EUPHRESCO 2008-2009

Státní rostlinolékařská správa

Odbor diagnostiky

Zapojení SRS do projektů Euphresco

1/ Cystotvorná háďátka bramborová r. Globodera – testy odborné způsobilosti diagnostiky druhů a ověření metodiky

testování rezistence (DL Praha) 2/ Ověření diagnostických metod detekce a identifikace

molicemi přenášených virů regulovaných či karanténních v rámci EU (DL Olomouc)

Část 1 – Globodera (DL Praha)Řešitelé: Vladimír Gaar, Ludmila Neubauerová

Cíle projektu:

1/ ověřit úroveň zúčastněných laboratoří při identifikaci cystotvorných háďátek r. Globodera

2/ pomocí vlastní zvolené metody ověřit účinnost testování rezistence odrůd brambor

Účastníci projektu:

Belgie, Bulharsko, Česká republika, Francie, Irsko, Itálie, Maďarsko, Německo, Nizozemsko, Rakousko,

Řecko, Slovinsko, Španělsko, Turecko, Velká Británie

Garanti projektu:

Loes den Nijs (NL), Nicole Viaene (B)

Plánovaný průběh projektu

- X.08 – pilotní schůzka účastníků (Gent)

- XI.-XII.08 – 1. část testů: testy identifikace - III.09 – 2. část: biologické testy - stanovení

rezistence dodaných odrůd (Pf:Pi)

- léto 09 – sklizeň a vyhodnocení testů

- X.09 – závěrečná schůzka (Gent)

Skutečný průběh projektu:

2008

1/ jednání a koordinace projektu s MZe2/ přiděleny finanční prostředky

(65.000 Kč) – cestovné, spotřební materiál3/ účast na pilotní schůzce

4/ provedena první část testů (diagnostika 8 vzorků -neznámých cyst r. Globodera: morfologicky, PCR)

Perinea Globodera pallida a G. rostochiensis

2009

1/ přiděleny finanční prostředky (67.000 Kč)2/ II. došly z NL vzorky cyst + hlíz, III.09 bude založen

biologický test rezistence, po jeho vyhodnocení zpracována a odeslána závěrečná zpráva

3/ závěrečná schůzka (zhodnocení projektu, porovnání účinnosti jednotlivých národních postupů s metodou

závaznou pro ČS EU (Council Directive 20007/33/EC), doporučení změn(?)

Část 2 – (DL Olomouc)Řešitelky: Gabriela Červená, Hana Orságová

Ověření diagnostických metod detekce a identifikace molicemi

přenášených virů regulovaných či karanténních v rámci EU

Zadání projektu:

Pomocí standardní PCR (popř. real-time PCR) ověřit diagnostické metody detekce a identifikace molicemi

přenášených virů regulovaných či karanténních, týkajících se území Evropy.

Ověřované metody budou porovnány se stávajícími standardy používanými ve většině laboratoří a získaná validační data budou použita při tvorbě nových EPPO

protokolů.

Pozn.: Laboratoř DL Olomouc se účastní projektu pouze metodou klasické PCR

Zaměření projektu:

a. Cucurbit yellow stunting disorder virus, CYSDV, Genus Crinivirus

b.  Cucumber vein yellowing virus, CVYV,

Genus Ipomovirus

c.  Tomato chlorosis virus, ToCV, Genus Crinivirus

d.  Tomato infectious chlorosis virus, TICV,

Genus Crinivirus         

e. Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV, Genus Begomovirus

Účastníci projektu

BelgieBulharsko

Česká republikaFrancie

KyprNizozemskoNový Zéland

ŘeckoVelká Británie

Koordinátor projektu: Neil Boonham (CSL, VB)

  Harmonogram projektu:

1/ XII.08 – zkušební test2/ III.09 - hlavní část projektu - distribuce primerů a

vzorků (CSL) a následná validace dodaných diagnostických metod (SRS).

3/ IV.09 - odeslání získaných výsledků do CSL. 4/ léto 09 - shrnutí a vyhodnocení výsledků,

statistická analýza atd. (CSL). 5/ podzim 09 - ukončení projektu (závěrečná

zpráva) (CSL).

       

Zkušební test - 2008:

Účel: prověření schopnosti zúčastněných laboratoří provádět analýzu;

ověření funkčnosti metody extrakce nukleových kyselin, PCR a vyhodnocení výsledků, rychlosti dodání výsledků zpět a odhalení

možných problémů.

Dodaný materiál: - 4 zkušební vzorky pro detekci TYLCV (viru žluté svinutky listů

rajčete) ve formě sušených listů (2 slepé vzorky, pozitivní kontrola, negativní kontrola) - primery pro PCR

- návrh postupu izolace DNA (možnost použití vlastní používané metody izolace)

Postup: - každý ze 4 dodaných vzorků rozdělen na dva dílčí vzorky

(vyšší spolehlivost výsledků)

Izolace provedena:

a) dle dodaného protokolu (CTAB izolace)

b) v laboratoři standardně používanou metodou pro izolaci DNA z rostlinného materiálu (Dneasy Plant minikit,

Qiagen). Vzhledem k tomu, že TYLCV se na území ČR nevyskytuje, laboratoř nemá rutinně zavedenou metodiku pro

detekci tohoto viru.

- u všech vyizolovaných vzorků provedena dle požadavků interní PCR kontrola s dodanými primery detekujícími

rostlinnou DNA (ověření správnosti izolace DNA a schopnosti amplifikace v reakci) a následně PCR s dodanými primery pro

detekci TYLCV.

Úspěšnost testu byla 100%.

Finanční prostředky požadované pro rok 2008 (15.000,-Kč) byly použity proprovedení celkem 40 PCR reakcí a jejich vyhodnocení agarosovou

elektroforézou:

4 dodané vzorky (8 izolací) + negativní a pozitivní kontrola pro PCR reakci= 10 reakcí (vzorky izolované CTAB metodou - interní PCR kontrola)

4 dodané vzorky (8 izolací) + negativní a pozitivní kontrola pro PCR reakci= 10 reakcí (vzorky izolované CTAB metodou - PCR detekce TYLCV)

4 dodané vzorky (8 izolací) + negativní a pozitivní kontrola pro PCR reakci= 10 reakcí (vzorky izolované Dneasy kit metodou - interní PCR kontrola)

4 dodané vzorky (8 izolací) + negativní a pozitivní kontrola pro PCR reakci= 10 reakcí (vzorky izolované Dneasy kit metodou - PCR detekce TYLCV)

Výše finančních požadavků pro rok 2009 byla stanovena na 30.000,-Kč

Následují dvě fotografie výsledků PCR - pro každou metodu izolace jedna. COX je interní PCR

kontrola, TYLCV potom specifická PCR pro detekce hledaného viru. 

Izolace pomocí DNeasy plant mini kitu

Izolace pomocí CTAB

Obecné zhodnocení projektů

Vyhlášené projekty naplňují poslání Euphresco – účastnické státy řeší výzkumné úkoly společně a koordinovaně

- úspora financí

- možnost průběžného srovnávání a konečné optimalizace použitých metod v jedinou

- možnost konzultací s kolegy, zabývající se stejnou problematikou ve stejném čase

- věrohodnost výsledků a jejich snazší přijatelnost

Přínos účasti na projektech pro SRS

1/ aktivní účast při ověřování metodických postupů a možnost ovlivnění nových metodik EPPO

2/ získání/prohlubování kontaktů se zahraničními specialisty a zvýšení povědomí o úrovni našich organizací, zabývajících se rostlinolékařstvím

3/ nové informace a postupy, které se mohou stát základem budoucích SOP

4/ získání referenčních materiálů, které lze dále využít jako pozitivní kontroly

Poděkování MZe ČR za koordinaci a financování projektu.

Vše. Díky!