Departamento de Bioloxía Celular e MolecularÁrea de Xenética

Estudo de anomalías xenéticas en humanos

Estudio de anomalías genéticas en humanos

A survey of chromosomal abnormalities in humans

Tania Verdía Cotelo

Traballo de Fin de Grao Data de defensa: 29/06/2015

Dirixido polas Doutoras Mª Montserrat Rodríguez Pedreira e Marta Vila Taboada

DeclaraciónO presente Traballo de Fin de Grao (TFG) realízase no marco dunha colaboración entre oSERGAS e a UDC. Ao tratarse dun diagnóstico molecular, a alumna non puido procesarpersoalmente as mostras analizadas (imperativo legal). Con todo, a alumna estivo presente nolaboratorio en todo momento e foi instruida polas persoas que realizaban eses procesos. Asfases de laboratorio nas que a normativa permite a manipulación por persoal alleo (v.g. partedo protocolo de extracción de ADN xenómico, cuantificación da cantidade/calidade do ADN enespectrofotómetro) sí foron realizadas pola alumna, obviamente baixo supervisión. As análisesbioinformáticas tamén foron realizadas pola alumna, dirixida polo persoal do SERGAS.

Dado que o TFG do Grao en Bioloxía pola UDC implica unha carga de traballo de 150 horas, aalumna a as súas titoras desexan especificar a distribución dese tempo.

Tarefa Horas Persoas implicadasRecollida de información xenealóxica e xenética dispoñible sobre o caso de estudo

5 Alumna, Dra. Rodríguez

Revisión da bibliográfica e discusión inicial 15 Alumna, Dras. Rodríguez e VilaTraballo de laboratorio 80 Alumna, equipo da Dra.

RodríguezAnálise de resultados 10 Alumna, equipo da Dra.

RodríguezElaboración da memoria 40 Alumna, Dras. Vila e RodríguezTotal 150

Pola presente ambas as dúas titoras autorizan a prentación deste Traballo de Fin de Graorealizado por Dª Tania Verdía Cotelo para ser defendido o día 29 de xuño de 2015 ante otribunal cualificador correspondente.

A Coruña, 18 de xuño de 2015,

Marta Vila Taboada e Montserrat Rodríguez Pedreira

AgradecementosEn primeiro lugar agradecerlle ao Dr. José Luis Fernández García, xefe da Unidade de XenéticaClínica e Molecular do Complexo Hospitalario Universitario da Coruña (CHUAC), a granoportunidade que me ofreceu permitíndome desenvolver este TFG nos laboratorios doHospital Teresa Herrera.

En segundo lugar, e con elo non menos importante, darlle as grazas ás miñas titoras, asdoutoras Montserrat Rodríguez Pedreira (CHUAC) e Marta Vila Taboada (UDC), por termeprestado atención cando espuxen o caso e apoiar en todo o momento que a partir del puideserealizar o presente TFG. Moitas grazas por todo ese apoio e polo tempo de atención durante aelaboración do documento.

Quería agradecer tamén ao Dr. Alejandro Mosquera Rey (CHUAC) todo o tempo que investiuneste traballo, particularmente as súas excelentes explicacións de protocolos de laboratorio eanálises bioinformáticas.

Por último, unha mención a todo o persoal do Laboratorio de Xenética, especialmente a LoliVázquez Calenti, pola súa supervisión no procesamento das mostras.

Contido

Resumo / abstract........................................................................................................................1

Introdución...................................................................................................................................2

CGH-arrays (Comparative Genomic Hybridization Arrays)........................................................2

Limitacións do CGH-array.........................................................................................................3

Comparativa con outros métodos............................................................................................4

Consello xenético.....................................................................................................................5

Historia familiar........................................................................................................................5

Obxectivos / objectives................................................................................................................8

Material e métodos......................................................................................................................9

Árbore familiar.........................................................................................................................9

Elección da proba axeitada para determinar os puntos de ruptura..........................................9

Determinación dos probandos ideais.......................................................................................9

Extracción de ADN e procesamento das mostras para a realización do CGH-array..................9

Extracción ADN de sangue periférico...................................................................................9

Repurificación do ADN .......................................................................................................10

Dixestión.............................................................................................................................10

Reacción de marcado (en escuridade)................................................................................10

Hibridación.........................................................................................................................11

Lavado do porta..................................................................................................................12

Escaneado do porta............................................................................................................12

HCForum e riscos de transmisión.......................................................................................12

Resultados..................................................................................................................................13

Lectura do KaryoArray 8x60K.................................................................................................13

Afecta número 1 (77140169)..............................................................................................13

Afecta número 2 (77140170)..............................................................................................15

Diagrama de Paquitene e cálculo de riscos............................................................................18

Discusión....................................................................................................................................20

Xenes, enfermidades e fenotipos asociados...........................................................................20

Implicacións............................................................................................................................21

Riscos de transmisión.........................................................................................................21

Probas prenatais.................................................................................................................22

Conclusións /conclusions...........................................................................................................23

Bibliografía.................................................................................................................................24

Anexo 1......................................................................................................................................25

1

Resumo/AbstractNeste traballo retómase a análise xenética dunha familia na que existen casos de retrasopsicomotor,abortosespontáneosenaqueosestudoscitoxenéticosrealizadoshai20anosnonforonconcluíntes,xaquecómpreunhametodoloxíamáisprecisaparaadeterminaciónexactados puntos de ruptura e as implicacións da hipotética translocación detectada naquelmomento.

Trasa revisióndaárbore familiarobsérvaseapresenciadeafectosvivospoloquesedecideutilizar CGH‐arrays (Comparative Genomic Hybridization Array) para a caracterización daanomalía cromosomósima. Os CGH‐arrays posibilitan a determinación de duplicacións oudelecións como posibles factores etiolóxicos en casos de retraso mental e outros fenotipospatolóxicosbaseándoseoseufuncionamentonahibridacióncompetitivadedousADN(oADNproblemaeoADNcontrol)marcadoscondistintosfluorocromos.Estacompetenciapermiteadetección de ganancias e perdas de rexións cromosómicas en todo o xenoma do casoproblema pola comparación das intensidades dos sinais de hibridación. Deste xeito, esteestudioeosCGH‐arrays(quesódetectanperdaseganancias,nonreordenaciónsequilibradas)sósepoderánlevaracabograzasáexistenciadeafectosvivosnoqueatranslocaciónnonéequilibrada.

Os resultadosaportadospoloCGH‐arraypermitendeterminarunhaperdanocromosoma18dearredorde18.800.000pbe unhagananciano cromosoma1dearredorde7.100.000pb.Estesdatossinalanqueacausadofenotipopatolóxicoestudadoéunhatranslocaciónfamiliarde fórmula t(1;18)(q43,q21.33). Inclúenseos riscos de transmisiónmaterna e paterna, unhaserie de recomendacións e probas diagnósticas aplicables de cara á descendencia deportadoresdamutación,asícomoascaracterísticasfenotípicasdosposiblesafectos.

…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..

This work takes over the genetic analysis of a family with several cases of psychomotorretardation and miscarriages, and for which cytogenetic studies made 20 years ago wereinconclusive: amoreprecisemethodologywas needed in order to accurately determine thebreakpointsandimplicationsofthathypotheticalautosomaltranslocation.

Pedigreeinspectionrevealedtheavailabilityoftwoaffectedindividuals.This ledtotheuseofanarray‐CGH(ComparativeGenomicHybridizationArray)asthepreferredtooltocharacterizethat chromosomal abnomality. CGH‐arrays allow the determination of duplications ordeletionsaspossibleetiologicalfactors incasesofmentalretardationandotherpathologicalphenotypes.This technique isbasedon thecompetitivehybridizationof twoDNAs (problemandcontrol) labeledwithdifferent fluorochromes.Thiscompetitionpermits thedetectionofgainsandlossesofchromosomalregionsthroughout thewholegenomeofthestudycasebycomparing the intensities of the hybridization signals. Thus, this genomic procedure (whichonlydetectlossesandgains)isonlyusefultoanalyzeaffectedindividualswhosetranslocationisunbalanced.

The results provided by the array‐CGH determined a loss in chromosome 18 of about18,800,000bpandagaininchromosome1ofabout7,100,000bp.Therefore,thecauseofthediseasephenotypeisafamilialtranslocationwiththeformulat(1;18)(q43,q21.33).Thisessayalso includes some issues about genetic counselling: the risk of maternal and paternaltransmission, some recommendations concerning prenatal testing as well as phenotypecharacteristicsoftheputativeaffectedprogeny.

2

IntroduciónAsprobas dediagnósticomolecular sonparte da actual revolución tecnolóxica e conceptualque supón a abordaxe xenómica da herdanza. Ata hai ben pouco, o diagnóstico xenéticobaseábasenunha aproximaciónquepoderiamosdenominar “xen a xen” e, amedidaque secoñecían máis rexións cromosómicas involucradas nunha mesma patoloxía, procedíase aincluiresanovainformaciónnasanálisesconducentesaodiagnóstico.Noano2001publícaseoborrador do xenoma humano e aparellado a ese proxecto internacional vai non só ocoñecemento (anotación) da estrutura e función das distintas rexións xenómicas, senón odesenvolvemento de tecnoloxía que permita caracterizar a información xenética dunindividuo,mesmoasposiblesdiferenzasentreassúas linaxescelulares.TermoscomoexomaouacrónimoscomoNGS1xaaparecennosmediosdecomunicaciónhabituais(v.g.DeBenito&Lillo2014).

Entre as múltiples causas de doenzas xenéticas, os reordeamentos cromosómicos de tipotranslocación están a ser estudados intensivamente desde a perspectiva xenómica ao serencausa de doenzas tan coñecidas e de relativa prevalencia como por exemplo determinadasleucemias e linfomas (translocacións somáticas). Que unha translocación remate ou non enenfermidade depende de varios factores: (1) das rexións cromosómicas implicadas natranslocación,(2)domomentonoqueseproduceoreordenamentocromosómico(denovoendeterminada linaxecelulardun individuooubenherdadoaoestarpresentena liña xerminaldo/s seu/s proxenitor/es) e (3) de se a translocación é equilibrada (i.e. a rotura e posteriorempalme dos cromosomas remate nun intercambio de material entre dous cromosomasdistintos sen ganacia nen perda de materia) ou non. As equilibradas adoitan ser menosproblemáticas, a menos que o corte‐empalme implique efectos deletéreos, v.g. porinterrupciónnapautadelecturadalgúnxenecodificante.

OCGH‐array(ComparativeGenomicHybridizationArray)éunhapotentetecnoloxíaqueestáaposibilitaradeterminacióndeduplicaciónsoudeleciónscomoposiblesfactoresetiolóxicosencasos de retrasomental, discapacidade intelectual, trastornos da aprendizaxe e do espectroautistae/ouenanomalíasconxénitasmúltiples.Aclasificacióndundeterminadofenotipo(unsíntoma,unconxuntodesíntomasenformadesíndrome,untumorespecífico,etc.)daformamáis precisa posible permite axustar o diagnóstico e o tratamento de xeito individual(medicinapersoalizada).Nonmenosimportanteéqueestatecnoloxíaestáacontribuiraunhamellor adaptación social de determinados pacientes (v.g. acceso á educación) e unha máisacertadaplanificaciónfamiliar.

A utilización dos CGH‐arrays presentan claras vantaxes científico/técnicas sobre a análisecitoxenética convencional no diagnóstico posnatal dos pacientes con retraso mental e/oumalformacións. Sen embargo, a súa aplicación no eido prenatal aínda se atopa en fase deavaliación.

CGH­arrays(ComparativeGenomicHybridizationArrays)TalcomoexplicanMorietal.(2012),oseufuncionamentobaséasenahibridacióncompetitivadedousADN(oADNproblemaeoADNcontrolnormal)marcadoscondistintosfluorocromosnunentramadodesondascolocadassobreunsoporte.O ADN problema márcase cun fluorocromo verde (Cy3) e o ADN control cun fluorocromovermello (Cy5). Ambos ADN mestúranse en cantidades equimolares e realízase unhahibridación,destaformaambosADNsmarcadoscompetiránporhibridarnosmesmoslugarescromosómicospodéndosedartressituaciónsdiferentes(Figura1):

1NextGenerationSequencing.Secuenciacióndenovaxeración(oumasiva)

3

• Encondiciónsnormais (casosenalteracións xenéticas)acantidadedeADNmarcadoenvermello(control)yverde(problema)seráamesma,oresultadofinalseránunhaproporción1:1deambosfluorocromos.

• En condicións patolóxicas (caso con ganancia cromosómica) a cantidade de ADNproblema dispoñible para hibridar será maior cá de ADN control resultando nunhamaiorproporcióndefluorocromodoADNproblema(verde).

• En condicións patolóxicas (caso con perda cromosómica) haberá máis cantidade deADNcontrol(vermello)parahibridarnesarexióncaADNproblemaresultandonunhamaiorproporcióndofluorocromodoADNcontrol(vermello).

Permiten,polotanto,adeteccióndegananciaseperdasderexiónscromosómicasentodooxenomadocasoproblemapolacomparacióndasintensidadesdasseñaisdehibridación(tendoencontaqueoscontroisseaxustanásmostrasporsexos).

Figura1.EsquemadunhaanálisemedianteCGH‐array(tomadodeMorietal.2012).

LimitaciónsdoCGH­arrayTalcomorecolleapublicacióndereferencia“ConsensoparalaImplementacióndelosArrays[CGHySNP‐arrays]enlaGenéticaClínica”coordinadaen2012porCigudosaGarcía&LapunzinaBadía,estatécnicaxenómica:

1. Sódetectacambiosdedosexénica,i.e.ganaciase/ouperdasdematerialxenético.Noninforma,polotanto,sobretranslocaciónsouinversiónsequilibradas.

2. Portanto,nonéquendedetectarpoliploidías,i.e.variaciónsnonúmerocromosómicoqueinvolucrendotaciónscompletasdecromosomas.

3. Paradoxicamente,ainterpretacióndoseusresultadosdificúltasepologrannúmerodeCNV2sen impactoclínicoclaroapriori (VOUS3)quepodedetectar.De feito,osCGH‐arrays poden ser deseñados con cobertura de xenoma completo (resoluciónsemellanteaolongodetodososcromosomas)oudirixidosadeterminadasrexiónsdeinteresepatolóxico(maiordensidadedesondasendeterminadasrexións).Aíndamáis,os propios profesionais podendecidir velar parte dos datos contando só con acceso

2Copynumbervariation.Variaciónnonúmerodecopias3Variantofuncertainsignificance.Variantedesignificadoincerto

4

aos resultados daquelas rexións xenómicas nas que si existe certeza de CNV consignificaciónclínica.

4. Acantidade ecalidadedoADNnecesariasé superiorásqueprecisanoutras técnicasmolecularesempregadasnodiagnósticoxenético.

5. Nonpodedetectarmosaicismosdebaixograo(xenotipodiferenteendistintascélulasdunmesmoindividuo)namostraanalizada,agásqueograodemosaicismosupereunvalor mínimo (10% segundo Mori et al. 2012; 20‐30% segundo Cigudosa García &LapunzinaBadía2012).

ComparativaconoutrosmétodosSegundoCigudosaGarcía&LapunzinaBadía (2012), deentreosmétodosaíndaempregadosen Xenética Clínica para o diagnóstico de ganancia/perda de material xenético, cómpreresaltarasvantaxeselimitaciónsdosCGH‐arrayfrontea:

1. CariotipoAdemais dunha resolución de 10 a 1000 veces menor ca do CGH‐array, o cariotipoatópaselimitadopolanecesidadedecélulasencontinuadivisión.OCGH‐arrayinformasobreo contido xenómicodemiles oumillóns de células simultaneamente,mentresqueocariotipofainodunhaspoucasdecenasdemetafasesdunmesmocultivo,v.g.20en oncohematoloxía e 50 en casos de mosaicismo. Con todo, o cariotipo pode, enprincipio, detectar graos de mosaicismo máis baixos (10‐15%) ca o CGH‐array (20‐30%). A maioría das plataformas clínicas actuais de CGH‐arrays poden detectarcambios no número de copias cun límite inferior de resolución de ∼400Kb, unharesolución alomenos 10 veces máis alta cá do cariotipo. Este nivel de resoluciónproporcionauncribadosuficientementefiableemáisindependentedaexperienciadoprofesional para identificar todos os síndromes coñecidos de microdeleción emicroduplicaciónrecurrentes.

2. FISH4Presenta dúas vantaxes sustanciais: (1) detecta alteracións quenon implican cambiode número de copia (inversións ou translocacións) sendo, ademais,moi sensible encasosdemosaicismoe(2)aportaaposibilidadedeasociarafluorescenciaaun locusourexióncromosómicadeterminada.OCGH‐array,aoserunatécnicaglobal,pódeseconsiderarunhaFISHenmaiordetallexaqueestaúltimasódetectadeleciónseduplicaciónsdotamañodasonda.Ademais,necesítase unha sospeita previa da rexión xenómica alterada para ser dirixido a elaespecificamente.

3. SKY5oumulti‐FISHBaseáse na asociación dun espectro de cores a cada par cromosómico permitindoidentificar coa resolución dun cariotipo poliploidías e reordenacións. É unha técnicapouco estendidapolo seu elevado coste e complexidade experimental e analítica. Asuagrandedesvantaxe éanecesidadeduncultivo ea súabaixa resolución.Porén, émoieficazparaidentificarreordenamentoscomplexos.

4. qF‐PCR6Baseáse no uso de varios loci de tipo microsatélite de localización cromosómicacoñecidaparadeterminarcantasvecesaparecenrepresentadosnoxenomadamostraproblema.OCGH‐arraycontacoavantaxedequenonestárestrinxidoacertasrexiónssenónquerealizaunbarridodetodooxenoma.AvantaxedaqF‐PCRéacapacidadededeteccióndepoliploidías,menores requerimentosdeADN,ademaisdunhamaiorrapideznaobtencióneinterpretacióndosresultados.

4Fluorescenceinsituhybridization.Hibridacióninsitufluorescente5Spectralkaryotyping.Cariotipoespectral6Quantitativefluorescencepolymerasechainreaction.Reacciónencadeadapolimerasacuantitativaefluorescente

5

5. MLPA7Esta técnica pode, nunha única reacción de reacción en cadea da polimerasa (PCR),detectar cambios no número de copias de ata 40 secuencias de localizacióncromosómicacoñecida.Asúagranvantaxeéobaixocustoeafacilidadedemanexo.Porén,aefectosdecobertura,unpaneldemarcadoresMLPAnonpodecompetircoaanálisexenómicaglobaldoCGH‐array.

ConselloxenéticoUnhavezdiagnosticadoun reordenamentocromosómicocomopoidaserunha translocaciónnonequilibrada,oconselloxenéticotrataderespostar,entreoutras,ásseguintespreguntas:

1. Hairiscodeterunfillo/aenfermo?2. Seohai,caléamagnitudedeserisco?3. Calseríaoseufenotipo?

ParaopresenteTFGcómpreaclararoconceptode“risco”,referíndoseaoseusignificadodeprobabilidade(v.g.probabilidadedetransmitirunhadeterminadamutaciónádescendencia).

Gardneretal. (2011) revisarondistintosmétodosparacalcularo riscode transmisióndunhadeterminadamutación.Porunhabandaatópaseochamado“riscoempírico”paraoquenonhaiunhaexplicaciónteóricaapartirdaquecalculareseparámetro,senónquesósecontacondatosdediversasxenealoxíasondesedeu esamutaciónprocedentesdabibliografíaebasesdedatos específicas. Poroutrabanda estáo“riscoMendeliano”, valor calculado candosi secoñeceopatróndeherdanzadamutaciónestudada.

Centrándonosnastranslocaciónsautosómicasdesequilibradas,haiquesalientarqueocálculodo risco tamén depende da casuística de cada familia. Non é o mesmo avaliar unhatranslocación na que hai afectos vivos (xa que ese feito demostra a viabilidade desereordenamentocromosómicoepolotanto incrementaorisco)queavaliarmutaciónsparaascales os datos familiares dispoñibles son número de abortos espontáneos ou infertilidade(caso no que a probabilidade de viabilidade do reordenamento cromosómico é menor). Apartir de aquí, dedúcese que o primeiro paso no cálculo do risco de transmisión dunhatranslocación autosómica será elaborar un diagrama dos posibles gametos producidos porunha persoa portadora da translocación, i.e. Diagrama de Paquitene (ver Resultados) ecomprobar se algunha das posibilidades que conducen a gametos non equilibrados (v.g.adxacente‐1,adxacente‐2)deulugaraunafectovivo.

AdemaisdoDiagramadePaquitene,estimarunriscodetransmisiónprecisadedatossobreosxenes involucrados na translocación obxecto de estudo. Cómpre suliñar que non hai unharelaciónmatemáticasimpleentre a lonxitudedossegmentostranslocadoseaviabilidadedocigoto,asíalgúnssegmentoscomao18pouextremodistal5penestadotrisómicoconlevanunmenor grao de patoxenicidade ca determinadas rexións máis curtas que, en aneuplodía,provocanmortedoembrión.

HistoriafamiliarNo ano 1994 o Centro Oncolóxico de Galicia e maila Universidade de Georgetown (EEUU)replican o estudo citoxenético de tres pacientes (individuos III‐4, IV‐3 e IV‐4, Figura 2) quepresentanantecedentesfamiliaresderetrasopsicomotoremúltiplesabortosespontáneos.

7Multiplexligation‐dependentprobeamplification.Amplificaciónmultiplexdependentedeligamentoasonda.

6

Figura2.Xenealoxíacompletadocasoobxectodeestudo.

OsresultadosdecariotipoeFISHdeámbalasdúas instituciónsapuntabanaposibilidadedunreordenamentocromosómiconaliñaxerminalinvolucrandooscromosomas1e18:ofenotiponormaldanai(III‐4)eaprimoxénita(IV‐3)iríaasociadoaunhatranslocaciónequilibrada1:18,mentres que o fenotipo patolóxico da filla menor (individuo IV‐4; cardiopatía complexa,hipotonía, dismorfías e finadaaoscatromesesde idade) semella causadoporunha trisomíaparcial do cromosoma 18 e monosomía parcial do cromosoma 1 (Figura 3). Nótese que ocariotipoprenatal realizadoánena IV‐4nondetectouningunhaanomalíacromosómica.Estefeito pondemanifesto a necesidadedeprobas diagnósticas demaior resoluciónde cara aoconsello xenético en familias coma esta, onde o pequeno tamaño do fragmento xenómicoalteradoseatopanolímitederesolucióndocariotipo.

a) b) Figura3.Cromosomas1e18procedentesdocariotiporealizadoen1994aosindividuos(a)III‐1(fenotiposan)e(b)

IV‐4(fenotipopatolóxico).Ádereitadecadafotografíaesquematízaseoreordenamentocromosomómicosospeitado:portadoradetranslocaciónequilibrada1:18emonosomíaparcialdo1etrisomíaparcialdo18,

respectivamente.

DadaaresolucióndasprobascariotipoeFISH,deduciusequeomaterialxenéticoinvolucradonesesreordenamentoscromosómicoshabíadecorrespondersecuntamañoigualoumenoraodunhaúnica bandametafásica. Ese pequeno tamañounido a outros factores, comoa baixacalidade das mostras de partida, impediu caracterizar inequivocamente a etioloxía daspatoloxías transmitidas nesa familia. Asemade, o feito de non ter atopado a anomalía

7

cromosómica en todas as mitoses dun mesmo individuo fixo postular a existencia demosaicismo nos individuos III‐4 e IV‐4. A interpretación actual dese resultado é que omosaicismoémoi improbablenestecaso,sendomáiscongruentequeassondasutilizadasouo seu tamaño e localización fixesen que se uniran a unha pequena porcentaxe das célulasanalizadas.

Por último, infórmase á familia de que, aínda que puidesen ter descendencia senreordenamentoscromosomómicosoucontranslocaciónequilibradaconducenteaunfenotiposan,un50%oumáisdadescendenciadeportadoresdatranslocaciónequilibrada(casosIII‐4eIV‐3)poderíaverseafectadoportrisomíasemonosomíasparciaiscomoasufridaporIV‐4.

A caracterización máis detallada da translocación, establecendo os seus puntos de ruptura,constitue a primeiro obxectivo do presente Traballo de Fin de Grao, utilizándose estainformación para proporcionar consello xenético aos membros da familia portadores datranslocación.

8

Obxectivos/AimsCaracterización dunha translocación equilibrada que involucra fragmentos de pequenotamaño no límite de resolución do cariotipo, a través de arrays de hibridación xenómicacomparada(CGH‐arrays)paraestablecerospuntosderupturadoreordenamento.

Estableceraaplicacióndosresultadosobtidos(1)nadeterminacióndosriscosreprodutivosdepersoasportadorase(2)noposiblediagnósticoprenatale/oupreimplantacionalarealizarenfuturasxestaciónsdeportadorasdadevanditatranslocación.

…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..

Characterization of a balanced translocation involving small size fragments, at the limit ofresolutionofthekaryotype,throughCGH‐array(ComparativeGenomicHybridizationArray)inordertoidentifythebreakpointsoftherearrangement.

Use the obtained results for genetic counselling: (1) determining the reproductive risks incarriers of the surveyed translocation and (2) revising the possibilities of prenatal diagnosisand/orpreimplantationgeneticdiagnosisinfuturepregnanciesofthosecarriers.

9

Materialemétodos

ÁrborefamiliarA xenealoxía foi realizada pola autora do presente TFG e nel recopilouse a seguinteinformaciónentrevistándosecosmembrosdafamiliaafectada:

• Se o individuo manifesta fenotipicamente retraso psicomotor, dismorfías ou outraspatoloxíascomúnscoindividuoIV‐4(Figura1).

• Seoindividuocontabaconalgúnestudiocitoxenéticoprevio.Indícase,noseucaso,sea condición é de portador da translocación 1:18 obxecto de estudio, non portador,afectadoousendeterminar.

• Númerodeabortossufridosporcadamuller.

Aíndaquenonserecollanestamemoria,taménserexistraronascausasdamortedetodososmembrosda familia,ascaracterísticas fenotípicasdos individuosafectados tantovivoscomafinadoseseosabortosforonnaturaisouinducidos.

EleccióndaprobaaxeitadaparadeterminarospuntosderupturaDecídeseutilizarunKaryoArray®CGHquecombinaunhacoberturadoxenomacompletocunincrementodesondasdirixidoacubrirmáisde380rexiónsclinicamenterelevantesasociadasadesequilibriosdedosexénica,incluíndotódalasrexiónssubteloméricasepericentroméricas(cunha cobertura mínima de 5Mb), así coma todas as rexións asociadas con síndromes demicrodeleción/microduplicacióncoñecidas, retrasomental eautismo.Todoelo,nun formatode8x60Kquecontén62.976sondasdeoligonucleótidosqueserepartennuntotalde46.609sondas específicas e controis, así como 16.367 sondas no esqueleto do array. A densidademediadecoberturaxenómicadoarrayéde43Kbeadensidademedianasrexiónpatoxénicascoñecidasascendeate7Kbea175Kbnoesquelete.Todoistoconlevaqueseteñadescrito:(1)un poder de resolución de 10 a 1.000 veces maior ca do cariotipo, (2) unha sensibilidadetécnicado98,41%e(3)unhaespecificidadedun95%.

DeterminacióndosprobandosideaisAcaracterizacióndospuntosderupturadatranslocación1:18obxectodeestudomedianteautilización de CGH‐Array precisa de probandos coas seguintes características: membro dafamiliaestudadaquepresentefenotipopatolóxico,asegurandoasíqueatranslocaciónnonédenovo, senónherdada e que existirá ganacia/perdadematerial xenético abondopara serdetectadapoloCGH‐array.

Aspersoasportadoras(heterocigotas)datranslocaciónperosenpatoloxía(v.g.individuosIII‐4ou IV‐3, Figura 1) non son idóneas para este tipo de estudo, xa que a translocación quepresentanéconelevadaprobabilidadeequilibrada(senganacia/perdadematerialxenético)eoCGH‐arraynondiferenciaríaaestaspersoasdunsuxeitoconxenotiposenatranslocación.

A existencia de dúas afectas vivas (individuos IV‐2 e IV‐14, Figura 1) fai por tanto posible acaracterizacióndospuntosderupturadatranslocaciónmedianteCGH‐array.

ExtraccióndeADNeprocesamentodasmostrasparaarealizacióndoCGH­array

ExtracciónADNdesangueperiféricoExtraer unha mostra de sangue periférico a cada unha das afectas nun tubo con EDTA.Introducir2,5mLdesanguenuntuboFalconecompletalocon11,5mLdetampóndelisedeeritrocitos(erythrocytelysisbuffer),levaraoconxeladordurante15minutosaxitándoocada5minutos.Unavezfeitoistocentrifugardurante10minutosa400rcpelevara4ºC.

10

Decantar o sobrenadante, resuspender opellet con 200 µL de soro e pasar todo a un tuboeppendorf de 2mL que se introducirá na plataforma robotizada QIAcube (QIAGENTM) ondetaménhaberápreparados5botescon:buffer AE,bufferAL,Washbuffer1,Washbuffer2 eetanolpuro,ademaisduneppendorfconproteasaepuntasdepipetaestériles(Figura4).

Figura4.InteriordamáquinaQIACUBE(QIAGEN)contodososreactivosnecesariosparaaextraccióndeADNda

sangueperiférica.

RepurificacióndoADN8Tomar3µgdeADNou100µLdeADNeengadir1/10voldeacetatodesodio(3M)durante10segundos,posteriormenteengadirtamén2½voldeetanol(EtoH)100%emesturar. Incubartododurante2horasa‐20ºC.

Centrifugar15minutosa14.000g,eliminarosobrenadanteeresuspenderopelleten500µLdeEtoH70%.Volvercentrifugar15minutosa14.000g,eliminarosobrenadante,secaropelleta temperatura ambiente durante 5‐10 minutos e resuspender en tampón TE 1X. Deixarincubando a 37ºC durante varias horas e cuantificar o ADN presente no espectrofotómetroNANODROPTM(ThermoFisherScientific).

DixestiónUniformizar as mostras problema á concentración de 600ng/10,1µL en tubos eppendorf de0,2mLeprepararoscontroisqueseaxustaráncoasmostrassegundooseusexo:osfemininoslevarán 4,16 µL de ADN feminino e os masculinos 2,94 µL de ADNmasculino. Complétansetodosataos10,1µL.

Para facer a mestura de dixestión das mostras, introducir as seguintes cantidades e naseguinteorde:

1. H2O:1µL2. BufferC:1,3µL3. SeroalbúminaBovina(BSA):0,1µL4. EnzimaderestriciónAluI:0,25µL5. EnzimaderestriciónRsaI:0,25µL

Engadir aos tubos eppendorf (tanto das mostras problema coma dos controis) 2,9 µL damesturadedixestiónelevalosaotermocicladorcunprogramaa37ºCdurante2horassubindoposteriormentea65ºCdurante10minutos.Finalmentebaixaraseataos4ºCotempoqueseprecise.

Reaccióndemarcado(enescuridade)Desconxelarosreactivosdemarcaxeeengadiracadamostra2µLdeH2Oe2,5µLderandomprimer. Mesturar ben. Meter as mostras ao termociclador nun programa a 95ºC durante 5minutosepasarinmediantamentea4ºCdurante5minutos.

8Pasononestritamentenecesario.Oquesefaiéunha“repurificacióndoADN”,elimínanseADNpequenosydemalacalidade.

11

PrepararamastermixparaareaccióndemarcadoseguindoaordequeaparecenaTáboa1:

Táboa1Reactivo X1tubo(µL) Para8mostras(µL) Para8controis(µL)5xbuffer 5 42 4210xDNTP 2,5 21 21Cy3DNTP(vermello) 1,5 12,6 Cy5DNTP(azul) 1,5 12,6EXOKleeno 0,5 4,2 4,2

Táboa1.ReactivosecantidadesutilizadasenµLparaareaccióndemarcado.

Engadiracadamostra9,5µLdomixqueconténCy3 (verde)e9,5µLdomixqueconténCy5(vermello)acadacontrol, levarao termocicladornunprogramaa37ºCdurante2horas,65ºCdurante10minutos.Unhavezrematadooprogramapasarasmostrasatuboseppendorfde1,5µLeengadirlles430µLdeTE.

Prepararunstubosdearrayconcolumna(CentrifugalFilterUnits,Millipore)epasaracadaununhamostra,posteriormentecentrifugara14.000rcpdurante10minutos.

Unhavezcentrifugado,decantarnoutroseppendorfoseluidosdascolumnaseengadir480µLdeTE.Volvercentrifugara14.000rcpdurante10minutosefinalmenteinvertircadacolumnadentrodetubosnovosvolvendoacentrifugara1.000rcfdurante1minuto.

ConcentrarasmostrasmarcadasdascolumnasnunconcentradorSpeedvacTMa75ºCdurante1heresuspenderen9,5µLdeTE.CuantificarADNnoNANODROP.

HibridaciónPrepararamixdehibridaciónsegundoaparecereflectidonaTáboa2:

Táboa2Reactivo X1tubo(µL) Para8mostras(µL)CotHuman 2 1810xBlock 4,5 40,52xHybrid 22,5 202,5

Táboa2.ReactivosecantidadesutilizadasenµLparaareaccióndehibridación.

Mesturarcadamostracocontroladxudicado(segúnosresultadosdacuantificacióndeADN)eengadiracadaeppendorf29µLdomixdehibridación.Meteraotermocicladorcunprogramaa95ºcdurante3minutos,37ºCdurante30minutos.

Preparar o cubreobxetos para arrays 8X (60K array/8x) na camara de hibridación (Figura 5)poñendoacaraqueconténassondas(portaobxectos)encontactocos40µLdemostraqueseintroducen en cada recadro do cubreobxectos. Meter a cámara de hibridación á estufarotatoriaa65ºCdurantealomenos24horas.

Figura5.Cámaradehibridación.Ádereitaabertaeáesquerdapechadacoportaobxectoseo

cubreobxectosdentro.

12

LavadodoportaPoñerobañoaquentara37ºCcunhacubetacheadesolución29mentres sepreparandúascubetasconsolución110(nunhadelashaseintroducirunaxitador).

Retirar o porta da cámara de incubación que tiñamos na estufa e introducilo na cubeta desolución 1 que non ten axitador; separar no seu interior o porta e o cubre e lavar o portaaxitándoodentrodasolución1.Pasaroportaáoutracubetadesolución1quetenoaxitadoredeixalodurante5minutostapado.

Finalmenteintroduciroportadurante1minutonasolución2eretiralo lentamenteparaqueseseque.

EscaneadodoportaOescaneadorealízasecoSoftwareMapix (Innopsys) nunescaner Innoscan710. Escaneaseoporta a un tamaño de 3µm, analizándose os datos co Software BlueFuse Multi v2.1(BlueGenome). O algoritmo Multi v2.1 permite estudiar os resultados aplicando sempre omesmocriterioparadeterminarperdaseganancias,tendendoadarresultadosconservadoresutilizandoocriteriodadesviacióndetressondasconsecutivasparaadeteccióndaanomalía.

HCForumeriscosdetransmisiónSeguindo o protocolo da Unidade de Xenética do CHUAC, o cálculo de transmisión datranslocación estudada foi calculado utilizando a ferramenta informática HCForum®(www.hcforum.net; Cohen et al. 2001), un repositorio que almacena datos procedentes dediversas fontes (publicacións e comunicacións directas dos laboratorios) correspondentes aanomalías estructurais autosómicas de tipo familiar. HCForum® constitúe unha valiosaferramenta para o consello xenético xa que permite seleccionar graficamente as rexiónscromosómicas implicadasnoreordenamentoeoseutamaño.Conestesdatos,obténseunhaestimacióndoriscodetransmisiónespecíficaparaesamutación,ademaisdereferenciassobrea existencia de reordenamentos semellantes na bibliografía. O cálculo dese risco utilizadistintasaproximacións:DiagramadePaquitene,odenominadoMétodoD(untipodeanálisede compoñentes principais) e modelos de regresión loxística que inclúen variables comocaracterísticascitoxenéticasdatranslocación, idadeesexodoparentalportadoreviabilidadepotencialdosgametos(revisadoporCohenetal.2001).

9Solucióndesecado.10Solucióndelavado.

13

Resultados

LecturadoKaryoArray8x60K

Afectanúmero1Controldecalidadedoarray:SD11Autosome/Robus:0.14/0.12SBR12Ch1/Ch2:8.96/8.20DLR13Raw/Fused:0.23/0.19Osresultadoscumplenoscriteriosdecalidadeparaoestudio.

Trasoescaneadodoobtivéronseasseguintesaberracións(Figura6):

1. No brazo pequeno do cromosoma 1 detectouse unha perda de 277.887 pb14 quecomeza na rexión 1p36.13 e remata na mesma (localizada no intervalo entre16.770.876e17.048.762pb).

2. No brazo grande do cromosoma 1 detectouse unha ganancia de 7.117.715 pb quecomezanarexión1q43erematana1q44(242.094.925‐249.212.639pb).

3. No brazo grande do cromosoma 18 detectouse unha perda de 18.796.349 pb quecomezanarexión18q21.33erematana18q23(59.157.788‐77.954.136pb).

Osparámetros indicadospordefectonoalgoritmodoprogramasuxirenque: (1)a perdade277.887pblocalizadanobrazopequenodocromosoma1podeserbenigna,(2)agananciade7.117.715 pb no brazo longo do mesmo cromosoma pode ser patoxénica e (3) a perda de18.796.349pbnobrazolongodocromosoma18podeserpatoxénica.

Figura6.ResultadodoescaneadorealizadopoloSoftwareMapix(Innopsys)easúalecturacoSoftwareBlueFuseMultiv2.1(BlueGenome)ondesepodenobservarasalteracióncromosómicaspresentesnamostradaafecta

número1.Encorverderepreséntanseasgananciaseencorvermellaasperdas.

11StandardDeviation.Desviaciónestándar(medidaentreasintensidadesdassondas)12Signal‐to‐backgroundratio.Cocienteentresinalesinaldefondo(variaciónentreasratioscalculadasparacadaundosdousfluorocromos)13Derivativelogratio.Cocientedederivadaslogarítmicas(diferenzaexistenteentreaintensidadedunhasondaeassondasdoseuarredor)14BasePairs.Paresdebases

14

Trasexaminarosresultadosquesuxireoprograma,obsérvanseosxenesinvolucradosencadaunhadas rexiónsalteradas ecompáranse con resultadossemellantes endiferentesbasesdedatos para corroborar a patoxenicidadeounonpatoxenicidadedamutación atopada.Destexeito,obsérvaseque:

1. Aperdade277.887pblocalizadanocromosoma1involucraanovexenesHGNC15(doscales6sonxenesOMIM16)ademaisdunhaenfermidadeOMIM(Anexo1.TáboaI).

2. Agananciade7.117.715pbdetectadanocromosoma1implica125xenesHGNC(doscales18sonxenesOMIM),ademaisdecincoenfermidadesOMIM(Anexo1.TáboaII).

3. Aperdade18.796.349pbatopadanocromosoma18 relaciónasecon95xenesHGNC(dos cales 43 son xenes OMIM), ademais de nove enfermidades OMIM (Anexo 1.TáboaIII).

Destexeitopúidoseconcluirque(1)aperdade277.887pbdocromosoma1ébenignapostoque,aíndaquearexiónestá incluídanosíndromedemicrodeleción1p36,haireferenciasdedelecións pequenas dentro desta mesma rexión descritas coma VOUS, (2) a ganancia de7.117.715pbdetectadanocromosoma1épatoxénicaxaquehaireferenciasdegananciasmoisimilaresouinclusomenoresnamesmazonaquesonpatoxénicas(Figura7)e(3)aperdade18.796.349pb detectada no cromosoma 18 é patoxénica xa que hai referencias de perdasmenoresentamañoinvolucrandoamesmazonaquesonpatoxénicas(Figura8).

Figura7.Abasededatos ISCA sinalaque gananciasnamesmazonaedetamañomenorágananciadetectadanocromosoma1damostrasonpatoxénicas.Nótesequenaimaxeseestánconsiderandoasdúasgananciascomaunhasoa.

Figura 8. A base de datos ISCA sinala que perdas namesmazonaedetamañomenoráperdadetectadanocromosoma18damostrasonpatoxénicas.

15HUGOGeneNomenclatureCommittee.Comitéparaanomenclaturadexenes:caracterizacadaxenehumanocunnomeúnicoesignificativo.16OnlineMendelianInheritanceinMan.Herdanzamendeliananohumanoenliña:basededatosqueconténinformaciónsobreosfenotiposeenfermidadeshumanosconbasexenéticaeasúaasociaciónaosxenesdoxenomahumano.

15

Afectanúmero2Controldecalidadedoarray:SDAutosome/Robus:0.15/0.13SBRCh1/Ch2:8.86/7.13DLRRaw/Fused:0.27/0.20Osresultadoscumplenoscriteriosdecalidadeparaoestudio.

Trasoescaneadodoportaobxectosobtivéronseasseguintesseisaberracións(Figura9):

1. No brazo grande do cromosoma 1 detectouse unha ganancia de 3.417.303 pb quecomezanarexión1q43erematana1q44(242.023.948‐245.441.250pb).

2. No brazo grande do cromosoma 1 detectouse unha ganancia de 3.707.573 pb quecomezanarexión1q44erematanamesma(245.505.067‐249.212.639pb).

3. No brazo grande do cromosoma 18 detectouse unha perda de 18.937.776 pb quecomezanarexión18q21.33erematana18q23(59.016.361‐77.954.136pb).

4. Nobrazograndedocromosoma22detectouseunhaperdade250.287pbquecomezanarexión22q11.1erematanamesma(16.639.458‐16.889.744pb).

5. No brazo pequeno do cromosoma X detectouse unha ganancia de 274.431 pb quecomezanarexiónXp22.33erematanamesma(305.744‐580.174pb).

6. No brazo pequeno do cromosoma X detectouse unha ganancia de 848.451 pb quecomezanarexiónXp22.33erematanamesma(1.499.764‐2.348.214pb).

Osparámetrosindicadospordefectonoalgoritmodoprogramasuxirenque:(1)agananciade3.417.303pb localizadanobrazolongodocromosoma1podeserpatoxénica,(2)agananciade3.707.573pblocalizadanobrazolongodocromosoma1podeserpatoxénica,(3)aperdade 18.937.776 pb no brazo longo do cromosoma 18 pode ser patoxénica, (4) a perda de250.287pbnobradolongodocromosoma22podeserdesignificadoincerto,(5)agananciade274.431pbnobrazopequenodocromosomaXpodeserbenignae(6)agananciade848.451pbnobrazopequenodocromosomaXpodeserdesignificadoincerto.

Figura9.ResultadodoescaneadorealizadopoloSoftwareMapix(Innopsys)easúalecturacoSoftwareBlueFuseMultiv2.1(BlueGenome)ondesepodenobservarasalteracióncromosómicaspresentesnamostradaafecta

número2.Encorverderepreséntanseasgananciaseencorvermellaasperdas.

16

Trasexaminaros resultadosqueproporcionaoprograma,obsérvanseosxenes involucradosencadaunhadasrexiónsalteradasecompáranseconresultadossimilaresendiferentesbasesde datos para corroborar a patoxenicidade ou non patoxenicidade do defecto no material.Destexeitoobsérvaseque:

1. A ganancia de 3.417.303 pb localizada no cromosoma 1 involucra a 35 xenes HGNC(dos cales 11 son xenes OMIM), ademais de dúas enfermidades OMIM (Anexo 1.TáboaIV).

2. Agananciade3.707.573pbdetectadanocromosoma1implicaa91xenesHGNC(doscalesnovesonxenesOMIM),ademaisdetrespatoloxíasOMIM(Anexo1.TáboaV).

3. Aperdade18.937.776pbatopadanocromosoma18involucraa97xenesHGNC(doscales43sonxenesOMIM)ademaisdenovetrastornosOMIM(Anexo1.TáboaVI).

4. Aperdade250.287pb localizadanocromosoma22 implicaadous xenesHGNC (doscalesningúnéxeneOMIM)(Anexo1.TáboaVII).

5. Agananciade274.431pbdetectadanocromosomaXinvolucraa3xenesHGNC(doscalesunéunxeneOMIM)(Anexo1.TáboaVIII).

6. A ganancia de 848.451 pb atopada no cromosoma X implica a 10 xenes HGNC (doscales12sonxenesOMIM)(Anexo1.TáboaIX).

Asímesmo,púidoseconcluírque(1)agananciade3.417.303pblocalizadanocromosoma1emailagananciade3.707.573pbdomesmocromosomaconstitúenunhasoade7.124.876pbqueépatoxénicaporquehai referenciasdegananciasdemenor tamañopatoxénicas (Figura10), (2) a perda de 18.937.776 pb detectada no cromosoma 18 é patoxénica xa que haireferenciasdeperdasmenores en tamaño involucrandoamesma zonaquesonpatoxénicas(Figura 11), (3) a perda de 250.287pb detectada no cromosoma 22 é benigna porque haireferencias de perdas demaior tamaño benignas (Figura 12), (4) a ganancia de 274.431 pbdetectadanocromosomaXébenignaxaquehaiunhareferenciadunhagananciamoisimilarbenigna (Figura 13) e (5) a ganancia de 848.451 pb detectada no cromosoma X é benignaporque hai ganancias de tamaño menor á ganancia detectada que son benignas ou designificadoincerto(Figura14).

Figura10.AbasededatosISCAsinalaquehaigananciasdetamañomenorágananciadetectadanocromosoma1damostra2quesonpatoxénicas.

Figura 11. A base de datos ISCA sinala que perdas namesmazonaedetamañomenoráperdadetectadanocromosoma18damostra2sonpatoxénicas.

17

Figura 12. A base de datos DECIPHER17 sinala que haiperdas de tamaño maior á perda detectada nocromosoma22damostra2quesonbenignas.

Figura13. Abasededatos ISCA sinalaunhareferenciadunhagananciademoisimilarágananciadetectadanocromosomaXdamostra2queébenigna.

Figura14.AbasededatosISCAsinalaquehaigananciasdetamañomenorágananciadetectadanocromosomaX da mostra 2 que son benignas ou de significadoincerto.

17DatabaseofgenomicvariationandphenotypeinhumansusingEnsemblresources.BasededatosdavariaciónxenómicaefenotipoenhumanosutilizandorecursosEnsembl:relacionainformaciónacercademicrodelecións,duplicacións,insercións,inversiónsetranslocaciónsconenfermidadesxenéticas.

18

DiagramadePaquiteneecálculoderiscos.Existen catro patróns de segregación básicos dunha translocación recíproca cuadrivalente(Figura15):

• Alternada:osdouscromosomasnormaismóvensecaraunpoloeosdouscromosomascoatranslocaciónaopolooposto.Todososgametosformadossonequilibrados.

• AdxacenteI:oscentrómerosnonhomólogosadxacentesdiríxensecaraomesmopolo.Istoresultanuncomplementocromosómicodesequilibradoqueconlevaráunzigotocon trisomíaparcialnuncromosomaemonosomíaparcial nooutro. Estepatróndesegregacióncasesempreécompatiblecoaviabilidade.

• Adxacente II: os centrómeros homólogos adxacentes diríxense cara o mesmo polo;resultandousualmentenun amplonúmerodedesequilibrios na cromatina, o que éhabitualmenteincompatiblecoasupervivenciaembrionaria.

• Segregación“3:1”:tresdoscaatrocromosomasmóvensecaraunpoloesóunaopolooposto. Despois da fertilización hase formar un embrión con 47 cromosomas eportadordatranslocación.

Figura15.Cuadrivalentecosresultadosdassegregaciónsalternada,adxacenteI,adxacenteIIesegregación3:1trala

fecundaciónporungametonormal.TomadodeMoore&Best(2001).

Deste xeito, para a determinación das posibles segregacións e cales delas son as máisprobablesdedar lugaraunconceptoviable,vesenecesariofacerundebuxodoDiagramadePaquitenedopresuntocuadrivalente.Amaioresdisto,débeseterencontaque:(1)seasumequeasegregaciónalternadaéfrecuenteasociándosecoanormalidadefenotípica,(2)omenosdesequilibradodosgametoséundosmáisprobablesnaproducióndunconceptoviablee(3)seossegmentostranslocadossonpequenosencontidoxenético,adxacenteIéasegregaciónmáisprobableparaaxeracióndedescendenciaanormal(Gardneretal.2011).

Trasa seleccióndas rexións implicadasdoscromosomas1e 18noprogramaHCForum,esteestablecequeas segregaciónsmáisprobablespara esta translocaciónseríanaalternada eaadxacenteItalecomosesupuxopreviamente(Figura16).

Destaforma,etendoencontaoscromosomasnosqueseproduciuatranslocacióneotamañodosfragmentosinvolucrados,resólvesequeasprobabilidadesdeherdanzadamutaciónparaadescendenciadeportadoressansson.Dosembarazosatermo:

19

• A maioría dos nacidos terán un fenotipo normal (unha das catro posibilidades desegregaciónrepresentadasnaFigura15),nosqueaproximadamenteametadeportaráuncariotiponormaleaoutrametadepresentaráatranslocaciónequilibrada(aoigualcoproxenitor).

• Dentro da segregación desequilibrada (tres das catro posibilidades da Figura 15), asque poderán cursar con malformacións serían os reordenamentos anómalosresultados dunha segregación adxacente I que impliquen trisomías ou monosomíasparciais en relación aos segmentos 1q43‐qter e 18q21.33‐qter. O risco demalformaciónsasociadoaestatranslocacióncandoseherdaporvíamaternaseríadeentreun23,19eun31,77%teóricomentresque,paraatransmisiónporvíapaternaoriscoéalgomenorsituándoseenteun21,88eun31,05%.

O resto de xestacións con cromosomopatías diferentes ás dúas anteriores resultarán enabortosespontáneosderepetición.

Por outro lado, as probabilidades de herdanza da translocación para a descendencia deportadores afectos (con fenotipo alterado) son, segundo a segregación cromosómicamendeliana(Figura17):

• Ametadedadescendenciaherdaríaadelecióneaduplicacióndeformaindependenteédicir,un25%herdaríaadelecióneun25%aduplicación.

• Un25%herdaríaasdúasxuntas.

• Un25%nonherdaríaningunha.

Figura16.DiagramadePaquiteneerepresentación

esquemáticadoresultadodasegregacióndunportadordatranslocación1:18obxectodeestudo.

Figura17.DiagramadePaquiteneerepresentaciónesquemáticadoresultadodasegregacióndunportador

afectodatranslocación

20

Discusión

Xenes,enfermidadesefenotiposasociadosNa literatura especializada non se ten descrito ningún paciente coa mesma alteracióncromosómicacaocasodeestudo.

A determación dos puntos de ruptura da translocación analizada debería, a priori, permitirunhaaproximaciónaosfenotiposasociadoságanacia/perdadesessegmentoscromosómicos.Así, as bases de datos informan sobre asociación entre retrasos do desenvolvemento edismorfíastantocandoexisteunhacopiaextradofragmento1q43‐qtercomacandofalta(v.g.síndromededeleción1q43‐44),perocuriosamentedascincoenfermidadesOMIMasociadasaese segmento cromosómico das que informa o software BlueFuseMulti v2.1 (BlueGenome)utilizado para a análise dos datos do CGH‐array, ningunha está causada por ganancias ouperdas,senónporsubstituciónsnucleotídicasnosxenesSDCCAG8(síndromeSeniorLoken7),NLRP3 (Síndromes Autoinflamatoria por frío, CINCA e Muckle‐Wells) e AKT3 (SíndromeMegalencefalia‐polimicrogiria‐polidactilia‐hidrocefaliatipo2).

Encantoaocromosoma18,dasseisenfermidadesOMIMasociadasádelecióndofragmento18q21.33‐qterhainasrelacionadas(1)consustituciónsnucleotídicas,comoporexemploasdoxenePIGNcausantesdaSíndromeconvulsiones‐hipotonía‐anomalíasconxénitasmúltiplestipo1, (2) con duplicación pero non con delecións, coma a causante dunha variante daenfermidadeóseadePagetnaqueseobservanduplicaciónsentándemdeaproximadamente25bpnoexón1doxeneTNFRSF11Ae(3)sócondelecións, comoaAtresiaAuralConxénita,consecuenciadunhadeleciónnarexión18q22.3‐q23.

A deleción 18q21.33‐qter pode englobarse dentroda Síndromededeleción 18q‐ (Figura 18;Feenstra et al. 2007) xa que non se poden identificar puntos de ruptura comúns entre osafectos,poloqueestespresentanunhagranvariabilidadeclínica.Aíndaasí,tensedescritoqueinclusoentremembrosdamesmafamiliacoamesmadeleciónexisteexpresividadevariableequeencaseun30%doscasosseacompañadunhaalteraciónnoutrocromosoma(Linnanvikietal. 2006), tal e como ocorre no presente caso de estudo. Isto é debido a que unha altaporcentaxe das delecións 18q son debidas a translocacións equilibradas nalgún dosproxenitores,aíndaquetaménsedescribencasosdenovo.

Figura18.Mapafenotípicodobrazolongodocromosoma18indicandoasrexiónscríticasparavariosfenotipos

patolóxicos.CAA,atresiaauralconxénita;CP/CL,padalelabioleporino;MR,retrasomental.TomadodeFeenstraetal.(2007).

21

A base de datos OMIM indica que aínda que o fenotipo asociado é moi variable, adoita irasociadoaretrasomental,baixaestatura,hipotonía,defectosdaaudiciónedeformidadesnospés.Ademais,un25%dospacientespresentacardiopatíasconxénitas,un10%padalfendidoelabio leporino, nun 40% dos casos descríbese epilepsia e o 25% dos varóns presentahipospadias. Aínda que estas características se consideran típicas, descríbense algúns casoscon afectación moi leve e sen afectación mental debido á variabilidade na expresión dossíntomasexplicadaanteriormente.

Polotanto,aíndaquenonéposibleprediciraexpresiónclínicadosposiblesafectos,ocadroclínico incluirácaracterísticasdoSíndromededeleción18q‐máisosderivadosdaduplicación1q43‐qter ou síntomasde trisomía do 18, peromoitomáis leves, ademais dos derivados damonosomía1q43‐qter.AsdúasafectasanalizadasnesteTFGpresentanvariabilidadefenotípicaentreelasnonpuidéndoseasociarunúnicopatrónfenotípicoátranslocaciónfamiliar.Entreossíntomas anteriormente referenciados, as afectas presentan padal fendido, dificultades deaprendizaxe, deformidades nos pés, Atresia Aural Conxénita, estatura baixa, convulsións edismorfíasfaciais.Outrosdosposiblesfenotiposnonpuideronserdiagnosticadosbenpornonter realizado as probas pertinentes ou por non ter a idade típica de para o seudesenvolvemento.

Implicacións

RiscosdetransmisiónOs riscos asociados a unha translocación dependen da seguinte serie de variables: (1)características citoxenéticas da translocación, (2) lonxitude de banda R dos segmentostranslocados,(3) idadeesexodoportadorparentale(4)aviabilidadepotencialdosgametos(Cansetal.1993)

Debido ao pequeno tamaño dos fragmentos obsérvase un aumento nas posibilidades detransmisióndecaraádescendenciadeportadoreseafectos.Istodébeseaqueatranslocación,deleción ou duplicación de fragmentos cromosómicos pequenos conleva un maior risco demalformaciónnos embrións queos portan, ademais de ser potencialmente viablesmentresque se fosen fragmentos máis grandes, a viabilidade veríase comprometida (v.g abortos derepetición). Por exemplo, unha translocación t (4;18)(q35;q12.12) leva asociado un riscoempírico de transmisión de entre o 10‐15% (Figura 19; Delgado Rubio et al. 2012). É dicir,moitomenor ca o asociado a fragmentos demenor tamaño, coma no presente caso, ondeaíndaqueocromosoma18taménestáimplicado,oriscoédun26,21‐27,27%demedia.

Figura19.Posibilidadestransmisióndunhatranslocación4:18.TomadodeDelgadoRubioetal.(2012).

22

Encantoaomaiorriscodemalformaciónsasociadoátransmisiónporvíamaterna,un27,27%fronteaun26,21%demedia,taménsedescribeenFarautetal.(2000)comaalgoqueocorrecon relativa frecuencia, habendo máis mulleres que son nais ca homes que son pais nastranslocaciónfamiliares.Así,narevisióndeFarautetal(2000)de1.597nenosenfamiliasconestetipodetranslocacións,indícasequeasnaissonasresponsablesdo61%dosnenosfroitodunha segregación adxacente I, do 70% dos nenos froito dunha segregación adxacente 2 epolomenosno92%doscasosdadescendenciadesequilibradaresultadodasegregación3:1.

Ocálculodoriscopersoalizadoparaunportadorheterocigotodunhatranslocaciónequilibradaimplica un problema importante do campo da xenética porque as translocacións son casesempre específicasde familiapoloquesedependeengranmedidadascifrasxeraisdo riscoderivados doutros estudios de familias con translocacións similares. Isto fai que o problemaestea particularmente adaptado para a análise estatística bayesiana, na que se podenintroducir certos coñecementos a priori, v.g. datos específicos da familia (VanDerwerken2015).

ProbasprenataisOs resultados deste TFG permiten avanzar respecto ás probas diagnósticas a realizar nasxestaciónsdefillosdeportadoresdestatranslocación.

Paravalorar seun feto éportadorounondo reordenamentodesequilibrado,haseofertaraposibilidadedediagnósticoprenatala realizararredordasemana12mediantebiopsiacorialounasemana16atravésdoestudodolíquidoamniótico.

O diagnóstico de translocación desequilibrada debería realizarse mediante CGH‐array paraevitarquedebidoaopequeno tamañodos fragmentos implicadospoidapasardesapercibidaunhasegregacióndesequilibradacomopasounocasodo individuo IV‐4(Figura2).Taménserecomendaráarealizaciónduncariotipoparacomplementaroresultado.

Astranslocaciónssonunhadascausascontempladaspolalexislaciónvixente(Ley14/2006,de26demayo,sobretécnicasdereproducciónhumanaasistidaeOrdenSSI/2065/2014,de31deoctubre, por la que semodifican los anexos I, II y III del Real Decreto 1030/2006, de 15 deseptiembre, por el que se establece la cartera de servicios comunes del SistemaNacional deSalud y el procedimiento para su actualizacion) para proceder ao Diagnóstico XenéticoPreimplantacional consistente nunha fecundación in vitro e posterior diagnóstico dosembrións, seleccionando só os carentes da translocaciónpara seren implantados. Con todo,esteprocesononestáexentodedificultades,comoporexemploasbaixastaxasdeembarazopor transferencia embrionaria (Táboa 3), así como o erro potencial asociado a esteprocedemento.

Táboa3Idade(anos) TaxadeembarazoporIVF‐ET1820‐24 44%25‐29 36%30‐34 24%35‐39 18%40‐44 10%45oumáis 8%Táboa3.TaxadeembarazoutilizandoatécnicadeIVF‐ETsegundodiferentesrangosdeidade.TomadadeBansal

(2011).

Esteconselloéestensibleaoutrosmembrosdestafamiliaenidadereproductivaqueportenamesmatranslocación.18InVitroFertilizationEmbryoTransfer.Transferenciadeembriónsresultantesdefecundacióninvitro

23

Conclusións/ConclusionsDescricióndunha trisomía 1q43‐q44de 7.1Mb e unhamonosomía 18q21.33‐q23de 18.8Mbnas dúas afectas vivas quepermite establecer que a fórmula cromosómicada translocacióndetectadanafamiliaét(1;18)(q43,q21.33).

Establéceseunriscodetransmisiónádescendencia,nocasodosportadoresequilibrados,quevaido23,19ao31,77%encasodatransmisiónporvíamaternaedo21,88ao31,05%nocasodatransmisiónporvíapaterna.

En caso de embarazo existe a posibilidade de diagnóstico prenatal mediante CGH‐array ecariotipohabendo,ademais,aopcióndediagnósticopreimplantacionalaplicandoestatécnicaa embrións procedente de fecundación in vitro e seleccionando para implantación aquelesválidoscromosomicamente.

…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..

Descriptionofa 1q43‐q44 trisomyof7.1MBand18q21.33‐q23monosomyof18.8Mb in thetwoaffectedindividuals.Therefore,thechromosomeformulaforthisfamilialtranslocationist(1;18)(q43,q21.33).

Theriskoftransmissionofthisrearrangementfromacarriertohis/heroffspringrangesfrom23.19to31.77%(maternaltransmission)andfrom21.88to31.05%(paternaltransmission).

Prenatal diagnosis by CGH‐array and karyotype are recomomended. In addition,preimplantationgeneticdiagnosis(selectionofunaffectedembryosproducedthrough invitrofertilization)iscurrentlyavailablefortranslocationsasthisoneunderthecurrentSpanishlaw.

24

BibliografíaBansal, K. 2011. Manual of Intrauterine insemination (IUI), In Vitro Fertilization (IVF) and

IntracytoplasmicSpermInjections(ICSI).2ndedition.JaypeeBrothersMedicalPublishers(P)Ltd.

Cans, C.; Cohen, O.; Lavergne, C.; Mermet, M.A.; Demongeot, J. & Jalbert, P. 1993. Logisticregressionmodel to estimate the riskofunbalanced offspring in reciprocal translocations.HumanGenetics,92:598‐604.

CigudosaGarcía,J.C.&LapunzinaBadía,P.(coord.)2012.ConsensoparalaImplementacióndelosArrays [CGH y SNP‐arrays] en la Genética Clínica.http://contenidos.institutoroche.es/pdf/2012/consenso_arrays.pdf Último acceso:14/05/2015.

De Benito, E. & Lillo, M. 2014. Los enfermos ‘raros’ toman las riendas.http://sociedad.elpais.com/sociedad/2014/02/27/actualidad/1393531241_119497.html.Últimoacceso:14/05/2015.

DelgadoRubio,A.;GalánGómez,E.;LapunzinaBadía,P.D.;Guillén‐Navarro,E.;Penchaszadeh,V.B.;Romeo Casabona, C.M. & Emaldi Cririón, A. 2012.Asesoramiento Genético en la PrácticaMédica.EditorialMédicaPanamericana,S.A.

Faraut,T.;Mermet,M.A.;Demongeot, J.&Cohen,O.2000.Cooperationofselectionandmeioticmechanisms in theproductionof imbalances in reciprocal translocations. CytogeneticsandCellGenetics,88:15‐21.

Feenstra, I.; Vissers, L.E.L.M.; Orsel, M.; van Kessel, A.G.; Brunner, H.G.; Veltman, J.A. & vanRavenswaaij‐Arts,C.M.2007.Genotype–PhenotypeMappingofChromosome18qDeletionsby High‐Resolution Array CGH: An Update of the Phenotypic Map. American Journal ofHumanGenetics,143A:1858–1867.

Gardner, R.J.M.; Sutherland, G.R. & Shaffer, L.G. 2011. Chromosome Abnormalities and GeneticCounseling. Oxford Monographs on Medical Genetics 61. 4th edition. Oxford UniversityPress.

Linnankivi,T.;Tienari,P.;Somer,M.;Kähkönen,M.;Lönnqvist,T.;Valanne,L.&Pihko,H.2006.18qdeletions:Clinical,molecular,andbrainMRI findingsof14 individuals.AmericanJournalofMedicalGenetics,140A:331‐339.

Moore,C.M.&Best,R.G.2001.ChromosomalGeneticDisease:StructuralAberrations.EncyclopediaOfLifesciences.

Mori,M.A.;Mansilla,E.;García‐Santiago,F.;Vallespín,E.;Palomares,M.;Martín,R.;Rodríguez,R.;Martínez‐Payo,C.;Gil‐Fournier,B.;Ramirof,S.;Lapunzina,P.&Nevado,J.2012.Diagnósticoprenatalyarray‐hibridacióngenómicacomparada (CGH)(I).Gestacionesdeelevadoriesgo.DiagnósticoPrenatal,23:34–48.

VanDerwerken, D. No prelo. Bayesian Assessment of Genetic Risk in Families with a BalancedTranslocation.JournalofGeneticCounseling.DOI:10.1007/s10897‐015‐9821‐0.

25

Anexo1TáboaI

XenesHGNC NECAP2,CROCCP3,RNU1‐1,NBPF1,CROCCP2,MST1P2,RNU1‐3,EIF1AXP1eESPNPXenesOMIM "NECAPENDOCYTOSIS‐ASSOCIATEDPROTEIN2;NECAP2(*611624)","RNA,U1A

SMALLNUCLEAR;RNU1A(*180680)","NEUROBLASTOMABREAKPOINTFAMILY,MEMBER15;NBPF15(*610414)","NEUROBLASTOMABREAKPOINTFAMILY,MEMBER1;NBPF1(*610501)","NEUROBLASTOMABREAKPOINTFAMILY,MEMBER11;NBPF11(*614001)","RNA,U1ASMALLNUCLEAR;RNU1A(*180680)"

EnfermidadesOMIM

CHROMOSOME1p36DELETIONSYNDROME(607872)

TáboaIIXenesHGNC BECN1P1,CFL1P4,MAP1LC3C,RNU6‐1139P,TUBB8P6,PLD5,RNA5SP81,RN7SKP12,

RSL24D1P4,RNU6‐747P,CEP170,SDCCAG8,FCF1P7,MIR4677,AKT3,FABP7P1,AKT3‐IT1,ZBTB18,RN7SL148P,C1orf100,TGIF2P1,ADSS,C1orf101,DESI2,COX20,HNRNPU‐AS1,HNRNPU,RN7SKP55,RNU6‐947P,EFCAB2,RNU6‐1089P,RNU6‐999P,RNU1‐132P,KIF26B,DNAJC19P8,SMYD3,CHCHD4P5,RNU6‐1283P,SMYD3‐IT1,TFB2M,CNST,SCCPDH,AHCTF1,ZNF695,ZNF670,ZNF669,C1orf229,FGFR3P6,ZNF124,MIR3916,MIR3916,RNA5SP82,VN1R17P,VN1R5,ZNF496,NLRP3,OR2B11,OR2W5,GCSAML,GCSAML‐AS1,OR2C3,OR2G2,OR2G3,RNU6‐691P,OR14L1P,OR3D1P,OR13G1,OR6F1,OR14A2,OR14K1,OR1C1,OR9H1P,OR14A16,HSD17B7P1,OR6R1P,OR11L1,TRIM58,OR2W3,OR2T8,OR2AJ1,OR2L13,OR2X1P,OR2L8,OR2AK2,OR2L9P,OR2L1P,OR2L6P,OR2L5,OR2L2,OR2L3,OR2T32P,OR2M1P,OR2M5,OR2M2,OR2M3,OR2M4,OR2T33,OR2T12,OR2M7,OR14C36,OR2T4,OR2T6,OR2T1,OR2T7,OR2T2,OR2T3,OR2T5,OR2AS2P,OR2G6,OR2AS1P,OR2T29,OR2T34,OR2T10,OR2T11,OR2T35,OR2T27,OR14I1,AHCYP8,LYPD8,SH3BP5L,MIR3124,ZNF672,ZNF692,PGBD2,RNU6‐1205P

XenesOMIM "MICROTUBULE‐ASSOCIATEDPROTEIN1,LIGHTCHAIN3,GAMMA;MAP1LC3C(*609605)","CENTROSOMALPROTEIN,170‐KD;CEP170(*613023)","SEROLOGICALLYDEFINEDCOLONCANCERANTIGEN8;SDCCAG8(*613524)","V‐AKTMURINETHYMOMAVIRALONCOGENEHOMOLOG3;AKT3(*611223)","ZINCFINGERPROTEIN238;ZNF238(*608433)","ADENYLOSUCCINATESYNTHETASE;ADSS(*103060)","DESUMOYLATINGISOPEPTIDASE2;DESI2(*614638)","CYTOCHROMEcOXIDASE20,S.CEREVISIAE,HOMOLOGOF;COX20(*614698)","HETEROGENEOUSNUCLEARRIBONUCLEOPROTEINU;HNRNPU(*602869)","KINESINFAMILYMEMBER26B;KIF26B(*614026)","SETANDMYNDDOMAIN‐CONTAININGPROTEIN3;SMYD3(*608783)","TRANSCRIPTIONFACTORB2,MITOCHONDRIAL;TFB2M(*607055)","CONSORTIN;CNST(*613439)","ATHOOK‐CONTAININGTRANSCRIPTIONFACTOR1;AHCTF1(*610853)","ZINCFINGERPROTEIN124;ZNF124(*194631)","ZINCFINGERPROTEIN496;ZNF496(*613911)","NLRFAMILY,PYRINDOMAIN‐CONTAINING3;NLRP3(*606416)","OLFACTORYRECEPTOR,FAMILY13,SUBFAMILYG,MEMBER1;OR13G1(*611677)"

EnfermidadesOMIM

SENIOR‐LOKENSYNDROME7;SLSN7(#613615),MEGALENCEPHALY‐POLYMICROGYRIA‐POLYDACTYLY‐HYDROCEPHALUSSYNDROME;(#603387),FAMILIALCOLDAUTOINFLAMMATORYSYNDROME1;FCAS1(#120100),CINCASYNDROME;CINCA(#607115),MUCKLE‐WELLSSYNDROME;MWS(#191900)

TáboaIIIXenesHGNC CDH20,RNF152,RPIAP1,PIGN,KIAA1468,TNFRSF11A,RPL17P44,ACTBP9,ZCCHC2,

RN7SL705P,PHLPP1,RNU6‐142P,BCL2,KDSR,VPS4B,SERPINB5,ATP5G1P6,SERPINB12,SERPINB13,SERPINB4,SERPINB11,SERPINB3,SERPINB7,SERPINB2,

26

SERPINB10,HMSD,SERPINB8,RPL12P39,LINC00305,RNU7‐146P,CDH7,PRPF19P1,CDH19,RNU6‐1037P,MIR5011,RPL31P9,DSEL,AKR1B10P2,TMX3,CCDC102B,RNU6‐39P,SDHCP1,DOK6,CD226,RTTN,SOCS6,RPS2P6,RN7SL795P,GTSCR1,CBLN2,HNRNPA1P11,NETO1,RNA5SP460,MIR548AV,RN7SL401P,FBXO15,TIMM21,RN7SL551P,CYB5A,C18orf63,FAUP1,FAM69C,CNDP2,CNDP1,LINC00909,ZNF407,ZADH2,TSHZ1,SMIM21,ZNF516,LINC00908,LINC00683,ARL2BPP1,RNU6‐346P,ZNF236,RPL26P35,MBP,GALR1,BDP1P,RNA5SP461,LINC01029,RNU6‐655P,SALL3,ATP9B,NFATC1,CTDP1,KCNG2,PQLC1,HSBP1L1,TXNL4A,RBFA,RBFADN,SLC25A6P4,ADNP2,PARD6G

XenesOMIM "CADHERIN20;CDH20(*605807)","PHOSPHATIDYLINOSITOLGLYCAN,CLASSN;PIGN(*606097)","TUMORNECROSISFACTORRECEPTORSUPERFAMILY,MEMBER11A;TNFRSF11A(*603499)","PHDOMAINANDLEUCINE‐RICHREPEATPROTEINPHOSPHATASE;PHLPP(*609396)","B‐CELLCLL/LYMPHOMA2;BCL2(+151430)","FOLLICULARLYMPHOMAVARIANTTRANSLOCATION1;FVT1(*136440)","VACUOLARPROTEINSORTING4,S.CEREVISIAE,HOMOLOGOF,B;VPS4B(*609983)","PROTEASEINHIBITOR5;PI5(*154790)","PROTEASEINHIBITOR13;PI13(*604445)","SERPINPEPTIDASEINHIBITOR,CLADEB(OVALBUMIN),MEMBER4;SERPINB4(*600518)","SERPINPEPTIDASEINHIBITOR,CLADEB(OVALBUMIN),MEMBER3;SERPINB3(*600517)","SERPINPEPTIDASEINHIBITOR,CLADEB(OVALBUMIN),MEMBER7;SERPINB7(*603357)","SERPINPEPTIDASEINHIBITOR,CLADEB(OVALBUMIN),MEMBER2;SERPINB2(*173390)","PROTEASEINHIBITOR10;PI10(*602058)","MINORHISTOCOMPATIBILITYANTIGEN,SERPINDOMAIN‐CONTAINING;HMSD(*612086)","PROTEASEINHIBITOR8;PI8(*601697)","CADHERIN7;CDH7(*605806)","CADHERIN19;CDH19(*603016)","DERMATANSULFATEEPIMERASE‐LIKE;DSEL(*611125)","DOCKINGPROTEIN6;DOK6(*611402)","CD226ANTIGEN;CD226(*605397)","ROTATIN;RTTN(*610436)","SUPPRESSOROFCYTOKINESIGNALING4;SOCS4(*605118)","PRECEREBELLIN2;CBLN2(*600433)","NEUROPILIN‐ANDTOLLOID‐LIKE1;NETO1(*607973)","F‐BOXONLYPROTEIN15;FBXO15(*609093)","TRANSLOCASEOFINNERMITOCHONDRIALMEMBRANE21,YEAST,HOMOLOGOF;(*615180)","CYTOCHROMEb5,TYPEA(MICROSOMAL);CYB5A(*613218)","FAMILYWITHSEQUENCESIMILARITY69,MEMBERC;FAM69C(*614544)","PEPTIDASEA;PEPA(*169800)","CARNOSINEDIPEPTIDASE1;CNDP1(*609064)","TEASHIRTZINCFINGERHOMEOBOX1;TSHZ1(*614427)","ZINCFINGERPROTEIN516;ZNF516(*615114)","ZINCFINGERPROTEIN236;ZNF236(*604760)","MYELINBASICPROTEIN;MBP(*159430)","GALANINRECEPTOR1;GALR1(*600377)","SAL‐LIKE3;SALL3(*605079)","ATPase,CLASSII,TYPE9B;ATP9B(*614446)","NUCLEARFACTOROFACTIVATEDTCELLS,CYTOPLASMIC,CALCINEURIN‐DEPENDENT(*600489)","C‐TERMINALDOMAINOFRNAPOLYMERASEIISUBUNITA,PHOSPHATASEOF,(*604927)","POTASSIUMCHANNEL,VOLTAGE‐GATED,SUBFAMILYG,MEMBER2;KCNG2(*605696)","THIOREDOXIN‐LIKE4A;TXNL4A(*611595)","PARTITIONING‐DEFECTIVEPROTEIN6,C.ELEGANS,HOMOLOGOF,GAMMA;PARD6G(*608976)"

EnfermidadesOMIM

MULTIPLECONGENITALANOMALIES‐HYPOTONIA‐SEIZURESSYNDROME1;MCAHS1(#614080),PAGETDISEASEOFBONE;PDB(#602080),FAMILIALEXPANSILEOSTEOLYSIS;FEO(#174810),OSTEOPETROSIS,AUTOSOMALRECESSIVE7;OPTB7(#612301),B‐CELLCLL/LYMPHOMA2;BCL2(+151430),POLYMICROGYRIAWITHSEIZURES;PMGYS(#614833),METHEMOGLOBINEMIATYPEIV(#250790),AURALATRESIA,CONGENITAL;CAA(#607842),CONGENITALCATARACTS,FACIALDYSMORPHISM,ANDNEUROPATHY(#604168)

TáboaIVXenesHGNC EXO1,BECN1P1,CFL1P4,MAP1LC3C,RNU6‐1139P,TUBB8P6,PLD5,RNA5SP81,

RN7SKP12,RSL24D1P4,RNU6‐747P,CEP170,SDCCAG8,FCF1P7,MIR4677,AKT3,FABP7P1,AKT3‐IT1,ZBTB18,RN7SL148P,C1orf100,TGIF2P1,ADSS,C1orf101,DESI2,COX20,HNRNPU‐AS1,HNRNPU,RN7SKP55,RNU6‐947P,EFCAB2,RNU6‐1089P,RNU6‐999P,RNU1‐132P,KIF26B

27

XenesOMIM "EXONUCLEASE1,S.CEREVISIAE,HOMOLOGOF;EXO1(*606063)","MICROTUBULE‐ASSOCIATEDPROTEIN1,LIGHTCHAIN3,GAMMA;MAP1LC3C(*609605)","CENTROSOMALPROTEIN,170‐KD;CEP170(*613023)","SEROLOGICALLYDEFINEDCOLONCANCERANTIGEN8;SDCCAG8(*613524)","V‐AKTMURINETHYMOMAVIRALONCOGENEHOMOLOG3;AKT3(*611223)","ZINCFINGERPROTEIN238;ZNF238(*608433)","ADENYLOSUCCINATESYNTHETASE;ADSS(*103060)","DESUMOYLATINGISOPEPTIDASE2;DESI2(*614638)","CYTOCHROMEcOXIDASE20,S.CEREVISIAE,HOMOLOGOF;COX20(*614698)","HETEROGENEOUSNUCLEARRIBONUCLEOPROTEINU;HNRNPU(*602869)","KINESINFAMILYMEMBER26B;KIF26B(*614026)"

EnfermidadesOMIM

SENIOR‐LOKENSYNDROME7;SLSN7(#613615),MEGALENCEPHALY‐POLYMICROGYRIA‐POLYDACTYLY‐HYDROCEPHALUSSYNDROME;(#603387)

TáboaVXenesHGNC KIF26B,SMYD3,CHCHD4P5,RNU6‐1283P,SMYD3‐IT1,TFB2M,CNST,SCCPDH,

AHCTF1,ZNF695,ZNF670,ZNF669,C1orf229,FGFR3P6,ZNF124,MIR3916,MIR3916,RNA5SP82,VN1R17P,VN1R5,ZNF496,NLRP3,OR2B11,OR2W5,GCSAML,GCSAML‐AS1,OR2C3,OR2G2,OR2G3,RNU6‐691P,OR14L1P,OR3D1P,OR13G1,OR6F1,OR14A2,OR14K1,OR1C1,OR9H1P,OR14A16,HSD17B7P1,OR6R1P,OR11L1,TRIM58,OR2W3,OR2T8,OR2AJ1,OR2L13,OR2X1P,OR2L8,OR2AK2,OR2L9P,OR2L1P,OR2L6P,OR2L5,OR2L2,OR2L3,OR2T32P,OR2M1P,OR2M5,OR2M2,OR2M3,OR2M4,OR2T33,OR2T12,OR2M7,OR14C36,OR2T4,OR2T6,OR2T1,OR2T7,OR2T2,OR2T3,OR2T5,OR2AS2P,OR2G6,OR2AS1P,OR2T29,OR2T34,OR2T10,OR2T11,OR2T35,OR2T27,OR14I1,AHCYP8,LYPD8,SH3BP5L,MIR3124,ZNF672,ZNF692,PGBD2,RNU6‐1205P

XenesOMIM "KINESINFAMILYMEMBER26B;KIF26B(*614026)","SETANDMYNDDOMAIN‐CONTAININGPROTEIN3;SMYD3(*608783)","TRANSCRIPTIONFACTORB2,MITOCHONDRIAL;TFB2M(*607055)","CONSORTIN;CNST(*613439)","ATHOOK‐CONTAININGTRANSCRIPTIONFACTOR1;AHCTF1(*610853)","ZINCFINGERPROTEIN124;ZNF124(*194631)","ZINCFINGERPROTEIN496;ZNF496(*613911)","NLRFAMILY,PYRINDOMAIN‐CONTAINING3;NLRP3(*606416)","OLFACTORYRECEPTOR,FAMILY13,SUBFAMILYG,MEMBER1;OR13G1(*611677)"

EnfermidadesOMIM

FAMILIALCOLDAUTOINFLAMMATORYSYNDROME1;FCAS1(#120100),CINCASYNDROME;CINCA(#607115),MUCKLE‐WELLSSYNDROME;MWS(#191900)

TáboaVIXenesHGNC CDH20,RNU6‐116P,RPL30P14,RNF152,RPIAP1,PIGN,KIAA1468,TNFRSF11A,

RPL17P44,ACTBP9,ZCCHC2,RN7SL705P,PHLPP1,RNU6‐142P,BCL2,KDSR,VPS4B,SERPINB5,ATP5G1P6,SERPINB12,SERPINB13,SERPINB4,SERPINB11,SERPINB3,SERPINB7,SERPINB2,SERPINB10,HMSD,SERPINB8,RPL12P39,LINC00305,RNU7‐146P,CDH7,PRPF19P1,CDH19,RNU6‐1037P,MIR5011,RPL31P9,DSEL,AKR1B10P2,TMX3,CCDC102B,RNU6‐39P,SDHCP1,DOK6,CD226,RTTN,SOCS6,RPS2P6,RN7SL795P,GTSCR1,CBLN2,HNRNPA1P11,NETO1,RNA5SP460,MIR548AV,RN7SL401P,FBXO15,TIMM21,RN7SL551P,CYB5A,C18orf63,FAUP1,FAM69C,CNDP2,CNDP1,LINC00909,ZNF407,ZADH2,TSHZ1,SMIM21,ZNF516,LINC00908,LINC00683,ARL2BPP1,RNU6‐346P,ZNF236,RPL26P35,MBP,GALR1,BDP1P,RNA5SP461,LINC01029,RNU6‐655P,SALL3,ATP9B,NFATC1,CTDP1,KCNG2,PQLC1,HSBP1L1,TXNL4A,RBFA,RBFADN,SLC25A6P4,ADNP2,PARD6G

XenesOMIM "CADHERIN20;CDH20(*605807)","PHOSPHATIDYLINOSITOLGLYCAN,CLASSN;PIGN(*606097)","TUMORNECROSISFACTORRECEPTORSUPERFAMILY,MEMBER11A;TNFRSF11A(*603499)","PHDOMAINANDLEUCINE‐RICHREPEATPROTEINPHOSPHATASE;PHLPP(*609396)","B‐CELLCLL/LYMPHOMA2;BCL2(+151430)","FOLLICULARLYMPHOMAVARIANTTRANSLOCATION1;FVT1(*136440)","VACUOLARPROTEINSORTING4,S.CEREVISIAE,HOMOLOGOF,B;VPS4B(*609983)","PROTEASE

28

INHIBITOR5;PI5(*154790)","PROTEASEINHIBITOR13;PI13(*604445)","SERPINPEPTIDASEINHIBITOR,CLADEB(OVALBUMIN),MEMBER4;SERPINB4(*600518)","SERPINPEPTIDASEINHIBITOR,CLADEB(OVALBUMIN),MEMBER3;SERPINB3(*600517)","SERPINPEPTIDASEINHIBITOR,CLADEB(OVALBUMIN),MEMBER7;SERPINB7(*603357)","SERPINPEPTIDASEINHIBITOR,CLADEB(OVALBUMIN),MEMBER2;SERPINB2(*173390)","PROTEASEINHIBITOR10;PI10(*602058)","MINORHISTOCOMPATIBILITYANTIGEN,SERPINDOMAIN‐CONTAINING;HMSD(*612086)","PROTEASEINHIBITOR8;PI8(*601697)","CADHERIN7;CDH7(*605806)","CADHERIN19;CDH19(*603016)","DERMATANSULFATEEPIMERASE‐LIKE;DSEL(*611125)","DOCKINGPROTEIN6;DOK6(*611402)","CD226ANTIGEN;CD226(*605397)","ROTATIN;RTTN(*610436)","SUPPRESSOROFCYTOKINESIGNALING4;SOCS4(*605118)","PRECEREBELLIN2;CBLN2(*600433)","NEUROPILIN‐ANDTOLLOID‐LIKE1;NETO1(*607973)","F‐BOXONLYPROTEIN15;FBXO15(*609093)","TRANSLOCASEOFINNERMITOCHONDRIALMEMBRANE21,YEAST,HOMOLOGOF;(*615180)","CYTOCHROMEb5,TYPEA(MICROSOMAL);CYB5A(*613218)","FAMILYWITHSEQUENCESIMILARITY69,MEMBERC;FAM69C(*614544)","PEPTIDASEA;PEPA(*169800)","CARNOSINEDIPEPTIDASE1;CNDP1(*609064)","TEASHIRTZINCFINGERHOMEOBOX1;TSHZ1(*614427)","ZINCFINGERPROTEIN516;ZNF516(*615114)","ZINCFINGERPROTEIN236;ZNF236(*604760)","MYELINBASICPROTEIN;MBP(*159430)","GALANINRECEPTOR1;GALR1(*600377)","SAL‐LIKE3;SALL3(*605079)","ATPase,CLASSII,TYPE9B;ATP9B(*614446)","NUCLEARFACTOROFACTIVATEDTCELLS,CYTOPLASMIC,CALCINEURIN‐DEPENDENT(*600489)","C‐TERMINALDOMAINOFRNAPOLYMERASEIISUBUNITA,PHOSPHATASEOF,(*604927)","POTASSIUMCHANNEL,VOLTAGE‐GATED,SUBFAMILYG,MEMBER2;KCNG2(*605696)","THIOREDOXIN‐LIKE4A;TXNL4A(*611595)","PARTITIONING‐DEFECTIVEPROTEIN6,C.ELEGANS,HOMOLOGOF,GAMMA;PARD6G(*608976)"

EnfermidadesOMIM

MULTIPLECONGENITALANOMALIES‐HYPOTONIA‐SEIZURESSYNDROME1;MCAHS1(#614080),PAGETDISEASEOFBONE;PDB(#602080),FAMILIALEXPANSILEOSTEOLYSIS;FEO(#174810),OSTEOPETROSIS,AUTOSOMALRECESSIVE7;OPTB7(#612301),B‐CELLCLL/LYMPHOMA2;BCL2(+151430),POLYMICROGYRIAWITHSEIZURES;PMGYS(#614833),METHEMOGLOBINEMIATYPEIV(#250790),AURALATRESIA,CONGENITAL;CAA(#607842),CONGENITALCATARACTS,FACIALDYSMORPHISM,ANDNEUROPATHY(#604168)

TáboaVIIXenesHGNC ZNF72P,ABCD1P4XenesOMIM ØEnfermidadesOMIM

Ø

TáboaVIIIXenesHGNC PPP2R3B,FABP5P13,KRT18P53XenesOMIM "PROTEINPHOSPHATASE2,REGULATORYSUBUNITB‐DOUBLEPRIME,BETA;PPP2R3B

(*300339)"EnfermidadesOMIM

Ø

TáboaIXXenesHGNC IL3RA,SLC25A6,LINC00106,ASMTL‐AS1,ASMTL,P2RY8,AKAP17A,ASMT,DHRSX,

DHRSX‐IT1XenesOMIM "INTERLEUKIN3RECEPTOR,ALPHA;IL3RA(*308385)","INTERLEUKIN3RECEPTOR,Y‐

CHROMOSOMAL;IL3RA(*430000)","ADENINENUCLEOTIDETRANSLOCATOR3,Y‐

29

CHROMOSOMAL;ANT3Y(*403000)","ALPHA‐2‐MACROGLOBULIN;A2M(*103950)","SOLUTECARRIERFAMILY25(MITOCHONDRIALCARRIER,ADENINENUCLEOTIDE(*300151)","ACETYLSEROTONINMETHYLTRANSFERASE‐LIKE;ASMTL(*300162)","ACETYLSEROTONINMETHYLTRANSFERASE‐LIKE,Y‐LINKED(*400011)","PYRIMIDINERGICRECEPTORP2Y,GPROTEIN‐COUPLED,8;P2RY8(*300525)","SPLICINGFACTOR,ARGININE/SERINE‐RICH,17A;SFRS17A(*312095)","SPLICINGFACTOR,ARGININE/SERINERICH,17A;SFRS17A(*465000)","ACETYLSEROTONINMETHYLTRANSFERASE,X‐CHROMOSOMAL;ASMT(*300015)","ACETYLSEROTONINMETHYLTRANSFERASE,Y‐CHROMOSOMAL;ASMT(*402500)"

EnfermidadesOMIM

Ø