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ESTUDIO HISTOLÓGICO E HISTOMORFOMÉTRICO CON BIOMATERIALES Y CÉLULAS
MADRE DE ORIGEN PULPAR EN MODELOS DE INESTABILIDAD
PERIIMPLANTARIA EN MINIPIG.
TESIS DOCTORAL
Doctorando: Alejandra Sáez López
Director: Manuel Fernández Domínguez
Codirector: Jorge Delgado Peña
2
3
Agradecimientos
Tengo que manifestar mi más sincero agradecimiento a todas las personas que durante
todo este tiempo me han apoyado en el desarrollo de mi Tesis Doctoral:
A mi director Manuel Fernández Domínguez, por prestarme su ayuda, por su interés, su
dedicación y por haber confiado en mí.
A mi padre, por ser mi ejemplo a seguir, por sus válidos consejos, por todo lo que
ambos tenemos pero solo los dos entendemos, y por enseñarme que el esfuerzo tiene
siempre una recompensa. Me siento muy orgullosa de ti.
A mi madre, por su infinita paciencia, por su optimismo, por transmitirme tanta calma
y por estar siempre a mi lado, en los buenos y en los malos momentos.
A mi hermano, al que echo de menos en tantos momentos, por su gran ayuda, sin él no
hubiera sido lo mismo.
A Nacho, por apoyarme siempre, por aportarme tanto, por completarme y hacerme feliz
día a día.
4
ÍNDICE
1. JUSTIFICACIÓN .............................................................................................................. 6
2. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 9
2.1 OSTEOINTEGRACIÓN ................................................................................................. 10
2.2 ENFERMEDAD PERIIMPLANTARIA .............................................................................. 13
2.3 BIOMATERIALES ........................................................................................................ 19
2.4 CÉLULAS MADRE ....................................................................................................... 27
2.4.1.- Clasificación de las células madre ........................................................................... 27
2.4.2.- Perspectivas clinicas de tratamiento en el ambito odontologico de las celulas madre
de origen dental ........................................................................................................................... 34
2.4.3.- Perspectivas clinicas de tratamiento en el ambito medico de las celulas madre de
origen dental ................................................................................................................................ 39
2.5 REGENERACION DENTINARIA..................................................................................... 43
3. OBJETIVOS .................................................................................................................. 49
4. MATERIAL Y MÉTODO ................................................................................................. 51
4.1 MATERIAL ................................................................................................................. 52
4.1.1.- Quirófano ......................................................................................................................... 52
4.1.2.- Material Quirúrgico ......................................................................................................... 52
4.1.3.- Implante ........................................................................................................................... 54
4.1.4.- Biomaterial....................................................................................................................... 56
4.1.5.- Membrana ........................................................................................................................ 57
4.1.6.- Ostell ................................................................................................................................ 57
4.1.7.- Animal de experimentación ............................................................................................. 60
4.2 MÉTODO ................................................................................................................... 63
4.2.1.- Protocolo anestésico: ....................................................................................................... 63
4.2.2.- Extracciones dentarias ..................................................................................................... 65
4.2.3.- Obtención de células madre ............................................................................................. 66
4.2.4.- Colocación de implantes .................................................................................................. 70
4.2.5.- Descripción del modelo experimental ............................................................................. 76
4.2.6.- Metodología experimental ............................................................................................... 81
4.2.6.1 Preparación de las muestras .................................................................................... 81
4.2.6.2 Técnica de histomorfometría ................................................................................... 85
4.2.6.3 Análisis estadístico de resultados ............................................................................ 91
4.2.6.4 Técnica de evaluación histológica ........................................................................... 91
5. RESULTADOS ................................................................................................................. 95
5.1. TÉCNICA DE EVALUACIÓN HISTOMORFOMÉTRICA MEDIANTE MICROSCOPÍA SEM ......... 96
5.2. TÉCNICA DE EVALUACIÓN HISTOLÓGICA MEDIANTE MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA
....................................................................................................................................... 106
5
5.3 FORMACIÓN DE DENTINA: ....................................................................................... 111
6. DISCUSIÓN .................................................................................................................. 113
7. CONCLUSIONES ............................................................................................................ 133
8. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................. 135
9. ANEXOS ....................................................................................................................... 147
9.1 ÍNDICE DE FIGURAS ...................................................................................................... 148
9.2 ÍNDICE DE TABLAS ....................................................................................................... 150
6
1. JUSTIFICACIÓN
7
La implantología constituye hoy en día la práctica terapéutica más utilizada para la
rehabilitación de pacientes total o parcialmente edéntulos, proporcionándonos un
elevado porcentaje de éxito (97%), evitando además problemas de asentamiento y
adaptación de prótesis removibles y mejorando la calidad de vida de los pacientes en
cuanto a estética y función se refiere.
Los implantes además nos aportan numerosos beneficios como la posibilidad de
conservar el nivel óseo de las zonas edéntulas, la capacidad de rehabilitar mediante
prótesis fijas, sustituyendo así a las prótesis removibles y evitan tener que dañar los
dientes adyacentes mediante el tallado de los mismos para la posterior colocación de
puentes.
Pese a todas estas ventajas, es importante destacar que existen una serie de limitaciones
a la hora de rehabilitar con implantes, como son aspectos económicos, anatómicos y
fisiológicos.
El odontólogo desempeña un papel fundamental para evitar el fracaso de los implantes.
Por ello, es necesario que, antes de la cirugía, el profesional establezca una planificación
correcta del número, tamaño y situación de los mismos, así como del diseño de la
prótesis con la que va a rehabilitar al paciente.
La supervivencia de los implantes puede verse comprometida por la enfermedad
periimplantaria, la cual engloba dos conceptos; por un lado la mucositis, que es la
inflamación de la mucosa que rodea a los implantes y, por otro lado, la periimplantitis,
inflamación de los tejidos blandos alrededor de los implantes que produce una pérdida
ósea que puede dar lugar al fracaso y por tanto, a la pérdida de los mismos.
La etiología de la periimplantitis es multifactorial y clínicamente se caracteriza por la
presencia de placa bacteriana y cálculo alrededor de los implantes, aumento de la
profundidad de sondaje, sangrado, signos radiológicos de reabsorción ósea, movilidad
del implante, destrucción ósea vertical en relación con la bolsa periimplantaria y
presencia de dolor.
El tratamiento se basa en reducir e intentar eliminar la destrucción ósea y llevar a cabo
la regeneración de los tejidos dañados o perdidos.
8
Nuestra línea de investigación con células madre de la pulpa dental, está dirigida a
determinar la capacidad regenerativa de estas células para reparar defectos óseos
debidos a reabsorciones y atrofias consecutivas a la periimplantitis.
Con los resultados obtenidos se pretende dar un mayor conocimiento de los procesos
implicados en la osteointegración de los implantes, desde la fase quirúrgica hasta la
conexión hueso-implante y el inicio de la fase protésica.
Además, se podrán desarrollar protocolos clínicos y quirúrgicos que faciliten la
evolución de las técnicas de ingeniería de tejidos y el desarrollo de nuevos biomateriales
que aseguren el éxito de los tratamientos.
9
2. INTRODUCCIÓN
10
2.1 OSTEOINTEGRACIÓN
La osteointegración de los implantes fue definida por Bränemark en 1977 como la
conexión estructural y funcional entre el hueso y la superficie del implante sometido a
carga1.
En 1986 Tomas Albrektsson, propone una serie de postulados que resumen los
principales criterios de éxito de los implantes:
El implante no debe presentar movilidad cuando se explora clínicamente.
La radiografía no mostrará ninguna evidencia de lesión radiolúcida
periimplantaria.
La pérdida ósea vertical anual debe ser inferior a 0,2 mm después del primer año
de la puesta en función del implante.
Ausencia de signos persistentes o irreversibles tales como el dolor, infección,
parestesias, neuropatías o lesión del conducto dentario inferior.
Existencia de un mínimo porcentaje de éxito del 85% a los 5 años y del 80% a
los 10 años.
Zarb comparte con Albertksson todos los criterios de éxito, matizando el objetivo tanto
estético como funcional que los implantes deben cumplir, destacando así la importancia
de las prótesis con las que se rehabilitarán dichos implantes 2.
Por otro lado, C. Kathan y J. del Río propusieron una serie de parámetros clínicos y
radiográficos para evaluar la osteointegración de los implantes y su relación con los
tejidos:
1. Torque de inserción:
El requisito previo fundamental para el éxito de la osteointegración es la
estabilidad primaria, que viene definida como la ausencia de movimiento de un
implante tras su inserción quirúrgica y depende de una serie de factores como la
técnica quirúrgica, la geometría, longitud, diámetro y superficie del implante; así
como de la densidad ósea del lecho 3.
Chiapasco propuso que el torque de inserción era un método fiable para
determinar la estabilidad primaria, y sostuvo que se puede considerar como
torque de inserción óptimo aquellos valores que oscilan entre 35-50 N 4,5
.
11
2. Dolor:
El dolor es uno de los primeros signos clínicos que indican fracaso
implantológico y puede ser percibido de manera espontánea por el paciente o
mediante percusión clínica o al aplicar el test de torque.
3. Percusión:
La percusión no es un método diagnóstico cuantificable, pero la experiencia
clínica demuestra que nos proporciona una gran ayuda a la hora de valorar la
pérdida de osteointegración, ya que al percutir los implantes lateralmente con el
mango de un espejo percibimos un sonido determinado que nos ayudará a
identificar el implante con patología o pérdida ósea 6.
4. Movilidad o Test de Torque:
La movilidad también es otro signo clínico que indica fracaso en la
osteointegración, pero, en ocasiones, es difícil detectarla, ya que un mínimo
contacto de hueso-implante puede evitar que aparezca movilidad, haciendo que
ésta pase desapercibida hasta estados avanzados de pérdida ósea
periimplantaria7.
El test de torque es el método más común para evaluar la movilidad del
implante, aunque no debe realizarse nunca en etapas tempranas de
osteointegración para no obtener falsos positivos y para no interferir en la unión
hueso-implante. Se realiza mediante llaves dinamométricas manuales o
instrumental rotatorio y se recomienda no usar fuerzas superiores a 20N 8
.
5. Sondaje:
Las diferencias con respecto a la composición, organización y unión de los
tejidos blandos al diente o al implante, hacen que la sonda penetre más
profundamente alrededor de implantes que en dientes naturales.
Además, un implante totalmente sano permite una profundidad de sondaje de
hasta 4 mm 7
.
Sin embargo, son muchos los autores contrarios al sondaje sistemático de los
implantes ya que consideran la posibilidad de introducir bacterias en los tejidos
periimplantarios favoreciendo así su colonización, además de poder separar el
12
epitelio de unión de la superficie del implante y de dañar dicha superficie. Por
todo ello, se recomienda el uso de sondas de plástico específicas 9,10,11
.
6. Mucosa queratinizada:
Existe gran controversia sobre la importancia de la presencia o no de encía
queratinizada alrededor de los implantes. Lo que la literatura sugiere, es que la
ausencia de encía puede aumentar la susceptibilidad de los tejidos
periimplantarios en presencia de placa bacteriana 12
.
7. Índices de placa / índices gingivales:
Dado que es evidente que existe una clara relación entre la higiene oral y la
reabsorción ósea, son varios los autores que proponen que los índices de placa y
gingivales pueden ser utilizados para valorar la higiene oral y el grado de
inflamación de los tejidos periimplantarios 13
.
8. Radiología:
La radiología es de gran utilidad para valorar la osteointegración de los
implantes, ya que detecta tanto la continuidad del hueso-implante, como la
pérdida ósea vertical y horizontal.
Se considera importante el dato de que la pérdida ósea vertical no debe ser
mayor a 1,5 mm antes de la carga protésica.
Para valorar la reabsorción ósea, se deben realizar radiografías periapicales ya
que son las radiografías simples que mayor precisión aportan 14,15
.
9. Análisis de la frecuencia de resonancia (Ostell)
Meredith y cols. fueron quienes introdujeron esta técnica como un método
diagnóstico capaz de valorar y monitorizar la estabilidad de los implantes antes
de ser sometidos a carga, mediante la medición de la frecuencia de resonancia
con un pequeño transductor unido al implante.
Las frecuencias de sonido se miden en valores ISQ (coeficiente de estabilidad
implantaria), que están condicionados por la pérdida ósea y el tipo de hueso 16,17
.
13
Robert y cols. consideraron que la estabilidad del implante era el factor más importante
para el éxito terapéutico en el momento de establecer la carga. Por lo tanto, es necesario
esperar un tiempo determinado para que el implante se haya osteointegrado.
Bränemark y Adell propusieron un protocolo quirúrgico en el que se consideraba como
tiempo ideal de osteointegración de 3 a 6 meses para poder someter el implante a carga.
Sin embargo, los avances en implantología y biomateriales de los últimos años, han
dado lugar a una reducción considerable del tiempo de osteointegración.
Hoy en día no existe un protocolo establecido para determinar el momento de la puesta
en función del implante 18
.
Sin embargo, se debe tener en cuenta la técnica de carga inmediata de los implantes, la
cual ha sufrido modificaciones en su definición:
En el ITI Consensus del 2004 se definió como la carga de los implantes al
menos 48 horas después de la cirugía, con contacto oclusal.
En el EAO Consensus del 2006, se definió como la carga en las siguientes 72
horas después de la cirugía, con contacto oclusal.
Y, por último, en la Cochrane Review del 2009, y en el ITI Consensus del 2014,
se definió como la carga de dichos implantes hasta una semana después de la
cirugía, con o sin contacto oclusal.
2.2 ENFERMEDAD PERIIMPLANTARIA
El fracaso de los implantes puede ocurrir en dos momentos diferentes, por lo que
podemos hablar de pérdida prematura del implante, cuando éste aún no ha llegado a
osteointegrarse, antes de haber sido sometido a carga, lo cual es debido a diferentes
factores de riesgo como la ausencia de estabilidad primaria, contaminación bacteriana,
enfermedades sistémicas, el tabaco, mala técnica quirúrgica, mala calidad ósea etc.
Y, por otro lado, la pérdida del implante una vez sometido a carga, cuyo factor
etiológico fundamental es la infección bacteriana y la sobrecarga oclusal 19,20
.
14
La enfermedad periimplantaria se caracteriza por la inflamación de los tejidos
periimplantarios y engloba dos términos bien diferenciados que se definieron en el
Workshop Europeo de Periodontología conducido por la Federación Europea de
Periodontología (Suiza 1993) 21
:
1. MUCOSITIS
Se define como inflamación reversible de los tejidos blandos que rodean a un implante
en función y es considerada como el punto de partida de la periimplantitis. Su clínica se
caracteriza principalmente por presencia de placa, edema, enrojecimiento, sangrado,
exudado y ausencia radiológica de reabsorción ósea 22
.
2. PERIIMPLANTITIS
Es la inflamación irreversible de los tejidos blandos que rodean al implante en función,
en el que además se produce una reabsorción ósea que puede dar lugar a la pérdida del
mismo 22
.
Ilustración 1: Periimplantitis (Dr. Ferrus y Bratos)
15
La periimplantitis se clasifica según Jovanovich y Spiekerman (1995) en 4 tipos
diferentes 23
:
1. Clase 1: Moderada pérdida ósea horizontal con mínimo componente
intraóseo.
2. Clase 2: Moderada-avanzada pérdida ósea horizontal con mínimo
componente intraóseo.
3. Clase 3: Moderada pérdida ósea horizontal con avanzada lesión intraósea
circunferencial.
4. Clase 4: Severa pérdida ósea horizontal y avanzada lesión intraósea
circunferencial y pérdida de la pared lingual o vestibular.
Dicha clasificación es muy similar a la de los defectos óseos periimplantarios propuesta
por Carranza. (2002) 24
La etiología de la periimplantitis es multifactorial, (sobrecarga mecánica, alteraciones
en los tejidos periimplantarios, diseño de la superficie del implante…) aunque se
considera que el factor etiológico fundamental es la infección por bacterias patógenas de
la placa bacteriana, en concreto de las bacterias Gram-, (bacilos móviles, fusiformes y
espiroquetas) 25,26
.
La clínica de esta patología se basa principalmente en un enrojecimiento de la mucosa
periimplantaria, sangrado al sondaje, pérdida radiológica de la altura ósea
periimplantaria, aumento de la profundidad de la bolsa, en ocasiones supuración, dolor,
y movilidad progresiva del implante 27
.
Así, es de especial importancia destacar, que cuando la periimplantitis se debe a un
proceso infeccioso, se detectará la presencia de las bacterias Gram-, supuración,
aumento de la profundidad y sangrado al sondaje así como dolor, mientras que, si se
trata de una periimplantitis por sobrecarga biomecánica, habrá ausencia de estas
bacterias, así como de supuración y signos inflamatorios, pero habrá evidencia de
ensanchamiento radiológico del espacio periimplantario y de pérdida de la altura ósea.
16
Respecto al diagnóstico de la periimplantitis, es importante destacar, que se debe
realizar un examen periódico anual, con el fin de identificar la enfermedad, plantear el
tratamiento a seguir y establecer un programa de mantenimiento adecuado para cada
paciente.
Así, el profesional debe realizar:
1. Examen clínico: Retirar las prótesis, comprobar la higiene, inspección y
palpación de los tejidos blandos, sondaje y percusión con mango del espejo.
2. Examen radiológico: Nos permite valorar el tejido óseo periimplantario para
detectar las reabsorciones del hueso.
3. Examen microbiológico: Nos permite detectar la presencia de determinados
patógenos mediante el cultivo de una muestra del exudado periimplantario o
mediante la obtención del fluído del surco periimplantario 28,29,30
.
Por lo tanto, el diagnóstico de la periimplantitis quedó definida en los Proceedings of
the 3rd European Workshop on Periodontology, como la presencia de los siguientes
signos clínicos 21
:
Existencia radiológica de reabsorción ósea vertical, que comienza en la porción
coronal del implante, manteniéndose la zona apical rodeada de hueso.
Formación de bolsas periimplantarias.
Sangrado después del sondaje, pudiendo acompañarse de supuración de la bolsa.
Inflamación, enrojecimiento, hiperplasia y tumefacción de los tejidos blandos
periimplantarios.
Frecuente ausencia de dolor, haciendo pasar desapercibida la enfermedad.
En cuanto al tratamiento de la periimplantitis, podemos hablar de dos tipos muy
diferenciados:
En primer lugar, el tratamiento no quirúrgico, que consiste en la aplicación tópica de
antibióticos como la Minociclina y en la detoxificación del implante, la cual se lleva a
cabo mediante spray abrasivo, ácido cítrico, clorhexidina y suero salino para disminuir
la carga bacteriana sin que la superficie del implante resulte dañada.
17
El Láser Er:YAG y CO2 también pueden ser utilizados como método de
descontaminación y así como los ultrasonidos con puntas de fibra de carbono.
En segundo lugar, el tratamiento quirúrgico, el cual debe ser lo más conservador
posible, donde destaca:
1. Cirugía resectiva: Ante la presencia de defectos horizontales y defectos
moderados (menos de tres milímetros), se deberá realizar un colgajo de
reposición apical y la remoción del tejido de granulación, para así llegar a
reducir la profundidad de sondaje y facilitar la higiene oral 31
.
Algunos autores como Sánchez y Gay recomiendan, que además de las técnicas
de cirugía resectiva se recurra a la implantoplastia, que consiste en la
modificación de la superficie del implante mediante una fresa para pulir las
superficies rugosas y disminuir la capacidad de adherencia bacteriana 32
.
2. Cirugía regenerativa: Incluye los procedimientos quirúrgicos de regeneración de
los defectos óseos severos (pérdidas óseas verticales o circunferenciales).
Para ello se mezclará hidroxiapatita de origen animal o sintético con hueso
autólogo, y se colocará en la zona a regenerar mediante una membrana
reabsorbible, con su posterior cierre primario con sutura 33
.
Por último, es importante destacar la existencia de dos protocolos muy establecidos para
el tratamiento de la periimplantitis.
En primer lugar, el Cumulative Interceptive Supportive Therapy (CIST) de Lang y cols.
(2000) 14
, en el que se distinguen tres tipos de tratamiento según la profundidad de la
bolsa:
Bolsa menor o igual a tres milímetros: El implante no precisa tratamiento, pero
si además tuviera placa o sangrado asociados al sondaje, se deberían dar
instrucciones de técnicas de higiene y realizar un desbridamiento con curetas
plásticas para disminuir eliminar el cálculo.
Bolsas de cuatro o cinco milímetros: Se realizará lo descrito anteriormente
además de desbridamiento con antiséptico.
18
Bolsas mayores de cinco milímetros: Se deberá realizar una radiografía para
poder valorar la existencia de pérdida de hueso. Si no hay pérdida ósea, se
realizará únicamente todo lo anteriormente descrito.
Si la pérdida ósea es menor o igual a dos milímetros, se aplicarán antibióticos
locales o sistémicos, mientras que, si es mayor, se llevarán a cabo técnicas de
cirugía resectiva o regenerativa.
En segundo lugar, el Protocolo de Mombelli (2002) 34
, en el que se valoran diferentes
parámetros empezando por la movilidad y se indica, que en el caso en el que el implante
sufriese dicha movilidad, éste debería ser explantado. Si no existen indicios de
movilidad, se deben sondar los tejidos periimplantarios.
Sondaje inferior o igual a tres milímetros: El implante no precisa tratamiento,
pero si además hubiera signos de inflamación, se debería llevar a cabo el
tratamiento típico de la mucositis, el cual consiste en enseñar técnicas de higiene
oral, descontaminar con clorhexidina y manejar los tejidos blandos.
Sondaje mayor a tres milímetros: Se debe realizar una radiografía y si no hay
signos evidentes de pérdida ósea, realizar todo lo anteriormente descrito. En el
caso de que haya pérdida ósea, tendremos que proceder a valorar la profundidad
del defecto.
Si es poco profundo, añadiremos al tratamiento agentes antibacterianos, pero si
es profundo, llevaremos a cabo las técnicas de cirugía resectiva o regenerativa y
la administración de antibióticos sistémicos en el caso en el que el defecto sea
profundo y además generalizado.
19
2.3 BIOMATERIALES
Los biomateriales son utilizados para reproducir la función de los tejidos vivos en los
sistemas biológicos de forma segura. Son implantados en el cuerpo de manera temporal
o permanente y tratan de restaurar el defecto existente y, en algunos casos, de conseguir
la regeneración tisular.
No deben producir ninguna alteración en el tejido donde se insertan, es decir, deben ser
biocompatibles. Aún así, existe gran diversidad de biomateriales como metales,
cerámicas, vidrios, acero, otras aleaciones metálicas, polímeros, tejidos biológicos
modificados, etc.
Dentro de los biomateriales utilizados para regeneración ósea, se distinguen los de
relleno o injerto, que son productos biológicos que rellenan defectos óseos; y los de
aislamiento o barrera, que son materiales naturales o sintéticos que actúan como barrera
evitando así que ciertos tipos celulares invadan un espacio concreto, y favoreciendo la
proliferación de grupos celulares específicos.
Según Rosenberg y Rose, los requisitos que deben cumplir los biomateriales son los
siguientes 35
:
1. Biocompatibilidad: Tolerancia de dicho material, su bioestabilidad, así como el
mantenimiento de sus propiedades y estructura durante el tiempo que se
encuentren en el organismo.
2. No ser tóxico.
3. Resistente a las infecciones.
4. No deberá producir reabsorción de la raíz de una pieza dentaria o anquilosis.
5. Debe ser fuerte y elástico (resilente)
6. Debe ser fácilmente adaptable, de obtención rápida y cantidad necesaria.
(Diseño, tamaño y forma adecuados)
7. Deberá necesitar un procedimiento quirúrgico mínimo para su colocación.
La neoformación ósea viene mediada por tres procesos básicos, que pueden suceder de
manera aislada o simultáneamente en función del material de reconstrucción
utilizado36,37.
20
1. Osteogénesis: Síntesis de hueso mediada por el trasplante de células vivas en el
material de relleno, que llevan a cabo la regeneración ósea de forma directa.
Este mecanismo es propio de los autoinjertos y tiene lugar a lo largo de las
primeras cuatro semanas.
2. Osteoinducción: Capacidad de algunos materiales de liberar determinadas
sustancias denominadas osteoinductoras, las cuales inducirán la formación de
hueso por un mecanismo endocondral en zonas alejadas del margen del lecho
receptor.
Las proteínas morfogenéticas (BMPs), presentan un mecanismo puro de
osteoinducción, obviando así la necesidad de usar hueso autógeno, mejorando
además la angiogénesis, cicatrización ósea y cartilaginosa.
El descubrimiento de estas proteínas morfogenéticas óseas, ha despertado un
gran interés por sus posibles aplicaciones clínicas, tanto para promover la
regeneración ósea como periodontal.
En la actualidad, se han conseguido mediante técnicas de clonación, seis
proteínas morfogenéticas óseas denominadas BMP-2 a BMP-7, las cuales
forman parte de la subfamilia del factor de crecimiento beta transformador
(TGF-β) 38
.
La BMP-2 induce la diferenciación de los osteoblastos para producir proteínas
de la matriz ósea. La BMP-3 (osteogenina) estimula preferentemente la
formación de cartílago antes que la formación ósea. Las BMP-5, 6 y 7 actúan
sobre la BMP-2 potenciando la formación ósea in vivo, aunque de forma
individual poseen escasa capacidad para inducir la formación ósea.
Entre los inconvenientes que presentan las BMP, están la forma de manejo y la
dispersión tras su aplicación clínica 39
.
La osteoinducción es propia de los aloinjertos y comienza a las dos semanas y
alcanza su máximo nivel entre las seis semanas y seis meses posteriores.
21
3. Osteoconducción: Proceso por el cual el material inorgánico implantado ofrece
una matriz (andamiaje de formación ósea) para el crecimiento de células óseas
progenitoras desde los márgenes del defecto. Dicho material podrá ser
permanente o reabsorbible.
Este proceso es propio del hueso autólogo y alogénico, hidroxiapatita,
xenoinjertos y cristales bioactivos.
Clasificación de los biomateriales:
Según su origen pueden ser clasificados como 40
:
1. Injertos Autólogos o Autógenos (Autoinjertos):
Es hueso obtenido del propio paciente y es el único con capacidad osteogénica,
osteoinductora y osteoconductora. Es el material de elección por su capacidad
osteogénica, su nula capacidad antigénica, es decir, que evita la transmisión de
enfermedades y el rechazo inmunológico, y porque proporciona los resultados
más rápidos y predecibles en relación con la calidad y cantidad del hueso
resultante.
Sin embargo, entre sus desventajas destacaría su limitada disponibilidad, la
morbilidad de las áreas donantes, su difícil almacenamiento y su tendencia a la
reabsorción.
Respecto a su limitada disponibilidad es importante destacar, que en el caso de
usarse para relleno de cavidades relativamente grandes, se puede mezclar con
otros biomateriales.
La elección de la zona donante debe basarse en el tipo y la cantidad de hueso
necesario, el acceso a dicha zona donante, el tiempo que requiera la intervención
y el coste. Así, el injerto autógeno se obtiene de diferentes zonas intraorales,
como del mentón, de la tuberosidad del maxilar o de la rama ascendente, así
22
como de zonas extraorales como de la cresta ilíaca, de la tibia, de la calota o de
las costillas cuando necesitemos un volumen de injerto óseo mayor.
El hueso autógeno esponjoso es el que tiene mayor capacidad osteogénica y los
injertos corticales son los que proporcionan mayor estabilidad.
2. Injertos homólogos, Alogénicos o Aloinjertos:
Proceden de individuos de la misma especie, pero genéticamente diferentes.
Entre sus ventajas destacan su amplia disponibilidad, en diferentes formas y
tamaños, la ausencia de morbilidad de las zonas donantes y su potencial
osteoinductor y osteoconductor.
Sus desventajas se relacionan con la calidad del nuevo tejido óseo, el cual no
siempre es previsible, así como la necesidad de un procesado para la eliminación
de su capacidad antigénica.
Se distinguen tres tipos: Congelados, desecados (liofilizados) y
desmineralizados.
3. Injertos heretólogos o Xenoinjertos:
Consiste en hueso de otra especie, es decir, de origen animal, generalmente
bovino.
Entre sus ventajas destacan la nula reacción inflamatoria, su alta
biocompatibilidad y su potencial osteoconductor.
Sin embargo, supone un proceso de elaboración costoso y carece de potencial
osteoinductor.
Además, es importante destacar, que el uso de este tipo de injerto proporciona
grandes ventajas en zonas de alta demanda estética, ya que sirve como apoyo del
tejido blando.
23
4. Injertos aloplásticos o sintéticos:
Son aquellos que se obtienen de materiales de origen sintético.
Se encuentran en gran variedad de texturas, formas, y tamaños, no generan
problemas de transmisión de enfermedades y su principal mecanismo de acción
es la osteoconducción. Además, tienen una disponibilidad ilimitada, fácil
manejo, alto nivel de calidad y almacenamiento sencillo.
Para favorecer la capacidad osteoconductiva de estos materiales, es necesario
que posean una notable porosidad que permita la vascularización y que
dispongan de un área de adherencia a las células osteogénicas.
Se clasifican en tres tipos: Cerámicas, polímeros y composites.
Membranas y plasma rico en factores de crecimiento:
Las membranas de regeneración ósea guiada se utilizan para mantener los injertos en su
posición y para evitar que los tejidos blandos circundantes interfieran en la cicatrización
ósea. Actúan, por lo tanto, como sistemas barrera, protegiendo el material de relleno del
medio oral, que es lo que se conoce como osteopromoción, o sellado por medios físicos
de un espacio anatómico.
Si se utiliza un injerto de hueso autólogo para el relleno de un defecto óseo, se podrá
añadir además una membrana de manera opcional para estabilizar y mantener en su
posición ideal a dicho injerto; aunque si el colgajo mucoperióstico queda intacto y cubre
por completo el defecto, no será necesario el uso de la membrana.
Sin embargo, en el caso de que se empleen materiales aloplásticos, sí será recomendable
el uso de una membrana.
Estas membranas pueden ser reabsorbibles por el organismo o no reabsorbibles, por lo
que es necesaria su remoción, lo que conlleva una segunda cirugía.
Por otro lado, la mezcla de estos injertos con plasma rico en factores de crecimiento,
acelera la regeneración ósea y la cicatrización de los tejidos blandos, ayuda a promover
24
la osteogénesis, disminuye la reabsorción postoperatoria y además, elimina la
posibilidad de transmisión de enfermedades y reacciones inmunológicas asociadas a los
preparados alogénicos y xenogénicos.
Hidroxiapatita:
La hidroxiapatita es el principal componente mineral del hueso, y también se puede
encontrar en la dentina y en el esmalte dental.
Es un material cerámico de fosfato de calcio, que se puede obtener de forma sintética,
totalmente biocompatible, ya que no produce toxicidad local ni sistémica, con
estabilidad química y propiedades bioactivas y osteoconductoras 41
.
Frame fue quien estudió la biocompatibilidad de la hidroxiapatita en animales de
experimentación, y Denissen y Kent lo hicieron en seres humanos, lo que dió lugar a
numerosos avances en el campo de la implantología y en el de la investigación.
El Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CENIT), comenzó desde el año 1986
a obtener hidroxiapatita densa y porosa a partir de la transformación química de los
corales porites-porites, seleccionados por oceanólogos.
La hidroxiapatita se puede encontrar en forma de bloques o gránulos y tiene un carácter
iónico que hace que se trate de un material duro, refractario, con un punto de fusión
mayor a 1500 ºC.
Respecto a su clasificación se puede hablar de Bovina (BioOss®)
, Equina, Coralina
(ProOsteon®)
, Ficógena y Sintética (cerámica/ no cerámica)
Marcas comerciales:
OsteoGraf/N: Hidroxiapatita reabsorbible obtenida mediante métodos físicos.
Biocompatible, macro y microporosa.
OsteoGen: Hidroxiapatita no cerámica, reabsorbible, altamente hidrofílica.
Calcitite: Hidroxiapatita cerámica, no reabsorbible compuesta por partículas de
forma esférica.
25
Osteo Biol
BioOss®
Entre sus amplias indicaciones destacan: aumento de los rebordes alveolares atróficos,
mejora del contorno de los tejidos blandos en implantes, recubrimiento de superficies
metálicas en implantes, liberación de medicamentos, preservación alveolar y relleno de
defectos óseos producidos por quistes, tumores y traumatismos.
Como ventajas se puede decir que la hidroxiapatita es un material de fácil manipulación
y obtención, baja morbilidad y que mantiene el contorno y volumen óseos; sin embargo,
como principal desventaja destaca su poca resistencia mecánica.
Respecto a la esterilización y conservación de la hidroxiapatita conviene matizar que:
Se presenta estéril en frascos de cristal, por lo que debe conservarse de esta
forma a temperatura ambiente.
No usar una vez abierto el frasco estéril. En este caso esterilizar nuevamente en
autoclave a temperatura de 123º C.
La fecha de vencimiento escrita en el frasco está referida al tiempo calculado de
duración de la esterilización inicial, pero el producto no se descompone, degrada
ni altera sus características, composición o propiedades, por lo que se puede
volver a esterilizar.
No usar el biomaterial si cambia su color blanco
Además, la hidroxiapatita tiene una muy fácil manipulación. La apertura del
frasco se deberá llevar a cabo encima de una mesa de instrumental estéril y su
contenido se depositará en una batea y se mezclará con suero salino. No se
recomienda combinarlo con soluciones antisépticas ni medicamentos de uso
tópico. La manipulación se realizará mediante el empleo de curetas y la cantidad
utilizada dependerá del tamaño del defecto óseo a rellenar.
26
Por último, el procedimiento clínico consiste básicamente en:
Preparación del lecho receptor: El biomaterial debe contactar con hueso sano. En
aquellos casos en los que haya infección previa, debe eliminarse el tejido
lesionado para garantizar un lecho receptor "limpio".
Colocación del biomaterial: Relleno del defecto óseo con hidroxiapatita
Observar la más estricta asepsia y antisepsia.
Permitir la presencia de sangre en el sitio de implante para garantizar su mezcla
con el biomaterial.
Rellenar todo el defecto óseo con el biomaterial, pero sin comprimir.
No pulverizar el biomaterial.
Impedir la presencia de gránulos o partículas del biomaterial en los tejidos
adyacentes.
Aplicación de antibióticos.
27
2.4 CÉLULAS MADRE
El término célula madre, en inglés stem cell, fue acuñado por Alexander Maksimov en
1909 al referirse a un tipo de células hematopoyéticas capaces de migrar hasta pequeños
nichos donde eran capaces de diferenciarse en diferentes células de estirpe sanguínea 42
.
La definición de stem cell hace referencia a un tipo de célula indiferenciada capaz de
renovarse a sí misma en nuevas células idénticas y de forma indefinida, y de
diferenciarse a otras estirpes celulares especializadas.
Los primeros intentos de uso terapéutico en humanos datan de la década de los 50,
cuando se administraron por vía oral concentrados de médula ósea para el tratamiento
de algunas patologías, sobre todo leucemias.
Ya en los años 60 se produjo en EEUU el primer trasplante de médula ósea en
humanos, en el que se usaban células madre hematopoyéticas para el tratamiento de
enfermedades sanguíneas, en lo que fue el primer tratamiento exitoso llevado a cabo
mediante células madre.
En 1978 se descubren por primera vez las células madre del cordón umbilical, y en 1981
se consigue crear la primera línea celular in vitro a partir de células de ratón.
Ya en los últimos años los avances en este campo han sido muy amplios, reconociendo
nuevos nichos celulares, y ampliando su capacidad de crecimiento y diferenciación, lo
que abre un extenso campo de investigación para su futuro uso en medicina
regenerativa, en el tratamiento de enfermedades tan dispares, pero de gran impacto
social y médico como el cáncer o la enfermedad de Alzheimer.
2.4.1.- Clasificación de las células madre
Actualmente se conocen diversos tipos de stem cell, que se caracterizan y se clasifican
en función de varios criterios, aunque la clasificación más utilizada y admitida es la que
las divide en función de su capacidad de división.
Las células madre totipotenciales son aquellas con capacidad para diferenciarse en
cualquier estirpe celular del organismo, incluyendo la placenta y el cordón umbilical.
Únicamente el zigoto, la célula resultante de la unión de óvulo y espermatozoide tiene
esta capacidad.
28
Las células madre pluripotenciales son aquellas que tienen la capacidad de diferenciarse
en cualquier célula de las 3 capas germinales embrionarias, esto es, endodermo,
mesodermo y ectodermo. Sin embargo, no pueden dar origen a células
extraembrionarias tales como las placentarias. Están presentes en los embriones durante
el desarrollo más temprano del mismo, es decir en sus primeros días, cuando todavía
recibe el nombre de blastocisto.
El uso de estos dos tipos celulares anteriormente nombrados, requiere de la utilización
de embriones, lo cual ha reducido su uso hasta ahora a animales en experimentación,
debido a los conflictos éticos que originaría la utilización de embriones humanos con
fines terapéuticos, por lo que en la actualidad, y a pesar de su mayor potencial de
diferenciación y crecimiento, los estudios con estas estirpes celulares no están
permitidos.
Actualmente se trabaja en un nuevo campo de investigación, el de las células madre
pluripotenciales que son creadas por ingeniería genética a partir de células
mesenquimales adultas, son las iPS cells. Estas células fueron creadas por primera vez
en el año 2006 por Takahashi y cols., quienes a partir de fibroblastos de ratón y la
inducción por una serie de factores de desarrollo, lograron que estas células, una vez
transferidas in vivo, generasen nuevas células de las 3 capas embrionarias. Así mismo si
eran transferidas a un embrión, ayudaban al desarrollo del mismo 43
.
Las células madre multipotenciales son aquellas con capacidad para diferenciarse en
una o más de una estirpe celular, pero nunca en todas ellas. Son conocidas también
como células madre adultas, aunque se hayan tanto en el período fetal como en la edad
adulta, en diferentes nichos repartidos por el organismo. Se encuentran en piel, folículos
pilosos, tejido adiposo, páncreas, médula ósea, y en recientes estudios se han
identificado en tejidos dentarios y peridentarios como la pulpa dental, el ligamento
periodontal, el saco folicular de dientes en formación o la papila dental.
Estas células además de tener limitado su rango de diferenciación, son incapaces de
dividirse de una forma indefinida como células indiferenciadas, como sí pueden hacer
las toti y pluripotenciales.
29
A este tipo celular pertenecen entre otras, las células madre mesenquimales de la
médula ósea, hasta ahora las más estudiadas y utilizadas en tratamientos y estudios
experimentales, así como las células madre de la pulpa dental.
Ilustración 2: Clasificacion células madre
Células madre de origen dental. Clasificación y características.
Las células madre de la pulpa dental, con sus siglas en inglés Dental Pulp Stem cells
(DPSC) fueron descubiertas por primera vez por Gronthos y cols. en el año 2000 44
.
Es importante resaltar la capacidad de la pulpa dental para reaccionar ante estímulos de
baja actividad, tales como atricciones dentales o caries de baja agresividad, produciendo
dentina terciaria o dentina de reparación, protegiéndose de tal forma de la agresión
externa. Unido al tardío desarrollo de la dentición definitiva, sobre todo en los terceros
molares, y al medio aislado que proporciona el esmalte, la dentina y el hueso alveolar,
los investigadores comenzaron a creer en la existencia de un nicho de células madre
mesenquimales en la pulpa dental.
30
Así, fue el grupo de Gronthos y cols. el que en el año 2000 aisló por primera vez células
madre mesenquimales de la pulpa dental. En este estudio, tras la extracción quirúrgica
de terceros molares incluidos, se aisló la pulpa de la cámara pulpar y se extendió en un
medio de cultivo, al mismo tiempo que como control se hacía lo mismo con la médula
ósea de pacientes sanos. El cultivo mostró mediante una serie de marcadores, no sólo la
existencia de células madre mesenquimales en la pulpa dental, si no que el número de
colonias formadas, así como el recuento celular era significativamente mayor que en el
control.
Posteriormente se trasladaron estas colonias celulares a ratones inmunocomprometidos,
donde demostraron su capacidad para desarrollar tejido óseo, e incluso un complejo
dentino-pulpar.
Desde su descubrimiento se ha ido estudiando in vivo la capacidad de las DPSC para
diferenciarse en células especializadas de los tejidos dentarios y peridentarios. Así se ha
logrado en estudios como el de Huang y cols. la regeneración pulpar tras la previa
extracción de la cámara y el conducto radicular 45
.
En otros estudios como el de Khorsand y cols., y tras la creación previa de defectos
periodontales en perros, se logró, regenerando el defecto con DPSC y un biomaterial, no
sólo la regeneración ósea del defecto, lograda también en el grupo control compuesto
únicamente por biomaterial, sino también la generación de nuevo cemento y ligamento
periodontal 46
.
Existen incluso trabajos realizados en humanos, como el del grupo de D’Aquino, que
consiguió regenerar un defecto óseo distal a segundos molares inferiores, originado por
la extracción de terceros molares en posición mesializada. Una vez exodonciados estos
últimos, se obtuvo de su cámara pulpar un concentrado celular que se utilizó junto a un
biomaterial para el relleno del defecto que se había creado tras la extracción. En el
seguimiento a 3 años se observaron diferencias significativas en la regeneración ósea
con respecto al grupo control tratado únicamente con biomaterial 47
.
Como se ha citado anteriormente, únicamente las células embrionarias o las iPS cells
tienen la capacidad de diferenciarse en cualquiera de las células de las 3 capas
embrionarias. Sin embargo, la obtención y uso de ambas conlleva muchas dificultades
31
tanto éticas en el caso de las células embrionarias, como de obtención en el caso de las
iPS.
Sin embargo, el grupo de Atari y cols. ha sido capaz de aislar en la cámara pulpar de
terceros molares incluidos que fueron exodonciados, un grupo de stem cells que
mostraron ser positivas a una serie de marcadores presentes únicamente en las células
pluripotenciales, lo cual ofrece la posibilidad de su uso en medicina regenerativa, sin
necesidad de utilizar embriones ni la reprogramación en el caso de las iPS 48
.
En un trabajo llevado a cabo por Shi y Gronthos se trató de aclarar el origen de los
nichos de stem cells presentes tanto en médula ósea como en pulpa dental. Se había
sugerido ya el origen perivascular de estos nichos, observando que los tejidos en los que
se habían encontrado células madre mesenquimales del adulto, eran todos ellos tejidos
muy vascularizados (medula ósea, pulpa dental, piel, folículos pilosos…). Por tanto en
este estudio, se aislaron colonias celulares de stem cells obtenidas tanto de médula ósea
de individuos sanos como de la extracción de terceros molares incluidos en personas
jóvenes. Estos concentrados celulares fueron testados en la expresión de marcadores
conocidos de células endoteliales (CD 146 y CD35), así como de marcadores
vasculares.
Tras el estudio histológico, ambos resultaron positivos a los marcadores endoteliales, y
negativos a los marcadores vasculares, lo que sugiere que su origen está en las células
perivasculares de los vasos sanguíneos que irrigan estos tejidos, y que posteriormente
son capaces de diferenciarse a pericitos, osteoblastos u odontoblastos en función de las
condiciones del medio en el que se encuentren 49
.
Sin embargo, otro estudio realizado por Lovschall y cols. pone en entredicho esta última
afirmación, y sugiere la presencia en la pulpa dental de más de un nicho de células
madre mesenquimales 50
, lo que explicaría la diferencia de respuesta en cuanto a la
formación odontoblástica al trasplante de colonias derivadas de una única célula
observada en el estudio de Gronthos y Brahim del 2002 51
.
Lovschall determinó la existencia de más de un nicho de células madre mesenquimales
en la pulpa dental, debido a la diferente expresión de determinados marcadores, en
función de en qué lugar se estudiaba la reacción celular ante un estímulo 50
. Así además
de las poblaciones de células perivasculares ya antes descritas, se observaron al menos
32
dos nichos más, uno cercano a la capa odontoblástica de la pulpa, justo por debajo de la
predentina, y otro en el estroma pulpar.
Posteriormente al descubrimiento de las DPSC se han ido reconociendo en los tejidos
dentales nuevos nichos de células madre con capacidad para diferenciarse a células
maduras, pero cuyas cualidades varían en mayor o menor medida con las de las células
madre de la pulpa dental descritas inicialmente por Gronthos.
Las células madre de los dientes deciduos o SHED (Stem cells from Human Exfoliated
Deciduous teeth) fueron descubiertas en la cámara pulpar de dientes temporales. Estas
células han sido recientemente estudiadas, mostrando sorprendentes resultados.
Presentan un nivel de proliferación mucho más alto que las células madre
mesenquimales derivadas de la médula ósea, e incluso más alto que el de las DPSC.
Tienen capacidad para diferenciarse en odontoblastos y osteoblastos, siendo muy útiles
para la regeneración ósea.
Esto se ha visto reflejado en un estudio llevado a cabo por Zheng y cols., en el que
defectos mandibulares creados artificialmente en minipigs, eran rellenados con SHED
autólogas obtenidas de la exodoncia de los incisivos inferiores deciduos de los animales.
Los resultados obtenidos muestran diferencias significativas tanto en el estudio
radiológico como histológico en la regeneración ósea de los defectos rellenados con
células madre junto a un biomaterial, con respecto a los defectos control que no fueron
rellenados, e incluso respecto a los que fueron rellenados únicamente con un
biomaterial52
.
Las células madre de la papila dental o SCAP (Stem Cells from Apical Papilla) se
encuentran en la papila dental de los dientes en formación, y son responsables de la
formación del ápice y la raíz dental. Estas células han mostrado en diversos estudios una
capacidad de proliferación mayor que las DPSC, y tienen potencial diferenciador en
odontoblastos.
Se cree que las SCAP han sido responsables de un fenómeno clínico observado y
publicado en algunos estudios. En dientes permanentes que no han terminado su
apicoformación, y que han sufrido algún tipo de patología infecciosa, incluso con la
formación de abscesos, la apicoformación se ha finalizado de forma natural, a pesar del
proceso de necrosis pulpar. Esto se cree que es debido a que la situación de las SCAP les
33
permite recibir vascularización procedente de los tejidos periodontales, y por tanto
sobrevivir al proceso infeccioso que invade la pulpa dental.
Por tanto, se cree, que tras la desinfección endodóntica, estas células son capaces de
diferenciarse a odontoblastos, terminando de ese modo el proceso de formación de la
raíz dental.
Otro grupo conocido es el de las células madre del ligamento periodontal (PDLSC
Periodontal Ligament Stem Cells). El ligamento periodontal está formado por una serie
de fibras que, situadas en diferentes orientaciones, unen el cemento con el hueso
alveolar. Estas fibras se originan durante la erupción dentaria, y por tanto se creía en la
posibilidad de que albergasen nichos de células madre.
Estas stem cells fueron descubiertas por primera vez por Seo y cols en el año 2004, al
obtenerlas del ligamento periodontal de terceros molares incluidos exodonciados,
mostrando características similares a otras células madre mesenquimales como las
derivadas de la médula ósea o las DPSC, al expresar una serie de marcadores de
superficie típicos, y un potencial de diferenciación similar 53
.
Los primeros estudios in vitro mostraban que estas células eran capaces de diferenciarse
en adipocitos, cementoblastos y osteoblastos, y en otros trabajos in vivo demostraron su
capacidad para producir cemento y ligamento periodontal. Por ello abren una nueva
ventana a la regeneración periodontal, teniendo en cuenta que la periodontitis es
causante de gran parte de las pérdidas dentales en adultos, e incluso la posibilidad de
crear un tejido periodontal maduro alrededor de un implante de titanio, como ya se ha
puesto en estudio en un trabajo en ratones llevado a cabo por Lin y cols. en el que
utilizando un concentrado de PDLSC y biomaterial que rellena el lecho implantario se
consigue la formación de cemento y fibras perpendiculares al implante, lo cual podría
suponer un paso más allá a la osteointegración actual 54
.
Las células madre derivadas del folículo dental (DFPC, Dental Follicle Precursor
Cells) fueron descubiertas por primera vez por el grupo de Morsczeck y cols. en el año
2005 55
.
El folículo dental es un tejido conectivo que rodea a los dientes en formación, y que ha
sido considerado desde hace años como un tejido multipotente, debido a su capacidad
para formar: cemento, hueso alveolar y ligamento periodontal.
34
En el primer estudio que fue capaz de aislarlas, a partir del folículo dental de terceros
molares incluidos, estas células demostraron su capacidad in vitro de generar nódulos
calcificados.
Más recientemente, en trabajos como el de Guo y cols., las DFPC han demostrado ser
capaces de originar complejos dentino-pulpares, así como cemento y hueso alveolar in
vivo, tras ser implantadas en ratones en un medio con TDM (treated dentin matrix), un
complejo que simula las condiciones naturales de la dentina, lo que nos muestra la
importancia del medio para la diferenciación de las stem cells 56
.
En otro estudio de Luan y cols., se demostró mediante el cultivo aislado de numerosas
líneas celulares obtenidas del folículo dental de ratones, y la reacción positiva ante
distintos marcadores que en las DFPC existen varios nichos celulares diferentes con
distintas capacidades para la regeneración de hueso alveolar y ligamento periodontal,
sin embargo no encontraron marcadores positivos para la diferenciación en
odontoblastos, y por tanto para la formación de dentina y pulpa, lo que tal vez se
explique por las distintas propiedades del medio de cultivo con respecto a otros estudios
donde sí se dieron resultados positivos en esta línea 57
.
2.4.2.- Perspectivas clinicas de tratamiento en el ambito odontologico de las celulas
madre de origen dental
La obtención de todos estos nichos celulares en los tejidos dentarios y peridentarios ha
abierto una nueva perspectiva sobre su uso tanto en odontología como en medicina
regenerativa, además de resultar susceptibles para una serie de trabajos que de momento
se reducen al campo de la experimentación animal.
La regeneración ósea es tal vez el campo más estudiado para el tratamiento con células
madre de origen oral. En la actualidad la regeneración ósea se basa en el uso de
biomateriales, ya sea aloinjertos o xenoinjertos con diferentes resultados.
Los defectos óseos pueden estar ocasionados por diferentes causas, y según el número
de paredes afectadas y las dimensiones del defecto, serán susceptibles o no a un
tratamiento de regeneración ósea. En el medio oral las infecciones periodontales o
periimplantarias, la presencia de quistes o tumores maxilares e incluso desórdenes
35
oclusales pueden originar defectos en maxilar y mandíbula. Del tratamiento y
recuperación de estos defectos va a depender en gran medida el mantenimiento de
dientes e implantes osteointegrados, y también la posibilidad de rehabilitar con
elementos protésicos a pacientes edéntulos totales o parciales.
Ya en el primer estudio en el que se descubrieron las DPSC, en el año 2000, se
demostró su capacidad in vitro para generar nódulos de una matriz mineralizada en
presencia de un medio que contenga hidroxiapatita, por lo que demuestran su capacidad
para diferenciarse a osteoblastos. Otros grupos de stem cells orales como las SHED y las
PDLSC han demostrado también su capacidad para generar estructuras mineralizadas in
vitro.
Sin embargo, para la recuperación de defectos óseos, se necesita no solamente la
formación de láminas de tejido mineralizado, si no la aparición de un tejido óseo
maduro, con una red vascular apropiada, y una estructura tridimensional adecuada. Esto
sí se pudo apreciar en trabajos in vivo como el de Zheng, en el que tras crear grandes
defectos mandibulares en minipigs, y rellenarlos con SHED autólogas, observó como a
los 6 meses el defecto se encontraba relleno de hueso maduro, al contrario de lo que
sucedía en los grupos control, donde el defecto se había cubierto de tejido conectivo 52
.
Para la valoración de trabajos de regeneración ósea in vivo resulta útil el trabajo de
revisión bibliográfica realizado por Morad, en el cual recoge 17 artículos llevados a
cabo en modelos animales y uno de ellos en humanos, en los que se rellenaron distintos
defectos óseos con concentrados de DPSC unidos a distintos biomateriales. Cinco de
estos trabajos estudiaban el relleno de defectos mandibulares. En todos estos estudios se
mostró un aumento estadísticamente significativo en el nivel de hueso formado en el
grupo en el que se rellenaban los defectos con stem cells con respecto a aquellos en los
que se introducía únicamente el biomaterial y a los que se mantenían como grupo
control sin ningún tipo de relleno de los defectos. El hueso recién formado se mostraba
en el análisis histológico como un hueso maduro, con una completa vascularización 58
.
En el estudio de D’Aquino y cols. llevado a cabo en humanos, se obtenía de la
extracción de los terceros molares maxilares el concentrado celular, que se introducía en
una segunda cirugía en el defecto distal a los segundos molares inferiores que aparecía
tras la extracción de los cordales mandibulares. Se observó en ese mismo estudio y en
otro de seguimiento realizado a los 3 años de la intervención, que la regeneración ósea
36
es significativamente mayor que en el grupo control, mostrándose además como un
hueso mejor organizado y vascularizado 47
.
Todos estos estudios han demostrado la capacidad de las células madre de origen
dentario, ya sean DPSC ó SHED para diferenciarse en osteoblastos, y de este modo
generar in vitro matrices mineralizadas e in vivo de regenerar defectos óseos de tamaño
considerable, incluso en humanos.
La regeneración pulpar es otro de los campos de estudio que se están desarrollando en la
actualidad como posible terapia con células madre de origen oral. Hasta ahora, las
necrosis pulpares provocadas por un proceso infeccioso de origen cariogénico o bien
por un traumatismo dental, tenían como único posible tratamiento la pulpectomía y el
relleno con un material como gutapercha o agregado trióxido mineral (MTA). Estos
tratamientos consiguen el tratamiento sintomático del diente, así como la remisión del
proceso infeccioso presente.
Sin embargo, el diente pierde su vitalidad, y por tanto la falta de vascularización termina
por debilitar su estructura, y favorece la aparición de fracturas dentarias que terminan
por provocar la pérdida total del diente.
Algunas de las estirpes de células madre de la cavidad oral (DPSC, SCAP y SHED) han
demostrado su capacidad para diferenciarse a odontoblastos, y por tanto teóricamente la
posibilidad de regenerar un tejido pulpar maduro.
Algunos estudios como el de Wang se han centrado en la regeneración pulpar de dientes
permanentes inmaduros, cuyo ápice no ha terminado todavía su formación, pero cuya
capacidad de recuperación ante estímulos es mayor. En este estudio en un modelo
canino, se rellenaba de DPSC autólogas el canal radicular de incisivos inferiores
inmaduros, observándose una posterior regeneración del complejo pulpar, así como un
cierre apical definitivo 59
.
Otro estudio de Huang y cols., trasplantó al dorso de ratones fragmentos de raíz de
dientes humanos, los cuales sellaba por uno de los extremos con MTA y por el otro
rellenaba con DPSC y SCAP humanas extraídas de terceros molares exodonciados. Los
resultados mostraron la regeneración de un complejo dentino-pulpar en el canal
radicular, presencia de odontoblastos maduros y túbulos dentinarios y con un aporte
vascular adecuado similar al de un tejido pulpar natural 60
.
37
Un paso más allá llega el trabajo de Sonoyama y cols., quienes rellenando un alveolo
postextracción de un incisivo inferior en minipig con SCAP y PDLSC de origen humano
consiguieron crear de novo un complejo radicular formado por dentina, ligamento
periodontal y cemento, al que luego se rehabilitó con una corona cerámica que permitió
la recuperación funcional del incisivo perdido 61
.
La regeneración periodontal es otro campo en desarrollo para el estudio con células
madre. La enfermedad periodontal afecta hasta a un 15% de la población adulta en los
países desarrollados.
Aunque su etiología es variable, la causa principal es una higiene oral deficiente, que se
agrava con otros factores como el tabaquismo o la diabetes. Además, en el desarrollo de
la periodontitis influyen otros factores como la genética, desórdenes hormonales e
incluso procesos psicológicos.
Hasta el momento se habían desarrollado diferentes técnicas para tratar de conseguir la
regeneración del tejido periodontal perdido a causa de la periodontitis.
Acondicionamiento radicular mediante raspado y alisado, recubrimiento con injertos
óseos, regeneración tisular guiada con membrana colágena y un injerto óseo, e incluso
aplicación de factores de crecimiento y proteínas derivadas de la matriz del esmalte, que
han demostrado en los últimos años ser capaces de regenerar nuevo cemento radicular y
nuevas fibras de ligamento periodontal.
Sin embargo, estas técnicas han presentado ciertas limitaciones en sus resultados,
especialmente en defectos avanzados, creándose en ciertas ocasiones un epitelio largo
de unión, que no responde a una regeneración periodontal íntegra.
Algunos estudios, como los de Hasegawa y Tobita, con células madre mesenquimales
derivadas de la médula ósea (BMSC) y del tejido adiposo respectivamente, han
demostrado su capacidad in vivo para la regeneración de tejido periodontal perdido 62,63
.
El descubrimiento de las células madre de origen dental, en especial de las PDLSC abre
una nueva línea para la regeneración. En estudios como el de Seo y Miura se demostró
que células madre periodontales humanas, obtenidas de terceros molares incluidos, eran
capaces de regenerar defectos periodontales creados artificialmente en ratones,
apareciendo nuevos cementoblastos y fibroblastos capaces de generar cemento radicular
alrededor del diente y nuevas fibras de ligamento periodontal 53
.
38
Otro campo de la regeneración periodontal lo constituye la formación de fibras
periodontales alrededor de los implantes dentales.
Éstos implantes de titanio son la técnica de elección para la reposición de dientes
perdidos y se osteointegran en los huesos maxilares. Sin embargo, las fibras que se
forman a su alrededor lo hacen únicamente de forma paralela, por lo que no se unen al
implante dental mientras que sí lo hacen al diente natural. Esta ausencia de unión
periodontal ocasiona que los implantes no presenten ninguna resiliencia ante las cargas
oclusales, y por tanto se muestren más susceptibles a ser dañados por estas cargas que
los dientes naturales.
Lin y cols. realizaron un trabajo en el que se colocaban una serie de implantes en
mandíbulas de ratones, y se rellenaba el lecho implantario con células madre del
ligamento periodontal. A las 8 semanas se procedió al estudio de los implantes,
observando como en uno de ellos se formaron cemento radicular y fibras periodontales
perpendiculares al implante tal y como sucede en un diente natural 54
.
El último de los procesos de regeneración dentaria, que resulta como combinación de
los hasta ahora revisados, consiste en la generación por completo y de novo de una
estructura dentaria y periodontal completa, es decir la formación de un nuevo diente a
partir de células madre e ingeniería tisular y genética.
Uno de los grandes problemas a la hora de llevar a cabo la generación de un nuevo
diente es que los tejidos dentarios tienen orígenes embrionarios distintos. Así los
odontoblastos que forman la pulpa y la dentina, y los fibroblastos que forman el
ligamento periodontal proceden del ectomesénquima que a la vez deriva de la cresta
neural. Sin embargo, el esmalte es un tejido de origen ectodérmico.
Estos distintos orígenes embrionarios hacen imposible que una única línea de células
madre multipotentes sea capaz de originar una estructura dentaria completa, y por tanto
sea necesaria la participación de células madre totipotenciales o pluripotenciales, y por
tanto de origen embrionario.
Un estudio de Volponi y cols. desarrolló in vitro un diente de novo a partir de células
madre adultas humanas y de células embrionarias de ratón. Este nuevo diente contenía
ameloblastos que formaron esmalte, odontoblastos e incluso restos de Malassez 64
.
39
Otro estudio realizado por Oshima y cols. consiguió no sólo crear el nuevo diente in
vitro, sino que además lo trasladó in vivo a un lecho creado en mandíbula de ratón,
donde se logró instaurar como un nuevo diente funcional y vital. Para ello todo el
proceso de formación del diente in vitro fue controlado por ingeniería tisular y genética,
para conseguir que la nueva unidad dental fuese similar en forma y tamaño a un diente
natural65
.
El desarrollo de nuevos dientes para su posterior implantación in vivo en humanos está
aún muy lejano, debido a la complejidad del proceso, y al diferente origen embrionario
de los tejidos dentarios, que provoca la necesidad de utilizar células pluripotenciales.
El desarrollo de las nuevas iPS cells podría favorecer el avance en estas técnicas, pues
podría evitar el uso de embriones humanos, cuya utilización hasta ahora está vetada por
motivos éticos, y sustituirlos por células adultas con capacidades pluripotenciales.
2.4.3.- Perspectivas clinicas de tratamiento en el ambito medico de las celulas madre
de origen dental
El estudio de las células madre de origen oral no sólo abre nuevos horizontes en lo que a
odontología regenerativa se refiere, sino que tiene otras futuras aplicaciones en el
campo de la medicina en diferentes especialidades, entre ellas la regeneración neuronal.
El tejido nervioso, formado por el sistema nervioso central SNC y periférico SNP está
compuesto principalmente por las neuronas, un tipo celular muy especializado con
origen ectodérmico.
Cuando se produce una lesión neuronal, ya sea un trastorno degenerativo como por
ejemplo la enfermedad de Parkinson o de Alzheimer, un accidente cerebrovascular, o la
sección de la médula espinal, esta lesión es irreversible, pues la especificidad de las
neuronas impide su regeneración.
La terapia con células madre aparece como una opción para la posible regeneración de
estos tejidos. Sin embargo, el origen ectodérmico de estas células dificulta el posible
tratamiento, pues las fuentes más comunes de células madre adultas proceden de tejidos
mesenquimales como la médula ósea o el tejido adiposo.
40
Además, se han reconocido dentro del encéfalo dos fuentes de células madre neurales,
en el hipocampo y en los ventrículos laterales, pero su situación y el pequeño número de
células disponibles, hace imposible su uso para la regeneración neuronal.
Sin embargo, las células madre de origen dental podrían ser una alternativa para estos
tratamientos regenerativos. La mayoría de los tejidos conectivos del esqueleto
craneofacial están formados por un tipo especial de tejido mesenquimal, cuyo origen
embrionario se encuentra en la cresta neural, y recibe el nombre de ectomesénquima.
La cresta neural es precursora también de las neuronas y del resto de células del tejido
nervioso, por tanto, la pulpa dental y el ligamento periodontal, como tejidos conectivos
provienen del ectomesénquima, y tienen un origen común con las neuronas del sistema
nervioso.
Fueron Gronthos y Brahim en el año 2002 los primeros en comprobar que las DPSC
expresaban marcadores neurales incluso en condiciones basales 51
.
Otros estudios posteriores, como el de Király y cols. demostraron que en cultivos in
vitro las DPSC eran capaces de generar células con una morfología similar a la de las
neuronas, esto es, con prolongaciones que recuerdan a axones y dendritas, y que incluso
fueron capaces de generar impulsos eléctricos 66
.
En otro estudio in vivo Arthur y cols. demostraron que, instaurando DPSC humanas en
el ganglio del trigémino en embriones de ave, estas células se acoplaban atrayendo
prolongaciones de axones hacia ellas, por lo que se puede decir que se acoplaban al
sistema neuronal 67
.
En el trabajo de Sakai y cols. demostraron como con ratas a las que se les había
seccionado la médula espinal, y a las que se les aplicaba un concentrado de DPSC de
origen humano junto a un pegamento de fibrina, se conseguía que a las 5 semanas
recuperasen la movilidad perdida tras la lesión 68
.
En otro estudio, Fujiwara y cols. consiguieron mediante la inoculación de iPS cells de
origen humano, que ratones a los que se había inducido una pérdida de la memoria
espacial, y por tanto su capacidad para recordar la localización de alimentos, fueran
capaces de recuperar esa capacidad. Esta memoria espacial corresponde en humanos a
41
la ubicación de lugares y labores cotidianas, por lo que esta terapia podría ser de gran
utilidad como tratamiento para la demencia senil 69
.
Otro campo de estudio es el de regeneración de la córnea. La córnea es un tejido que se
encuentra en la parte frontal del ojo, y cuya función es la de refractar la luz para dirigirla
a los tejidos fotosensibles. Por tanto, se trata de un órgano transparente formado
principalmente por tejido epitelial especializado.
Algunas enfermedades, ya sean de origen genético, infeccioso o químico, producen la
lesión irreversible de este epitelio, con la consecuente sustitución por tejido conectivo y
la pérdida de transparencia que afecta a la visión.
Existen en la actualidad una serie de tratamientos efectivos para la curación de estas
enfermedades, que pasan desde el uso de lentes hasta el trasplante de una córnea de
cadáver en casos más severos. Estos tratamientos tienen una tasa de éxito relativamente
alta, pero presentan ciertas dificultades, como la de encontrar un donante o el posible
rechazo al tejido trasplantado.
El trabajo de Pereira y cols. que se realizó sobre conejos con DPSC de origen humano,
sí demostró la diferenciación de las células trasplantadas a células del epitelio de la
córnea, y consiguió la recuperación de la transparencia de la misma a los tres meses de
la intervención.
Esto se cree debido una vez más al origen de las DPSC, que se encuentra en el
ectomesénquima que a su vez deriva de la cresta neural, de la que derivan los tejidos de
origen ectodérmico de cabeza y cuello 70
.
En el campo de la cardiología también se han realizado trabajos con DPSC con
resultados positivos y a tener en cuenta. En el estudio de Gandía y cols. del año 2008, se
indujo en ratas un infarto de miocardio mediante la ligadura de la arteria coronaria. La
inyección a los 7 días de un concentrado de células madre de origen humano obtenidas
de dientes deciduos y su posterior estudio a las 4 semanas mostró que en los animales
de estudio se producía una mejora en la vascularización y una reducción del área
infartada con respecto a los animales del grupo control 71
.
La regeneración de glándulas salivares ha sido otro de los ámbitos de trabajo. Procesos
autoinmunes como el síndrome de Sjögren, o causas iatrogénicas como el tratamiento
42
con radioterapia en algunos cánceres de cabeza y cuello provoca una disminución o
incluso el déficit total de la función de las glándulas salivares menores y mayores, sobre
todo de la glándula parótida, responsable de hasta un 35% del porcentaje de saliva
eyectada al medio oral.
En el trabajo de Janebodin y cols. se demostró in vivo como un concentrado de DPSC
unido a células propias de glándulas salivares conseguían una mayor diferenciación a
glándula salivar madura, así como la presencia de un mayor número de estructuras
acinares y ductales con abundante vascularización 72
.
43
2.5 REGENERACION DENTINARIA
La dentina también llamada sustancia ebúrnea o marfil es el eje estructural del diente y
constituye el tejido mineralizado que conforma el mayor volumen del diente.
En la porción coronaria se halla recubierta por el esmalte, mientras que en la región
radicular, por el cemento. Interiormente, la dentina delimita una cavidad llamada
cámara pulpar, dentro de la que se encuentra la pulpa dental.
En la estructura de la dentina podemos distinguir dos componentes básicos: La matriz
mineralizada y los conductos o túbulos dentinarios que la atraviesan y que alojan a los
procesos odontoblásticos, los cuales son prolongaciones citoplasmáticas de las células
llamadas odontoblastos.
Por lo tanto, son los odontoblastos los que producen la matriz colágena de la dentina y
participan en el proceso de calcificación de la misma, siendo, además, responsables de
la formación y del mantenimiento de la dentina.
Los cuerpos celulares de los odontoblastos están separados de la dentina mineralizada
por una zona de matriz orgánica no mineralizada denominada predentina 73
.
Ilustración 3: Detalle del borde incisal en el estadío de campana aposicional: Se distinguen las capas de
ameloblastos y odontoblastos en relación al esmalte y dentina en formación.( Gómez de Ferraris Mª. E)
44
La diferenciación de los odontoblastos se realiza a partir de las células
ectomesenquimales de la papila que evolucionan transformándose primero en
preodontoblastos, luego en odontoblastos jóvenes y, por último, en odontoblastos
maduros o secretores.
Estos adoptan una forma cilíndrica con un núcleo polarizado hacia la región distal de la
célula. En su extremo proximal o libre (futuro polo secretor) se diferencia una
prolongación citoplasmática única que queda localizada en plena matriz dentinaria,
llamada proceso odontoblástico, prolongación odontoblástica o fibrilla de Tomes.
Los procesos odontoblásticos determinan la morfología de los túbulos y son más anchos
en su base (cerca del cuerpo del odontoblasto) y terminan prácticamente en punta
afilada 73
.
Ilustración 4: Disposición de ameloblastos y odontoblastos secretores.( Gómez de Ferraris Mª. E)
Los odontoblastos se encuentran formando una especie de epitelio cilíndrico simple en
la periferia de la papila y están separados por espacios intercelulares que a veces
contienen fibras reticulares de Von Korff e incluso capilares o nervios.
Sintetizan las fibrillas colágenas tipo I y los glicosaminoglicanos de la matriz orgánica
de la dentina.
45
Cuando se forma la dentina, la porción central de la papila se transforma en pulpa
dentaria, que se caracteriza por presentar fibroblastos jóvenes con abundante sustancia
fundamental.
La dentina y la pulpa conforman una unidad estructural, dado que las prolongaciones de
los odontoblastos están incluidas en la dentina; una unidad funcional, ya que la pulpa
mantiene la vitalidad de la dentina, y la dentina protege a la pulpa; y por último,
comparten un origen embrionario común, pues ambas derivan del ectomesénquima que
forma la papila del germen dentario.
Por todas estas razones, se considera a la dentina y a la pulpa en su conjunto como una
sola estructura integrada, denominada complejo dentino-pulpar.
Respecto a la clasificación histogenética de la dentina se distinguen tres tipos 73
:
A. La dentina primaria es la que se forma en primer lugar y representa la mayor
parte de ésta, delimitando así la cámara pulpar. Por lo tanto, se considera dentina
primaria la que se deposita desde las primeras etapas de la dentinogénesis hasta
que el diente entra en oclusión.
B. La dentina secundaria es la que se produce después de haberse completado la
formación de la raíz del diente. Se deposita mucho más lentamente que la
primaria, pero su producción continua durante toda la vida del diente. Los
anatomopatólogos la denominan dentina regular o fisiológica.
La dentina secundaria se forma en toda la periferia de la cámara pulpar,
alcanzando mayor espesor en el techo, piso y paredes, mientras que es más
delgada en los cuernos pulpares.
La formación de este tipo de dentina determina una progresiva disminución de
la cámara pulpar, dato que debe tener en cuenta el odontólogo ante tratamientos
de operatoria dental, ya que en un individuo adulto que ha sufrido reducción del
volumen pulpar, se puede trabajar con mayor grado de seguridad ya que el
riesgo de hacer una exposición pulpar accidental es menor que en un individuo
joven.
46
El límite entre ambas se manifiesta mediante un cambio en la dirección de los
túbulos dentinarios.
Ilustración 5: Sector de transición entre las dentinas primaria y secundaria. Se observa el cambio de dirección de los
túbulos dentinarios. Técnica por desgaste, x 60.( Gómez de Ferraris Mª. E)
Ilustración 6: Distribución topográfica de las dentinas primaria y secundaria.( Gómez de Ferraris Mª. E)
C. Por último, la dentina terciaria, conocida por los anatomopatólogos como
dentina reparativa, reaccional, irregular o patológica, es aquella que se forma
más internamente deformando la cámara, pero solo en las zonas expuestas a un
estímulo localizado.
Es decir, que esta dentina es producida por los odontoblastos directamente
implicados por el estímulo nocivo, de manera que sea posible aislar la pulpa de
la zona afectada.
47
Ilustración 7: Detalle de la dentina secundaria y terciaria. Se visualiza en la parte central la dentina terciaria
deformando la cámara pulpar su derecha. Técnica por mineralización. Tricrómica de Masson, x 150.( Gómez de
Ferraris Mª. E)
Algunos autores hacen una distinción entre dentina reaccional o reactiva,
segregada ante un estímulo nocivo por los odontoblastos terminales; y la dentina
reparativa, que es elaborada por una nueva generación de odontoblastos
originados a partir de células precursoras de la pulpa tras la muerte de éstos
como consecuencia del estímulo nocivo 73
.
La cantidad y calidad de dentina terciaria que se produce se halla relacionada
con la duración e intensidad del estímulo; cuanto más acentuados sean estos
factores, más rápida e irregular será la aposición de dentina reparativa.
Además, la dentina terciaria ofrece una protección pulpar de acuerdo con su
espesor, pero la pulpa subyacente a la dentina terciaria puede inflamarse.
Los patólogos consideran a la dentina reparativa dentro de la categoría de
dentina de neoformación, en la cual también está incluida la dentina cicatrizal o
puente de dentina, que se forma bajo la acción de protectores pulpares como el
hidróxido de calcio o el óxido de zinc.
El odontólogo utiliza tales sustancias para estimular la producción de nueva
dentina cuando ha habido extirpación casi total de la dentina en caries muy
profundas, o incluso exposición pulpar o pulpectomía parcial.
Los protectores pulpares inducen a la diferenciación de las células
ectomesenquimáticas o células madre pulpares cercanas a la zona afectada, las
cuales se transforman en odontoblastos y elaboran dentina de cicatrización.
48
Respecto a la actividad defensiva de la dentina terciaria, se diferencian otros dos
tipos como son la dentina translúcida o esclerótica, que es la que suele formarse
debajo del esmalte con fisuras o con caries de evolución lenta; y la dentina
opaca, que es la que se forma ante lesiones más intensas, en las que se produce
la retracción de las prolongaciones odontoblásticas, o hasta incluso la necrosis
de las mismas.
Esta última se localiza principalmente en los vértices de los bordes incisales o de
los cuernos pulpares, y en las regiones cervicales por abrasión o por exposición
de la dentina.
Ambas dentinas son consideradas como dentinas de remineralización, que son
menos permeables y más resistentes que la normal, otorgándole mayor
protección en casos de filtración o invasión bacteriana.
En relación con la terapéutica dentinaria, hay que resaltar, que las nuevas técnicas de
ingeniería tisular están desarrollando protocolos de regeneración de la dentina,
induciendo el desarrollo de la misma, a partir de la acción sobre la pulpa de distintas
sustancias inductoras (BMP-2, 4, 7 o proteína osteogénica 1 –OP1-) que unidas a
diferentes matrices se colocan en la proximidad de la superficie pulpar para producir
dentina terciaria.
Otras técnicas de ingeniería tisular intentan elaborar material semejante a dentina
humana cultivando células de la pulpa dental de terceros molares con β -glicerofosfato
para fabricar distintos tipos de núcleos mineralizados 73
.
49
3. OBJETIVOS
50
OBJETIVOS:
1) Demostrar que las técnicas de ingeniería tisular con el uso de células madre de
origen pulpar son eficaces en la regeneración de defectos óseos periimplantarios
en tibia y maxilar de minipig.
2) Analizar la regeneración ósea periimplantaria producida con biomateriales y
células madre de origen pulpar en defectos yuxtacrestales versus defectos
sobredimensionados en modelo de experimentación animal.
3) Determinar la neoformación ósea generada en defectos óseos periimplantarios
en función de los parámetros histomorfométricos BIC (Bone Implant Contact) y
BA (Bone Area).
4) Evaluar si en el estudio histológico de fluorescencia se obtienen diferencias de
regeneración ósea entre maxilar superior y tibia.
5) Verificar si las células madre de origen pulpar tienen potencial formador de
dentina en maxilar y tibia de Minipig.
51
4. MATERIAL Y MÉTODO
52
4.1 MATERIAL
4.1.1.- Quirófano
El estudio experimental se realizó en la Sección de Cirugía y Hospitalización del
Servicio de Cirugía experimental del Centro Militar de Veterinaria Gómez Ulla.
Los procedimientos de anestesia, reanimación postoperatoria, seguimiento de los
Minipigs intervenidos y el sacrificio de los mismos se llevaron a cabo en las siguientes
instalaciones:
1. Antequirófano (Sala de anestesia y recuperación)
2. Sala de esterilización
3. Quirófanos
Ilustración 8: Sala de quirófano
4.1.2.- Material Quirúrgico
Material para las exodoncias:
1. Bisturí
2. Periostotomo
3. Pinzas mosquito
4. Cucharilla de legrar
5. Botadores
6. Fórceps
53
7. Fresas quirúrgicas para odontosección, para pieza de mano y para
contraángulo
8. Tijeras
9. Pinzas
10. Portaagujas
11. Sutura Vicryl 2/0
12. Pieza de mano
13. Contraángulo
Material para colocación de implantes:
1. Bisturí
2. Periostotomo
3. Pinza mosquito
4. Tijeras
5. Pinzas
6. Portaagujas
7. Sutura Vicryl
8. Motor quirúrgico
9. Caja quirúrgica: fresas de grosor creciente, transportador, destornilladores,
aditamerntos.
10. Llave dinamométrica.
54
4.1.3.- Implante
El material objeto de estudio consistió en implantes de un único fabricante todos de un
mismo modelo de implante (modelo KL) y de una misma dimensión (12mm de longitud
por 3.75mm de diámetro).
Ilustración 9: Implante Klockner KL
Este implante presenta una serie de características micro y macroscópicas entre las que
destacan en primer lugar su composición de titanio comercialmente puro de grado III.
Macroscópicamente se presenta como un implante cónico tanto en el ápice como en el
tercio coronal, mientras en el tercio medio presenta paredes paralelas. El diámetro
utilizado en este estudio es el de 3,75 mm, con una longitud de 12 mm. El diámetro del
hombro del implante en su parte más ancha es de 4,1 mm, y al tratarse de un implante
de conexión externa, se mide también la altura del hexágono que es de 0,7mm y el
diámetro del hexágono externo de 2,7mm.
Microscópicamente este implante ha sido tratado mediante dos métodos físico
químicos: el shot blasting y el pasivado químico.
55
El shot blasting es un método de tratado físico de los implantes dentales, que consiste
en el bombardeo del implante con pequeñas micropartículas con el fin de crear
pequeños defectos en la superficie del implante que favorezcan la unión entre el hueso
vivo y el propio implante.
Norton estudió en el año 1998, la capacidad de estos microdefectos en la superficie de
los implantes para favorecer la osteointegración, y describió además cual sería la
superficie ideal para la mayor retención posible, de este modo exponía que cuanto
mayor concentrado de cavidades y mayor sea su tamaño hasta un límite, la unión hueso-
implante resultará más fuerte 74
.
Otros estudios más recientes como el de Gil y cols. demostraron en un estudio en
Minipigs, que los implantes tratados con shot blasting requerían menor tiempo de
osteointegración que los no tratados 75
.
También resulta interesante el estudio llevado a cabo por Santander y colaboradores, en
el que se demuestra in vitro que los implantes tratados con shot blasting mejoran la
osteoinducción de células madre mesenquimales humanas 76
.
El pasivado químico consiste en la inmersión del implante en un medio ácido con el fin
de generar una capa homogénea de óxido de titanio de entre 5 y 10 micras que previene
la salida al medio de iones de titanio, así como la corrosión de la superficie del implante
al actuar como una capa protectora del mismo.
Estudios como el de Schwarz han demostrado además una mejora en la regeneración
ósea en los implantes que han sido tratados con un pasivado químico 77
.
56
4.1.4.- Biomaterial
Maxresorb es un material de sustitución ósea compuesto por fosfato de tricálcico (40%)
y por hidroxiapatita (60%), que se caracteriza por ser completamente sintético y por sus
propiedades de reabsorción controlada.
Ilustración 10: Maxresorb
Proporciona una excelente estabilidad mecánica y volumétrica, y es considerado como
un biomaterial innovador, seguro, estéril y fiable, por lo que tiene un alto grado de
predictibilidad clínica y seguridad.
Sus propiedades osteoconductivas son el resultado de una matriz con un alto grado de
porosidad, que favorece el crecimiento de células osteogénicas, promueve la
regeneración de tejido óseo y facilita una mayor vascularización.
Además, posee unas características excelentes de manipulación ya que es viscoso y
moldeable, y puede ser inyectado facilitando así su manejo clínico.
Sus indicaciones en el campo de la Odontología son numerosas entre las que destacan
tratamientos implantológicos y periodontales, elevación de seno, aumento de cresta
ósea, defectos intra-óseos, alveolos post-extracción, defectos óseos complejos o simples
y defectos de furca.
57
4.1.5.- Membrana
La membrana utilizada en nuestro estudio de experimentación es de tipo colágeno
reabsorbible Jason ®, la cual se obtiene a partir de pericardio de origen porcino.
Ilustración 11: Membrana Jason reabsorbible
4.1.6.- Ostell
La estabilidad de un implante es un valor fundamental para conocer su nivel de relación
con el hueso que lo rodea. El concepto de estabilidad primaria se refiere al anclaje del
implante en el momento de su colocación, y varía en función del hueso disponible, del
implante colocado, del torque de inserción y de la técnica quirúrgica.
Esta estabilidad que lleva consigo la ausencia de movimientos clínicos del implante
durante su etapa de osteointegración, es fundamental para el éxito del tratamiento, ya
que un implante con movilidad sufriría un proceso de fibrointegración que llevaría al
fracaso 78
.
Por otra parte, la estabilidad secundaria del implante se refiere ya a la ausencia de
movimiento una vez los tejidos óseos han cicatrizado a su alrededor, es decir, a la
osteointegración.
Por tanto, es fácil determinar que la medición de la estabilidad de un implante resulta
sumamente importante para predecir su futuro éxito, así como para valorar la posible
utilización de un protocolo de carga inmediata, cada vez más demandado por los
58
pacientes, o bien asegurarse que es el momento adecuado para llevar a cabo la carga
protésica diferida.
Sin embargo, tradicionalmente la estabilidad implantaria se determina clínicamente de
una forma subjetiva mediante la percusión del implante, reconociendo un sonido sordo
en caso de una buena estabilidad, teniendo en cuenta el torque de inserción, en la
ausencia de zonas radiolúcidas alrededor del implante en una radiografía periapical, y
también por la experiencia del clínico valorando la estabilidad y la ausencia de
movilidad del mismo 78
.
Para tratar de estandarizar y medir de una forma objetiva y comparable la estabilidad de
un implante dental se desarrolló Ostell ®, siguiendo los primeros estudios de Meredith y
cols. en el año 1994 sobre la frecuencia de resonancia 16
.
Ilustración 12: Ostell
La resonancia es un fenómeno que se produce cuando a un cuerpo capaz de vibrar se le
somete a la acción de una fuerza periódica, cuyo período de vibración coincide con el
del cuerpo. En este momento la tasa de absorción es la máxima posible y así una fuerza
59
pequeña aplicada de forma repetida hace que la amplitud de un sistema oscilante se
haga más grande.
El Ostell aplica un impulso magnético y valora la vibración en la frecuencia de
resonancia del smart-peg, estando esta vibración en relación directa con la estabilidad
de la unión de la interfase hueso-implante.
El valor ISQ se ha desarrollado en relación directa con la frecuencia de resonancia del
smart-peg, en una escala de 1 a 100 que permite una monitorización clínica sencilla de
los valores de estabilidad implantaria.
Se consideran estables valores de ISQ situados entre 50 y 85, siendo de dudoso
pronóstico aquellos resultantes entre 40 y 50 y de alta tasa de fracasos las mediciones
por debajo de 40 ISQ.
La estabilidad del implante variará en función de la medición, puesto que está en
relación directa con la calidad y cantidad ósea que rodea al implante dental.
Generalmente la medida más alta corresponde a la mesio-distal, y la más baja a la
vestíbulo-lingual.
Las medidas de Osstell pueden llevarse a cabo en cualquier momento tras la colocación
del implante, al tratarse de un método no invasivo y siempre y cuando el implante esté
accesible. Por norma general se realiza una medida en el momento de la colocación del
implante, para valorar su estabilidad primaria, y otra al momento de situar la carga
protésica.
En el caso de querer realizar carga inmediata de los implantes se consideran valores
aptos aquellos situados entre 60 y 70 ISQ 78
.
Numerosos estudios han demostrado la correlación entre los valores de medición de la
frecuencia de resonancia de los implantes dentales y el posterior éxito en el tratamiento
de los mismos, y las mediciones varían ligeramente entre unos y otros, ya que no se
tienen en cuenta otros factores como el tipo de implante, sus dimensiones, la situación
que ocupa dentro de las arcadas dentarias, o la higiene y hábitos del paciente entre
otros.
60
Así en el trabajo de Rodrigo y cols. sobre más de 4000 implantes colocados, en
aquellos en los que el valor de ISQ medido en el momento de la carga protésica era 60 o
superior no se produjo ningún fracaso en el tratamiento durante el periodo de
seguimiento, lo que sí ocurrió para valores inferiores a 60 ISQ 79
.
En otro trabajo realizado por Nedir y cols. se demostró al colocar 63 implantes
inmediatos y 43 con carga diferida, que aquellos con medición ISQ superior a 54 ISQ
para carga inmediata y 49 ISQ para carga diferida resultaron exitosos en un seguimiento
de un año 80
.
4.1.7.- Animal de experimentación
El animal seleccionado para este estudio ha sido el cerdo doméstico (Sus Scrofa
Domesticus), en concreto 4 hembras de 6 meses de edad.
La selección se debió a las características similares en lo que se refiere a dimensiones
que presenta el maxilar del animal con respecto al maxilar humano, en cuanto a altura y
anchura, y a su mayor longitud, lo que permite la colocación de un número adecuado de
implantes, manteniendo los suficientes dientes que permitan al animal alimentarse.
A diferencia de los humanos, el maxilar superior está dividido en maxilares y huesos
incisivos. De tal modo que los maxilares albergan a premolares, molares y caninos, y
los huesos incisivos, que forman la extensión rostral de la calavera del animal, a tres
parejas de incisivos 81
.
La dentición permanente de estos animales está formada por tres pares incisivos (pinzas,
medianos y extremos), un par de caninos, cuatro premolares y tres molares en cada una
de las arcadas dentarias.
La fórmula de los dientes permanentes es: 2(I 3/3 C 1/1 P 4/4 M 3/3)=44.
Por otra parte, la fórmula de los dientes deciduos se compone de tres pares de incisivos,
un par de caninos y tres pares de premolares, es decir, 2 (Di 3/3 Dc 1/1 Dp 3/3)=28. 81
.
61
En cuanto a la cronología dentaria del animal se distinguen tres períodos 82
:
1: Erupción de los dientes deciduos:
- Al nacimiento: los extremos y caninos han erupcionado en los machos
- A los 8 días: erupción del 3º premolar superior
- 15-20 días: erupción de las pinzas inferiores y 3º premolar inferior
- 25-30 días: erupción de las pinzas superiores y 1º premolar
- 30-45 días: erupción de los medianos inferiores y 2º premolar
- 60 días: erupción de los medianos superiores
- 3 meses: Erupción de todos los dientes deciduos sin desgaste
- 4 meses: Desgaste de las pinzas inferiores
- 5 meses: erupción del primer premolar permanente y del primer molar. Los
medianos presentan desgaste
Ilustración 13: Dientes superiores deciduos animal joven. (R. Getty)
62
2: Erupción de los dientes permanentes:
- 8-9 meses: erupción de extremos y caninos. Erupción 2º molar
- 12-14 meses: erupción de las pinzas. Erupción 4º, 3º y 2º premolares
- 18-20 meses: erupción de los medianos. Erupción 3º molar
Ilustración 14: Dientes superiores permanentes animal adulto. (R. Getty)
3: Desgaste de los dientes permanentes:
- 2 años: nivelamiento de las pinzas inferiores.
- 3 años: los colmillos de las hembras no miden más de 3,5 cm, mientras que en
los machos crecen de forma continua.
63
4.2 MÉTODO
4.2.1.- Protocolo anestésico:
A. Medidas preoperatorias:
Los animales fueron sometidos al ayuno de alimentos sólidos durante las 24 horas
previas a la intervención, pudiendo beber únicamente agua.
Antes de la intervención quirúrgica se procede a pesar a cada animal y a
identificarlo mediante un microchip.
B. Anestesia:
Premedicación:
Se consiguió la sedación del animal mediante la aplicación de:
• Sulfato de atropina, en dosis de 2 mg/50 kg
• Carazolol (Suacron), en dosis de 0,2 ml/10 kg.
Se trata de un betabloqueante de receptores adrenérgicos que actúa a
nivel del sistema nervioso autónomo, limitando el número de los ritmos
cardiacos y respiratorios que pueden ser inducidos por mediadores
químicos del estrés. Cuando se producen situaciones de estrés, hay una
reducción del ritmo cardiaco y un menor consumo de oxígeno,
previniendo así los trastornos funcionales miocárdicos que aparecen
como consecuencia de una insuficiente perfusión sanguínea.
• Azaperona (Stresnil), en dosis de 0,25-1 ml/10 kg.
Produce una sedación rápida y ejerce función protectora del sistema
neurovegetativo, evitando el estrés.
64
Inducción:
Se realizó mediante la administración vía intramuscular de los siguientes
fármacos:
• -Midazolam, en dosis de 0,5 ml/10 kg.
• -Ketamina, en dosis de 10-18 mg/ 10 kg.
Se trata de una droga disociativa con potencial alucinógeno, derivada de la
fenciclidina, usada por sus propiedades analgésicas y anestésicas.
Intubación y ventilación:
La intubación endotraqueal se realizó con el animal en posición de decúbito
prono, con un tubo del número 6.5, conectando respirador-ventilador automático
de la marca Boyle Internacional, modelo Ohmeda 7000, así como capnógrafo de
la casa Dragüer.
Mantenimiento anestésico:
Se realizó mediante la mezcla gaseosa de:
• Isofluorano al 2%, anestésico por inhalación no inflamable con el que los
reflejos faríngeos y laríngeos desaparecen rápidamente, el ritmo cardíaco
permanece estable y la respiración se deprime por lo que es
monitorizada.
• Protóxido de Nitrógeno: 3 litros/minuto
• Oxígeno: 2 litros/ minuto.
65
4.2.2.- Extracciones dentarias
Las exodoncias quirúrgicas se llevaron a cabo bajo anestesia general, según el protocolo
anestésico.
Se realizaron las extracciones dentarias de incisivos, premolares y de los gérmenes
dentarios del maxilar superior derecho e izquierdo conservando los caninos y molares.
Después del cierre de la herida, se esperó a la cicatrización de los alveolos durante al
menos cuatro meses para lograr una cresta alveolar totalmente cicatrizada en el maxilar.
Ilustración 13: Luxación dentaria maxilar de Minipig - Extracciones dentarias maxilar Minipig
La técnica empleada para las extracciones se llevó a cabo de la manera más cuidadosa
posible evitando en la medida de lo posible las osteotomías a favor de las
odontosecciones con el fin de preservar la mayor cantidad de hueso posible y mantener
las mejores condiciones para una correcta cicatrización y regeneración ósea.
Las extracciones se realizaron siguiendo el siguiente orden:
1. Sindesmotomía: Desprender el diente de sus inserciones gingivales mediante el
uso del periostotomo, el cual se introduce en el surco gingival y va separando
mediante movimientos suaves, las fibras que unen el cuello dentario con el
margen gingival. Con este procedimiento conseguiremos que el diente solo
quede unido al hueso por el ligamento periodontal.
66
2. Luxación: Introducción de la punta del botador o luxador en el alveolo a nivel
mesial y distal de la cara vestibular, realizando así fuerzas suaves evitando
movimientos que puedan fracturar las coronas dentarias.
3. Presión: Se seleccionan los fórceps necesarios para cada pieza dental,
dependiendo de la forma de la corona y número y disposición de las raíces.
4. Tracción: Aplicación de fuerzas en sentido vestíbulo-palatino y, en dientes
unirradiculares, se aplican además movimientos de rotación.
5. Avulsión: Aplicación de la fuerza necesaria para lograr la extrusión del diente.
4.2.3.- Obtención de células madre
Después de haber realizado las extracciones dentarias al Minipig, se procedió a la
extracción del tejido pulpar en laboratorio.
En primer lugar, se introdujeron los dientes en una Placa de Petri con ETOH al 70%,
donde se limpiaron y se retiraron los restos de tejido periodontal, tejido óseo y placa
bacteriana. A continuación se incubaron durante treinta minutos bajo luz ultravioleta,
dejando que reactivos como la colagenasa tipo I se activasen a 37º.
A continuación, se procedió a la fractura radicular bajo una campana de flujo laminar y
medidas de máxima esterilidad, sobre una superficie lisa mediante escoplo y martillo
quirúrgico.
67
Ilustración 14: Campana de flujo laminar - Limas de endodoncia para extracción de la pulpa
La extracción de la pulpa se llevó a cabo mediante limas de endodoncia y fue procesada
en una placa de Petri con medio Hanks con colagenasa.
Se disgregó la muestra en fracciones de dos milímetros y se introdujo durante una hora
a 37º en un tubo de ensayo.
A continuación se realizó el centrifugado de la misma a 1200 rpm a 22º durante diez
minutos, desechando el sobrante y conservando el precipitado celular o Pellet.
Simultáneamente, se dividió la muestra mecánicamente mediante el uso de pipetas y se
frenó la acción de la colagenasa diluyéndola y la muestra se cultivó en Flasck F25
durante 24 horas.
Ilustración 15: Pipetas utilizadas en el proceso
68
Después se realizó la citometría, prueba que demuestra si las células procesadas son
mesenquimales, caracterizándolas mediante marcadores específicos de célula
mesenquimal y reparación tisular:
CD29: Integrina B1: Receptor de membrana asociado en adhesión,
reparación tisular, respuesta inmune y hemostasis. Es marcador de
células mesenquimales y debe ser positivo.
CD34: Glicoproteina para stem cells de médula: Es un marcador
hematopoyético y debe dar negativo.
CD45: Tyrosine Phosphatos: Receptor de tipo C. Descrita para
proliferación, diferenciación, ciclo de mitosis. Precursor de línea
Hematopoyética. Debe ser negativo.
CD73: NT5E: Reguladora del Ph situada fuera de la membrana
plasmática. Debe ser positiva.
CD90: Proteína altamente glicosilada homóloga a p25: Es un marcador
de respuesta inmunológica y debe ser positivo.
A las dos semanas, se procedió a marcar las células por transfección con una proteína
fluorescente verde.
La transfección consiste en la inserción de material genético, como ADN o ARN de
doble cadena, en células eucariotas más específicamente de mamíferos, mediante
plásmidos, vectores víricos u otras herramientas de transferencia.
Ilustración 16: Transfección de células
69
La inserción de ADN en una célula permite la expresión o producción de proteínas,
usando las células su propia maquinaria celular, mientras que la inserción de ARN en
una célula se utiliza para regular la producción de una proteína específica.
Mientras que el lugar de acción para la transfección de ARN es el citoplasma, el ADN
debe ser transportado al núcleo para que sea eficaz. Allí puede ser expresado
transitoriamente durante un corto período de tiempo, o ser incorporado en el núcleo,
donde dicha manipulación se transmitirá a las células descendientes a partir de la
progenitora.
En nuestro estudio se utilizó como ADN un plásmido con proteína verde (GFP), Green
Fluorescent Protein y para su introducción se usó la Lipofectamine LTX + Plus™
Reagent.
El plásmido de ADN que se introdujo, fue marcado con una proteína fluorescente GFP
(Green Fluorescent Protein), y permitió observar al microscopio las células marcadas.
Por último, se efectuó el marcaje con nanopartículas, las cuales son diminutas
partículas de semiconductores, como el seleniuro de cadmio, que se comportan como si
fueran átomos individuales ya que pueden absorber la energía de la luz, llevando sus
electrones internos a niveles de energía más altos, y entonces liberar la energía
emitiendo luz.
Ilustración 17: Marcaje con nanopartículas
70
Se usaron por lo tanto, nanopartículas de 1micra de diámetro de sílice con un cubierta
autofluorescente verde que emitía a 525 nanómetros.
La selección de este proceso con nanopartículas se eligió por su sencillez y rapidez en el
proceso y su bajo índice de toxicidad.
4.2.4.- Colocación de implantes
La cirugía de colocación de implantes se llevó a cabo siguiendo los pasos que se
explican a continuación:
1. Incisión: Se realizó una incisión de trazo continuo mediante el uso del bisturí
con hoja del número 15, desinsertando así la mucosa del periostio y preparando
un colgajo mucoperióstico que nos permitiese el acceso a la cresta ósea evitando
realizar descargas.
2. Disección: Se llevó a cabo mediante un periostotomo para lograr un acceso
amplio a la cresta ósea y a las corticales vestibular y palatina.
3. Regularización de la cresta: En aquellas zonas en las que, debido a las
extracciones previas, no se disponía de una superficie ósea plana, se realizaró
regularización del hueso mediante una fresa redonda y abundante irrigación.
4. Elaboración del lecho receptor: La colocación de los implantes requiere la
preparación mediante osteotomía de un lecho receptor de dimensiones
adecuadas a dicho implante.
5. Técnica de implantación:
• Uso de irrigación: Mediante suero fisiológico para evitar el
sobrecalentamiento del lecho por encima de los 47 ºC e impedir que se
produzca necrosis ósea.
71
• Secuencia de fresado: La velocidad de fresado para la preparación del
lecho es de 1500 rpm.
Se realizó fresado secuencial, según las normas establecidas por la casa
comercial de los implantes utilizados.
• Colocación del implante: A baja velocidad (50 rpm), con la posterior
colocación de tornillo de cierre.
Los implantes del lado derecho se colocaron junto a células madre de la
pulpa dental y biomaterial Max Resorb, los del lado izquierdo
exclusivamente con DPSCs y, por último, los del grupo control sin
DPSCs ni Max Resorb.
6. Sutura: Se utilizó sutura Vicryl 3/0 con aguja curva de 15mm mediante puntos
sueltos con aproximación de los bordes del colgajo.
7. Tratamiento postoperatorio:
• Ketoprofeno 30 mg/10 kg
• Amoxicilina 2,50 gr/ 5 kpv
Ilustración 18: Preparación del lecho implantológico - Protocolo inserción implantes
72
Ilustración 19: Implantes maxilar superior Minipig
Ilustración 20: Implantes maxilar superior con membrana.
.
Respecto a la cirugía de implantes en la tibia derecha e izquierda, se realizó una incisión
longitudinal en el lado medial de las mismas y se insertaron tres implantes en el área
metafisaria proximal, varios milímetros por debajo de la tuberosidad tibial anterior.
En el lado derecho se colocaron los implantes junto a células madre de la pulpa dental y
biomaterial Max Resorb; en el lado izquierdo únicamente implantes junto a DPSC y en
el grupo control los implantes sin células ni biomaterial.
73
Ilustración 21: Preparación del lecho implantológico en tibia
Ilustración 22: Colocación de implantes en tibia de Minipig.
Ilustración 23: Implantes en tibia cubiertos con membrana.
74
Tras la colocación de los implantes se procedió a realizar el estudio radiológico, así
como el registro de los valores del análisis de radiofrecuencia o RFA mediante Osstel.
Ilustración 24: Radiografía maxilares y tibia Minipig
Tres meses después del sacrificio animal, se procedió a realizar los cortes tanto del
maxilar como de las tibias mediante una sierra y, a continuación, se volvió a hacer el
control radiológico y el registro de los valores RFA mediante Osstel.
Ilustración 25: Medición con Osstel en Maxilar y tibia.
75
Ilustración 26: Implantes osteointegrado en maxilar y tibia.
76
4.2.5.- Descripción del modelo experimental
En el diseño experimental se realizaron intervenciones quirúrgicas en maxilar superior y
tibia de cuatro cerdos Minipig de seis meses de edad y de entre cuarenta y sesenta Kg de
peso.
Ilustración 27: Preparación y premedicación del Minipig
Ilustración 28: Calavera Minipig 1 año
77
Se colocaron un total de doce implantes dentales en tibia y maxilar de dichos minipigs.
De estas doce muestras a analizar, siete correspondían a implantes dentales con defectos
de tipo “yuxtacrestal”, otros tres implantes al defecto “sobredimensionado” y otras dos
muestras corresponden al tipo “control”.
Por lo tanto, se distinguen tres tipos de modelos de defecto en este estudio:
1. Modelo de defecto yuxtacrestal: Este tipo de defecto simula la pérdida de hueso
por efecto del apantallamiento de tensiones “Stress Shielding”, que tal y como
describe la ya conocida “teoría de Wolf” responde a la remodelación adaptativa
del tejido óseo circundante al implante dental como resultado de la variación del
nivel de tensión mecánica transmitida al hueso. El retroceso de los tejidos óseos
y gingivales provoca la exposición del implante al medio oral, propiciando tanto
la infección bacteriana como la rotura prematura por fatiga del implante.
2. Modelo de defecto sobredimensionado: Este tipo de defecto simula el típico
error durante el transcurso de la cirugía de colocación del implante dental,
simulando en este caso la realización de un diámetro de fresado excesivo,
caracterizado por un diámetro de fresado superior al diámetro del implante.
3. Modelo de defecto control: Caracterizado por la realización de un defecto
yuxtacrestal mediante una trefina y sin relleno de biomaterial ni de células
madre.
Ilustración 29:Tipos de modelos de defectos utilizados.
78
Se colocaron doce implantes en los cuatro animales según la siguiente descripción:
A. Hemimaxilar derecho: Dos defectos yuxtacrestales y un defecto control.
B. Hemimaxilar izquierdo: Un defecto yuxtacrestal y dos
sobredimensionados.
C. Tibia derecha: Dos defectos yuxtacrestales y un defecto control.
D. Tibia izquierda: Dos defectos yuxtacrestales y un sobredimensionado.
Ilustración 30: Descripción modelo experimental en maxilar superior de Minipig
Ilustración 31: Descripción modelo experimental en tibia derecha e izquierda de Minipig.
79
De las doce muestras, el implante colocado en el defecto sobredimensionado de la tibia
izquierda no pudo ser analizado en uno de los animales, ya que dicha muestra no se
pudo cortar para su posterior procesado histológico debido a problemas técnicos con la
sierra.
Por lo que, en los otros tres animales de experimentación, se realizaron los mismos
modelos de defecto en las mismas posiciones que en el primer minipig, sin tener en
cuenta esta última posición de implante.
La regeneración ósea guiada (GBR) de los diferentes defectos óseos se realizó de
acuerdo a los siguientes modelos:
• Lado derecho del animal Implante + GBR con DPSCs y biomaterial
• Lado izquierdo del animal Implante + GBR solo con DPSCs
• Grupo control Implante sin biomaterial ni DPSCs.
Las células madre utilizadas eran de origen autólogo, perteneciente a los mismos
animales a los que se ha realizado la implantación final de los implantes.
Tres meses antes de realizar la implantación de las muestras, se llevó a cabo la
extracción de las células madre a partir de molares, folículos dentales y dientes deciduos
de los propios animales. Asimismo, una semana antes de la implantación se realizaron
extracciones de sangre con el fin de obtener “sérum sanguíneo” de los animales, que se
utilizó finalmente para vehicular la introducción de las células madre en los diferentes
defectos analizados.
Con el fin de analizar la respuesta de las células madre sobre el tejido óseo adyacente al
implante dental, se han utilizado dos sistemas de marcaje celular:
80
1. Un marcaje con NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES: Se ha realizado un
marcaje con partículas nanométricas con autofluorescencia de color verde, que
se llevó a cabo en todas las muestras implantadas en el lado izquierdo de los
animales. Uno de los objetivos del estudio fue analizar la viabilidad de
observación de este tipo de marcaje celular para valorar su eficacia.
2. Un marcaje por TRANSFECCIÓN GENÉTICA: Se ha realizado un marcaje por
transfección genética consistente en la expresión de una proteína con
fluorescencia verde (GFP), que se llevó a cabo en todas las muestras
implantadas en el lado derecho de los animales. Otro de los objetivos del estudio
fue analizar la viabilidad de observación histológica de este tipo de marcaje
genético para valorar su eficacia.
El sacrificio de los animales se realizó a los tres meses de acuerdo a los protocolos
estandarizados de eutanasia del Servicio de Cirugía Experimental del Centro Militar de
Veterinaria.
Tras el sacrificio del animal, las muestras fueron remitidas para su estudio histológico e
histomorfométrico.
Se realizaron además, estudios radiológicos y mediciones de valores ISQ con el Ostell
(medidas de estabilidad implantaria) el día de la cirugía de colocación de los implantes
y el día del sacrificio de los animales.
81
4.2.6.- Metodología experimental
El estudio histomorfométrico se realizó por los investigadores del grupo de
Biomateriales, Biomecánica e Ingeniería de Tejidos de la Universidad Politécnica de
Cataluña; un total de dos cortes histológicos para cada muestra analizada.
El primero de los cortes fue utilizado para realizar su evaluación
histomorfométrica mediante microscopia SEM de alta resolución, para lo que se
requirió un proceso previo de pulido y de recubrimiento de carbono.
El segundo de los cortes se utilizó para evaluar la evolución y determinar la
posición de las células madre mediante microscopía de fluorescencia.
Ilustración 32: Fotografía del corte longitudinal de una de las muestras.
4.2.6.1 Preparación de las muestras
Para el procesado de muestras se utilizó la técnica de sección y pulido descrita por
Donath y Breuner, mediante la utilización del sistema de corte y pulido EXAKT
(EXAKT Vertriebs, Alemania) y el plástico como medio de inclusión 83
.
A continuación, se describen las etapas básicas de proceso de preparación de muestras
histológicas:
A. Corte de las tibias y mandíbulas objeto de estudio con una sierra cinta de corte
histológico de precisión, modelo (Exakt 310, Exakt, Alemania), para delimitar el
82
implante y el hueso que lo rodeaba en secciones con un grosor menor de 4 mm
para asegurar una correcta fijación posterior.
Ilustración 33: Sierra de cinta de diamante EXACT 310 ( Exakt Apparatebau GmbH, Alemania) utilizada para realizar
los cortes de las muestras en este proyecto.
B. Fijación de los cortes en una solución de formol tamponado al 10% durante un
mínimo de dos días hasta el momento de su procesado, ya que las muestras ya
habían estado en formol más de 3 semanas previamente
C. Deshidratación de las muestras con la finalidad de eliminar completamente el
agua y la grasa mediante concentraciones crecientes de alcohol en pasos de entre
tres y cuatro días con la finalidad de permitir la correcta penetración del plástico
en el siguiente paso del proceso.
D. Inclusión en resina fotopolimerizable usando baños de concentración creciente
de resina con un solvente miscible hasta alcanzar el 100% de concentración en
resina, que se ha llevado a cabo durante un tiempo aproximado de tres semanas
para realizar la inclusión en plástico.
E. Polimerización de la resina incluida en una unidad de control de luz y
refrigeración externa (Histolux, Kulzer-Heraus, Alemania). La polimerización
83
de las muestras se ha realizado en dos etapas secuenciales sucesivas,
consistentes en una primera etapa de polimerización bajo exposición a luz
blanca y una segunda etapa de polimerización bajo exposición a luz ultravioleta.
Ilustración 34: Unidad foto-polimerizadora utilizada (Histolux, Kulzer-Heraus, Alemania).
F. Corte histológico longitudinal de los implantes mediante la utilización de una
sierra de cinta de diamante (Exact 310, Exakt, Alemania) provista de un sistema
de refrigeración por irrigación continua para evitar sobrecalentamiento y
deterioro de los tejidos circundantes al implante, bajo condiciones de máxima
velocidad de rotación de la banda y mínima carga de avance.
G. Desbaste inicial seguido de un pulido progresivo con papeles abrasivos de
carburo de silicio (SiC) de diferente granulometría, que se ha realizado mediante
la utilización de un equipo (Exakt 400 CS, Exakt, Alemania) provista de un
sistema de control de paralelismo.
84
Ilustración 35: Pulidora utilizada en el proyecto (Exakt 400 CS, Exakt, Alemania).
H. Corte de desbaste mediante la utilización de la sierra de cinta de diamante (Exact
310, Exakt, Alemania) para obtener la sección más fina posible de la muestra
pulida previamente. La cara pulida se adhiere a un portaobjetos a través de la
polimerización de un monómero transparente usando una fuente de rayos
ultravioleta.
Ilustración 36: Fuente de rayos UV Exakt para polimerización utilizada.
I. Desbaste y pulido final con papeles de SiC mediante la pulidora Exakt 400 CS
(Exakt, Alemania) hasta alcanzar un espesor de muestra comprendido entre 50 y
100µm, con el objetivo de obtener una lámina de la región de interés con
posibilidad de ser observada con microscopía óptica y de fluorescencia.
85
Ilustración 37: Muestra de mandíbula MIS2 pulida entre 50 y 100 µm para observación por microscopía de
fluorescencia
4.2.6.2 Técnica de histomorfometría
La técnica de histomorfometría por SEM se utilizó para la evaluación cuantitativa de los
principales parámetros de regeneración ósea (BIC, BA, ROI).
A. Adquisición de imágenes
Las muestras pulidas fueron observadas individualmente mediante microscopía
electrónica de barrido (SEM), mediante la utilización de un equipo “Surface Scanning
Electron Focused Ion Beam Zeiss (Zeiss, Germany)” equipado con una sonda de
detección de electrones retrodispersados para diferenciar con mayor detalle el hueso de
la superficie, con un potencial de 15kV y una resolución hasta 1.1 nm. Previamente, las
muestras fueron recubiertas con carbono grafito con el fin de asegurar una correcta
conductividad eléctrica necesaria para la óptima observación mediante microscopia
electrónica de barrido.
86
Ilustración 38: Imagen del microscopio electrónico utilizado para el estudio de la superficie. Dispone de detectores
de electrones retrodispersados y espectrómetro de energía dispersiva de rayos X (EDX).
La evaluación mediante microscopía SEM de cada corte consistió en la realización de
un barrido secuencial de toda la zona perimetral del implante, así como del propio
implante, obteniendo como resultado un grupo total de imágenes comprendidas entre 80
y 100 micrografías a x 250 aumentos de la región de interés de cada muestra.
Tras la obtención de las imágenes SEM, se procedió a la unión “cosido” de las mismas
en una sola imagen, que se llevó a cabo mediante la utilización de la función de cosido
“Stitching” presente en el programa de análisis de imagen (ImageJ).
El objetivo del ensamblaje de las imágenes se centra en la obtención de una única
imagen general de alta resolución para cada implante a evaluar.
En la siguiente ilustración puede observarse la imagen completa del implante de titanio
y del tejido adyacente, creada a través de imágenes individuales.
87
Ilustración 39: Imagen general SEM obtenida mediante el cosido “stitching” de 50 micrografías tomadas a x250
aumentos.
Una vez obtenidas todas las imágenes a través del stitching que permite la microscopía
electrónica de barrido, se procedió a su análisis y cuantificación mediante los programas
de análisis de imagen Photoshop y Image-J para cada imagen, con el objetivo de
calcular numéricamente el BIC y el BA, este último mediante la determinación de ROIs:
BIC (bone implant contact): Se define como el porcentaje de tejido óseo
mineralizado en contacto íntimo con el material superficial del implante
calculado en el nivel de su perímetro exterior.
BA (bone area): Definido como el porcentaje de densidad ósea calculado en el
espacio ubicado entre dos espiras de un mismo implante, el cual indica el
porcentaje de tejido óseo que ha crecido en dirección al implante a partir del
defecto creado en la implantación 84
.
ROI (region of interest): Es la zona de interés de la muestra evaluada, que en
este caso se corresponde con el área comprendida entre dos espiras de un
implante, zona establecida para la determinación del BA.
88
B. Determinación del BIC
El análisis de las muestras mediante microscopía SEM de alta resolución a grandes
aumentos permitió observar y determinar el nivel exacto de retracción del tejido
causado por efecto del proceso de deshidratación durante la preparación histológica.
Este proceso provoca la contracción de los tejidos circundantes al implante, dejando
como resultado una separación mínima entre hueso e implante de aproximadamente 20
píxeles (~15 µm), en el mejor de los casos.
Por este motivo, el tejido óseo que se encontró a una distancia de 20 píxeles del
perímetro externo del implante se consideró como tejido en contacto con el titanio,
estableciendo así una distancia homogénea y fija sobre la cual se ha calculado el BIC
para todas las muestras evaluadas.
Se consultaron referencias al respecto para establecer la distancia a la que se
determinaba el cálculo del BIC, y se posicionaba también a 15 µm de la superficie del
implante, lo que corresponde aproximadamente a unos 20 píxeles en la conversión a
unidades de distancia 84
.
Se obtuvieron y cuantificaron un total de dos regiones distintas para cada imagen
histomorfométrica SEM, las cuales correspondían al perfil más externo del implante que
se observaba en la muestra pulida.
El parámetro BIC fue calculado en la zona del implante que se encontraba envuelto por
hueso cortical, seleccionando el área susceptible de poder encontrarse en contacto
íntimo con el tejido. Se calculó el porcentaje de tejido óseo en contacto con el implante
en ambas zonas obteniendo valores para BIC1 y BIC2, a partir de los cuales se
determinó el BIC total para cada muestra:
89
Ilustración 40: Imagen obtenida a partir del procesado de imágenes con Photoshop y Image J de la zona a evaluar
para determinar el BIC en la zona delimitada por la presencia de tejido óseo de tipo cortical.
Debido a la metodología manual de corte de las muestras y al desconocimiento sobre el
eje de orientación exacto de los implantes, las imágenes obtenidas a partir de los cortes
realizados no presentan superficies completamente paralelas al eje longitudinal del
implante ni corresponden al plano de corte que contiene la longitud máxima del
diámetro del implante.
Con respecto a los tejidos considerados como hueso y con la intención de afectar en la
menor medida a la comparativa histomorfométrica entre los distintos tipos de muestras
estudiadas, se tuvieron en cuenta las siguientes consideraciones:
1. Todas las mediciones se llevaron a cabo a ciegas y de forma aleatoria, sin seguir
ningún orden específico de análisis de las muestras y sin conocer de antemano la
identificación por tipo de defecto realizado, todo ello con el fin de garantizar la
más estricta objetividad durante la realización de la evaluación y medición
cuantitativa de los parámetros histomorfométricos determinados (BIC, BA).
2. Todas las imágenes fueron obtenidas bajo las mismas condiciones de aumentos
microscópicos, tamaño y calidad de imagen.
3. La cuantificación del BIC y del BA se realizó a una distancia de 20 píxeles en
todas las muestras.
90
C. Determinación del BA y ROIs
El parámetro BA “Bone Area” indica la cantidad de tejido óseo formado que se ha
introducido en el espacio que existía inicialmente entre el defecto realizado por la
cirugía y los huecos existentes entre las espiras de la rosca del implante en el momento
de la implantación.
Para determinar el parámetro BA fue sido necesario establecer el área de interés “ROI”
entre las zonas expuestas al tejido óseo que se encuentran entre dos espiras consecutivas
de un mismo implante. Para ello, se utilizó una potente herramienta de cálculo
informático, más concretamente, mediante la utilización del software de tratamiento de
imagen (Image J), con el que se delimitó la zona a evaluar a partir del contorno
realizado en Photoshop usado en la determinación del BIC.
Los ROIs considerados para el cálculo del BA fueron aquellos que se encontraron en la
parte del implante comprendida entre tejido óseo y que, por tanto, eran susceptibles a la
colonización de hueso neoformado, sin tener en cuenta el espacio entre espiras que
quedan fuera del hueso cortical.
Por ello se establecieron los ROIs a lo largo del perfil del implante en contacto con el
hueso cortical para cada implante, tal y como se observa en la siguiente imagen.
Ilustración 41: Imagen obtenida a partir del procesado de imágenes con SEM, Photoshop y Image J con las zonas
delimitadas para ROIs a partir de las cuales se calculará el BA.
91
4.2.6.3 Análisis estadístico de resultados
Los valores numéricos obtenidos en la cuantificación del BIC fueron tratados mediante
el software estadístico Minitab 16 (Minitab ® 16.2.1, Minitab Inc., EE.UU), con el fin
de determinar la existencia o no de posibles influencias y/o dependencias entre las
variables analizadas, las cuales correspondían al porcentaje de BIC y de BA en función
del tipo de muestra y del tipo de defecto, considerándose que las diferencias eran
estadísticamente significativas cuando el valor de probabilidad fuese p< 0,05 para un
intervalo de confianza del 95%.
Los datos fueron recogidos en hojas de cálculo del software Excel (MsOffice XP) y se
graficaron con el mismo tipo de software, cuyos resultados se muestran tanto en
formato tabla como en forma de diagramas de barras.
4.2.6.4 Técnica de evaluación histológica
A continuación, se detalla la técnica de evaluación histológica mediante microscopía de
fluorescencia, con el fin de analizar el resultado de la inclusión de células madre y con
la que se pretende:
A. Analizar el efecto de la presencia de “células madre mesenquimales foliculares o
de pulpa dental” sobre la cinética y la calidad de regeneración ósea.
B. Evaluar la eficiencia de marcaje fluorescente de las dos técnicas de tinción
celular utilizadas, nanopartículas de fluorescencia y transfección con proteína
fluorescente GFP.
C. Evaluar la viabilidad de esta nueva técnica de regeneración para el rescate y/o
restauración de implantes dentales defectuosos.
92
En la técnica de fluorescencia se utilizan “fluorocromos” que dependiendo de la energía
de excitación emitirán con una longitud de onda determinada, la cual puede ser
observada mediante filtros adecuados. La luz ultravioleta, por ser una radiación de alta
energía, se utiliza en las técnicas de fluorescencia para excitar los electrones de las
sustancias presentes en las células o tejidos.
El equipo de microscopía óptica utilizado en este estudio corresponde al modelo Leica
AF7000 (de Meyer Instruments, USA) con el cual se puede seleccionar el rango de
longitud de onda adecuado con el que se debe iluminar la muestra. En función del tipo
de luz que atraviesa la muestra y del filtro aplicado se pueden obtener diferentes tipos
de imágenes: a color o de fluorescencia.
Para obtener las imágenes fue necesario hacer un barrido superficial del área de interés
de la muestra, el cual consiste en el tejido óseo adyacente al implante, utilizando el
microscopio de fluorescencia. Para ello se realizó un escaneado de toda la zona
obteniendo una serie de imágenes a 10 aumentos con un posterior cosido de todas las
imágenes con el fin de obtener una imagen de fluorescencia completa de toda la muestra
a alta resolución.
Una vez obtenidas las imágenes completas, se analizaron digitalmente con el software
de tratamiento de imágenes Photoshop con el objetivo de resaltar las partículas
fluorescentes, disminuir el “background” expuesto debido a la auto florescencia del
tejido óseo y para reducir la saturación cromática y de intensidad.
93
Ilustración 42: Microscopio óptico Leica AF7000 utilizado para la obtención de las imágenes de fluorescencia y de
tinción de este proyecto.
Ilustración 43: Imagen de fluorescencia completa de la muestra MDC1 compuesta por 150 imágenes a 10 aumentos
Este equipo también permite la posibilidad de obtener imágenes a color para poder
observar la tinción histológica realizada en las muestras. Para ello es necesario colorear
previamente la muestra con diferentes compuestos químicos (colorantes) que tienen la
capacidad de reaccionar con los diversos componentes de las estructuras celulares. La
posibilidad de observar una coloración dada en una estructura se debe a que ésta se
comporta como un filtro de color, dejando pasar solamente la luz de determinada
longitud de onda.
94
Técnicas de tinción histológica utilizadas en el estudio experimental:
La histología se encarga del estudio de los tejidos. La mayoría de éstos son incoloros y
por ello es necesario teñirlos con el uso de colorantes, para observar sus características
morfológicas con el microscopio óptico.
La Tinción Hematoxilina Eosina es la técnica más utilizada en histología y
medicina diagnóstica. Las características de sus compuestos hacen posible
observar al microscopio óptico las células individualizadas y sus núcleos, que
se tiñen de forma diferenciada.
La Hematoxilina es un colorante básico que tiñe de azul violeta los núcleos y las
partes del citoplasma con una abundancia de retículo endoplasmático rugoso.
La Eosina es un colorante ácido que tiñe de rojo otras partes del citoplasma así
como muchos componentes extracelulares fibrosos 85
.
La técnica histoquímica del Tricrómico de Masson diferencia mediante tres
colorantes distintos, tres tipos de estructuras, como son el núcleo, el citoplasma
y el tejido conjuntivo. Ésta técnica se aplica en biopsias fijadas en formol
tamponado al 10 %, para lo cual, será necesario desparafinar e hidratar 86
.
Ilustración 44: Glándulas cutáneas de un antílope.Tinción con Hematoxilina-Eosina (Izquierda) Núcleos celulares en
violeta y citoplasma en rojo.1.Glándulas odoríferas 2.Glándulas sebáceas 3.Tejido conjuntivo. Tinción Tricrómica de
Masson (Derecha) 1.Fibras colágenas en azul oscuro. Componentes celulares en rojo: 2.Glándulas odoríferas 3.
Glándulas sebáceas. Ulrich Welsch and Johannes Sobotta.
95
5. RESULTADOS
96
5.1. TÉCNICA DE EVALUACIÓN HISTOMORFOMÉTRICA MEDIANTE
MICROSCOPÍA SEM
Se correlacionaron todos los datos de las muestras de tibia y maxilar comparando el
lado derecho donde se realizó la colocación del implante dental con aplicación de
células madre de origen pulpar y biomaterial Maxresorb respecto al lado izquierdo
donde únicamente se utilizaron las células madre junto al implante dental.
A continuación, se muestran los resultados obtenidos en la cuantificación del BIC y del
BA en los cuatro Minipigs utilizados en el estudio de experimentación.
Estos resultados se han recogido en tablas y gráficas que reúnen los valores medios en
cada uno de los defectos óseos de los 4 cerdos analizados.
Las muestras han sido identificadas siguiendo un código alfa-numérico para indicar las
diferentes variables que se han considerado en el estudio: tipo de hueso donde habían
sido implantadas (mandíbula “M” o tibia “T”); tipo de marcaje celular utilizado para las
células madre incorporadas (transfección GFP en el lado derecho “D” y nanopartículas
con película de sílice en el lado izquierdo “I”); tipo de defecto que se había practicado
en la cirugía (yuxtacrestal “Y”, sobredimensionado “S” y control “C”); y posición de
colocación en el hueso en función del plano medio palatino o tibial, según lugar de
implantación (posición más proximal “1” o más distal “2”)
Muestra Lugar de implantación Tipo de defecto Posición
MDC1 Mandíbula Derecha Control 1
MDY1 Mandíbula Derecha Yuxtracrestal 1
MDY2 Mandíbula Derecha Yuxtracrestal 2
MIY1 Mandíbula Izquierda Yuxtracrestal 1
MIS1 Mandíbula Izquierda Sobredimensionado 1
MIS2 Mandíbula Izquierda Sobredimensionado 2
TIY1 Tibia Izquierda Yuxtracrestal 1
TIY2 Tibia Izquierda Yuxtracrestal 2
TIS1* Tibia Izquierda Sobredimensionado 1
TDC1 Tibia Derecha Control 1
TDY1 Tibia Derecha Yuxtracrestal 1
TDY2 Tibia Derecha Yuxtracrestal 2
Tabla 1: Identificación de las muestras analizadas
Las muestras a estudiar, inicialmente, consistían en siete muestras con defecto
yuxtacrestal (MDY1, MDY2, MIY1, TDY1, TDY2, TIY1, TIY2); una muestra control
97
en maxilar (MDC1), un control en tibia (TDC1), y por último, dos implantes con
defecto sobredimensionado del maxilar izquierdo (MIS2) y un implante con defecto
sobredimensionado en la tibia izquierda (TIS1).
Finalmente, se pudieron extraer resultados de todos los implantes indicados excepto de
la muestra TIS1, ya que debido a problemas técnicos con la sierra no pudo ser cortada
para su procesado histológico.
Por todo esto, con los otros tres animales de experimentación se procedió a realizar los
mismos modelos de defectos periimplantarios en las mismas posiciones que en el
primer cerdo anteriormente descrito.
Se debe tener en cuenta, que la desviación que presentan los resultados se debe al modo
de elaboración manual del proceso de preparación de muestras para histomorfometría.
Hay que considerar que los cortes realizados en las muestras para la obtención de las
imágenes se ejecutaron con la mayor precisión posible, aunque su realización manual
dificulta de forma intrínseca la obtención de planos de corte perfectamente
perpendiculares al eje longitudinal del implante, así como el plano de pulido que deja el
tejido al descubierto. Asimismo, la cantidad de muestras analizadas hasta el momento
representa una población de muestras no excesiva como para minimizar efectos de
dispersión.
5.1.1. Determinación del BIC
El cálculo del BIC se efectuó para cada muestra a partir del BIC1 y BIC2, realizando el
promedio a partir de ellos y obteniendo también su desviación estándar.
Muestra %BIC 1 %BIC 2 %BIC Total Desviación
MDC1 37,26 28,59 32,93 6,13
MDY1 55,08 56,80 55,94 1,22
MDY2 13,85 41,08 27,46 19,26
MIY1 48,74 58,65 53,70 7,01
MIS1 20,60 42,94 31,77 15,79
MIS2 25,66 44,22 34,94 13,13
TIY1 55,57 52,44 54,00 2,21
TIY2 40,14 37,49 38,82 1,87
TDC1 25,41 17,89 21,65 5,31
TDY1 14,38 23,41 18,89 6,39
TDY2 33,63 47,73 40,68 9,97
Tabla 2: Resultados numéricos de la cuantificación del BIC1, BIC2, BIC total y su desviación estándar
98
El análisis estadístico de los resultados obtenidos no mostró diferencias
estadísticamente significativas entre ellos (p>0.05), ni en función del tipo de defecto
realizado en la cirugía ni respecto al tipo de marcaje fluorescente de las células madre
incorporadas, ya que los resultados del test Anova fueron (p=0.388) y (p=0.228),
respectivamente.
No obstante, sí se pudo observar una cierta tendencia en los resultados obtenidos en
ambos casos, ya que los valores promedio del porcentaje de BIC total en función del
defecto y de las células varían, tal y como se observa en las siguientes imágenes.
Ilustración 44: Diagrama de barras comparativo con los valores promedio del porcentaje de BIC total según el
defecto óseo realizado en la cirugía de implantación.
YSC
40
30
20
10
0
Media
de %
BIC
41,3554
33,3549
27,2898
%BIC promedio según defecto
99
Ilustración 45: Diagrama de barras comparativo con los valores promedio del porcentaje de BIC total según lado.
En la siguiente imagen puede observarse una representación gráfica en forma de
diagrama de barras con los resultados de BIC total obtenidos para cada muestra
analizada, en la que se observa gráficamente cómo las muestras con defecto
“yuxtacrestal” presentan mayores valores de % BIC. No obstante, aparecen dos
muestras con defecto “yuxtacrestal” (MDY2, TDY1) que presentan valores muy bajos
de BIC.
A partir de estos valores se ha podido comprobar que los implantes colocados con
defecto yuxtacrestal presentan mayor porcentaje de BIC que los que fueron implantados
sobre defectos sobredimensionados, indicando que la geometría yuxtacrestal favorece el
crecimiento de nuevo tejido óseo alrededor del implante.
Cabe destacar que los implantes colocados en las zonas consideradas como control han
presentado el menor valor promedio de porcentaje de BIC, por lo que se puede afirmar
que la realización de los defectos sobredimensionados o yuxtacrestal mejoran la
osteointegración respecto de los implantes control.
Los valores máximos de BIC se encuentran en las muestras con defecto yuxtacrestal,
siendo concretamente MDY1 y TIY1, las cuales han obtenido unos resultados del
55.94% y 54% de BIC total, respectivamente.
36
38
40
42
44
46
48
Derecho Izquierdo
%BIC Promedio Según Lado
Maxilar Tibia
100
Ilustración 46: Diagrama de barras comparativo del porcentaje de BIC total para cada una de las muestras
evaluadas
En el caso de la muestra TDY1 podría considerase como no relevante porque el cálculo
del porcentaje de tejido óseo entre las espiras (%BA) dió un valor muy elevado, por lo
que se puede intuir que la retracción que han sufrido los tejidos en el proceso de
preparación de las muestras, debido a la deshidratación y a la inclusión en resina, ha
sido mayor que en el resto de casos. No obstante, se trata de un caso aislado en el
conjunto de muestras con defecto yuxtacrestal, ya que si se observa la imagen SEM de
dicha muestra se aprecia que todo el perfil del implante metálico está rodeado de tejido
óseo.
Por el contrario, la muestra MDY2 tiene un porcentaje de BA y de BIC muy reducido,
por lo que el proceso de remodelación ósea en la dirección del implante no se ha visto
muy favorecido en comparación con el resto de muestras. En la imagen SEM obtenida
para MDY2 no se observa tejido óseo adyacente al hueso, por lo que los resultados
calculados son tan reducidos. Este hecho podría ser debido a que el implante ha sufrido
movimiento durante el periodo de implantación o que el tejido no ha aflorado suficiente
en el proceso de pulido.
0
10
20
30
40
50
60
MDC1 MDY1 MDY2 MIY1 MIS1 MIS2 TIY1 TIY2 TDC1 TDY1 TDY2
% T
ejid
o ós
eo
% BIC TOTAL
101
Ilustración 47: Imagen SEM de la muestra TDY1 - Imagen SEM de la muestra MDY2
En cuanto al marcaje celular, se deduce que los implantes insertados en el lado
izquierdo de los animales operados, han presentado un valor de BIC total mayor que los
implantados en la banda derecha. La diferencia entre la situación a izquierda y derecha
radica en el tipo de marcaje celular utilizado, siendo con nanopartículas recubiertas de
una película de sílice fluorescente en el primer caso y mediante transfección GFP en el
lado derecho. Pero en ambos casos se han incorporado el mismo tipo de células madre,
por lo que a nivel de histomorfometría (%BIC, %BA) no producen ninguna variabilidad
de resultados. Sin embargo, estos valores serán objeto de estudio en la evaluación por
microscopía de fluorescencia, con el fin de analizar la viabilidad de cada metodología.
102
5.1.2. DETERMINACIÓN DEL BA MEDIANTE ROIS
La cuantificación del BA se realizó a partir del porcentaje de tejido óseo calculado en
cada ROI en las zonas enmarcadas entre espiras consecutivas para cada muestra,
realizando el promedio a partir de ellos y obteniendo también su desviación estándar.
Los valores numéricos resultantes se muestran en la tabla 3.
Los resultados obtenidos mostraron diferencias estadísticamente significativas (p<0.05)
al comparar los valores que presentó cada una de las muestras. El resultado de %BA
total presentó también diferencias estadísticamente significativas en función del tipo de
defecto óseo efectuado en el momento de la implantación, obteniendo un valor de
p<0.05.
Muestra %BA Desviación
MDC1 52,18 17,16
MDY1 72,65 10,27
MIY1 61,86 19,11
MDY2 30,48 33,85
MIS1 35,25 17,82
MIS2 33,28 30,43
TIY2 78,81 6,08
TIY1 65,17 10,15
TDY2 77,82 4,90
TDC1 70,53 11,29
TDY1 71,54 6,71
Tabla 3: Resultados numéricos de la cuantificación del BA promedio para cada muestra y su desviación estándar
Los valores promedio de BA total según la geometría del defecto efectuado se muestran
en la siguiente imagen.
YSC
70
60
50
40
30
20
10
0
% t
ejid
o ós
eo
68,8
38,3004
57,5733
%BA promedio según tipo de defecto
Ilustración 48: Diagrama de barras comparativo con los valores promedio del porcentaje de BA total según el defecto
óseo realizado en la cirugía de implantación.
103
A continuación, se muestra un diagrama de barras con los resultados del porcentaje de
BA total obtenido para cada muestra analizada, en la que se observa gráficamente cómo
también en la valoración de este parámetro las muestras con defecto yuxtacrestal
presentan valores mayores de %BA.
Ilustración 49: Diagrama de barras comparativo del porcentaje de BA total para cada una de las muestras
evaluadas.
En el caso del cálculo del “Bone Area” las muestras control no han presentado el
resultado promedio más bajo, como sí ha ocurrido con el porcentaje total de BIC, sino
que en este caso lo presenta la implantación sobre el defecto sobredimensionado. Este
hecho es debido a que este tipo de defecto consiste en sobredimensionar el orificio en el
cual se implanta el dispositivo, creando un defecto óseo de mayor diámetro que el
propio implante. Esto implica que la distancia que debe recorrer el tejido óseo de nueva
formación hasta alcanzar la superficie del implante, a partir de la remodelación que
sufre el tejido circundante, sea mayor y, consecuentemente, disminuya la cantidad de
hueso en las áreas entre espiras para un mismo tiempo de implantación. Por este mismo
motivo, el defecto control resulta con un mayor porcentaje de BA en el mismo periodo.
No obstante, este resultado plantea dudas sobre el porcentaje de BIC obtenido para el
defecto sobredimensionado, el cual es mayor al defecto control. Este hecho podría ser
debido a que el tejido óseo se adhiere correctamente al titanio por su alta
biocompatibilidad y su demostrada capacidad de osteointegración, favorecido por la
utilización de las células madre.
Pero la densidad ósea que se crea en las zonas adyacentes al implante y entre las espiras
no es tan elevada como en el resto de casos a causa de la sobredimensión del defecto
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
MDC1 MDY1 MIY1 MDY2 MIS1 MIS2 TIY2 TIY1 TDY2 TDC1 TDY1
% T
ejid
o ós
eo
%BA TOTAL
104
realizado en la cirugía. Por tanto, el tejido óseo neoformado avanza hacia la interfase del
implante con menor densidad ósea, debido al espacio que existe entre el frente de
remodelación y la superficie metálica del implante.
Los resultados de BA total según el tipo de marcaje celular no presentaron diferencias
estadísticamente significativas (p>0.05), aunque sí mostraron valores promedios
diferentes, tal y como se indica en la siguiente imagen.
En este caso, los valores mayores de BA se encuentran en los implantes insertados en el
lado derecho de los animales operados, los cuales corresponden al marcaje celular
mediante transfección GFP, al contrario de lo que presentaban los resultados para BIC.
Estos resultados podrían estar relacionados con el método de operación en función de
cuál era la posición del animal en el momento de la implantación y del efecto de dicha
posición sobre la colocación de los implantes. De todos modos, la viabilidad en la
observación de los dos métodos de marcaje se analizará con la microscopía de
fluorescencia.
Ilustración 50: Diagrama de barras comparativo con los valores promedio del porcentaje de BA total según lado.
59
60
61
62
63
Derecho izquierdo
%BA Medio en función del lado
%BA Medio en función del lado
105
Imágenes de microscopía electrónica SEM de los implantes evaluados
MDY1 MDY2
MDC1 MIY1
MIS1 MIS2
TIY1 TIY2
TDY1 TDY2
106
TDC1
5.2. TÉCNICA DE EVALUACIÓN HISTOLÓGICA MEDIANTE
MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA
Las muestras fueron identificadas siguiendo un código alfa-numérico para indicar las
diferentes variables que se consideraron en el estudio: tipo de hueso donde habían sido
implantadas (mandíbula “M” o tibia “T”); tipo de marcaje celular utilizado para las
células madre incorporadas (transfección GFP en el lado derecho “D” y nanopartículas
con película de sílice en el lado izquierdo “I”); tipo de defecto que se había practicado
en la cirugía (yuxtacrestal “Y”, sobredimensionado “S” y control “C”); y posición de
colocación en el hueso en función del plano medio palatino o tibial, según lugar de
implantación (posición más proximal “1” o más distal “2”), quedando definidos tal y
como se indican en la siguiente tabla.
Muestra Lugar de implantación Tipo de defecto Posición
MDC1 Mandíbula Derecha Control 1
MDY1 Mandíbula Derecha Yuxtracrestal 1
MDY2 Mandíbula Derecha Yuxtracrestal 2
MIY1 Mandíbula Izquierda Yuxtracrestal 1
MIS1 Mandíbula Izquierda Sobredimensionado 1
MIS2 Mandíbula Izquierda Sobredimensionado 2
TIY1 Tibia Izquierda Yuxtracrestal 1
TIY2 Tibia Izquierda Yuxtracrestal 2
TIS1* Tibia Izquierda Sobredimensionado 1
TDC1 Tibia Derecha Control 1
TDY1 Tibia Derecha Yuxtracrestal 1
TDY2 Tibia Derecha Yuxtracrestal 2
Tabla 4: Identificación de las muestras analizadas
107
Las muestras a estudiar, inicialmente, consistían en siete muestras con defecto
yuxtacrestal (MDY1, MDY2, MIY1, TDY1, TDY2, TIY1, TIY2); una muestra control
en maxilar (MDC1), un control en tibia (TDC1), y por último, dos implantes con
defecto sobredimensionado del maxilar izquierdo (MIS2) y un implante con defecto
sobredimensionado en la tibia izquierda (TIS1).
Finalmente, se pudieron extraer resultados de todos los implantes indicados excepto de
la muestra TIS1, ya que debido a problemas técnicos con la sierra no pudo ser cortada
para su procesado histológico.
Por todo esto, con los otros tres animales de experimentación se procedió a realizar los
mismos modelos de defectos periimplantarios en las mismas posiciones que en el
primer cerdo anteriormente descrito.
De modo que las muestras de las cuales se obtuvieron las imágenes, son las que se
muestran en la siguiente tabla.
Muestra Lugar de implantación Tipo de defecto Posición
MDC1 Mandíbula Derecha Control 1
MDY1 Mandíbula Derecha Yuxtracrestal 1
MDY2 Mandíbula Derecha Yuxtracrestal 2
MIY1 Mandíbula Izquierda Yuxtracrestal 1
MIS1 Mandíbula Izquierda Sobredimensionado 1
MIS2 Mandíbula Izquierda Sobredimensionado 2
TIY1 Tibia Izquierda Yuxtracrestal 1
TIY2 Tibia Izquierda Yuxtracrestal 2
TDC1 Tibia Derecha Control 1
TDY1 Tibia Derecha Yuxtracrestal 1
TDY2 Tibia Derecha Yuxtracrestal 2
Tabla 5: Muestras analizadas por microscopía de fluoresecencia y de color.
5.2.1. Fluorescencia
La técnica de evaluación histológica mediante microscopia de fluorescencia fue
utilizada con el fin de observar la evolución y determinar la posición de las células
madre con los dos tipos de marcaje utilizados: un marcaje con partículas nanométricas
con autofluorescencia de color verde en el lado izquierdo (I), y un marcaje por
transfección genética consistente en la expresión de una proteína con fluorescencia
verde (GFP) en las muestras correspondientes al lado derecho (D).
A continuación, se muestran las imágenes originales a grandes aumentos obtenidas por
microscopía, así como las imágenes tratadas mediante Photoshop, con el fin de tener
una referencia visual sobre los resultados que se comentan. No obstante, la evaluación
por microscopía de fluorescencia en este caso debería ser a nivel cualitativo y no
cuantitativo.
108
Por lo tanto, dichas imágenes han sido el punto de partida para analizar comparativa y
cualitativamente las diferencias de observación entre las células marcadas con
nanopartículas y con GFP(Green Fluorescent Protein).
En las muestras control no se observa ningún tipo de marcaje en el tejido tanto en
maxilar como en tibia ya que no hay células madre.
Ilustración 51: Corte Implante Maxilar derecho Control y Tibia derecha Control
En las muestras correspondientes a implantes insertados en maxilar, se observa mejor el
marcaje del lado izquierdo correspondiente a las nanopartículas fluorescentes, que el del
lado derecho, el cual consiste en el marcaje con GFP.
Esta diferencia se aprecia en las muestras sobredimensionadas izquierdas, en las cuales
se pueden identificar mejor las partículas fluorescentes a los mismos aumentos en
comparación con muestras yuxtacrestales derechas.
109
Ilustración 52: Corte Implante Maxilar Derecho Yuxtracrestal 1 y 2
Ilustración 53: Corte Implante Maxilar Izquierdo Yuxtacrestal 1
Ilustración 54: Corte Implante Maxilar Izquierdo Sobredimensionado 1 y 2
En las muestras correspondientes a defectos sobredimensionados, las partículas
fluorescentes identificadas se observan a lo largo del implante debido al tipo de defecto
ocasionado. Como este defecto consiste en un lecho de implantación de mayor diámetro
y un relleno óseo alrededor, las partículas se reparten por el tejido contiguo a la
superficie externa del implante.
110
Sin embargo, en las muestras yuxtacrestales no se observan las partículas a lo largo del
perfil del implante, ya que en este caso el defecto creado fue yuxtacrestal y no se han
repartido por la zona.
Por tanto, cuando se trata de implantación en maxilar, se observa mucho mejor las
partículas insertadas con el cemento óseo en un defecto sobredimensionado que en uno
yuxtacrestal.
Si se comparan las imágenes entre maxilar y tibia se observa que en el tejido óseo de la
tibia la presencia de partículas fluorescentes se identifica con más facilidad que en
maxilar.
En el caso de las muestras yuxtacrestales derechas se observan perfectamente las
partículas fluorescentes, las cuales corresponden a las células marcadas con GFP, aun
siendo un defecto yuxtacrestal.
Cabe destacar que los implantes insertados en tibia han atravesado todo el tejido cortical
y han llegado a penetrar en la zona esponjosa, lo que podría influenciar en la
distribución de las partículas por el tejido 87
.
Ilustración 55: Corte Implante Tibia Derecha Yuxtacrestal 1 y 2
Ilustración 56: Corte Implante Tibia Izquierda Yuxtacrestal 1 y 2.
111
5.3 FORMACIÓN DE DENTINA:
Los resultados de nuestro estudio experimental demostraron una evidente formación de
dentina alrededor de nuestros implantes tanto en tibia como en maxilar de los Minipigs.
Pero es importante destacar, que fue en la tibia donde se encontró una mayor formación
de dentina periimplantaria en comparación con el maxilar de los animales.
Por lo que, se puede afirmar, que la terapia con células madre constituye una línea
prometedora en la regeneración de la dentina ya que, la pulpa dental, contiene células
madre que pueden diferenciarse en odontoblastos formadores de dentina.
En las siguientes imágenes se muestran los cortes descalcificados teñidos mediante
Hematoxilina-eosina. Esta técnica es una de las más utilizadas en histología animal, ya
que las características de los compuestos que la forman hacen posible observar al
microscopio óptico las células individualizadas y sus núcleos, que se tiñen de forma
diferenciada.
Se puede diferenciar perfectamente la capa de dentina mineralizada de color rosa
oscuro, ya que tiene más afinidad por la hematoxina que la predentina, de color rosa
pálido.
La predentina es una capa de dentina sin mineralizar, situada entre los odontoblastos y
la capa circumpulpar. Es la primera capa de matriz extracelular que forman los
odontoblastos y es de mucha importancia ya que constituye una fuente de producción
continua de dentina durante todo el ciclo vital del diente.
Ilustración 57: Dentina, predentina y odontoblastos. Técnica por descalcificación y HE.
112
En la interfase entre ambas, se pueden distinguir los calcosferitos, que son núcleos de
cristalización globulares que se producen por la aposición de cristales de hidroxiapatita
Se observa también, la capa odontoblástica adyacente a la predentina, que está
constituida por los odontoblastos dispuestos en empalizada.
Bajo los odontoblastos se encuentran lo que algunos autores denominan como células
subodontoblásticas de Köhl, que proceden de la última división mitótica que da origen a
los odontoblastos.
En la siguiente imagen se puede apreciar el tejido conjuntivo laxo con distintos tipos
celulares (fibroblastos, células ectomesenquimáticas y macrófagos), vasos sanguíneos y
nervios.
También se pueden observar las células odontoblásticas y sus prolongaciones que
forman los túbulos dentinarios que penetran en la dentina.
Ilustración 58: Detalle de zona odontoblástica y dentina. Técnica por descalcificación y HE.
113
6. DISCUSIÓN
114
Los tratamientos con implantes osteointegrados requieren una adecuada cantidad y
calidad de hueso no disponible en todas las situaciones, por lo que se han descrito
técnicas alternativas, destacando entre todas, la Regeneración Ósea Guiada.
Los principios en los que se basa dicha técnica son los desarrollados a partir de las
primitivas técnicas de regeneración tisular guiada y su actual evolución con la inclusión
de plasma rico en factores de crecimiento, de los nuevos materiales de injerto a base de
hidroxiapatita reabsorbible y la aparición de membranas cada vez más eficaces.
Todo ello ha dado lugar a que se convierta en la técnica de elección y de máxima
aplicación en la mayor parte de los casos en los que es necesario usar procedimientos de
regeneración ósea periimplantaria.
Dahlin realizó un trabajo en el que establecieron cinco condiciones para la
predictibilidad de la formación de hueso aplicando las técnicas de Regeneración Ósea
Guiada, que consistían fundamentalmente en la presencia de células osteogénicas,
adecuada vascularización, estabilidad mecánica de la zona de la herida, mantenimiento
del espacio a regenerar y por último, la exclusión del tejido blando 88
.
La interacción entre las células y la superficie de los implantes, así como el tratamiento
de dicha superficie, son de esencial importancia para lograr la osteointegración y el
éxito clínico 76.
En la actualidad, se realizan numerosos procedimientos de reparación de hueso
mediante el uso de injertos óseos. Sin embargo, el procedimiento de obtención de
dichos injertos, es invasivo y en ocasiones, induce a la morbilidad de la zona donante.
Por otro lado, estos injertos óseos tienen una utilidad limitada debido a los riesgos de
rechazo inmunológico y de transmisión de enfermedades infecciosas.
Existen otros inconvenientes como la reabsorción de los injertos, la dificultad para
ajustarse a los defectos y la cantidad de injerto necesaria para rellenar determinados
defectos óseos por completo, ya que a veces resulta insuficiente.
La ingeniería tisular representa una alternativa, ya que puede crear tejido funcional
usando polímeros biocompatibles y biodegradables y células vivas logrando así la
neoformación ósea.
115
1. Regeneración ósea con células madre:
Las células madre son de especial importancia en el campo de la ingeniería de tejidos ya
que sirven como una fuente inagotable proliferativa en las terapias de reemplazo y de
regeneración de defectos óseos.
La medicina regenerativa y la biotecnología están revolucionando la práctica de la
medicina y los numerosos avances que se están produciendo en este campo están
ayudando a impulsar el uso de células madre para regeneración de tejidos, lo que se está
transformando ya en una realidad clínica.
Existen numerosos estudios que muestran que el uso de células madre mesenquimales
humanas o MSC, mejoran de manera significativa la oseointegración y ayudan a
promover la neoformación ósea, ya que contribuyen a reducir la inflamación evitando
así el desarrollo de lesiones periodontales; y ejerciendo a su vez un efecto de
neovascularización 89,90,91
.
Las MSC se localizan principalmente de la médula ósea y del tejido adiposo.
A diferencia de las células madre de la médula ósea o BMSCs, las del tejido adiposo o
ASC, se pueden obtener fácilmente en grandes cantidades por medio de la liposucción
bajo anestesia local, ya que se considera que el tejido adiposo es la fuente más rica de
MSC. Sin embargo, las ASC presentan una capacidad reducida de diferenciación en
hueso y cartílago en comparación con las BMSCs 92,93
.
Lin y cols. demuestran que las células madre de la médula ósea y del tejido adiposo son
capaces de regenerar el hueso alveolar y formar una estructura similar a la del ligamento
periodontal 94
.
Muchas de las técnicas utilizadas en la ingeniería de tejidos, precisan del uso de
membranas que pueden ser naturales o sintéticas. Están diseñadas para soportar la
adhesión, la propagación de las células y para ayudar a depositar el nuevo tejido óseo.
Estas membranas deben cumplir unas características químicas y físicas específicas
como ser biocompatibles, biodegradables, estables y resistentes.
116
Por lo tanto, la utilización de una matriz para transportar las células madre a la zona del
defecto es de vital importancia, por lo que es necesario el uso de un biomaterial y de una
membrana para que el resultado de la regeneración periimplantaria o de la colocación
del implante resulte exitosa, ya que tanto la manipulación de dichas células madre,
como su almacenamiento dentro del defecto, y la manera de evitar la intromisión de
otros tejidos, resultan complejas, lo cual se correlaciona con la sistemática utilizada en
estudio del Dr D’Aquino y colaboradores 47
.
Las células madre dentales son células multipotenciales y por lo tanto, pertenecen al
grupo de células madre adultas y tienen capacidad de formar células con carácter
osteo/odontogénico, adipogénico y neurogénico. Se clasifican en:
1. Células madre de la pulpa dental (DPSCs), que fueron aisladas por primera vez
por el grupo de Gronthos y cols en el año 2000 tras la exodoncia quirúrgica de
terceros molares incluidos.
Su enfoque terapéutico precisa de una interacción correcta con los diferentes
biomateriales, que van a servir de soporte para su aplicación.
Las SBP-DPSCs son una subpoblación de DPSCs que presentan la capacidad de
diferenciarse hacia osteoblastos, pudiendo reconstruir in vitro estructuras
tridimensionales que se pueden diferenciar en osteoblastos.
Las células madre pulpares presentan la ventaja de un fácil acceso (tan solo se
precisa la exodoncia de la pieza dentaria), gran capacidad de diferenciación y
correcta interacción con los biomateriales, por lo que se consideran como muy
adecuadas en procedimientos de regeneración tisular.
2. Células madre de dientes deciduos (SHEDs), identificadas en 2003 por Miura y
cols. en la cámara pulpar de dientes temporales.
Presentan un nivel de proliferación mucho más alto que las células madre
mesenquimales derivadas de médula ósea y que el de las DPSCs. Tienen
capacidad de diferenciarse en odontoblastos y osteoblastos, siendo muy útiles en
regeneración ósea, así como en células angiogénicas para regeneración de tejido
conjuntivo.
117
3. Células madre de la papila dental (SCAPs): Sonoyama y cols fueron los
primeros en estudiar las células que se localizan en el ápice de la papila de los
dientes permanentes que no han terminado su apicoformación. Las SCAPs
parecen las responsables de regenerar la raíz, y se encuentran situadas entre la
papila apical y la pulpa.
4. Células madre del folículo dental (DFPCs): El folículo dental es un tejido
conectivo que rodea a los dientes en formación, y que ha sido considerado desde
hace años como un tejido multipotente, debido a su capacidad para formar
cemento, hueso alveolar y ligamento periodontal. Las DFPCs fueron
descubiertas por primera vez por Morsczeck y cols. en el año 2005.
5. Células madre del ligamento periodontal (PDLSCs): Durante la maduración del
diente se produce la maduración del ligamento periodontal, cuya función será
soportar presiones durante las fuerzas oclusales. La presencia de múltiples tipos
de células en el periodonto sugiere que este tejido contiene células madre
llamadas PDLSCs que mantienen la homeostasis y la regeneración del tejido
periodontal.
Se considera que, en comparación con las células madre de la médula ósea llamadas
BMScs, las DPSCs son las mejores candidatas para el estudio de la formación ósea
debido a su alta capacidad de proliferación y diferenciación a osteoblastos, así como su
fácil obtención y disponibilidad 95,96
.
Al tener un origen ectomesenquimal, las DPSCs contienen marcadores específicos de
hueso y depositan una matriz extracelular, que con el tiempo genera tejido óseo
mineralizado 95,97,98,99
.
Yamada y cols. evaluaron la regeneración ósea en defectos mandibulares de perros con
células madre mesenquimales de médula ósea (BMSCs), con células madre de la pulpa
dental (DPSCs) y con células madre de los dientes de leche de sus cachorros. Se
observó la formación de hueso en los 3 grupos del estudio en comparación con el grupo
control (vacío o con plasma rico en plaquetas “PRP”) 100
.
118
Liu Y. y cols. hicieron un estudio en modelos de experimentación porcino, a los que se
les generó una lesión periodontal en la zona de los primeros molares mediante la
extirpación quirúrgica de hueso, en donde se trasplantaron células madre del ligamento
periodontal que habían sido obtenidas previamente de dientes extraídos de los mismos
cerdos.
Así, llegaron a la conclusión de que las PDLSCs eran capaces de regenerar los tejidos
periodontales, por lo que podían solucionar problemas de periodontitis 101
.
2. Regeneración ósea en distintos tipos de defectos periimplantarios:
En el estudio de experimentación desarrollado, se colocaron implantes Klockner KL en
defectos óseos de maxilares y tibias de cerdos “minipig” junto a células madre de origen
pulpar (DPSCs) y biomateriales para demostrar que se produce regeneración ósea de
dichos defectos y para analizar la osteointegración de los implantes utilizados.
Se utilizaron tres modelos de inestabilidad periimplantaria con el objetivo de comprobar
el funcionamiento de dichas células madre junto a biomateriales.
Los defectos que obtuvieron mejores valores histológicos de formación ósea fueron los
de geometría yuxtacrestal, por lo que los implantes con defectos yuxtacrestales tienen
mayor capacidad de osteointegrarse que los implantes control.
Esto nos permite afirmar que un implante colocado en una situación de debilidad
periimplantaria, ya sea postextracción o con la presencia de un defecto previo, con la
utilización de células madre puede adquirir valores de osteointegración mayores que un
implante estándar.
En los implantes con defectos sobredimensionados, debido a los micromovimientos
producidos por el ensanchamiento del defecto en el momento de colocar el implante, las
células madre no resultaron tan efectivas como en el caso de los implantes
yuxtacrestales 102,103,104,105
, por lo que esta eficacia se ve disminuída en los casos en los
que no se consigue una estabilidad primaria.
119
Los implantes sobredimensionados del lado derecho al ser colocados junto al
biomaterial, el cual aportaba mayor estabilidad y una consecuente disminución los
micromovimentos, no solo aumentaron el BIC y el BA, sino que en las imágenes de
fluorescencia se pueden diferenciar de manera mucho más clara las células madre
utilizadas en el lado derecho que en el izquierdo.
Es importante analizar, que la finalidad del estudio experimental en el que se procedió a
realizar defectos yuxtacrestales alrededor de los implantes, no fue solo simular un
defecto de inestabilidad periimplantaria previo, sino también la posibilidad de tratar
defectos provocados por la periimplantitis.
Estos defectos periimplantarios yuxtacrestales son similares a los producidos por la
periimplantitis, la cual se caracteriza por lesiones óseas de tipo crateriforme.
Muchos son los autores que han investigado en el tratamiento de la enfermedad
periimplantaria como Carl. E Misch, (Jung, Bashutski et al. 2012, Bombeccari, Guzzi et
al. 2013, Park, Kim et al. 2015, Ishii, Matsuo et al. 2016), pero en la gran mayoría de las
veces el tratamiento queda reducido a la eliminación de los factores causantes y del
tejido granulomatoso, por lo que en la mayoría de las ocasiones resulta muy complicado
devolver al implante a una situación de normalidad 106,107,108,109,110
.
Con nuestros resultados, sin embargo, podemos considerar que la utilización de las
DPSCs, puede aumentar las posibilidades de éxito en el tratamiento de esta enfermedad
y devolver a un implante ya colocado y que sufre enfermedad periimplantaria a una
situación incluso mejor o al menos similar a la inicial, hipótesis también valorada por
autores como Ozgur Erdogan y colaboradores 111
.
3. Regeneración ósea mediante el uso de biomateriales. Estudio histomorfométrico:
En la literatura existen algunos trabajos llevados a cabo con células madre en defectos
óseos en animales de experimentación.
En estudios como el de Bruder y cols, se insertaron células madre humanas de médula
ósea junto con hidroxiapatita y fosfato tricálcico en defectos de fémur de ratas y, para
poder compararlos, en el otro miembro de los animales se insertó sólo el biomaterial.
120
A las 8 semanas ya se podían observar en el fémur donde estaban las células madre
signos radiográficos e histológicos de neoformación ósea.
Por lo tanto, llegaron a la conclusión de que las células madre mesenquimales producen
regeneración ósea y pueden ser una alternativa a los injertos óseos 112
.
En el trabajo de Chang y cols se estudió que las células madre de la médula ósea o
BMSCs junto con la proteína morfogenética ósea o BMP mejoraba la formación de
hueso autólogo en la reparación de defectos óseos maxilares en cerdos 113
.
El mismo autor y cols, hicieron otro estudio esta vez en ratones, en el que se demostró
que las células madre mesenquimales o MSC combinadas con Wnt-4, tenían más
capacidad para regenerar tejidos óseos y para reparar grandes defectos alveolares que
las MSC por sí solas. Por lo tanto, las células Wnt-4 promovían la diferenciación
osteogénica in vitro de las MSC aisladas de tejidos craneofaciales humanos y producían
la formación de hueso in vivo 114
.
En el estudio de Niemeyer y cols, se insertaron células madre de la médula ósea BMSC
y del tejido adiposo ASC de ganado ovino en esponjas de colágeno mineralizado y se
implantaron en defectos óseos de tibia de ovejas. En un grupo adicional, se mezclaron
ASC con plasma rico en plaquetas o PRP.
Los estudios radiográficos mostraron que el grupo de células BMSC tenían mayor
cantidad de tejido óseo neoformado en comparación con las ASC por lo que se
concluyó que las ASC tienen un potencial osteogénico menor que las BMSC lo que
puede ser parcialmente compensado al añadir PRP 115
.
Por otro lado, Yamada y cols, realizaron un trabajo experimental en defectos óseos
mandibulares de perros usando por un lado PRP como membrana autóloga junto a
células madre mesenquimales (MSC), por otro lado, un segundo grupo únicamente con
121
PRP y un tercer grupo con células madre mesenquimales y partículas de hueso
esponjoso autógeno (PCBM).
Los tres grupos mostraron diferencias significativas y se demostró que la mezcla de
PRP con MSC dió lugar a la regeneración ósea de los defectos mandibulares analizados,
pudiendo servir dicha combinación como sustituto óseo osteogénico 116
.
En el trabajo de Antona LB y cols, se hizo un estudio en defectos óseos del fémur de
ratas, en donde se insertaron beta-fosfato tricálcico (β-TCP) y células madre
mesenquimales (MSC), por otro lado, sólo beta-fosfato tricálcico y por último un grupo
control con el defecto sin rellenar.
En el grupo en el que se empleó β-TCP junto a células madre mesenquimales, se pudo
observar cierta actividad osteogénica, pero sin diferencias importantes por lo que se
llegó a la conclusión de que esta combinación no generaba resultados significativos de
regeneración ósea 117
.
Existen numerosos estudios de diferentes autores en los que se utilizaron células madre
de la pulpa dental o DPSCs para regenerar defectos óseos en animales de
experimentación:
Costa y cols estudiaron la reconstrucción de defectos de hueso craneal en la región
parietal de ratas mediante células madre de la pulpa dental (DPSCs). Para ello, se
establecieron tres grupos, uno en donde se colocaron membranas de colágeno con
DPSCs, otro únicamente con membranas y por último, el grupo control sin ningún tipo
de relleno.
Después de un análisis exhaustivo se observó, una mayor formación de hueso maduro
en el lado de la membrana de colágeno con DPSCs, en comparación con los otros
grupos del estudio 118
.
122
Graziano y cols. mostraron que al trasplantar células CD34 obtenidas de la pulpa dental
(DPSCs) en el tejido subcutáneo de ratas, se formaron nódulos óseos 119
.
Con respecto a los defectos de hueso alveolar, Liu H.c. y cols. hicieron un estudio en
conejos y mostraron que las DPSCs expresaban la proteína morfogenética ósea 2 (BMP-
2) y daban lugar a neoformación ósea 120
.
Recientemente se ha investigado mucho sobre el papel de las DPSCs en la regeneración
ósea alrededor de los implantes dentales y fue en un estudio de Ito y cols, en el que se
utilizaban DPSCs, BMSCs y células del periostio todas ellas combinadas con plasma
rico en plaquetas (PRP) y se trasplantaban junto a implantes en defectos óseos
mandibulares de perros. Tras el análisis histológico e histomorfométrico de las
muestras, se observó que las DPSCs son las que tenían mayor potencial ostogénico 121
.
Por otro lado, Bernabé y cols. hicieron un estudio en el que hacían defectos óseos en
tibias de 64 ratas y las dividían en cuatro grupos diferentes: grupo I (control), grupo II
(defecto rellenado con el injerto óseo llamado GenOxs), grupo III (defecto cubierto de
membrana GenDerm) y grupo IV (defecto rellenado con GenOxs y cubierto de
GenDerm). Se demostró que todos los grupos tuvieron una formación ósea superior a la
del grupo control, siendo el grupo IV en el que mayores valores de formación de hueso
se registraron 122
.
Ito y cols. realizaron un estudio en el que los implantes se colocaron en defectos óseos
regenerados con materiales de injerto (MSC con PRP y fibrina, MSC y fibrina, fibrina o
no regenerado). La regeneración ósea periimplantaria más óptima tuvo lugar cuando se
utilizaron MSC con PRP y fibrina 123
.
123
Por otro lado, Kim y cols, utilizaron células madre del ligamento periodontal (PDLSCs),
y de la médula ósea (BMSCs) junto a hidroxiapatita y fosfato tricálcico (HA/TCP) para
estudiar si se producía regeneración ósea en defectos periimplantarios en la mandíbula
de perros. Dicha regeneración fue más efectiva en los grupos con células madre que en
el grupo control (sólo con HA/TCP) y fue el grupo de las BMSCs, el que obtuvo los
valores más altos de neoformación ósea 124
.
Por otro lado, Calvo Guirado y cols. han escrito numerosos artículos en los que estudian
el uso de injertos óseos para lograr la regeneración ósea de defectos en modelos de
animales de experimentación y la aplicación de la melatonina.
Respecto a la melatonina, realizó un estudio en tibia de conejos, en el que evaluó su
aplicación tópica en injertos óseos en comparación con los injertos de hueso porcino
colagenizado (MP3).
Los resultados mostraron que los injertos impregnados con melatonina eran los que
obtuvieron valores superiores de formación ósea cortical, por lo que se consideró que
podría funcionar como estimulador óseo en comparación con el MP3 y grupos
control125
.
También resulta interesante el artículo en el que analiza si la melatonina mejoraba la
diferenciación de células madre mesenquimales adultas (MSCs) en osteoblastos, en
comparación con las MSC cultivadas con dexametasona (DEX). Los resultados
mostraron que la melatonina estimuló la viabilidad y la actividad de las MSC haciendo
que se diferenciasen tempranamente en osteoblastos de manera directamente
proporcional a la concentración de la dosis de la melatonina. Por lo tanto, se consideró
que podría ser aplicada como agente farmacéutico para promover la regeneración
ósea126
.
124
Así mismo, comparó junto a otros autores, la capacidad de dos matrices óseas
desmineralizadas (DBMs) , una de ellas enriquecida con ácido hialurónico y la otra sin
enriquecer; de estimular in vitro la proliferación y diferenciación osteogénica de células
madre humanas del tejido adiposo (ADSCs), insertadas en una membrana
osteoconductiva.
En los resultados se observó que ambas DBM tenían capacidad de inducir a estas
células a la diferenciación osteogénica.
Por lo tanto, se podía concluir que las células madre humanas del tejido adiposo eran
capaces de adherirse, proliferar y diferenciarse en células similares a los osteoblastos,
incluso en ausencia de factores osteogénicos 127
.
Por otro lado, José Luis Calvo Guirado y otros colaboradores estudiaron la
remodelación ósea fisiológica después de la colocación del implante en alveolos
postextracción de las mandíbulas de cinco perros Beagle con y sin la aplicación de
procedimiento regenerativo (hueso porcino y membrana reabsorbible) alrededor de
dichos implantes.
Los resultados mostraron que las técnicas regenerativas empleadas fueron capaces de
limitar la reabsorción de la cresta alveolar después de las extracciones dentales 128
.
También hicieron un estudio para comparar la neoformación ósea y la reabsorción de la
cresta ósea resultantes al rellenar los alveolos postextracción en mandíbulas de perros
con dos tipos de biomateriales: por un lado hueso bovino Endobone y hueso porcino
MP3.
Llegaron a la conclusión de que era el hueso porcino MP3 el que proporcionó los
valores más altos de formación ósea y de reabsorción del biomaterial tanto en defectos
grandes como en pequeños 129
.
Es importante destacar otro trabajo que realizó con sus colaboradores, en defectos óseos
de tibias de conejos en los que colocaron injerto bovino en la tibia izquierda (4Bone), e
injerto porcino en la tibia derecha (OsteoBiol, MP3)
125
Los resultados mostraron reparación completa de los defectos óseos en ambos lados y el
análisis histomorfométrico mostró que el injerto porcino tenía valores más altos de
neoformación ósea y que se reabsorbió más rápidamente que el injerto bovino.
Los autores concluyeron que dependiendo de las necesidades clínicas, cada biomaterial
podría ser útil en la práctica clínica diaria 130
.
Además, Calvo Guirado y cols., realizaron un estudio en el que evaluaron la
regeneración ósea formada en defectos mandibulares en perros Beagle, estableciendo
así tres grupos: Grupo A con hidroxiapatita junto a betafosfato tricálcico (HA/ βTCP),
grupo B con HA / β-TCP más 3% de silicio y un grupo control sin rellenar.
Tras el estudio histológico e histomorfométrico llegaron a la conclusión de que la HA /
β-TCP más 3% de silicio aumenta la formación de hueso en defectos de tamaño crítico
y la incorporación de 3% de silicio reduce la tasa de reabsorción de HA / gránulos 131
.
También es interesante señalar, el trabajo en el que se estudió el proceso de
caracterización y la aplicación in vivo de betafosfato tricálcico de alta porosidad
llamado 4 Bone (HA 60% y β-TCP 40%) en defectos óseos de las tibias de conejos.
Los resultados mostraron valores muy positivos en cuanto a la neoformación ósea en
comparación con el grupo control por lo que llegaron a la conclusión de que este
biomaterial inducía a la regeneración de defectos óseos, facilitando el crecimiento de
hueso 132
.
Además, hizo dos estudios en los que analizaba el uso de membranas de colágeno
reabsorbibles en defectos óseos en tibias de conejo:
Por un lado, se investigó el efecto de las membranas de colágeno reabsorbibles (RCM)
en defectos óseos rellenos con betafosfato tricálcico o βTCP llamado 4Bone.
126
Para ello se diferenciaron tres grupos: Grupo A (4Bone), Grupo B (4Bone junto a
membrana de colágeno reabsorbible RCM) y Grupo C (Grupo de control sin rellenar).
Tanto el análisis radiológico como la evaluación histomorfométrica mostraron que el
βTCP permitía la formación de tejido mineralizado y que la adicción de membranas de
colágeno absorbibles mejoró la neoformación ósea en comparación con los grupos no
tratados con membrana 133
.
En el otro estudio, se investigó mediante el análisis radiológico e histomorfométrico, el
efecto de las membranas de colágeno reabsorbibles sobre defectos óseos también en
tibias de conejo rellenas con betafosfato tricálcico o βTCP llamado Ossceram.
Para ello se analizaron tres grupos: Grupo A (Ossceram), Grupo B (Ossceram más
membrana Alveoprotect) y Grupo C (Grupo de control sin rellenar). Tanto el análisis
radiológico como la evaluación histomorfométrica mostraron que el βTCP permitía la
formación de tejido mineralizado y que la adicción de membranas de colágeno
absorbibles mejoró la neoformación ósea en comparación con los grupos no tratados
con membrana 134
.
En nuestro trabajo de experimentación se llevó a cabo un estudio histomorfométrico en
el que se analizaron los parámetros BIC y BA.
El parámetro BIC “Bone Implant Contact” (contacto hueso-implante) calculaba el
porcentaje de tejido óseo en contacto con el implante y los resultados obtenidos
indicaron una regeneración significativamente más alta en el lado derecho que en el
izquierdo, lo cual se corrobora con el aumento observado del “Bone Area” o BA en este
lado del maxilar. Por lo tanto, se puede afirmar que la utilización de células madre junto
a biomaterial produce una sinergia, por lo que el biomaterial no solo sirve como
vehículo, sino que mantiene la zona inmovilizada, evitando así el colapso del tejido
blando y la entrada de células de otra estirpe celular, dado lugar a un aumento del
porcentaje de células madre que se diferenciaron en osteoblastos.
127
Esta sinergia tiene estrecha relación con lo demostrado por autores como D’ Aquino o
B.R Coyac y colaboradores junto a otros (D’Aquino, De Rosa et al. 2009,
Govindasamy, Ronald et al. 2011, Coyac, Chicatun et al. 2013, Feng and Lengner 2013)
135,136,137,138.
Los únicos datos que no se ajustan a esta afirmación son los obtenidos en el BIC de las
tibias, pero tras estudiar en profundidad los cortes de los implantes tibiales, tenemos que
tener en cuenta la corticalidad de este hueso y la capacidad regenerativa de la medula
ósea perforada.
Por lo tanto, las células osteoprogenitoras de la médula influyen en el resultado final.
Esta respuesta regenerativa de la medula ósea de la tibia es corroborada por autores
como Daniela Carmagnola y colaboradores (Carmagnola, Abati et al. 2008, Park, Kim
et al. 2011, Bernabe, Melo et al. 2012, Erdogan, Supachawaroj et al. 2015), de ahí que
los valores obtenidos de BIC en las tibias no sean significativos 139,109,122,111
.
Aun así los valores de BA, siguen siendo muy similares entre lado derecho e izquierdo.
Merecen ser destacados trabajos como los de los autores Buser y colaboradores (Buser
D. et al. 1999, Cochran D.L. et al. 2002, Calvo Guirado J.L. et al. 2010) en los que se
establece que los implantes con superficies rugosas mostraban una mejor aposición
ósea y un porcentaje más elevado de contacto hueso-implante (BIC) que los implantes
con superficies lisas, lo que se traducía en una osteointegración más rápida140,141,142
.
Además otros autores como Matsuo y colaboradores (Matsuo, M. et al. 2000, Plakco
H.E. et al. 2000, Novaes A.B. et al. 2002) afirmaron que esta rugosidad de la superficie
de los implantes, influía positivamente en la proliferación y migración celular, lo que
proporcionaba valores más elevados de BIC. Por lo tanto, llegaron a la conclusión de
que la microestructura del implante contribuía en la interacción biomaterial-tejido
143,144,145.
128
Por otro lado, Clavo Guirado y cols. realizaron un estudio en seis perros en cuyas
mandíbulas se colocaron tres implantes inmediatos crestales y subcrestales.
Los resultados mostraron menor reabsorción ósea en los implantes posicionados a dos
milímetros de la cresta, por lo que afirmaron que la colocación subcrestal de un
implante, también podía proporcionar una ventaja al facilitar un BIC previo en el cuello
de los implantes 146
.
En otro trabajo de este mismo autor, se estudió el efecto de la aplicación tópica de la
melatonina mezclada con hueso porcino MP3 sobre la osteointegración de los implantes
en la mandíbula de perros Beagle.
En el análisis histomorfométrico se observó que las zonas con implantes junto a
melatonina y hueso porcino tenían valores superiores en cuanto a perímetro óseo que
estaba en contacto directo con los implantes (BIC), densidad ósea y nueva formación
ósea, en comparación con las zonas que sólo se había insertado hueso porcino alrededor
de los implantes. Por lo tanto, concluyeron que la combinación de melatonina y hueso
porcino MP3 aumentaba el BIC y disminuía la pérdida de hueso de la cresta 147
.
4. Fluorescencia:
Los resultados de fluorescencia han permitido asegurar que las células objeto del
estudio han servido al fin previsto, y que después de la osteointegración del implante,
dichas células se diferenciaron en tejido óseo.
Además, no se detectaron imágenes relacionadas con fibrointegración en las muestras
analizadas.
El uso de la técnica de fluorescencia como método de evaluación histológica ha sido
utilizado desde hace tiempo por otros autores como R. De Barros entre otros. (de
Barros, Novaes et al. 2012, Suaid, Novaes et al. 2014,) 148,149
.
129
En el estudio histológico de fluorescencia, tiene un papel fundamental el uso del
microscopio de fluorescencia, el cual permite la observación de los fluoróforos o
sustancias fluorescentes, que se utilizan como marcadores para la detección de
moléculas tisulares.
Éstos absorben en el rango de la luz ultravioleta y emiten en el rango de la luz visible.
Para determinar el rango de longitud de onda con que serán iluminados, se usan filtros
específicos localizados entre la fuente y la muestra que sólo dejan pasar un determinado
rango de frecuencias.
Mientras que en los microscopios de fluorescencia convencionales aparece una luz
difusa que proviene de los fluoróforos del tejido que se encuentran fuera del plano de
enfoque, en los microscopios confocales, se consiguen imágenes de mayor nitidez al
discriminar esta luz difusa 150
.
5. Regeneración dentinaria:
La pulpa dental es esencial para mantener las funciones dentarias, tales como las
funciones sensoriales, la formación de dentina, la nutrición y las reacciones de defensa.
(Nagaoka et al., 1995; Jontell et al., 1998) 151,152 .
La dentina proporciona apoyo mecánico y protección de la pulpa, pero si pierde su
integridad estructural puede quedar expuesta a diferentes estímulos adversos.
La dentina reparadora se forma para mantener la integridad de la estructura de la
dentina durante una lesión o traumatismo, y evitar así el daño o exposición de la pulpa,
que obliga a su eliminación debido al riesgo de necrosis.
Actualmente, el agregado de trióxido mineral (MTA) y el hidróxido de calcio son
materiales comunes de revestimiento para restaurar la pulpa expuesta, pero las
indicaciones son limitadas.
La ingeniería tisular basada en células madre constituye una alternativa prometedora
para la regeneración dentinaria.
130
Tanto las células madre de pulpa dental (DPSCs), las células madre de la parte apical de
la papila (SCAP) y las células madre de los dientes deciduos exfoliados (SHED) son las
tres candidatas ideales para la regeneración de la dentina (Iohara et al., 2004; Sonoyama et
al., 2006, Huang et al., 2008, Alsanea et al., 2011) 153,154,60,155
.
En nuestro estudio experimental con células madre pulpares de Minipigs, se han
obtenido muestras que indican una evidente formación de dentina alrededor de los
implantes insertados en los defectos óseos realizados en tibia y maxilar de los animales.
Por lo tanto, se puede afirmar, que la terapia con células madre constituye una
prometedora línea de investigación en la regeneración de la dentina, ya que la pulpa
dental, contiene células madre que pueden diferenciarse en odontoblastos formadores de
dentina.
Estos odontoblastos son células especializadas que se encargan de sintetizar los distintos
tipos de dentina y que se ubican en la unión pulpa-predentina.
Pertenecen tanto a la pulpa como a la dentina, porque su cuerpo se localiza en la
periferia pulpar y sus prolongaciones se alojan en los túbulos de la dentina.
Gronthos y cols. afirmaron que las células madre de la pulpa dental o DPSCs fueron
capaces de formar dentina ectópica y tejido pulpar asociado in vivo 51
.
Nakashima realizó un trabajo en 1994, en el que se examinó la proteína morfogenética
de hueso humano recombinante (BMP-2, BMP-4) y el factor de crecimiento
transformante (TGF) -β1 combinado con matriz de colágeno como soporte, para
determinar sus efectos sobre la regeneración de la pulpa y la formación de dentina. Los
hallazgos sugirieron que tanto BMP-2 como -4 inducían la formación de gran cantidad
de osteodentina si se combinaban con la matriz de colágeno 156
.
En 2003, Nakashima y cols, hicieron un estudio en el que mediante terapia genética,
optimizaron la transferencia de genes de crecimiento y diferenciación del factor 11
(Gdf11) y un plásmido de ADN en células madre de la pulpa dental in vivo, lo que
estimuló una gran cantidad de formación de dentina reparadora en la pulpa dental en
131
dientes de perros in vivo. Estos resultados sugieren el posible uso de BMPs utilizando
terapia mediada por ultrasonido para el tratamiento dental endodóntico 157
.
Iohara y cols, realizaron un experimento en perros en el que obtuvieron grandes
cantidades de formación de dentina reparadora en la pulpa dental inducida con la BMP-
2 comparado con el grupo control. Por lo que llegaron a la conclusión de que la terapia
celular con BMP2 podía convertirse en una realidad clínica para la caries y la terapia
endodóntica ya que inducía a la diferenciación celular en odontoblastos y a la formación
de dentina153
.
Miura y cols, aseguraron que las células madre de dientes decíduos o SHEDs, tenían la
capacidad de diferenciarse in vitro en odontoblastos.
Para justificar esta afirmación trasplantaron éstas SHEDs en ratones
inmunocomprometidos, lo que produjo odontoblastos directamente asociados a una
estructura dentinaria, la cual era inmunorreactiva al anticuerpo específico de dentina
DSPP 158
.
Estos hallazgos indicaron que las SHEDs humanas tenían capacidad de diferenciarse en
odontoblastos in vivo. Sin embargo, no fueron capaces de regenerar un complejo
dentinario completo como lo hacían las células madre de la pulpa dental o DPSCs in
vivo.
En el trabajo de Batouli, Miura y otros autores, se hizo un estudio en ratones
inmunocomprometidos a los que trasplantaron por un lado células madre de la médula
ósea o BMSSCs para comprobar la formación de hueso medular; y por otro lado,
células madre de la pulpa dental o DPSCs para comprobar la formación de dentina.
En los resultados obtuvieron que la expresión de la sialoproteína dentinaria o DSP
marcó de manera específica la síntesis de dentina en los transplantes de DPSCs.
132
Además, las DPSCs fueron capaces de generar un tejido de dentina terciaria reparadora
en la superficie de la dentina humana in vivo 159
.
Por otro lado, Decup y cols, implantaron sialoproteína ósea o BSP, en la pulpa de los
primeros molares superiores de una rata y llegaron a unos resultados en los que se
demostraba que la sialoproteína ósea presentaba propiedades bioactivas y que era capaz
de estimular el desarrollo de un tejido dentinario reparador en la pulpa llenando así el
tercio mesial de la cámara pulpar 160
.
Yu Jinhua y cols, hicieron un estudio en el que se investigó el efecto de un
microambiente de células germinales (TGC) sobre la diferenciación y dentinogénesis de
las DPSC tanto in vitro como in vivo. Para ello, se aislaron las células madre pulpares
de los incisivos inferiores de ratas y se cultivaron en un medio acondicionado con las
TGC. Los resultados mostraron que las TGC crearon el microambiente más
odontogénico estimulando a las DPSCs a diferenciarse en odontoblastos funcionales y a
formar un complejo dentino-pulpar 161
.
En el estudio in vivo e in vitro de Yang y cols. se demostró que las DPSCs junto a
membranas de quitosano/colágeno dieron lugar a la formación de un complejo dentino-
pulpar y que dichas células junto a discos de HA / TCP lograron la formación de
hueso162
.
En el estudio realizado, se ha demostrado la formación de dentina alrededor de nuestros
implantes tanto en tibia como en maxilar, siendo mayor la cantidad formada en tibia, lo
que se podría justificar por la anatomía estructural de la tibia, formada por hueso
esponjoso rico en células y factores de crecimiento.
Aunque existen evidencias científicas avaladas por estudios histológicos e
histomorfométricos de regeneración ósea con el uso células madre de origen pulpar y
biomateriales en modelo de experimentación animal, es necesario completar este
proyecto, mediante el análisis del curso clínico de la reabsorción ósea en pacientes con
alto riesgo de periimplantitis en los que se han realizado técnicas de ingeniería tisular.
133
7. CONCLUSIONES
134
CONCLUSIONES:
1. Las técnicas de ingeniería tisular con el uso de células madre de origen pulpar
son eficaces en la regeneración de defectos óseos periimplantarios en tibia y
maxilar de minipig.
2. Los implantes colocados en lechos con defectos yuxtacrestales presentan
mejores valores histomorfométricos según los parámetros BIC (Bone Implant
Contact) y BA (Bone Area), respecto a los ubicados en defectos
sobredimensionados.
3. El parámetro BA (Bone Area) está influenciado directamente con el tipo de
defecto efectuado en la cirugía, mientras que el BIC (Bone Implant Contact) no
muestra diferencias estadísticamente significativas según el tipo de defecto.
4. Los resultados del estudio histológico de fluorescencia muestran que en el tejido
óseo tibial se identifican con mayor facilidad la presencia de partículas
fluorescentes que en el maxilar, ya que los implantes insertados en tibia llegan a
penetrar en la zona esponjosa, es decir, en la médula ósea, lo que influye en la
distribución de las partículas.
5. Se ha demostrado la formación de tejido dentinario a nivel periimplantario en
defectos yuxtacrestales mediante células madre de origen pulpar y de
biomateriales en tibia y maxilar de Minipig.
135
8. BIBLIOGRAFÍA
136
BIBLIOGRAFÍA:
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Albrektsson T. Prótesis oseointegradas. La oseointegración en la odontología clínica.
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147
9. ANEXOS
148
9.1 ÍNDICE DE FIGURAS
Ilustración 1: Periimplantitis (Dr. Ferrus y Bratos) ___________________________________________ 14
Ilustración 2: Clasificacion células madre __________________________________________________ 29
Ilustración 3: Detalle del borde incisal en el estadío de campana aposicional: Se distinguen las capas de
ameloblastos y odontoblastos en relación al esmalte y dentina en formación.( Gómez de Ferraris Mª. E)
___________________________________________________________________________________ 43
Ilustración 4: Disposición de ameloblastos y odontoblastos secretores.( Gómez de Ferraris Mª. E) ____ 44
Ilustración 5: Sector de transición entre las dentinas primaria y secundaria. Se observa el cambio de
dirección de los túbulos dentinarios. Técnica por desgaste, x 60.( Gómez de Ferraris Mª. E) _________ 46
Ilustración 6: Distribución topográfica de las dentinas primaria y secundaria.( Gómez de Ferraris Mª. E)
___________________________________________________________________________________ 46
Ilustración 7: Detalle de la dentina secundaria y terciaria. Se visualiza en la parte central la dentina
terciaria deformando la cámara pulpar su derecha. Técnica por mineralización. Tricrómica de Masson, x
150.( Gómez de Ferraris Mª. E) _________________________________________________________ 47
Ilustración 8: Sala de quirófano __________________________________________________________ 52
Ilustración 9: Implante Klockner KL _______________________________________________________ 54
Ilustración 10: Maxresorb ______________________________________________________________ 56
Ilustración 11: Membrana Jason reabsorbible ______________________________________________ 57
Ilustración 12: Ostell __________________________________________________________________ 58
Ilustración 13: Luxación dentaria maxilar de Minipig - Extracciones dentarias maxilar Minipig _______ 65
Ilustración 14: Campana de flujo laminar - Limas de endodoncia para extracción de la pulpa ________ 67
Ilustración 15: Pipetas utilizadas en el proceso _____________________________________________ 67
Ilustración 16: Transfección de células ____________________________________________________ 68
Ilustración 17: Marcaje con nanopartículas ________________________________________________ 69
Ilustración 18: Preparación del lecho implantológico - Protocolo inserción implantes _______________ 71
Ilustración 19: Implantes maxilar superior Minipig __________________________________________ 72
Ilustración 20: Implantes maxilar superior con membrana. ____________________________________ 72
Ilustración 21: Preparación del lecho implantológico en tibia __________________________________ 73
Ilustración 22: Colocación de implantes en tibia de Minipig. ___________________________________ 73
Ilustración 23: Implantes en tibia cubiertos con membrana. ___________________________________ 73
Ilustración 24: Radiografía maxilares y tibia Minipig _________________________________________ 74
Ilustración 25: Medición con Osstel en Maxilar y tibia. _______________________________________ 74
Ilustración 26: Implantes osteointegrado en maxilar y tibia. ___________________________________ 75
Ilustración 27: Preparación y premedicación del Minipig______________________________________ 76
Ilustración 28: Calavera Minipig 1 año ____________________________________________________ 76
Ilustración 29:Tipos de modelos de defectos utilizados. _______________________________________ 77
Ilustración 30: Descripción modelo experimental en maxilar superior de Minipig __________________ 78
Ilustración 31: Descripción modelo experimental en tibia derecha e izquierda de Minipig. ___________ 78
Ilustración 32: Fotografía del corte longitudinal de una de las muestras. _________________________ 81
Ilustración 33: Sierra de cinta de diamante EXACT 310 ( Exakt Apparatebau GmbH, Alemania) utilizada
para realizar los cortes de las muestras en este proyecto. _____________________________________ 82
Ilustración 34: Unidad foto-polimerizadora utilizada (Histolux, Kulzer-Heraus, Alemania). ___________ 83
Ilustración 35: Pulidora utilizada en el proyecto (Exakt 400 CS, Exakt, Alemania). __________________ 84
Ilustración 36: Fuente de rayos UV Exakt para polimerización utilizada. _________________________ 84
Ilustración 37: Muestra de mandíbula MIS2 pulida entre 50 y 100 µm para observación por microscopía
de fluorescencia ______________________________________________________________________ 85
149
Ilustración 38: Imagen del microscopio electrónico utilizado para el estudio de la superficie. Dispone de
detectores de electrones retrodispersados y espectrómetro de energía dispersiva de rayos X (EDX). ___ 86
Ilustración 39: Imagen general SEM obtenida mediante el cosido “stitching” de 50 micrografías tomadas
a x250 aumentos. _____________________________________________________________________ 87
Ilustración 40: Imagen obtenida a partir del procesado de imágenes con Photoshop y Image J de la zona
a evaluar para determinar el BIC en la zona delimitada por la presencia de tejido óseo de tipo cortical. 89
Ilustración 41: Imagen obtenida a partir del procesado de imágenes con SEM, Photoshop y Image J con
las zonas delimitadas para ROIs a partir de las cuales se calculará el BA. ________________________ 90
Ilustración 42: Microscopio óptico Leica AF7000 utilizado para la obtención de las imágenes de
fluorescencia y de tinción de este proyecto. ________________________________________________ 93
Ilustración 43: Imagen de fluorescencia completa de la muestra MDC1 compuesta por 150 imágenes a 10
aumentos ___________________________________________________________________________ 93
Ilustración 44: Diagrama de barras comparativo con los valores promedio del porcentaje de BIC total
según el defecto óseo realizado en la cirugía de implantación. _________________________________ 98
Ilustración 45: Diagrama de barras comparativo con los valores promedio del porcentaje de BIC total
según lado. __________________________________________________________________________ 99
Ilustración 46: Diagrama de barras comparativo del porcentaje de BIC total para cada una de las
muestras evaluadas __________________________________________________________________ 100
Ilustración 47: Imagen SEM de la muestra TDY1 - Imagen SEM de la muestra MDY2 ______________ 101
Ilustración 48: Diagrama de barras comparativo con los valores promedio del porcentaje de BA total
según el defecto óseo realizado en la cirugía de implantación. ________________________________ 102
Ilustración 49: Diagrama de barras comparativo del porcentaje de BA total para cada una de las
muestras evaluadas. _________________________________________________________________ 103
Ilustración 50: Diagrama de barras comparativo con los valores promedio del porcentaje de BA total
según lado. _________________________________________________________________________ 104
Ilustración 51: Corte Implante Maxilar derecho Control y Tibia derecha Control __________________ 108
Ilustración 52: Corte Implante Maxilar Derecho Yuxtracrestal 1 y 2 ____________________________ 109
Ilustración 53: Corte Implante Maxilar Izquierdo Yuxtacrestal 1 _______________________________ 109
Ilustración 54: Corte Implante Maxilar Izquierdo Sobredimensionado 1 y 2 ______________________ 109
Ilustración 55: Corte Implante Tibia Derecha Yuxtacrestal 1 y 2 _______________________________ 110
Ilustración 56: Corte Implante Tibia Izquierda Yuxtacrestal 1 y 2. ______________________________ 110
Ilustración 57: Dentina, predentina y odontoblastos. Técnica por descalcificación y HE. ___________ 111
Ilustración 58: Detalle de zona odontoblástica y dentina. Técnica por descalcificación y HE. ________ 112
150
9.2 ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Identificación de las muestras analizadas __________________________________________ 96
Tabla 2: Resultados numéricos de la cuantificación del BIC1, BIC2, BIC total y su desviación estándar _ 97
Tabla 3: Resultados numéricos de la cuantificación del BA promedio para cada muestra y su desviación
estándar ___________________________________________________________________________ 102
Tabla 4: Identificación de las muestras analizadas _________________________________________ 106
Tabla 5: Muestras analizadas por microscopía de fluoresecencia y de color. _____________________ 107
