojas y semillas de L. ovallei, fenómeno del desierto

Florido Año 2011. Las hojas fueron tomadas al azar de 40 plantas para hacer un

compósito de 100 hojas representativas aproximadamente, en triplicado, y las semillas

colectadas correspondieron a un universo de 30 inflorescencia (c/u entre 10 a 12 flores)

de las cuales se colectó una sola flor (aproximadamente 20 a 30 semillas). Los lugares de

los cuales se tomaron las muestras fueron: Carrizal Bajo (Sector Desembarco), Quebrada

del Mono (Km 54, al interior del Parque Nacional Llanos del Challe) y Mina Oriente. Las

hojas y semillas fueron tratadas según se señala en el punto 3. Tratamiento Preliminar

de las Muestras. Las semillas una vez molidas se sometieron nuevamente a secado para

determinar el contenido de agua al interior de éstas que resultó ser significativo.

Dentro de los análisis realizados destaca en las hojas L. ovallei un contenido de agua

significativo de 71%, correspondiendo a materia seca sólo un 29%, del cual un 16,56%

corresponde a cenizas (Componente mineral inorgánico) y un 4,83 % a polifenoles

(componente sintetizados por las plantas en el metabolismo secundario y relacionado

directamente a respuestas de estress hídrico, entre otros factores de carencia). Si bien

no fue posible realizar el análisis de nitrógeno para estimar el contenido de proteínas por

agotamiento de la muestra recolectada y la fibra (que en su conjunto representarían el

72,6 % de la materia seca, lo que supondría un alto contenido en fibra) las hojas

manifestaron ser ricas en componentes lipídicos saponificables y no saponificables,

representados por el extracto etéreo con un 5,26 %. Dentro de los macro elementos

esenciales se observó que el contenido de fósforo obtenido en el análisis, 0,14%, se

presentó al límite. Valores entre 0,10 a 0,15 % es señal de déficit en las plantas y entre

los microelementos destacó el bajo contenido de Fe (56 mg/Kg) cuyo valor normal en

plantas es de 80 a 320 mg/Kg.

Respecto a las semillas es importante hacer notar que al ser secadas presentaron un

54% de humedad, quedando reducidas de tamaño significativamente. En este estado

mantuvieron en el interior un 25% de humedad que permanece y que sólo puede ser

eliminada al pulverizar mecánicamente la semilla. El contenido de agua total en la semilla

finalmente fue de un 79%. La materia seca que representa un 21% del total de la semilla

contiene un 2,01% de cenizas (componente mineral), siendo ricas en Hierro y Zinc, 73 y

35 mg/kg, respectivamente, mayor contenido que el encontrado en las hojas de estos

dos microelementos, un 52 % de azúcares totales solubles, siendo mayoritarios los

azúcares reductores con un aporte del 38 % en la materia seca. Se destaca además su

alto contenido en compuestos polifenólicos (antioxidantes) con un 6,9%. El aceite de la

semilla (11,7% como Extracto Etéreo), extraído en frío, resultó ser rico en ácido Linoleico

(ácido graso esencial y omega 6 ) alcanzando un 49,7 % y de ácido oleico (omega 9)

con un 34,1%. Semejante al aceite de soja, sólo que con un contenido superior en ácido

oleico. El aceite se describiría como rico en poliinsaturados (50,1%) y monoinsaturados

(34,1%) y bajo en grasas saturadas (14,0%). Se hace notar que el aceite aportaría con

un 0,1% de alfa-linolénico, ácido graso esencial (omega 3).

28

TABLA 1: COMPONENTES QUÍMICOS DE Leontochir ovallei (GARRA DE LEÓN)

PARÁMETROS QUÍMICOS HOJAS SEMILLAS

HUMEDAD (%) 71 ± 3 Primer secado: 54 ± 2 Pulverizadas: 25± 2

Total en semilla: 79 ± 2

MATERIA SECA (%) 29 ± 3 21 ± 2

ANÁLISIS DE LA MATERIA SECA: Cenizas (%)

Extracto etéreo (%) Azúcares Totales (%) Azúcares Reductores

Azúcares No-Reductores Proteína Bruta (%) Fibra (%) Polifenoles totales (metabolismo secundario)

16,6 ± 0,3

5,26 ± 0,2 0,67 ± 0,06

NA

NA NA NA

4,83 ±

2,01 ± 0,2

11,7 ± 0,3 52 ± 2

14,1 ± 0,9

38 ± 3 NA NA

6,9 ± 0,8

ANÁLISIS DE LAS CENIZAS

Macronutrientes Calcio (%) 2,74 ± 0,3 0,11 ±0,02

Magnesio (%) 0,74 ± 0,09 NA

Sodio (%) 1,1 ± 0,5 0,07 ± 0,04

Potasio (%) 2,8 ± 0,1 0,1 ± 0,0

Fósforo (%) 0,14 ± 0,03 NA

ANÁLISIS DE LAS CENIZAS Micronutrientes Hierro (mg/Kg) 56 ± 7 73 ± 11

Cobre (mg/Kg) 26 ± 3 6 ± 3

Manganeso (mg/Kg) 82 ± 11 7,7 ± 0,1

Zinc (mg/Kg) 21 ± 6 35 ± 1

Boro (mg/Kg) 37 ± 18 NA

ANÁLISIS DEL EXTRACTO ETÉREO (perfil de ácidos grasos : % en el aceite) Ácido palmítico (C16:0)

Ácido Esteárico (C18:0) Ácido Oleico (C18:1) omega 9 Ácido Linoleico (C18:2) omega 6

Ácido Linoleico (C18:3) omega 3 Ácido Araquídico (C20:0) Ácido Eicosanoico (C20:1) Ácido Behénico (C22:0) Otros S/identificación:

NA

10,3

3,1 34,1 49,7

0,1 0,4 0,2 0,2 2,0

Nota: NA: componente no analizado químicamente.

29

4.2.2. Lucumillo (M. coquimbensis): En la tabla 2 se resumen los valores obtenidos

de los análisis llevado a cabo en las hojas, frutos y semillas de M. coquimbensis. Las

hojas y frutos fueron tomadas en un sólo sector, por lo que las plantas se agruparon

originando tres muestras formadas por aproximadamente 100 hojas, las cuales fueron

tratadas según se señala en el punto 3. Tratamiento Preliminar de las Muestras.

Las hojas de M. coquimbensis dieron bajo contenido de K, Fe y Zn, mientras que el Cu y

Mn fueron elevados, los demás nutrientes foliares se presentaron dentro de los rangos de

suficiencia. Es interesante en esta planta, con un aporte de 94% de materia seca, la gran

riqueza polifenólica de sus hojas, 19% (en el Té verde rico en polifenoles se reporta un

componente polifenólico de entre 15 a 20%). Este resultado abre una puerta interesante

de investigar para establecer capacidades antioxidantes e identificar polifenoles

individuales que podrían tener aplicaciones nutraceútica interesante de elucidar. Con una

riqueza en el extracto etéreo (12%) y Azúcares reductores y No reductores en

proporciones semejantes (5%). M. coquimbensis dio positivo la identificación de

terpenos, taninos, triterpenos, antraquinonas, flavonoides y cumarinas, corroborando el

alto valor encontrado en el contenido de polifenoles. Por otro lado el extracto que

presentó actividad antimicrobianas en ambas cepas bacterianas estudiadas, Escherichia

coli (gram -) y Staphylococus aureus (gram +) fue el macerado en agua (8M.H2O). En

pruebas preliminares la presencia de cumarinas gálicas se asoció al efecto antibacteriano.

Por otro lado el estudio químico del mesocarpio del fruto y de la semilla resultó, en

magnitudes semejantes, rico en carbohidratos solubles totales (76%) siendo los azúcares

no-reductores los mayoritarios (63%), seguido de un 9% de extracto etéreo (lípidos,

pigmentos, alcoholes y ácidos grasos orgánicos) y un aporte en proteinas de 4 a 5 %. El

ácido graso mayoritario en el mesocarpio fue el ácido graso saturado Palmítico (C16:0),

34%, seguido por linoleico (omega 6), 30%, oleico (omega 9), 13% y linolénico (omega

3), este último con una riqueza destacable de un 10%. La semilla sin embargo fue baja

en ác. linoleico (2,5 %) , y rica en ácido oleico (36%), ácido palmítico (27%) y ácido

linoleico (25%).

TABLA 2: COMPONENTES QUÍMICOS DE Myrcianthes coquimbensis (LUCUMILLO)

Hojas Fruto Semillas

HUMEDAD (%) 6,43 0,2 24,5 0,2 38,5 0,2

MATERIA SECA (%) 93,6 0,2 75,5 0,2 61,5 0,2

ANÁLISIS DE LA MATERIA SECA:

Cenizas (%) Extracto etéreo (%)

Azúcares Totales (%) Azúcares no reductores (%) Azúcares Reductores (%) Proteína Bruta (%) Fibra (%) Polifenoles totales (%) (metabolismo

secundario)

8,99 0,07

12,3 0,6

10,1 0,7

5,0 0,5

5,1 0,6

NA NA

19 3

3,7 1

9,2 0,2

76 1

62 1

14,54 0,04

5,39 0,003

5,8 2 6,4 0,4

2,7 0,3

8,6 0,2

76,2 0,9

63 2

13 1

3,9 0,2

9 2 1,7 0,1

30

ANÁLISIS DE LAS CENIZAS Macronutrientes

Nitrógeno (%) Calcio (%) Magnesio (%) Sodio (%)

Potasio (%) Fósforo (%)

NA 0,7 0,2

0,25 0,02

0,28 0,04

1,2 0,02

0,9 0,3

0,950 0,006

0,186 0,004

NA 0,20 0,02

1,30 0,02

NA

0,68 0,03

0,061 0,002

0,048 0,002

0,070 0,007 1,06 0,02

NA

ANÁLISIS DE LAS CENIZAS

Micronutrientes Hierro (mg/Kg) Cobre (mg/Kg) Manganeso (mg/Kg)

Zinc (mg/Kg) Boro (mg/Kg

65 29

7 1

49 7

7 2

55 12

58 3

12,0 0,2

<LD 130 5

NA

28 2

6,0 0,6

<LD 49 4

NA

ANÁLISIS DEL EXTRACTO ETÉREO Perfil de ácidos grasos : % en el aceite Ácido palmítico (C16:0) Ácido Palmitoleico (C16:1)

Ácido Margárico (C17:0) Ácido Margaroleico (C17:1) Ácido Esteárico (C18:0) Ácido Oleico (C18:1) omega 9 Ácido Linoleico (C18:2) omega 6 Ácido Linolénico (C18:3) omega 3 Ácido Araquídico (C20:0)

Ácido Eicosanoico (C20:1) Ácido Behénico (C22:0) Otros S/identificación:

NA

34,16 0,41

- 0,15 1,72 12,5 29,6 10,4 0,95

0,18 0,33 9,6

27,2 0,2

0,1 -

2,5 36,4 25,1 2,5 1,0

0,4 0,2 4,4

Otras Familias de Metabolitos Secundarios

metabolitos Reactivos reveladores

Terpenos Taninos Alcaloides Triterpenos Esteroles Antraquinonas

Flavonoides

Cumarinas

p-Anisaldehido FeCl3 Reactivo de Dragendorf R. Libermann Burchand R. Libermann Burchand Reactivo de Bontrager

R. AlCl3, FeCl3 y Vapores

NH3

R. AlCl3

Positivo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo

Positivo

Positivo

NA

NA

Nota: NA: componente no analizado químicamente

<LD: componente a nivel traza, menor al límite de detección del instrumento de medida.

4.2.3. Algarrobo dulce (P. flexuosa): En la tabla 3 se entregan los valores obtenidos

de los análisis llevado a cabo en las hojas de P. flexuosa y vainas. En el caso de las

vainas se recolectaron separadamente según grosor por lo que se analizaron por

separado. Las hojas fueron tomadas al azar de varias plantas en los sectores: Quebrada

Morel, Totoral 1, Totoral 2, Totoral 3, Puerto Viejo y El Donkey; pertenecientes a la

Provincia de Huasco, Región de Atacama. Se realizó un compósito de 100 hojas

representativas, aproximadamente, las cuales fueron tratadas según se señala en el

punto 3. Tratamiento Preliminar de las Muestras. En el caso de las vainas se hizo un

compósito en triplicado de los sectores muestreados, las vainas no fueron separadas de

31

sus semillas, procediéndose de la misma manera que las hojas para la preparación de la

muestra analítica.

De los resultados en las hojas, entre poblaciones, los azúcares totales, mayoritariamente

no-reductores y la fibra presentaron las mayores dispersiones. Lo mismo ocurrió en los

microelementos Hierro, cobre, manganeso y boro, presentando éste último la mayor

variación. Los demás componentes analizados entre sectores no presentaron variaciones

significativas. Las hojas destacaron en su contenido de lípidos 5,4%, un alto contenido en

proteínas 17% y polifenoles totales (antioxidantes) de 1,5%. Con un contenido de 7% en

cenizas, los macronutrientes se presentaron dentro de los valores normales de

suficiencia, no presentando carencias y los micronutrientes en valores levementes

superior a los rangos normales para los vegetales. En lo que respecta al análisis químico

nutricional de las vainas estas manifestaron una riqueza nutricional en Carbohidratos

totales (Azúcares solubles) de 44 a 61%, mayoritariamente no reductores, proteína bruta

entre 6,8 a 5,9 %, y lípidos con un 8,3 a 9% dentro del cual domina en el perfil lipídico

el ácido linoleico (ácido graso esencial, omega 6) con un 35% y en segundo lugar el

ácido oleico (26%). Con un aporte no menor cercano al 3 % de ácido linoleico (ácido

graso esencial, omega 3).

TABLA 3: COMPONENTES QUÍMICOS DE Prosopis flexuosa (ALGARROBO DULCE)

GRUPOS DEL METABOLISMO PRIMARIO HOJAS Vainas delgadas Vainas gruesas

HUMEDAD (%) 21 ± 6 3,19 ± 0,04 2,4 ± 0,2

MATERIA SECA (%) 79 ± 6 96,81 ± 0,04 97,6± 0,02

ANÁLISIS DE LA MATERIA SECA:

Cenizas (%) Extracto etéreo (%) Azúcares Totales (%) Azúcares Reductores (%) Azúcares No-Reductores (%) Proteína Bruta (%) Fibra (%)

Polifenoles totales (%) (metabolismo secundario)

7 ± 2 5,4 ± 0,4

11 ± 7 0,9 ± 0,3 10 ± 7 17 ± 2

60 ± 11

1,5 ± 0,5

2,87 ± 0,1 9 ± 3 67 ± 1

0,9± 0,2 66 ± 1

6,8 ± 0,7 14 ± 5

0,37 ± 0,03

3,31 ± 0,01 8,3 ± 0,4 48 ± 7

0,59 ± 0,02 48 ± 7

5,9 ± 0,2 34 ± 8

0,61 ± 0,07

ANÁLISIS DE LAS CENIZAS Macronutrientes Nitrógeno (%)

Calcio (%) Magnesio (%)

Sodio (%) Potasio (%) Fósforo (%)

3,0 ± 0,3

1,8 ± 0,8 0, 4 ± 0,1

0,2 ± 0,04 1,9 ± 0,3

0,14 ± 0,02

1,3 ± 0,1

0,5 ± 0,4 0,050 ± 0,007

0,17 ± 0,03 1,38 ± 0,03

0,076 ± 0,004

1,04 ± 0,04

0,030 ± 0,004 0,0075 ± 0,0006

0,03 ± 0,01 0,148 ± 0,003 0,060 ± 0,009

ANÁLISIS DE LAS CENIZAS

Micronutrientes Hierro (mg/Kg) Cobre (mg/Kg) Manganeso (mg/Kg) Zinc (mg/Kg) Boro (mg/Kg)

Niquel (mg/Kg) Cobalto (mg/Kg)

174 ± 23 31 ± 9 56 ± 23 57 ± 14 138 ± 82

10 ± 2 NA

38 ± 8 15 ± 3 < LD <LD

51 ± 7

7 ± 3 14 ± 7

71 ± 16 23 ± 2 < LD

10 ± 3 33 ± 14

4,2 ± 0,4 17 ± 4

ANÁLISIS DEL EXTRACTO ETÉREO

Perfil de ácidos grasos : % en el aceite Ácido palmítico (C16:0) Ácido palmitoleico

12,67 0,47

32

Ácido Esteárico (C18:0) Ácido Oleico (C18:1) omega 9

Ácido Linoleico (C18:2) omega 6 Ácido Linoleico (C18:3) omega 3 Ácido Araquídico (C20:0) Ácido Eicosanoico (C20:1)

Ácido Behénico (C22:0) Otros S/identificación:

4,52 26,25

35,37 2,87 2,86 0,75

3,08 11,16

Nota: NA: componente no analizado químicamente <LD: componente a nivel traza, menor al límite de detección del instrumento de medida.

4.2.4. Algarrobo (P. chilensis).En la tabla 4 se resumen los valores obtenidos de los

análisis llevado a cabo en las hojas de P. chilensis y en las vainas con y sin semillas. Las

hojas fueron tomadas al azar de varias poblaciones en los sectores de Elqui, Limarí,

Choapa y Valparaiso (Ruta 1) para hacer un compósito de 100 hojas representativas,

aproximadamente, las cuales fueron tratadas según se señala en el punto 1. Tratamiento

Preliminar de las Muestras. Los sectores donde fueron muestreadas las vainas

correspondieron a poblaciones de P. chilensis creciendo en las provincias de Elqui, Limarí,

Choapa, Los Andes y Chacabuco.

Las hojas de P. chilensis en peso correspondieron mayoritariamente a materia seca, 93%

presentando la mayor fuente de variabilidad entre poblaciones en el contenido de los

azúcares totales, 34 a 40 % y fibra bruta entre 22 a 30%, siendo por lo tanto una fuente

rica en carbohidratos y fibra. El contenido de cenizas cercano al 8% y de lípidos 7,2% no

variaron significativamente entre poblaciones y son un aporte adicional y significativo al

componente nutricional de las hojas. Respecto al análisis de las cenizas los valores

encontrados de Ca 2,3 % se consideraron bajos (4 a 8 % son los valores normales en

plantas) y altos en Mg 0,69 % (valores normales en promedio en plantas es 0,19 %).

Fósforo no superó el 0,04%. Los requerimientos en fósforo en plantas es de 0,18 %

presentando déficit bajo 0,10 % – 0,15 % lo que estaría indicando una carencia de este

elemento en la especie en todas las poblaciones estudiadas. Respecto a los

microelementos esenciales los valores encontrados fueron altos en B (161 mg/Kg), alto

en Cu (59 mg/Kg), alto en Mn (128 mg/Kg) y normal en hierro (239 mg/Kg); con

variaciones significativas de todos ellos entre poblaciones.

Respecto a las Vainas con y sin semillas, al ser comparadas, las variaciones mas

significativas se presentaron en los contenidos de proteína y lípidos. Siendo más ricas en

estos dos grupos nutricionales las vainas con semillas, con un aporte de 5% en lípidos y

9% de proteínas frente a las vainas sin semillas de 1,8 y 6% respectivamente. Las

vainas sin semillas presentaron la mayor riqueza de azúcares totales, mayoritariamente

no-reductores 58% respecto a las vainas con semillas de 30%. Tanto las hojas como las

vainas con y sin semillas estarían aportando con un 1,5%, 2,5% y 3, 5%

respectivamente con polifenoles, reconocidos por sus capacidades antioxidantes.

TABLA 4: COMPONENTES QUÍMICOS DE Prosopis chilensis (ALGARROBO)

GRUPOS DEL METABOLISMO PRIMARIO HOJAS

Vainas sin

semillas

Vainas con

semillas

HUMEDAD (%) 6,5 ± 0,3 8 ± 3 5 ± 1

MATERIA SECA (%) 93,5 ± 0,3 92 ± 3 95 ± 1

33

ANÁLISIS DE LA MATERIA SECA:

Cenizas (%)

Extracto etéreo (%)

Azúcares Totales (%)

Azúcares Reductores (%)

Azúcares No-Reductores (%)

Proteína Bruta (%)

Fibra (%)

Polifenoles totales (%) (metabolismo

secundario)

8 ± 1

7,2 ± 0,9

40 ± 6

8 ± 3

32 ± 8

14,7 ± 0,8

30 ± 8

1,7 ± 0,2

3,3 ± 0,4

1,8 ± 0,9

58 ± 15

0,008 ± 0,0009

58 ± 15

6,14 ± 1,4

30,8 ± 18

2,5 ± 1,7

3,3 ± 0,3

5 ± 2

30 ± 13

0,006 ± 0,001

30 ± 13

9 ± 3

52,7 ± 18

3,5 ± 1,6

ANÁLISIS DE LAS CENIZAS

Macronutrientes

Nitrógeno (%)

Calcio (%)

Magnesio (%)

Sodio (%)

Potasio (%)

Fósforo (%)

2,6 ± 0,1

2,3 ± 0,5

0,67 ± 0,02

0,11 ± 0,05

1,51 ± 0,01

0,04 ± 0,01

1,08 ± 0,2

NA

NA

NA

NA

NA

1,6 ± 0,5

NA

NA

NA

NA

NA

ANÁLISIS DE LAS CENIZAS

Micronutrientes

Hierro (mg/Kg)

Cobre (mg/Kg)

Manganeso (mg/Kg)

Zinc (mg/Kg)

Boro (mg/Kg)

Niquel (mg/Kg)

Cobalto (mg/Kg)

239 ± 67

59 ± 21

126 ± 62

57 ± 43

161 ± 57

7 ± 1

NA

NA

NA

NA

NA

NA

NA

NA

NA

NA

NA

NA

NA

NA

NA

34

5. CONCLUSIONES y RECOMENDACIONES

5.1. Garra de Léon (Leontochir ovallei):

Se logró desarrollar exitosamente un protocolo de propagación sexual (semillas) y

asexual (rizomas) para esta especie. Recomendamos a CONAF utilizar bolsas de

papel adosadas a las inflorescencias cada vez que haya desierto florido. Este

simple método permite colectar el 100% de semillas de cada inflorescencia.

Además recomendamos una desinfección simple con antifúngico tipo Captan,

deshidratación hasta peso constante y conservación en frío (4ºC), pues se verificó

que viabilidad de las semillas se mantiene intacta (semillas no recalcitrantes).

Se logró obtener una cantidad importante de rizomas de L. ovallei, que

continuaremos propagando y una parte importante de ellos, serán devueltos al

Parque Nacional Llanos de Challe.

En relación al análisis fitoquímico, dado que no existen analisis químicos

reportados en la literatura, estos resutados corresponderían al Primer Estandar

Nutricional de la especie L. ovallei realizados en hojas y semillas,. Hay que hacer

notar que estos resultados se basan en la última aparición ocurrida en esta planta

ocurrida en el año 2011, por lo cual sería recomendable repetir estos análisis con

plantas florecidas en años posteriores con el find e establecer un patrón químico d

ela especie.

En virtud del alto contenido de extracto etéreo (componentes lipídicos) y de

polifenoles observados tanto en hojas como en semillas, se sugiere realizar un

fraccionamiento para identificar presencia de otros metabolitos secundarios como

Alcaloides, Triterpenos, Esteroles, Antraquinonas, Flavonoides y Cumarinas.

Se sugiere determinar en el aceite las vitaminas liposolubles tales como

tocoferoles (Vitamina E), vitamina A y K, entre otras. En este estudio no se pudo

realizar este procedimiento debido a que se requería mayor cantidad de material y

las limitaciones propias de la planta (protegida) no posibilitaron colectar

demasiadas hojas. Lo que se encontró es que de 100 g de hojas, solo 20 gramos

corresponderán a materia seca. Con esta información se podría estimar la

cantidad de hojas que deberán ser recolectadas para futuros análisis.

5.2. Lucumillo (Myrcianthes coquimbensis):

Se logró optimizar un protocolo de germinación muy exitoso, donde resultó

fundamental remover el mesocarpio (pulpa) del fruto y colectar frutos maduros.

Aunque la siembra se puede realizar desde Agosto hasta Enero, el momento

óptimo es entre Octubre y Diciembre.

Se logró establecer un interesante protocolo de propagación de esquejes in vitro y

propagación de esquejes en cama caliente. En ambos casos es importante utilizar

individuos jóvenes, ojalá provenientes de germinaciones en vivero para disminuir

la presencia de microorganismos patógenos.

Los protocolos de propagación asexual posibilitaría la propagación masiva de M.

coquimbensis, el cuál dado su delicado estado de conservación e interesante

potencial como especie ornamental podría abstacer la demanda de viveristas u

otros interesados en utilizarla con este u otros fines comerciales.

35

En relación al análisis fitoquímico, los resultados obtenidos corresponderían al

Primer Estándar Nutricional reportado en esta especie, tanto de hojas, como de

mesocarpio y semillas.

La especie se presenta como un verdadero reservorio nutraceútico que debe

seguir estudiándose, sobre la base de los metabolitos secundarios identificados y

la riqueza polifenólica de sus hojas y frutos.

5.3. Algarrobo dulce (P. flexuosa):

Se logró desarrollar exitosamente un protocolo de germinación de semillas, donde

se recomienda implementar el sistema de colecta de semillas usando bolsas de

papel utilizado en L. ovallei, dado que son muy pocos los ejemplares que quedan

en pie, y las amenzas sobre esos individuos son muy elevadas, sobre todo la

ganadería no controlada y eventos cada vez mas prolongados de sequía. Por lo

mismo, creemos necesario que CONAF refuerce sus estrategias para colectar

semillas de esta especie. Se aconseja colectar semillas en el punto indicado en la

metodología (carretera Caldera-Copiaó) dado el excelente estado sanitario en que

se encuentran dichos individuos.

Para la propagación asexual se recomienda usar individuos jóvenes, o estimular la

generación de brotes nuevos mediante podas in situ de los árboles adultos a partir

de los cuales luego se puedan colectar esquejes tiernos. Si esto se realiza, hay

que asegurar el traslado de los esquejes sumergidos en agua y luego realizar una

desinfección de los esquejes de moderada a fuerte. Es importante hacer notar que

P. flexuosa no requiere el uso de enraizantes pues tiene buan capacidad para

enraizar naturalmente.

En relación al análisis fitoquímico, los resultados obtenidos corresponderían al

Primer Estandar Nutricional de la especie en Chile (existen reportes de análisis de

la especie en Argentina, pero sólo en vainas).

Se destaca en las vainas un potencial alimentario interesante por su alto

contenido en Azúcares totales solubles, mayoritariamente no reductores, y

proteína, con un perfil lipídico que aporta ácido oleico, linoleico y linolénico, estos

dos últimos ácidos grasos esenciales.

Se recomienda estudiar la digestibilidad y estabilidad química de las vainas, junto

con identificar la presencia de metabolitos secundarios que pudiesen generar

toxicidad, así como completar los estudios en función de los aportes nutricionales

en vitaminas.

5.4. Algarrobo (P. chilensis):

El comportamiento de P. chilensis fue muy similar a P. flexuosa. Se logró

desarrollar un protocolo óptimo para germinar tanto sus semillas como propagarlo

asexualmente.

Se aconseja mantener el riego periódico de las plántulas aclimatadas de P.

chilensis pues aunque algunas plantas muestren signos de deshidratación severa,

la capacidad de recuperación de este árbol en condiciones de vivero es

extraordinaria. Un signo evidente que las plantas aún están vivas es el color de su

tallo. Si este se encuentre verde la planta está viva mas allá que carezca

completamente de hojas. Esta característica de recuperación también la presenta

P. flexuosa por lo que podríamos estar ante una estrategia de supervivencia

conservada en el género Prosopis spp.

En relación al análisis fitoquímico, los resultados obtenidos corresponderían a una

actualización de los estándares nutricionales conocidos hasta ahora. El último

reporte químico, con datos algo más completos de esta especie es el reportado

por F.M. Galera (2000), texto en los Depósitos de Documentos de la FAO.

36

En acuerdo con F.M Galera (2000), en P. chilensis se destaca en las vainas un

potencial alimentario interesante por su alto contenido en Azúcares totales

solubles, mayoritariamente no reductores, y proteína. Estudios futuros de esta

especie debieran enforcarse a una posible industrialización de sus vainas con fines

alimentarios.

Se recomienda completar los estudios en función de los aportes nutricionales en

vitaminas, polifenoles y otros componentes del metabolismo secundario que

podrían estar presentes en el extracto etéreo, así como la caracterización de los

azúcares individuales con fines nutraceúticos.

37

6. PRODUCTOS OBTENIDOS

6.1 Actividades de Difusión

6.1.1 DEVELOPMENT OF PROTOCOLS TO PROPAGATE FOUR NATIVE PLANTS

ENDANGERED BY HUMAN ACTIVITY AND HARSH ARID ENVIRONMENTAL

CONDITIONS OF NORTHERN CHILE. Marta Vargas, Elda Jofré, Catherine Rojas,

Paloma Gachón, Carlos Navarrete, Jaime Bravo and Cristian Ibáñez. Poster

presentado en la VII Reunión de Biología Vegetal. Pucón, 3-6 Diciembre

2012 (Ver Anexo n° 14)

6.1.2 PROPAGATION STRATEGY FOR Myrcianthes coquimbensis, AN ENDANGERED

SPECIE OF COQUIMBO COASTAL REGION. Marta Vargas, Catherine Rojas, Paloma

Gachón, Carlos Navarrete, Jaime Bravo and Cristian Ibáñez. Poster presentado

en la VII Reunión de Biología Vegetal. Pucón, 3-6 Diciembre 2012 (Ver Anexo

n° 15).

6.1.3 FIRST CHEMICAL APPROACHES TO ANALYZE FOUR ENDANGERED PLANTS FROM

NORTH OF CHILE. Fabiola Jamett, Manuel Tapia, Esthefany Muñoz, Jessenia

Velásquez, Carlos Navarrete, Jaime Bravo, and Cristian Ibáñez. Poster

presentado en la VII Reunión de Biología Vegetal. Pucón, 3-6 Diciembre

2012 (Ver Anexo n° 16).

6.1.4 ESTABLECIMIENTO DE PROTOCOLOS DE PROPAGACIÓN IN VITRO E

IDENTIFICACIÓN DE BIOCOMPUESTOS EN ESPECIES NATIVAS DE ALTO VALOR

ECOLÓGICO DEL NORTE CHICO. Crisitian Ibáñez y Fabiola Jamett. Oradores en

el II Encuentro Temático del Fondo de Investigación del Bosque Nativo

“Aportando al conocimiento de Formaciones Xerofíticas”. Iquique, 13 de

Agosto 2013 (Anexo n° 17).

6.1.5 EVALUACIÓN DE LA GERMINACIÓN DE GARRA DE LEÓN (Leontochir ovallei), UNA

ESPECIE EN PELIGRO DE EXTINCIÓN. Elda Jofré, Marta Vargas, Alejandra Araya,

Maricela Rojas, Ana María Vásquez, Carlos Navarrete, Fabiola Jamett y Cristian

Ibáñez. Poster presentado en el III Congreso Nacional de Flora Nativa.

Santiago, 5-7 Septiembre 2013 (Anexo n° 18).

6.1.6 CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DE Bomarea ovallei (Garra de León), Myrcianthes

coquimbensis (Lucumillo), Prosopis flexuosa (Algarrobo dulce) y Prosopis chilensis

(Algarrobo). Fabiola Jamett. Orador en el III Congreso Nacional de Flora

Nativa. Santiago, 5-7 Septiembre 2013 (Anexo n° 19).

6.1.7 ESTABLECIMIENTO DE PROTOCOLOS DE PROPAGACIÓN DE CUATRO ESPECIES

NATIVAS DE ALTO VALOR ECOLÓGICO DE LA REGIÓN ÁRIDA y SEMIÁRIDA DE

CHILE. Cristian Ibáñez. Orador en el III Congreso Nacional de Flora Nativa.

Santiago, 5-7 Septiembre 2013 (Anexo n° 20).

6.1.8 DEVELOPING A CUTTING PROTOCOL FOR PROPAGATION OF Prosopis flexuosa, AN

ENDANGERED SPECIE FROM NORTH OF CHILE. Marta Vargas, Elda Jofré,

Alejandra Araya, Maricela Rojas, Ana María Vásquez, Carlos Navarrete y Cristian

Ibáñez. Poster presentado en la VIII Reunión de Biología Vegetal. Pucón,

2-5 Diciembre 2013 (Ver Anexo n° 21).

38

7. BIBLIOGRAFÍA

Abugoch JLE (2009). Chapter 1. Quinoa (Chenopodium quinoa Willd.): Composition,

Chemistry, Nutritional, and Functional Properties. Advances in Food and Nutrition

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42

8. ANEXOS

PROPAGACIÓN

ANEXO n° 1: Colecta de semillas de Garra de León (L. ovallei).

a) Las semillas de L. ovallei son depredadas por la fauna silvestre y colectadas

intensamente por floristas/viveristas. Es por ello que se recomienda proteger las

inflorescencias con una bolsa de papel, después que la inflorescencia se haya

formado.

b) En la Fig. 1A y 1B se muestran las inflorescencias de L. ovallei en el Parque

Nacional Llanos de Challe en Noviembre de 2011, el último año que se les vio

florecer. La Fig. 1C muestra la inflorescencia ya cubierta por la bolsa de papel

(Diciembre de 2011) y las Fig. 1D y 1E, muestran el excelente estado en que

quedan las inflorescencias protegidas por las bolsas de papel y que permitió

recuperar el 100% de semillas (Febrero de 2012).

c) La fig. 1F muestra una inflorescencia no protegida con bolsa de papel y cuyas

semillas fueron consumidas por algún animal silvestre.

d) En general, las semillas tienen una muy buena sanidad, no presentando larvas ni

presencia de microrganismos. Una vez colectadas, las semillas deben secarse

hasta lograr peso constante y pueden mantenerse en frío (4°C).o temperatura

ambiente hasta su utilización.

1A Parque Nacional Llanos de Challe. Noviembre 2011

43

1B

1C

Parque Nacional Llanos de Challe. Noviembre 2011

Método para colectar de semillas

44

1E

1D Método para colectar de semillas

El Método permitió controlar la indehiscencia explosiva.

45

1F Inflorescencia sin bolsas de papel cuyas semillas se perdieron o fueron

consumidas por animales y

46

ANEXO n° 2: Protocolo de Germinación in vitro de Garra de León (L ovallei)

a) Desinfección: sumergir las semillas en etanol 70% durante 1 minuto. Enjuagar

con agua destilada estéril. Luego embeber en Hipoclorito de Sodio 1,5% por 15

min. Realizar cuatro enjuagues con agua destilada estéril. Realizar un corte

superficial en la testa de cada semilla antes de sembrar.

b) Medio de siembra: A placas Petri de 90mm, agregar 30 mL de medio Murashige

and Skoog 1962 (MS), Sacarosa (2%), ácido giberélico (5mg/L), 6-

Bencilaminopurina (0,5 mg/L), Cloruro de Sodio (20 uM) y agar (8 g/L), pH 5,8.

Medir pH antes de agregar el agar

c) Mantener las placas con semillas durante dos meses a 21°C, fotoperiodo 16h/8h

(luz/oscuridad), intensidad de 120 umolm-2s-1 (Fig. 2A).

d) Una vez germinadas (Fig 2B y 2C), traspasar las plántulas a sustrato estéril

arena:vermiculita (2:1) y mantener en las mismas condiciones de crecimiento

durante dos meses. Las plántulas de L. ovallei son muy sensibles a la

deshidratación por lo cual es fundamental que se utilicen frascos plásticos, donde

se pueda ir graduando el contacto de las plantas con su medio externo (Fig. 2D).

Como protección, también se pueden utilizar bolsas de plástico, a las que se les

corta gradualmente sus esquinas.

e) Traspasar a invernadero, idealmente, con condiciones controladas de luz y

temperatura. Regar poco, y cubrir con una bolsa de plástico para minimizar la

deshidratación excesivamente. En la Fig. 2E se muestra una planta de 6 meses

crecida en invernadero con dos rizomas ya desarrollados. Hay que indicar que un

número importante de las plantas transferidas al invernadero sufre una

deshidratación severa, aún con los cuidados antes mencionados (Fig. 2F). Sin

embargo, está comprobado que si se continúa con el régimen de riego, al cabo de

unas semanas los rizomas volverán a crecer y darán inicio a nuevas plantas.

f) Con este protocolo se obtuvo un 13% de germinación de semillas, lejos el más

alto.

47

12

2A

2B

Germinación in vitro en la cámara de crecimiento con condiciones

controladas

Cotiledón y radícula de semillas germinación in vitro

48

2C

2D

Plantas de 5 meses aclimatadas al

interior de la cámara de crecimiento

Plantas en proceso de

aclimatación

Plántula de 1 mes de edad

49

2E

Plantas de seis meses de edad, con dos rizomas ya formados

Plantas de ocho meses de edad, transferidas a invernadero y

que sufrieron una severa deshidratación. Sin embargo, todas

estas plantas se recuperan al cabo de 1 mes

aproximadamente.

2F

50

ANEXO n° 3: Protocolo de multiplicación de rizomas de Garra de León (L.

ovallei)

a) Después de 8 meses (Fig. 3A), una planta de L. ovallei debería generar, en

promedio, cinco rizomas (Fig. 3B).

b) Saturar con abundante agua el sustrato de arena:vermiculita (2:1) en que se

encuentran las plantas de L. ovallei (Fig 3C).

c) Remover con cuidado la zona radicular e iniciar la propagación de las plántulas

cortando las secciones de tallos que unen cada rizoma entre sí. Procurar mantener

unida la respectiva estructura de reserva a su rizoma (Fig. 3D).

d) Trasladar el rizoma y su estructura de reserva a una nueva bolsa o maceta con

sustrato de arena:vermiculita (3:1) (Fig. 3E)

e) Regar 2 veces por semana hasta que comience a crecer una nueva planta.

Mantener el mismo régimen de riego por 4 semanas y luego distanciar el riego a 1

vez por semana.

3A

Plantas de ocho meses de edad,

aclimatada en invernadero

51

3C

3B Rizomas obtenidos de una planta de ocho meses de edad

Rizomas obtenidos de una planta de ocho meses de edad

52

3E Rizomas en pleno crecimiento, a 1 mes de haber sido dividido y plantado

3D Disección de rizomas

53

ANEXO n° 4: Protocolo de germinación semillas de Lucumillo (Myrcianthes

coquimbensis).

a) Colectar frutos maduros. Estos se reconocen por tener una tonalidad

rojo/naranja intenso, y porque se desprenden fácilmente del arbusto (Figs.

4A,. 4B)

b) Remover el mesocarpio (pulpa) de las semillas (Fig. 4C)

c) Sembrar directamente sobre un sustrato de tierra:arena (2:1) humedecido.

Sembrar a 1.5-2 cm de profundidad (Fig. 4D)

d) Regar diariamente la primera semana, las siguientes dos semanas hacerlo

cada dos días, para luego continuar con riegos 2 veces por semana y

mantener luego 1 vez por semana (Fig. 4E)

e) Con este protocolo se consiguió un 80% de germinación.

4A Detalle de las hojas y frutos maduros

54

4B

4C

Semillas maduras Cotiledón y

embrión Semillas inmaduras

Mesocarpio

a = Semilla con mesocarpio

a b c

b = Semilla con radícula deshidratada

c = Semilla sin mesocarpio

55

4E

4D Semilla germinada mostrando su gran cotiledón carnoso

Plántulas creciendo en sombreadero

56

ANEXO n° 5: Protocolo de propagación ex vitro por esquejes en Lucumillo (M.

coquimbensis)

a) Cortar esquejes de la mitad superior de ramas de lucumillo con 6 pares de yemas

(5A).

b) Lavar los esquejes durante 5 minutos con agua corriente.

c) Sumergir los esquejes en una solución antifúngica (Eco Opción o Captan) durante

15 minutos.

d) Cortar los esquejes dejándolos con dos pares de yemas. Mantener las hojas del par

superior de las yemas y cortar las hojas del par inferior.

e) Sumergir la base del explante en Ácido Indolbutírico (IBA Root) a 10.000 mg/L por

5 segundos.

f) Colocar los esquejes en un sustrato de tierra de hojas o vermiculita en una cama

de propagación a 21°C (Figs. 5B, 5C, 5D)

g) Mantener durante 60 días y traspasar los esquejes enraizados (Figs. 5D, 5E) a

bolsas o vasos plásticos con tierra de hojas (Fig. 5G).

h) Después de 30 días, las nuevas plantas deberían aumentar considerablemente su

masa radicular (Fig. 5H).

i) Con este protocolo se obtuvo un 85% de enraizamiento final.

57

5A

5B Cama caliente mostrando su sistema de calefacción

Esqueje antes de ser seccionado

58

5D

5C

Embebimiento de explantes en Ácido Indolbutírico (IBA root)

Explantes montados sobre la cama caliente

59

5E

5F

Explante enraizado de 1 mes de edad

Explantes enraizados de 2 meses de edad

60

5G

5H

G

Explantes enraizados transferidos a vasos de

plástico para iniciar su aclimatación

Explante mostrando su masa radicular en

crecimiento después de estar 1 mes en invernadero

61

ANEXO n° 6: Protocolo de propagación in vitro de Lucumillo (M. coquimbensis)

a) Cortar explantes de 3-5 cm que contengan al menos 1 par de yemas laterales

(Fig. 6A). Se recomienda utilizar como plantas madres, individuos jóvenes (6

meses a 1 ½ año de edad), desarrolladas a partir de semillas en invernadero.

La utilización de esquejes provenientes de plantas silvestres, resultó en una

contaminación permanente que fue imposible de erradicar (6B).

b) Lavar los explantes con agua corriente durante 5 minutos.

c) Desinfectar los explantes sumergiéndolos en etanol 70% durante 30 segundos.

Luego en Hipoclorito de Sodio 1,5% + 2 gotas tween por 10 minutos.

Posteriormente realizar tres enjuagues con agua destilada estéril.

d) Medio de cultivo para el establecimiento: En frascos de vidrio adicionar un

volumen final de 15ml de medio de establecimiento. Cada litro de medio de

cultivo está constituido por medio básico de Murashige & Skoog 1962 (MS),

sacarosa (2%), 6-bencilaminopurina (14,1 µM), Polivinilpirrolidona (PVP,

1mg/L) y Agar-Agar (8,0 g/L), pH 5,8 previo a la adición del agar. Autoclavar

el medio a 121°C, presión de 1Kg/cm2 y por 20 min. Traspasar el explante

desinfectado a este medio y mantener en cámara con temperatura 21°C,

fotoperiodo largo (16h luz/8h oscuridad), 70% H.R, 120 µmolm-2s-1.

e) A los 30 días, transferir los explantes con sus yemas brotadas a medio fresco

de cultivo. Mantener por otros 30 días y luego pasar a la etapa de

enraizamiento.

f) Enraizamiento: Colocar los brotes desarrollados en frascos de vidrio con 15 mL

de medio de enraizamiento. Cada litro de medio de enraizamiento está

constituido por sacarosa (3%), Polivinilpirrolidona (PVP, 1mg/L), Kinetina

(1mg/L), Ácido Indolbutírico (AIB, 5 mg/L) y Carbón activado (1g/L).

Autoclavar el medio según lo indicado en punto d. Traspasar el brote

desarrollado a este medio y mantener por 1 mes en cámara de crecimiento

con condiciones controladas de luz, temperatura y humedad relativa ya

descritas en el punto d. Pasado el mes, subcultivar en un medio fresco y

mantener por 1 mes más (Fig. 6C y 6D).

g) Transferencia a tierra y aclimatación: Extraer las plántulas de los tubos, lavar

raíces y extraer el agar. Plantar en vasos plástico cerrados con sustrato

autoclavado de arena:vermiculita (2:1) o sólo de vermiculita y mantener

durante 1 ½ mes en cámara de crecimiento, facilitando gradualmente el

intercambio gaseoso y con riegos cada 7 días con solución nutritiva Hoagland.

Luego transferir a invernadero (Fig. 6E).

h) i) Con este protocolo se obtuvo un 80% de enraizamiento final.

62

6A

G

Esqueje antes y después de eliminar sus hojas

63

6B

6C

Esqueje adulto contaminado a pesar de la desinfección realizada

Esqueje enraizado in vitro y en presencia de carbón activado

64

6D

G

Esqueje enraizado in vitro y en ausencia de carbón activado.

Las raíces son más cortas.

6E

G

Plántulas de 3 meses de edad ya aclimatadas en invernadero

65

ANEXO n° 7: Protocolo de germinación semillas de Algarrobo dulce (Prosopis

flexuosa)

a) Extraer las semillas de las vainas (Figs. 7A y 7B), eliminando las semillas

vanas o comidas por insectos. Almacenar en frío (4°C) por mínimo 1 mes.

b) Escarificar las semillas con ácido sulfurico (H2SO4) a temperatura ambiente

durante 3 minutos (Fig. 7C). Enjuagar con agua destilada por 2 minutos.

Secar con papel absorbente y guardar a 4°C por 24 horas.

c) Al siguiente día, poner las semillas a germinar en placas Petri con papel filtro

embebido en agua destilada en una cámara de crecimiento a 21ºC.

d) A las 48 horas se debería tener sobre un 50% de germinación (Fig. 7D).

e) Con este protocolo se consiguió un 95% de germinación.

7A

C

Frutos inmaduros de P. flexuosa

66

7B

C

Frutos maduros y

semillas de P. flexuosa Frutos maduros y

semillas de P. chilensis

7C

C

Escarificación con H2SO4 de semillas de P. flexuosa

67

7D

C

Semillas germinadas de P. flexuosa

68

ANEXO n° 8: Protocolo de propagación ex vitro por esquejes de Algarrobo dulce

(P. flexuosa)

a) Cortar esquejes de la mitad superior de ramas de con 6 yemas.

b) Lavar los esquejes durante 5 minutos con agua corriente.

c) Sumergir los esquejes en una solución antifúngica (Eco Opción o Captan) por 15

minutos.

d) Cortar los esquejes dejándolos con dos yemas. Mantener las hojas de la yema

superior y cortar las hojas de la yema inferior (Fig. 8A).

e) Colocar los esquejes en un sustrato de tierra de hojas en una cama de propagación

a 21°C (Fig. 8B). Nota: P. flexuosa no necesita Ácido Indolbutírico (IBA root) para

enraizar.

f) Mantener durante 60 días y hacer el traspaso a bolsas con tierra de hojas.

g) Con este protocolo se obtuvo un 70% de enraizamiento final (Figs. 8C y 8D).

69

8B

8A

G

Esqueje de P. flexuosa antes y después de ser seccionado

Establecimiento de esquejes de P. flexuosa en la cama caliente

(zona amarilla demarcada)

70

8C

8D

Esquejes de P. flexuosa de 1 mes de edad

con un incipiente enraizamiento

Esquejes de P. flexuosa de 2 meses de edad ya enraizados

71

ANEXO n° 9: Protocolo de propagación in vitro de Algarrobo dulce (P. flexuosa)

a) Cortar explantes de 3-5 cm que contengan al menos 1 yema lateral. Se

recomienda utilizar como plantas madres, individuos jóvenes (1 año de edad),

desarrolladas a partir de semillas en invernadero (Fig. 9A).

b) Lavar los explantes con agua corriente durante 5 minutos.

c) Desinfectar los explantes sumergiéndolos en etanol 70% durante 1 minuto.

Luego en Hipoclorito de Sodio 1,5% + 2 gotas tween por 10 minutos.

Posteriormente realizar tres enjuagues con agua destilada estéril.

d) Medio de cultivo para el establecimiento: En frascos de vidrio adicionar un

volumen final de 15ml de medio de establecimiento. Cada litro de medio de

cultivo está constituido por medio básico de Murashige & Skoog 1962 (MS),

sacarosa (2%), 6-bencilaminopurina (4,4 µM), Polivinilpirrolidona (PVP, 1,5

g/L) y Agar-Agar (8,0 g/L), pH 5,8 previo a la adición del agar. Autoclavar los

medios a 121°C, presión de 1Kg/cm2 y por 20 min. Traspasar el explante

desinfectado a este medio y mantener en cámara con temperatura 21°C,

fotoperiodo largo (16h luz/8h oscuridad), 70% H.R, 120 µmolm-2s-1.

e) A los 30 días, transferir los explantes con sus yemas brotadas a medio fresco

de cultivo. Mantener por otros 30 días y luego pasar a la etapa de

enraizamiento.

f) Enraizamiento: Colocar los esquejes brotados en frascos de vidrio con 15 mL

de medio de enraizamiento. Cada litro de medio de cultivo está constituido por

medio MS, sacarosa (3%), Kinetina (1mg/L) y Ácido Indolbutírico (AIB, 10

mg/L). Autoclavar según lo indicado en punto d. Durante un mes mantener en

cámara de crecimiento con condiciones controladas de luz, temperatura y

humedad relativa ya descritas en el punto d (Fig. 9B y 9C).

g) Extraer la plántula de los tubos, lavar raíces y extraer el agar. Plantar en

vasos plástico cerrados con sustrato autoclavado de arena vermiculita (2:1) o

sólo de vermiculita y mantener durante 1 mes en cámara, facilitando

gradualmente el intercambio gaseoso y con riegos cada 7 días con solución

nutritiva Hoagland. Luego transferir a invernadero.

h) Con este protocolo se obtuvo un 70% de enraizamiento final (Fig. 9D).

72

9A

73

9B

9C

74

9D

75

ANEXO n° 10: Protocolo de germinación semillas de Algarrobo (P. chilensis)

a) Extraer las semillas de las vainas (Fig. 10A). Eliminar las semillas vanas o

comidas por insectos. Almacenar en frío (4°C) por mínimo 1 mes.

b) Escarificar las semillas con ácido sulfúrico (H2SO4) a temperatura ambiente

durante 3 minutos. Enjuagar con agua destilada por 2 minutos. Secar con

papel absorbente y guardar a 4°C por 24 horas.

c) Al siguiente día, poner las semillas a germinar en placas Petri con papel filtro

embebido en agua destilada en una cámara de crecimiento a 21ºC.

d) A las 48 horas se debería tener sobre un 50% de germinación.

e) Con este protocolo se consiguió un 95% de germinación (Fig. 10B), y sobre el

90% de las semillas germinadas lograron desarrollarse exitosamente (Fig.

10C).

10A

76

10B

10C

77

ANEXO n° 11: Protocolo de propagación ex vitro por esquejes de Algarrobo (P.

chilensis)

a) Cortar esquejes de la mitad superior de ramas de con 6 yemas.

b) Lavar los esquejes durante 5 minutos con agua corriente.

c) Sumergir los esquejes en una solución antifúngica (Eco Opción o Captan) por 15

minutos.

d) Cortar los esquejes dejándolos con dos yemas (Fig. 11A). Mantener las hojas de la

yema superior y cortar las hojas de la yema inferior.

e) Sumergir la base del explante en Ácido Indolbutírico (AIB, 7500 mg/L) durante 5

segundos.

f) Colocar los esquejes en un sustrato de tierra de hojas o vermiculita en una cama

de propagación a 21°C (Fig. 11B).

g) Mantener durante 60 días y hacer el traspaso a bolsas con tierra de hojas.

h) Con este protocolo se obtuvo un 70% de enraizamiento final (Fig. 11C)

78

11A

11B

79

11C

80

ANEXO n° 12: Protocolo de propagación in vitro de Algarrobo (P.

chilensis)

a) Cortar explantes de 3-5 cm que contengan al menos 1 yema lateral

provenientes de plantas jóvenes (1 año de edad), desarrolladas a partir de

semillas en invernadero.

b) Lavar los explantes con agua corriente durante 5 minutos.

c) Desinfectar los explantes sumergiéndolos en etanol 70% durante 1 minuto.

Luego en Hipoclorito de Sodio 1,5% + 2 gotas tween por 10 minutos.

Posteriormente realizar tres enjuagues con agua destilada estéril.

d) Medio de cultivo para el establecimiento: En frascos de vidrio adicionar 15 mL

de medio básico de Murashige and Skoog (MS), sacarosa (2%), 6-

bencilaminopurina (4,4 µM), PVP (1,5 g/l) y Agar-Agar (8,0 g/L), pH 5,8

previo a la adición del agar. Autoclavar los medios a 121°C, presión de

1Kg/cm2 y por 20 min. Mantener en cámara con temperatura 21°C,

fotoperiodo largo (16h luz/8h oscuridad), 70% H.R, 120 µmolm-2s-1 (Fig 12A).

e) Enraizamiento: En frascos de vidrio colocar los brotes en un medio de

enraizamiento con MS, sacarosa (3%), Kinetina (1mg/L), Ácido Indolbutírico

(AIB, 5 mg/L) y Carbón Activado (1g/L). Autoclavar según lo indicado en

punto d. Durante un mes mantener en cámara de crecimiento con condiciones

controladas de luz, temperatura y humedad relativa ya descritas en el punto

d.

f) Extraer la plántula de los tubos, lavar raíces y extraer agar. Plantar en vasos

plástico cerrados con sustrato autoclavado de arena vermiculita (2:1) o sólo

de vermiculita y mantener durante 1 mes en cámara, facilitando gradualmente

el intercambio gaseoso y con riegos cada 7 días con solución nutritiva

Hoagland. Luego transferir a invernadero.

g) Con este protocolo se obtuvo un 30% de enraizamiento final (Fig 12B).

81

12A

12B

82

ANEXO n° 13: Materiales usados en la parte de propagación

Campana de flujo laminar y reactivos típicos del cultivo in vitro

83

84

ANEXO n° 14: Poster 1 presentado en la VII Reunión de Biología Vegetal. Pucón

2012

85

ANEXO n° 15: Poster 2 presentado en la VII Reunión de Biología Vegetal. Pucón

2012

86

ANEXO n° 16: Poster 3 presentado en la VII Reunión de Biología Vegetal. Pucón

2012

87

ANEXO n° 17: Programa II Encuentro temático del FIBN, Iquique 2013

88

ANEXO n° 18: Certificado de aceptación trabajo oral Cristian Ibáñez. Tercer

Congreso de Flora Nativa. Santiago 2013.

89

ANEXO n° 19: Certificado de aceptación trabajo oral Fabiola Jamett. Tercer

Congreso de Flora Nativa. Santiago 2013.

90

ANEXO n° 20: Certificado de aceptación Poster 4 presentado al Tercer Congreso

de Flora Nativa. Santiago 2013.

91

ANEXO n° 21: Poster 5 presentado en la VIII Reunión de Biología Vegetal,

Pucón 2013.

92

ANEXOS TABLAS

ANEXO Tabla 1. Esquema y posterior detalle de los tratamientos de germinación de

semillas de Leontochir ovallei probados durante esta investigación.

Detalle de los alguno de los tratamientos probados:

T1: Semillas a temperatura ambiente, en medio MS, con carbón activado, con luz y a 21ºC.

T2: Semillas a temperatura ambiente, en medio MS, con carbón activado, con luz y a 30ºC.

T3: Semillas a temperatura ambiente, en medio MS, con carbón activado, sin luz y a 21ºC.

T4: Semillas a temperatura ambiente, en medio MS, con carbón activado, sin luz y a 30ºC.

T5: Semillas a temperatura ambiente, en medio MS, sin carbón activado, con luz y a 21ºC.

T6: Semillas a temperatura ambiente, en medio MS, sin carbón activado, con luz y a 30ºC.

T7: Semillas a temperatura ambiente, en medio MS, sin carbón activado, sin luz y a 21ºC.

T8: Semillas a temperatura ambiente, en medio MS, sin carbón activado, sin luz y a 30ºC.

Estratificación

de semillas

4°C 20°C

Murashige

& Skoog Gamborg-5 Murashige

& Skoog

Gamborg-5

Con

carbón

activado

Sin

carbón

activado

Con

carbón

activado

Sin

carbón

activado

Con

carbón

activado

Sin

carbón

activado

Con

carbón

activado

Sin

carbón

activado

Medio de cultivo

Condiciones de almacenamiento

Con luz Sin luz

30°C 21°C 21°C 30°C

93

T9: Semillas a temperatura ambiente, en medio Gamborg-5, con carbón activado, con luz y a 21ºC.

T10: Semillas a temperatura ambiente, con medio Gamborg-5, con carbón activado, con luz y a

30ºC.

T11: Semillas a temperatura ambiente, con medio Gamborg-5, con carbón activado, sin luz y a 21ºC.

T12: Semillas a temperatura ambiente, con medio Gamborg-5, con carbón activado, sin luz y a 30ºC.

T13: Semillas a temperatura ambiente, con medio Gamborg-5, sin carbón activado, con luz y a 21ºC.

T14: Semillas a temperatura ambiente, con medio Gamborg-5, sin carbón activado, con luz y a 30ºC.

T15: Semillas a temperatura ambiente, con medio Gamborg-5, sin carbón activado, sin luz y a 21ºC.

T16: Semillas a temperatura ambiente, con medio Gamborg-5, sin carbón activado, sin luz y a 30ºC.

T17: Semillas a 4ºC, con medio MS, con carbón activado, con luz y a 21ºC.

T18: Semillas a 4ºC, con medio MS, con carbón activado, con luz y a 30ºC.

T19: Semillas a 4ºC, con medio MS, con carbón activado, sin luz y a 21ºC.

T20: Semillas a 4ºC, con medio MS, con carbón activado, sin luz y a 30ºC.

T21: Semillas a 4ºC, con medio MS, sin carbón activado, con luz y a 21ºC.

T22: Semillas a 4ºC, con medio MS, sin carbón activado, con luz y a 30ºC.

T23: Semillas a 4ºC, con medio MS, sin carbón activado, sin luz y a 21ºC.

T24: Semillas a 4ºC, con medio MS, sin carbón activado, sin luz y a 30ºC.

T25: Semillas a 4ºC, con medio Gamborg-5, con carbón activado, con luz y a 21ºC.

T26: Semillas a 4ºC, con medio Gambor-5, con carbón activado, con luz y a 30ºC.

T27: Semillas a 4ºC, con medio Gambor-5, con carbón activado, sin luz y a 21ºC.

T28: Semillas a 4ºC, con medio Gambor-5, con carbón activado, sin luz y a 30ºC.

T29: Semillas a 4ºC, con medio Gambor-5, sin carbón activado, con luz y a 21ºC.

T30: Semillas a 4ºC, con medio Gambor-5, sin carbón activado, con luz y a 30ºC.

T31: Semillas a 4ºC, con medio Gambor-5, sin carbón activado, sin luz y a 21ºC.

T32: Semillas a 4ºC, con medio Gambor-5, sin carbón activado, sin luz y a 30ºC.

Tratamientos de escarificación química y mecánica probados.

Tratamiento Estratificación

de semillas

Escarificación química Escarificación

mecánica

Escarificación

térmica

Ácido

sulfúrico

Ácido

giberélico

(embebidas

x72 hrs)

Agua de

coco

(embebidas

x72 hrs)

Lija (1 min) Agua en

ebullición

10

min

15

min

1(min) 3(min)

T1 4°C X

T2 X

T3 X

T4 X

T5 X

T6 X

T7 X

T8 24°C X

T9 X

T10 X

T11 X

T12 X

T13 X

T14 X