16. Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida. Anlisis de protenas de hojas de Arabidopsis thalianaAna Mara Maldonado Alconada, Jess V. Jorrn NovoDepartamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba

RESUMEN

La electroforesis en geles de poliacrilamida es uno de los mtodos ms utilizados para la purificacin, anlisis y caracterizacin de protenas. La tcnica permite separar molculas cargadas y explota diferencias en movilidad cuando se les somete a la accin de un campo elctrico. La electroforesis se lleva a cabo sobre un soporte inerte, generalmente sobre geles de poliacrilamida (PAGE). En la electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE), como su propio nombre indica, se utilizan agentes desnaturalizantes de protenas, como pueden ser: detergentes (p.e. SDS), catropos (p.e. urea) y agentes reductores (2- mercaptoetanol, DTT). Para la visualizacin de las protenas se utilizan diferentes mtodos de tincin, siendo el ms habitual el azul de coomassie. En la SDS-PAGE, la separacin es funcin del tamao (masa molecular), lo que permite determinar el peso molecular de las protenas. Para ello se compara la movilidad electrofortica (Rf) de la protena de peso molecular desconocido con el de protenas de referencia de peso molecular conocido. En esta prctica, en la que se pretende que el alumno comprenda el fundamento terico de esta tcnica y sus aplicaciones, se llevar a cabo la separacin de protenas de hojas de A. thaliana mediante SDS-PAGE. Palabras clave: Desnaturalizante, electroforesis, protenas, rubisco. Abreviaturas empleadas: APS: persulfato amnico; DTT: ditiotetriol; PAGE: electroforesis en geles de poliacrilamida; SDS-PAGE: electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida; SDS: dodecil sulfato sdico; TEMED: N,N,N,N-tetrametilentilendiamina. 1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS 1.1. Separacin electrofortica de protenas. La separacin y purificacin de protenas son necesarias para llevar a cabo el estudio y caracterizacin del proteoma de los sistemas biolgicos. Para ello, stas deben ser separadas selectivamente a partir de muestras complejas mediante un procedimiento de fraccionamiento adecuado. Los mtodos de

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separacin se basan en diferentes caractersticas de las protenas tales como solubilidad, tamao o carga, entre otras. Una de las tcnicas ms utilizadas es la electroforesis. El trmino electroforesis fue introducido por primera vez en 1907 por Michaelis para definir el fenmeno por el cual una molcula que posee carga neta se desplaza en respuesta a la aplicacin de un campo elctrico. La velocidad de migracin o movilidad a travs del campo elctrico depender de varios factores como son: la intensidad de dicho campo; la carga neta, tamao y forma de las molculas; as como la fuerza inica, viscosidad y temperatura del medio en el cual las molculas se estn moviendo. La electroforesis es una herramienta analtica simple, rpida y muy sensible, lo que la convierte en una tcnica de gran utilidad para la separacin y el estudio de molculas cargadas tales como protenas y cidos nucleicos. Existen numerosas variaciones de esta tcnica en funcin del equipo utilizado, soporte y condiciones fsico-qumicas en las cuales se va a llevar a cabo la separacin: i) ii) iii) iv) v) vi) Electroforesis capilar. Electroforesis en papel. Electroforesis en gel de agarosa. Electroforesis en gel de poliacrilamida. Isoelectroenfoque. Electroforesis bidimensional.

En este captulo, haremos referencia a la electroforesis en gel de poliacrilamida, y ms concretamente a la electroforesis desnaturalizante. La descripcin de los otros tipos de electroforesis puede encontrarse en la bibliografa recomendada (Westermeier, 2001). Los soportes de eleccin para la electroforesis de protenas son los geles de poliacrilamida (PAGE, polyacrilamide gel electrophoresis) debido a su buena resolucin y gran versatilidad. Adems, poseen una serie de ventajas tales como: ser qumicamente inertes, estables en un amplio rango de pH, temperatura y fuerza inica y fciles de generar mediante la polimerizacin de acrilamida. En la mayora de los casos, el gel se dispone entre dos receptculos independientes y separados que contienen tampn de electroforesis y los electrodos positivo y negativo, de forma que la conexin elctrica entre ambos receptculos slo es posible a travs del gel. Una vez que la electroforesis ha tenido lugar, el gel de poliacrilamida se puede teir, documentar o incluso se puede purificar la molcula de inters cortando literalmente el fragmento del gel. En la Figura 1, se representa la reaccin de polimerizacin de la acrilamida. Los geles de poliacrilamida actan a modo de tamiz molecular retardando el movimiento de macromolculas grandes mientras que permiten a molculas ms pequeas moverse libremente, potenciando de esta forma la separacin. El entramado de los geles de poliacrilamida se genera mediante la polimerizacin, a travs de radicales libres, de monmeros de acrilamida en presencia de pequeas cantidades de bis-acrilamida (N,N,N,N'-metilen-bis-acrilamida). Se forman enlaces cruzados entre los2

polmeros de acrilamida, de manera que se generan geles con tamao de poro determinado tanto por la concentracin total (%T) como por la concentracin relativa de acrilamida y de bisacrilamida. El tamao del poro puede ser ajustado para optimizar la separacin de la muestra de inters. As, geles con un porcentaje alto de acrilamida (10-15%T) son ptimos para la separacin de protenas de pequeo tamao (menores de 50KDa), mientras que geles de porcentajes menores (