ESTUDIO DE LOS COMPUESTOS LIPDICOS DURANTE LA DEGRADACIN DE LA MADERA DE
EUCALIPTO POR DIFERENTES HONGOS: TRANSFORMACIN DE LOS EXTRABLES
LIPOFLICOS Y SNTESIS DE NUEVOS METABOLITOS FNGICOS
Isabel Valles Alberdi
UniversFacu
TESIS DOCTORAL
idad Complutense de Madrid ltad de Ciencias Biolgicas
2006
Portada: Basidiomiceto de podredumbre parda creciendo sobre frondosa en Chillida-leku, Hernani (Guipzcoa). Agosto de 2005.
ESTUDIO DE LOS COMPUESTOS LIPDICOS DURANTE LA DEGRADACIN DE LA MADERA DE
EUCALIPTO POR DIFERENTES HONGOS: TRANSFORMACIN DE LOS EXTRABLES
LIPOFLICOS Y SNTESIS DE NUEVOS METABOLITOS FNGICOS
TESIS DOCTORAL PRESENTADA POR ISABEL VALLES ALBERDI PARA OPTAR AL TTULO DE DOCTOR POR LA UNIVERSIDAD
COMPLUTENSE DE MADRID
Universidad Complutense de Madrid
Facultad de Ciencias Biolgicas Madrid, 2006
Directores
Dra. Ana Gutirrez Surez (Cientfico Titular, CSIC)
Dr. Jos Carlos del Ro Andrade Dr. ngel T. Martnez Ferrer (Investigador Cientfico, CSIC) (Profesor de Investigacin, CSIC)
Pap, Mam por vosotros
Desde el barco nada parece peligroso, pero aqu con el agua bajo los pies, el fondo est muy oscuro y hace falta ser muy bueno para no hundirse Ray Loriga Hroes
Agradecimientos El presente trabajo, desarrollado en el Instituto de Recursos Naturales y Agrobiologa (Sevilla) y en el Centro de Investigaciones Biolgicas (Madrid), ambos del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas, se realiz con la financiacin de los proyectos AGL2002-00393 del Programa Nacional de Recursos y Tecnologas Agroalimentarias y QLK5-1999-01357 del V Programa marco de la Unin Europea.
Y ahora la parte ms difcil como agradecer a todos aqullos que de una
forma directa o indirecta han participado en esta Tesis, a todosgracias!!. Al Prof. ngel T. Martnez, al Dr. Jos Carlos del Ro y a la Dra. Ana
Gutirrez, directores de esta Tesis, por darme la posibilidad de participar en sus respectivos grupos de investigacin, lo que ha supuesto una gran experiencia a nivel profesional.
A la Dra. Mara Jess Martnez, por sus lecciones sobre microbiologa
que tanto me ayudaron en mis comienzos, por su complicidad y su apoyo con el que s que cuento.
Al Prof. Jess Jimnez-Barbero y a la Dra. M ngeles Canales del CIB,
CSIC, por los anlisis de NMR. A la Dra. Alicia Prieto del CIB, CSIC, por los anlisis de los polisacridos y cmo no, por su nimo y comprensin. Al Dr. Kenneth Hammel del Forest Products Laboratory (Madison, Wisconsin), agradecerle las interesantes discusiones sobre los cidos alquilitacnicos y los ensayos con el dmero de lignina. A Javier Romero (ENCE), por suministrarme la madera de eucalipto utilizada en esta Tesis. A los Drs. F. Javier Hidalgo y Rosario Zamora del Instituto de la Grasa, CSIC por sus consejos sobre TBARS.
A la Dra. Josefina Rodrguez, tutora de esta Tesis, por su ayuda con la
parte burocrtica. A mis compaeros del CIB, agradecerles su gran ayuda, tanto dentro
como fuera del laboratorio, a lo largo de estos cuatro aos. Agradecerles tambin, aquellas caas, cenas y dems eventos que hicieron que todo esto fuera ms llevadero. A los de antes y a los de ahora, a Vctor, Ana, Mara Jos, Vctor GT, Ana Aguilar. A Paco por las entretenidas discusiones
sobre TBARS, peroxidaciones y radicales; a Quique por sus clases magistrales sobre HPLC; a Mara por cederme aquellas unidades de VP cuando ya no me quedaba tiempo para nada; a Javi por amenizarnos las largas tardes con la magia del nitrgeno lquido; a Marta y Mariela por aquellos divertidos aquelarres en la calle Mjico; a mi mami Susana por su preocupacin tanto dentro como fuera del laboratorio y por sus buenos consejos sobre hongos, labores domsticas y otras cuestiones. A Patricia por su sentido prctico y porque me he redo mucho con ella. A Elvira por su sonrisa. A David por despertar mi faceta como psicoanalista y por ayudarme a ordenar mi desordenada cabeza y finalmente a Olga por su confianza, su sinceridad y porque siempre est ah. Agradecer tambin a mis compaeros del IRNAS especialmente a Isa, por su imprescindible ayuda y porque s que tengo una buena amiga en Sevilla.
A mis amigos con los que he pasado muy buenos momentos y me han
ayudado a superar los malos, a los de toda la vida, los de Ponferrada, porque ao tras ao siguen ah dispuestos a echarme un cable en cualquier momento. A los de Len, especialmente al abuelo y a las Mejores porque formamos una gran y divertida familia. A Ruth, Mara y Antonio, mis compis de piso, porque sin duda son los que ms me han sufrido con esta Tesis. Al Broncas por soportar estoicamente las largas y aburridas charlas sobre Tesis. A Asun y Vctor por esos das de playa, brandy y choco plancha y sin dudarlo, a Asun por su optimismo contagioso !!.
A mi familia de Sevilla por su acogida en mis mltiples y largas visitas. A Quique porque casi sin darme cuenta pas a ser una de las personas
ms importantes de mi vida. Gracias por ayudarme a superar mis limitaciones, por darme nimos cuando ya no me quedaban fuerzas para terminar esta Tesis y porque contigo todo es ms fcil y divertido!!.
A mi familia, mi padre por inculcarme su sentido comn que tanto me
ha ayudado, a mi madre por apoyarme en todos los momentos de mi vida, y por ensearme a utilizar la poca paciencia que tengo, a mi hermano porque le adoro, a mi abueli por su ilusin, y a la hermana que nunca tuve, Cuca, persona a la que le debo agradecer demasiadas cosas.
Abreviaturas
AAD aril-aldehdo deshidrogenasa AAO aril-alcohol oxidasa ABTS 2,2-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) AAI cido alquilitacnico AI cido itacnico ATCC coleccin de cultivos tipo de los EEUU (American Type Culture
Collection) BSTFA bis-(trimetilsilil)-trifluoroacetamida CBS coleccin de cultivos de hongos de los Pases Bajos
(Centraalbureau voor Schimmelcultures) DMP 2,6-dimetoxifenol ECF secuencia de blanqueo libre de cloro elemental (Elemental
Chlorine Free) coeficiente de extincin molar FID detector de ionizacin de llama (Flame Ionization Detector) GC cromatografa de gases (Gas Chromatography) GC/MS cromatografa de gases/espectrometra de masas (Gas
Chromatography/Mass Spectrometry) HBT 1-hidroxibenzotriazol HMBC correlacin heteronuclear a mltiples enlaces (Heteronuclear
Multiple Bond Connectivity) HPLC cromatografa lquida de altas prestaciones (High Performance
Liquid Chromatography) HSQC correlacin heteronuclear a un enlace (Heteronuclear Single
Quantum Coherence) IJFM coleccin de cultivos de hongos del Centro de Investigaciones
Biolgicas, del CSIC, procedente del antiguo Instituto Jaime Ferrn de Microbiologa
ITD detector de trampa de iones (Ion Trap Detector) L radical acilo L.A.S. lignina cido soluble LiP lignina peroxidasa LO radical alcoxilo LOO radical peroxilo LOOH hidroperxido MDA malondialdehdo
MnP manganeso peroxidasa NMR resonancia magntica nuclear (Nuclear Magnetic Resonance) rpm revoluciones por minuto SPE extraccin en fase slida (Solid Phase Extraction) SSF fermentacin en estado slido TAPPI Technical Association for the worldwide Pulp, Paper, and
converting Industry TBARS especies reactivas al cido tiobarbitrico TCF secuencia de blanqueo totalmente libre de cloro (Totally Chlorine
Free) TMSi grupo trimetilsililo U unidad enzimtica VP peroxidasa verstil
Contenido CAPTULO 1 INTRODUCCIN: COMPOSICIN QUMICA Y DEGRADACIN BIOLGICA DE LA LIGNOCELULOSA .................1
1. COMPOSICIN DEL MATERIAL LIGNOCELULSICO........... 3 1.1. Polisacridos........................................................................................3 1.2. Lignina..................................................................................................4 1.3 Fraccin extrable de la madera........................................................6
2. HONGOS DE LA MADERA .................................................................. 8 2.1. Hongos de podredumbre blanca .....................................................9 2.2. Hongos de podredumbre parda .......................................................9 2.3. Hongos de podredumbre blanda .....................................................9 2.4. Hongos que tien la madera.......................................................... 10
3. SISTEMA LIGNINOLTICO DE LOS HONGOS......................... 10 3.1. Enzimas ligninolticas ..................................................................... 10 3.2. Agentes de bajo peso molecular.................................................... 12 3.3. Biodegradacin de lignina: Un sistema multienzimtico........... 13
4. BIOTECNOLOGA EN LA INDUSTRIA PAPELERA................. 13 4.1. Fabricacin de pasta de papel........................................................ 13 4.2. Eliminacin de lignina y extrables de la madera........................ 15
5. OBJETIVOS GENERALES DE ESTE TRABAJO .......................... 17 CAPTULO 2 PATRONES DE TRANSFORMACIN DE LOS LPIDOS DE LA MADERA DE EUCALIPTO POR DIFERENTES HONGOS: DEGRADACIN DE ESTEROLES Y FORMACIN DE OXODERIVADOS............................................................................................ 19
1. INTRODUCCIN.................................................................................... 21
2. RESULTADOS .......................................................................................... 23 2.1. Degradacin de esteroles libres y esterificados por hongos
de podredumbre blanca y parda.................................................... 23 2.2. Evolucin de las cetonas esteroidales en madera
