Establecimiento de protocolos de micropropagación e identificación de bioproductos en especies nativas de alto valor ecológico del norte chico

(Proyecto CONAF 037/2011)

Dr. Cristian Ibáñez G. Departamento de Biología

cibanez@userena.cl

MSc. Fabiola Jamett D. Departamento de Química

fjamett@userena.cl

1.  Estandarizar protocolos de propagación por semillas, por esquejes y de tipo in vitro para Garra de Léon (Leontochir ovallei), Lucumillo (Myrcianthes coquimbensis), Algarrobo dulce (Prosopis flexuosa) y Algarrobo (Prosopis chilensis).

Objetivos específicos

Evaluar y resguardar el patrimonio genético de plantas nativas de zonas áridas y semiáridas mediante el establecimiento de protocolos de propagación vegetativa de tipo in vitro y determinación de compuestos naturales presentes en el metaboloma de hojas, frutos o raíces.

General

2. Estandarizar protocolos para identificar y cuantificar compuestos metabólicos naturales presentes en las hojas, frutos o raíces de estas cuatro plantas nativas

3. Generar un registro de los metabolitos presentes en estas cuatro plantas nativas para evaluar así su potencial bioquímico en la industria agroalimentaria y/o biomédica nacional.

OBJETIVOS

Garra de León (Leontochir ovallei) ♦ Planta rizomatosa endémica de la Región de Atacama ♦ Categorizada En Peligro de Extinción (Ravenna et al, 1998) ♦ Florece cada 5-7 años

Fam. Alstroemeriaceae

Lucumillo (Myrcianthes coquimbensis) ♦ Arbusto leñoso endémico de la Región de Coquimbo ♦ Categorizada En Peligro de Extensión (Hechenleitner et al., 2005) ♦ Semilla recalcitrante

Fam. Myrtaceae

Algarrobo dulce (Prosopis flexuosa) ♦ Árbol/Arbusto leñoso, nativo de las Regiones de Atacama y Coquimbo

♦ Hábitat altamente alterado (sobrepastoreo) y ataque de brúquidos

Fam. Fabaceae

♦ Categorizada En Peligro de Extinción (Squeo et al., 2001, 2008)

Algarrobo (Prosopis chilensis) ♦ Árbol leñoso, nativo desde las Regiones de Atacama a L. B. O´Higgins ♦ Categorizada Vulnerable (Squeo et al., 2001) ♦ Hábitat altamente alterado (sobrepastoreo) y ataque de brúquidos. Leña

P.flexuosa

L. ovallei

M. coquimbensis

P.chilensis

P. flexuosa: Copiapó-Caldera L. ovallei: P.N. Llanos de Challe M. coquimbensis: El Arrayán, Serena Norte P. chilensis: Maitencillo, Valle de Elqui

♦ Colectaron semillas y hojas en:

Leontochir ovallei

METODOLOGÍA

SEXUAL ASEXUAL

Escarificación y/o Estratificación

Siembra en medio de cultivo MS

Siembra directa en sustrato

Obtención plantas

Semillas

Obtención plantas

Obtención esquejes

Desinfección

Ex vitro

Establecimiento en sustrato

Auxinas

Obtención plantas

In vitro

Obtención de esquejes

Desinfección

Establecimiento medio de cultivo

Citoquininas

Establecimiento medio de cultivo

Auxinas

Aclimatación Obtención plantas

ESTRATEGIAS DE PROPAGACIÓN

RESULTADOS

Cantidad de metodologías probadas

Propagación Prosopis flexuosa

Leontochir ovallei

Myrcianthes. coquimbensis

Prosopis chilensis

Semillas 2 3 (108) 6 2 Ex vitro 24 2 24 24 In vitro 6 2 27 6

SEMILLAS: Escarificación química (Ácido sulfúrico, ác. clorhídrico), mecánica y térmica; Con/Sin Pericarpio, temperatura, desinfecciones, c/s luz, oxigenación, hormonas.

EX VITRO: Desinfección; Enraizamiento; Con/Sin Raspaje; Sustratos (Arena, vermiculita, tierra de hojas).

IN VITRO: Medios de cultivo (MS, Gambord, Hoagland); Desinfección; Oxidación; Inducción brotes; Enraizamiento.

RESULTADOS

Tiempo requerido en establecimiento de protocolos

Propagación Prosopis flexuosa

Leontochir ovallei

Myrcianthes. coquimbensis

Prosopis chilensis

Semillas 3 días 17 meses 6 meses 3 días

Ex vitro 2 meses 8 meses 2 meses 2 meses

In vitro 4 meses ? - 17 meses 4 meses

RESULTADOS

Porcentajes de propagación con PROTOCOLOS

Propagación Prosopis flexuosa

Leontochir ovallei

Myrcianthes. coquimbensis

Prosopis chilensis

Semillas 100 % 13 % 90 % 100 %

Ex vitro 85 % 10 % ? 60 % 70% ?

In vitro § 100 % (solo

apical) 60 % §

§ Evaluación finaliza 28 de Agosto

RESULTADOS Leontochir ovallei + relevantes SEMILLAS (13%) 1.  Semillas pueden almacenarse en frío. 2.  Desinfección simple con Etanol 75%(1 min) y

extensa de Hipoclorito de Sodio 1,5% (15 min) 3.  Germinación lenta (mínimo dos meses) 4.  Utilizar sustrato (arena o vermiculita). Riego

bajo. 5.  Después de 8 meses, se producen cinco (5)

rizomas por planta (aprox).

Último test: Oxigenación (3 d) + escarificación Ac. Sulfúrico (4 min) aumentó germinación a 70%

PROPAGACIÓN EX VITRO (10%) 1.  Dividir rizomas y traspasar nuevamente al

mismo sustrato PROPAGACIÓN IN VITRO (100%) 1.  Exitosa pero insuficiente (solo apices)

RESULTADOS Myrcianthes coquimbensis + relevantes SEMILLAS (90%) 1.  Sin problemas. Eliminar pericarpio. Semillas

maduras

PROPAGACIÓN EX VITRO (60%) 1.  Requiere tratamiento antifúngico fuerte (20 min) 2.  Enraizamiento con 5000 mg/L de IBA root

PROPAGACIÓN IN VITRO (60%) 1.  Exitosa pero lenta 2.  Establecer en medio MS + Sacarosa (2%) + BAP

(14,1 uM) + agar (8 g/L), pH 5,8. 3.  Enraizamiento en medio MS + Sacarosa (3%) +

Kinetina (1mg/L) + 5000 mg/L IBA + 1g/L Carbón activado

RESULTADOS Prosopis flexuosa y P. chilensis + relevantes SEMILLAS (100%, ambos) 1.  Sin problemas de germinación (Ac. Sulfúrico) PROPAGACIÓN EX VITRO (85% P. fl y 70% P. ch) 1.  Usar esquejes plantas jóvenes (6 a 18 meses) 2.  Sin problemas para desinfectar esquejes 3.  Enraizamiento: P. flexuosa 2500ppm de IBA root;

P. chilensis 5000ppm de IBA root. 4.  Usar cama caliente a 21°C 5.  Enraizamiento exitoso después de 1 mes.

PROPAGACIÓN IN VITRO (?): 1.  Establecer en medio MS + Sacarosa (2%) + PVP

(1,5 g/L) + BAP (4,4 uM (1 mg/L)) + agar (8 g/L), pH 5,8 (ambos Prosopis)

2.  Enraizamiento en medio MS + Sacarosa (3%) + Kinetina (1mg/L) + 5000 mg/L IBA + 1g/L carbón activado (ambos Prosopis)

3.  Enraizamiento exitoso después de 1 mes.

PROYECCIÓN

Organogénesis indirecta (callos) en la cuatro especies. Producción rizomas

(L. ovallei)

ANÁLISIS FITOQUÍMICOS

Humedad

Proximal

§  Fibra §  Cenizas §  Proteínas §  Extracto Etereo §  Azúcares Totales

Análisis de cenizas

Macronutrientes: Ca, Mg, Na, K, P, N

Micronutrientes: Fe, Cu. Mn, Zn, B

Perfil de ácidos grasos Extracto Etéreo

§  Alcaloides §  Antraquinonas §  Flavonoides §  Terpenos §  Cumarinas

Familias ce Metabolitos secundarios

Etapa I

Etapa II

Etapa III

Etapa IV

Materia Seca

Extracto No Nitrogenado §  Azúcares Reductores §  Azúcares No Reductores §  Polifenoles Totales

Macroelementos Alstromeria spp

% Bajo Suficiente Alto N 3,2-3,69 3,7-5,6 >5,60 P 0,21-0,29 0,3-0,7 >0,75 K 3,00-3,69 3,7-4,8 >4,80

Ca 0,40-0,59 0,06-1,5 >1,50 Mg 0,15-0,19 0,2-0,5 >0,50

Humedad  Carrizal  Bajo   Quebrada  del  Mono   Mina  Oriente    Promedio  

71,9  %   74,6  %   66,5  %   71,0  %  

Leontochir ovallei (Hojas)

Fuente: Jones, Wolf & Mills, 1991

Análisis proximal y macronutrientes (peso seco)

0,67  

4,83  

16,56  

0,14  

2,74  

0,75   1,10  2,76  

0,00  

2,00  

4,00  

6,00  

8,00  

10,00  

12,00  

14,00  

16,00  

18,00  

AZ-­‐T   Pfenol   cenizas   P   Ca   Mg   Na   K  

Porcen

taje  

Macronutrientes  

Carrizal  Bajo   Quebrada  del  mono   Mina  Oriente   Promedios  

- L. ovallei casi duplica su contenido de Ca, y tiene bajo contenido de P. - En plantas, P entre 0,10-0,15 % es señal de déficit

Microelementos Alstromeria spp

% Bajo Suficiente Alto B 10 - 12 13-50 >50

Cu 2 - 3 4-50 >50 Fe 100-149 150-300 >300 Mn 40-49 50-200 >200

Micronutrientes (ppm)

Leontochir ovallei (Hojas)

Fuente: Jones, Wolf & Mills, 1991

37  

56  

26  

82  

21  

0  

20  

40  

60  

80  

100  

B   Fe   Cu   Mn   Zn  

mg/Kg

 

Micronutrientes  

Carrizal  Bajo   Quebrada  del  Mono   Mina  oriente   Promedios  

- L. ovallei tiene un bajo contenido de Fe (Normal en plantas, 80-320 ppm). - Mn es levemente elevado (normal en plantas, 22 ppm) - Zn normal (20 ppm en plantas)

Análisis proximal y de polifenoles

Prosopis flexuosa (Hojas)

0

5

10

15

20

25

30

Humedad Cenizas EE polifenoles

Por

cent

aje

Proximal y otros

Quebrada Morel Totoral 1 Totoral 2 Totoral 3 Puerto Viejo Promedio

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Ca Mg Na K P

Por

cent

aje

Macronutrientes

Quebrada Morel Totoral 1 Totoral 2 Totoral 3 Puerto Viejo Promedio

Macronutrientes

- Hojas de P. flexuosa tiene un contenido interesante de polifenoles (1,4%). Hojas de olivos tienen 2,7%. - Bajo contenido de cenizas (7%) pero todos los macronutrientes están en niveles normales. - E.E (5,5%) se considera interesante.

Prosopis flexuosa (Hojas)

Micronutrientes

0

50

100

150

200

250

Cu Mn Zn Fe Ni B

mg/

Kg

Micronutrientes

Quebrada Morel Totoral 1 Totoral 2 Totoral 3 Puerto Viejo promedio

- P. flexuosa tiene todos sus micronutrientes en valores levemente superior a lo normal, por lo cual, no estaría demostrando deficiencias.

Prosopis chilensis (Hojas)

Análisis proximal y de polifenoles

32,3  

8,1  

1,7  

6,5  

8,0  7,2  

%AZ-­‐NR  

%AZ-­‐R  

%  Fenoles  

%  Humedad  

%  Cenizas  

%  EE  

Valores  promedios  

-­‐10,00  

0,00  

10,00  

20,00  

30,00  

40,00  

50,00  

60,00  

AZ-­‐NR   AZ-­‐R   AZ-­‐T   Fenoles   Humedad   Cenizas    EE  

Porcentaje  

Proximal  y  otros  

Elqui  Limarí  Matancilla  12  (Choapa)  Matancilla  13  (Choapa)  San  Agustín,  Choapa  Valparaíso,  Ruta  1  Promedio  

- P. chilensis tiene un alto contenido de azúcares en hojas (40%) - Interesante: Hojas alto contenido polifenoles (1%) - Bajo contenido de cenizas (8%). Otros estudios reportaron 13%. - E.E (7%) se considera interesante.

Prosopis chilensis (Hojas)

Macronutrientes

2,34  

0,67  

0,11  

1,51   %p/p  Ca  

%p/p  Mg  

%p/p  Na  

%p/p  K  

Valores  promedios  

0,00  

0,50  

1,00  

1,50  

2,00  

2,50  

3,00  

3,50  

 Ca    Mg    Na    K  

Porcentaje  

Macronutrientes  

Elqui  Limarí  Matancilla  12  (Choapa)  Matancilla  13  (Choapa)  San  Agustín,  Choapa  Valparaíso,  Ruta  1  Promedio  

- P. chilensis tiene un bajo contenido de Ca y alto en Mg. - K y Na están dentro de los valores normales encontrados en plantas- - P muy bajo en hojas

Prosopis chilensis (Hojas)

Micronutrientes Valores  promedios  

59   126   57  

239  

7  

381  

161  

ppm  Cu    

ppm  Mn  

ppm  Zn  

ppm  Fe  

ppm  Ni  

ppm  P  

ppm  B  

0  

100  

200  

300  

400  

500  

600  

 Cu      Mn    Zn    Fe    Ni    P    B  

mg/Kg  

Micronutrientes  

Elqui  

Limarí  

Matancilla  12  (Choapa)  

Matancilla  13  (Choapa)  

San  Agustín,  Choapa  

Valparaíso,  Ruta  1  

Promedio  

- P. chilensis tiene un bajo contenido de P (381ppm). Normal es 0,18% (1800ppm). - Alto contenido de B (161ppm). Normal es 30ppm - Alto contenido de Cu (59ppm). Normal 6ppm - Alto contenido de Mn (128ppm). Normal 22ppm - Sin deficiencia de Fe. Normal 80-320ppm

Myrcianthes coquimbensis (Hojas)

0,70"

0,24"0,28"

0,56"

Ca (%)" Mg (%)" Na (%)" K (%)"

EXTRACTO ETÉREO: 12,3 % (alto) En evaluación: 1. Tocoferoles (HPLC) 2. Perfil de ácidos grasos (GC-FID) 3. Aceites esenciales: GC-MS  

Macronutrientes (%)

65,1"

26,1"

49,4"

5,3"

Fe (ppm)" Cu (ppm)" Mn (ppm)" Zn (ppm)"

Micronutrientes (ppm)

- M. coquimbensis tiene bajo contenido de K, Fe y Zn mientras que el Cu y Mn están elevados. - Humedad es baja (6%). - Azucares totales son 10,1%. - Polifenoles (19%). Té verde tiene entre 15-20%.

PROYECCIÓN

•  Evaluación capacidad antifúngica, antibacteriana y farmacológica de los extractos acuosos, metanólicos y otros solventes orgánicos

•  Individualización de azúcares

•  Extracción y caracterización de aceites esenciales

•  Evaluación de capacidades antioxidantes

•  Identificación de polifenoles

AGRADECIMIENTOS

AGRADECIMIENTOS

•  Dr Jaime Bravo (Departamento Biotecnología, Universidad Politécnica de Pénjamo, México.

•  Dra Alexandra Stoll, Centro Estudios Avanzados en Zonas Áridas.

•  Maricela Rojas (Propagación ex vitro P. flexuosa y P. chilensis).

•  Ana Vásquez (Propagación ex vitro M. coquimbensis).

Estudiantes •  Katherine Rojas (Propagación semillas P. flexuosa y P. chilensis).

•  Paloma Gachón (Propagación semillas M. coquimbensis)

•  Elda Jofré (Propagación semillas L. ovallei).

•  MSc © Marta Vargas (Depto Biología, Universidad de La Serena) •  Marcelo Tapia y Natalia Rojas (Depto Química, Universidad de La Serena)

•  Elizabeth Gonzalez (Análisis químico hojas P. chilensis).

•  Leyla Muñoz y Karen Fuenzalida (Análisis químico vainas P. chilensis)

•  Yessenia Velásquez (Análisis químico hojas M. coquimbensis).

•  Manuel Tapia (Análisis químico hojas y vainas P. flexuosa)

•  Katherine Herrera (Análisis químico hojas L. ovallei).

Colaboradores