EVALUACIÓN IN VITRO DE LA DECOLORACION DE INDIGO, MEDIANTE EL USO DEL HONGO DE PODREDUMBRE BLANCA, Pleurotus ostreatus.

Erika Katherine Herrera Sastoque Laura Juliana Rincón Chisino

Director

PhD. Aura Marina Pedroza Rodríguez Pontificia Universidad Javeriana

Bogotá-Colombia

Codirector

Ing. Sonia Esperanza Ruíz Balaguera Universidad Industrial de Santander

Bucaramanga-Colombia

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

Bogotá

2010

EVALUACIÓN IN VITRO DE LA DECOLORACION DE INDIGO, MEDIANTE EL USO DEL HONGO DE PODREDUMBRE BLANCA, Pleurotus ostreatus.

Erika Katherine Herrera Sastoque Laura Juliana Rincón Chisino

__________________________ ___________________________

Dra. Ingrid Schuler PhD. Dra. Janeth Arias Palacios Msc.

Bióloga Bacterióloga

Decana Académica Facultad de Ciencias Directora Carrera Microbiología

EVALUACIÓN IN VITRO DE LA DECOLORACION DE INDIGO, MEDIANTE EL USO DEL HONGO DE PODREDUMBRE BLANCA, Pleurotus ostreatus.

Erika Katherine Herrera Sastoque Laura Juliana Rincón Chisino

___________________________ ___________________________

Aura Marina Pedroza MsC. PhD. Ing Sonia Esperanza Ruíz

Bacterióloga Ingeniera Química Candidata a Msc

Directora Codirectora

___________________________

Ivonne Gutiérrez Rojas

Bacterióloga

Jurado

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada

contrario al dogma y a la moral católica y por que la tesis no contenga ataques

personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar

la verdad y la justicia”

DEDICATORIA

Este trabajo lo dedicamos principalmente a Dios, a

nuestros padres y a todas aquellas personas que

nos guiaron y acompañaron durante este tiempo.

AGRADECIMIENTOS

Queremos expresar nuestros más sinceros agradecimientos

- A Dios, por la oportunidad que nos da cada nuevo día de aprender y compartir con las

personas a nuestro alrededor.

- A nuestros padres, por su apoyo incondicional, constancia y cariño que nos brindan día a

día.

- A Aura Marina Pedroza y Sonia Ruiz por su constante ayuda, asesoría y dedicación durante

este tiempo.

- Al laboratorio de Microbiología Ambiental y Suelos por su permanente colaboración.

- A Aurita, Ruka y todo el grupo de monitoria por su ayuda y apoyo incondicional.

TABLA DE CONTENIDO

PÁG.

INDICE DE TABLAS…………………………………………………………………………………………...iii

INDICE DE FIGURAS………………………………………………………………………………………….iv

RESUMEN………………………………………………………………………………………..……………...v

INTRODUCCION………………………………………………………………………………….……………vi

JUSTIFICACION…………………………………………………………………………………..…………...vii

1. MARCO TEÓRICO……………………...……………………………………………………………...1

2. OBJETIVOS……………………………………………………………………………………………..4

2.1 OBJETIVO GENERAL……..………………………………………………………………………..…4

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS………………………….…………...……………………………….....4

3. METODOLOGIA……………………………………………………..………………………………....5

3.1 REACTIVACION DE LA CEPA…………………………………………………………………..…...5

3.1.1 ORIGEN DE LA CEPA…………………………………………………………………………………5

3.1.2 PRESERVACION DE LA CEPA A MEDIANO PLAZO……………………………….…….………5

3.2 CARACTERIZACION DEL COLORANTE Y ESTUDIOS DE ADSORCION A LA BIOMASA

FUNGICA………………………………………………………………………………..………………5

3.2.1 PREPARACIÓN DEL COLORANTE INDIGO…...……………………….…………………….……5

3.2.2 BARRIDO DE ABSORCIÓN………………………………………….…………………………….…5

3.2.3 CURVA DE CALIBRACIÓN…………………………………………………………..…………..…...5

3.2.4 ESTANDARIZACIÓN PORCENTAJE DE HUMEDAD Y PESO SECO DE BIOMASA…………5

3.2.5 ESTUDIOS DE ADSORCIÓN………………………………………………………………………....6

3.3 PRUEBAS DE DECOLORACIÓN EN MEDIO AGARIZADO…………………………………...…6

3.4 PLACKETT BURMAN………………………………………………………………...………………..7

3.4.1 CUANTIFICACIÓN ENZIMÁTICA…………………..……………………………….………….….…7

3.4.2 PORCENTAJE DE DECOLORACIÓN…………………………………………….………………....7

3.4.3 DETERMINACION DE DQO…………………………………………………………………..…...…7

3.4.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO………………………………………………………...……………..…….7

3.5 DISEÑO EXPERIMENTAL DE PASO ASCENDENTE PARA LOS FACTORES

SIGNIFICATIVOS SEGÚN LOS RESULTADOS DEL PLACKETT BURMAN…………………..7

3.6 CINÉTICA DE DECOLORACIÓN DE INDIGO A ESCALA DE LABORATORIO……….…........8

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…….……………………………………………………………….…9

4.1 REACTIVACIÓN DE LA CEPA………………………………………………..…………………...…9

4.2 CARACTERIZACION DEL COLORANTE Y ESTUDIOS DE ADSORCION A LA BIOMASA

FUNGICA………………………………………………………………………………………….…….9

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4.2.1 PREPARACIÓN DEL COLORANTE INDIGO…………………………………………...…….…….9

4.2.2 BARRIDO DE ADSORCIÓN……………………………………………………..………………..…..9

4.2.3 CURVA DE CALIBRACIÓN…………………………………………..……………………………...10

4.2.4 PORCENTAJE DE HUMEDAD Y PESO SECO DE LA BIOMASA……………………………..10

4.2.5 ESTUDIOS DE ADSORCIÓN………………………………………………………….………….…10

4.3 PRUEBAS DE DECOLORACIÓN EN MEDIO AGARIZADO………………………………….…12

4.4 PLACKETT BURMAN…………………………………………………………………….……….....14

4.5 DISEÑO EXPERIMENTAL DE PASO ASCENDENTE……………………………………….…..16

4.6 CINETICA DE DECOLORACION DE INDIGO A ESCALA DE LABORATORIO……………...18

4.6.1 DQO Y DECOLORACIÓN……………………..…………………………………………….………18

4.6.2 BIOMASA Y pH………………………………………………………………………………………..19

4.6.3 CUANTIFICACION DE ENZIMAS…………………………………………………..………….…...20

5. CONCLUSIONES……………………………………….……………………………..…………..…22

6. BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………………………………..…23

7. ANEXOS…………………………………………………………………………………………….....27

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INDICE DE TABLAS

TABLA 1. Matriz Plackett Burman……………………………………………………………..………..7

TABLA 2. Diseño experimental de paso ascendente para el tratamiento 11…………..……..…....8 TABLA 3. Concentraciones máximas adsorbidas de colorante/g soporte y constantes de

Langmuir………………………………………………………………………………….…..11 TABLA 4. Fotografías de la decoloración in vitro en Radha bajo dos condiciones nutricionales

con el hongo Pleurotus ostreatus. 30ºC, 11 días……………………………….…..……13 TABLA 5 (A) Valores de referencia para los vertimientos realizados a la red de alcantarillado.

Resolución 3957…………………………………………………………………..…………27 TABLA 6 (B) Valores de referencia para los vertimientos realizados a la red de alcantarillado.

Resolución 3957…………………………………………………………………………..…28 TABLA 7 Enzimas producidas por diferentes cepas de hongos y sus actividades…………..….29 TABLA 8 Preparación de los patrones de biftalato de potasio a partir de una solución stock de

8000mg/L………………………………………………………………………………….….34

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INDICE DE FIGURAS

FIGURA 1. Reactivación en agar extracto salvado de trigo. Crecimiento en placa: (A) Pleurotus ostreatus (anverso), (B) Pleurotus ostreatus (reverso), (C) microscopía óptica 100 X. A 30°C durante 7 días…………………………………………..………………….…….....9

FIGURA 2. Isoterma de Adsorción Biomasa viable a 160 ppm de índigo durante 6h……............12 FIGURA 3. Isoterma de Adsorción Biomasa inactiva a 160ppm de índigo durante 12h………..…12 FIGURA 4. Crecimiento micelial libre de P. ostreatus bajo dos condiciones nutricionales…….....13 FIGURA 5. Decoloración (%) de índigo mediado por P. ostreatus bajo dos condiciones

nutricionales….………………………………………………………………………….…...13 FIGURA 6. Diseño experimental Plackett Burman…………………………………………….….…...16 FIGURA 7. Diseño de optimización de paso ascendente. Variables de respuesta………………...17 FIGURA 8. Perfil de Decoloración, pH y Biomasa. Tratamiento biológico y control de adsorción. (Índigo a 160ppm, pH de 8, a 30°C y120rpm)………………………………………........19 FIGURA 9. Perfiles de la producción de enzimas (Lac, MnP y LiP) y pH a través del tiempo…....20 FIGURA 10. Barrido Uv/vis del colorante inicial, y de la cinética a las 24h para biomasa viable e

inactiva………………………………………………………………………………….…..21 FIGURA 11. Formación del colorante índigo………………………………………………………..…27 FIGURA 12. Curva de Calibración DQO…………………………………………………………….....29 FIGURA 13. Modificación química del colorante índigo durante su elaboración…………………..35 FIGURA 14. Barrido adsorción Uv/Vis Colorante 40 ppm…………………………………………....35 FIGURA 15. Curva de calibración del índigo…………………………………………………………..36 FIGURA 16. Grupo cromóforo presente en el índigo………………………………………………....36 FIGURA 17. Degradación del índigo catalizado por la enzima Lacasa……………………………..37 FIGURA 18. Adsorción del colorante por la biomasa………………………………………………....37

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RESUMEN El índigo, es un colorante ampliamente usado en la industria textil en procesos de teñido de hilos de algodón tipo denim. Al finalizar el proceso, se generan vertimientos que pueden afectar el ecosistema acuático generando así una problemática a nivel mundial asociada con la contaminación del recurso hídrico. En cuanto a su remoción, los métodos de eliminación clásicos no son muy eficientes para disminuir el color y por el contrario se pueden dar reacciones de oxidación o reducción que generan productos secundarios altamente tóxicos, por lo cual se ha venido investigando el uso de sistemas biológicos en donde los hongos de la podredumbre blanca han tenido gran impacto debido a su capacidad para degradar diferentes tipos de colorantes ya sea por mecanismos enzimáticos, adsortivos o combinados. En el presente trabajo, se evaluó la decoloración de índigo por medio de Pleurotus ostreatus para lo cual se realizaron pruebas preliminares de decoloración en agar (bajo dos condiciones nutricionales: concentración del colorante (160 y 320ppm) y adición o no de co-sustrato (glucosa)) encontrando un porcentaje de decoloración de hasta 94.4% (160ppm sin adición de co-sustrato) y 71.5% (320ppm con adición de co-sustrato). Posteriormente se realizaron estudios de adsorción usando biomasa viable e inactiva, en donde se determinaron las constantes de saturación máximas correspondientes a 18.05 mg/g y 35.21 mg/g respectivamente. Se aplicó un diseño experimental multifactorial Plackett Burman con el fin de seleccionar las condiciones de operación y factores nutricionales que favorezcan la decoloración, encontrando diferencias altamente significativas (p<0.0001) entre los 12 tratamientos evaluados para decoloración y DQO. Los tratamientos 11 y 12 entre si no presentaron diferencias (p>0.0001) con valores de 89 y 78% de remoción determinando la selección del tratamiento 11 (160 ppm, pH 8.0, a 30º C, sin cobre, a 120 rpm, por 12h, 10g/L de glucosa, sin suplemento de nitrógeno y 160 µMol/L de MnSO4.) ya que con este se obtuvieron valores de 83% y 78% de remoción de color y DQO respectivamente, con una actividad lacasa de 21.1U/L. A partir de este tratamiento, se realizó un diseño experimental de paso ascendete/descendente en donde se evaluaron tres ascensos del factor significativo (agitación ascendente y glucosa descendente) encontrando diferencias altamente significativas entre tratamientos (p<0.0001) para la remoción de color, DQO y actividad lacasa, demostrándose que la máxima respuesta se obtuvo en el punto central con valores de 77%, 51% y 17 U/L respectivamente. Por último, a partir de este tratamiento (11 punto central) se realizó una cinética a escala de laboratorio donde se obtuvieron diferencias en los porcentaje de remoción de color y de DQO entre la biomasa viable e inactiva con valores máximos de 88 y 23% y de 62 % a las 48h respectivamente, con un máximo de actividad lacasa de 4.21U/L a las 6h. Además se realizaron barridos Uv/vis en donde se presentó una disminución en el pico característico del índigo en el espectro visible y la aparición de nuevos picos en rangos de absorbancia entre 200 y 240nm que podrían corresponder a los subproductos de la degradación como el isatín y el ácido antranílico.

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INTRODUCCION

Actualmente, se ha incrementado el interés a nivel mundial por la problemática de la contaminación debida a la presencia de color en los cursos de agua. En la industria textil se produce una cantidad de agua estándar de 120m3 /Ton de fibra procesada, lo que equivale a un valor en color aproximado de 1100-1300 unidades Hazen (1). Ahora bien, el problema de que existan cierto tipo de colorantes en el agua es que pueden ser tóxicos (toxicidad aguda) (2) y a la vez de difícil remoción, como es el caso del índigo, proveniente de la planta Indigofera tinctoria. Este, ha sido durante siglos, uno de los colorantes más empleados por las industrias textiles en procesos de teñido donde se generan residuos que causan daño al ecosistema, en la actividad fotosintética de la vida acuática y repercusión en la salud humana. Estos colorantes, son de difícil degradación debido a su compleja estructura y su naturaleza recalcitrante por lo que se torna de carácter obligatorio para las industrias removerlo de sus efluentes antes de que sean vertidos a sistemas hidrológicos (1). Con este fin, se hace uso de métodos químicos o fisicoquímicos los cuales son generalmente costosos y de aplicación limitada. Por consiguiente, hay una necesidad de desarrollar un método biológico de tratamiento de colorantes que se puede utilizar para una amplia gama de residuos (3). Actualmente, se ha reportado la capacidad de los hongos de la podredumbre blanca para degradar, por el uso de mecanismos ya sean enzimáticos o de adsorción a su pared celular, una amplia gama de productos químicos sintéticos y naturales, muchos de los cuales son recalcitrantes a la biodegradación (3). En la actualidad, se han estudiado diversos colorantes, sin embargo, un número determinado de organismos han sido probados, para el caso de índigo, se ha reportado el uso de hongos como Phellinus gilvus, Pleurotus sajor-caju, Phanerochaete chrysosporium y Trametes versicolor. Este trabajo presenta un estudio con Pleurotus ostreatus como primer reporte en Colombia de su uso para la decoloración de índigo además por su capacidad para decolorar una gama de tintes estructuralmente diferentes.

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JUSTIFICACIÓN. El agua residual de las industrias textiles constituye una seria amenaza para el medio ambiente en muchas partes del mundo, debido a la gran producción de residuos tanto sólidos como líquidos (120m3 /Ton de fibra procesada), donde un 15% de los colorantes usados en los procesos de teñido son vertidos en el efluente (1). La problemática radica en la estabilidad de varios colorantes a la luz, temperatura y ataque microbiano, convirtiéndolos en compuestos recalcitrantes, muchos de ellos tóxicos (4). Debido a esto, los procesos de tratamiento biológico, en condiciones aeróbicas, no son eficaces en la eliminación del color y si producen una gran cantidad de lodos, los cuales se estiman en aproximadamente 20 toneladas/día (2,5). El colorante índigo, es uno de los más usado en las industrias textiles para procesos de tinción, y es un compuesto que genera contaminación visual en los efluentes de este tipo de industrias.

Una característica clave en los procesos de degradación, especialmente en los procesos aerobios, involucra la generación de formas activadas de oxígeno, permitiendo el ataque inicial en la estructura estable, por procesos de oxidación. Después de la transformación, hay etapas más sencillas en las que varios organismos pueden participar degradando o mineralizando completamente el compuesto, como es el caso de los hongos de podredumbre blanca, cuyo uso ha sido ampliamente estudiado, debido a su capacidad para transformar varios tipos de colorantes en productos de fácil degradación y no tóxicos (5,6). Esta capacidad para degradar compuestos recalcitrantes, es debida a la presencia de un sistema enzimático extracelular de baja especificidad y de amplio espectro, compuesto por lignina peroxidasa (EC 1.11.1.14) y manganeso peroxidasa (EC.1.11.1.13) (4,2). Otras enzimas utilizadas para este fin son: las enzimas productoras de H2O2, como por ejemplo, la glucosa-1-oxidasa (EC 1.1.3.4) y glucosa 2-oxidasa (EC 1.1.3.4), junto con lacasa (EC 1.10.3.2), y una enzima fenol-oxidasa., las cuales son las mismas usadas para la degradación de la lignina (7). Además, estos microorganismos hacen uso de otro mecanismo de degradación conocido como biosorción, el cual involucra la unión de los solutos a la biomasa mediante procesos que no implican la energía metabólica o de transporte, aunque estos procesos pueden ocurrir simultáneamente, si se hace uso de biomasa viable. La unión del colorante a la biomasa se da mediante intercambio iónico en donde juega un papel importante la atracción electrostática en los lugares cargados de la superficie. Por lo tanto, puede ocurrir tanto en biomasa viable como inactiva (8).

Así, se ha querido evaluar como alternativa de tratamiento a escala de laboratorio la decoloración de índigo, empleando Pleurotus ostreatus.

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1. MARCO TEÓRICO

Colorantes textiles de origen natural, como el índigo, son muy populares y altamente utilizados en fibras de celulosa como el algodón. El índigo, proviene de la planta Indigofera tinctoria y se obtiene a partir del glucósido denominado Indican, el cual se hidroliza mediante enzimas, en glucosa e indoxilo (amarillo), donde este último en contacto con el aire se oxida generando el colorante azul (9) (anexo 1), el cual ha sido durante siglos, uno de los colorantes empleados en cantidades importantes por las industrias textiles. Este, es un tinte azul, brillante y muy sólido, presenta un punto de fusión elevado (p.f. 392°), es completamente insoluble en agua, ácidos o bases y resistente a la luz y al lavado (9). Su composición química es C18H10O2N2 (10). En cuanto al proceso de tinción, se requiere que el colorante a emplear, sea estable, es decir, que permanezca en la tela luego de procesos de lavado. El índigo, según la aplicación al tejido, se clasifica en colorante a la tina (11), ya que luego de un proceso de reducción en medio alcalino, este es soluble en agua, al cual se denomina leucoíndigo incoloro. Cuando el algodón se introduce en la tina, el leucoíndigo es adsorbido por enlaces de hidrógeno que se forman entre los grupos hidroxilo de subunidades de glucosa y grupos del colorante (11), permitiendo, que este último permanezca fijo sobre el tejido. Una vez sumergidas las telas, estas se exponen al aire ó se emplean oxidantes como el perborato sódico, agilizando el proceso de oxidación del leucoíndigo a índigo (color azul), el cual queda atrapado dentro de las fibras, obteniéndose así una tintura sólida (9,11). Ahora bien, durante estos procesos de teñido, se genera una serie de efluentes líquidos, que tienen impactos ambientales múltiples debido a la gran variedad de materias primas, reactivos y métodos de producción. En estos efluentes se pueden encontrar sales (sulfatos, sulfitos, tiosulfatos) (12) almidón, peróxidos, EDTA, tensoactivos, enzimas, metales, compuestos orgánicos de variada estructura y colorantes, los cuales se pierden en efluentes en más de un 50% (13). Todos estos compuestos provienen de las distintas etapas del proceso global de tinción (14). Los afluentes generados por industrias de tipo textil, imprenta, papelera, plásticos, como se mencionó previamente, contienen colorantes de tipo indigoide. Residuos de este colorante, interfieren en la transmisión de luz, inhibiendo la actividad fotosintética de la biota acuática (13,14), además causa irritación gastrointestinal, nauseas, vómito y diarrea (13) siendo de vital importancia su remoción. Con el fin de evitar vertimientos en alcantarillados con alta carga contaminante, las industrias deben regirse por decretos y resoluciones publicadas por organismos gubernamentales. En cuanto a los decretos, industrias como la textil, debe tener presente el art. 73 del decreto 1594/84, donde se mencionan los límites para vertimientos en alcantarillado público ó el art 72 del mismo decreto para vertimientos en cuerpos acuíferos. De igual forma, en el distrito capital, se establece una norma para el cumplimiento de vertidos en alcantarillado público mediante la resolución 3957 (anexo 2). Los colorantes, al tener gran persistencia en el ambiente, y debido a que los métodos de eliminación clásicos no son útiles a causa de que oxidaciones o reducciones parciales pueden

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generar productos secundarios altamente tóxicos (15), los tratamientos biológicos con el uso de hongos de podredumbre blanca entraron recientemente como una alternativa viable a los métodos físico-químicos conocidos, debido a su costo, eficacia y beneficio para el medio ambiente. Estos procesos, tienen potencial para mineralizar los colorantes en compuestos inorgánicos como CO2 y H2O. Además, pueden ser aeróbicos, anaeróbicos o la combinación de ambos dependiendo del tipo de microorganismos que se emplee (16). Los hongos de podredumbre blanca, han demostrado ser organismos adecuados para el tratamiento de efluentes textiles, por su capacidad de producir enzimas oxidativas (lacasa (EC 1.10.3.2), lignina peroxidasa (LiP) (EC 1.11.1.14) y manganeso peroxidasa (MnP) (EC.1.11.1.13)) que permiten degradar una amplia gama de contaminantes, incluyendo los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH), bifenilos policlorados (PCB), pesticidas, explosivos, polímeros y colorantes sintéticos y además son favorables por la tolerancia a altas concentraciones de estas sustancias (8,17). Estas enzimas, catalizan la oxidación de algunos sustratos, por procesos de transferencia de electrones a su sitio activo o por la generación de radicales libres en el ciclo catalítico enzimático (15). La lacasa (EC 1.10.3.2), es una glicoproteína que contiene cobre y requiere de oxigeno (O2) para oxidar fenoles, polifenoles, aminas aromáticas, así como sustratos orgánicos no fenólicos por medio de la sustracción de electrones, lo cual resulta en la formación de agua (H2O) y radicales activos, como el grupo hidroxilo (OH), los cuales sufren una posterior despolimerización, repolimerización, demetilación, deshalogenación o formación de quinonas. Por otro lado, en cuanto a las peroxidasas (LiP y MnP), la LiP (EC 1.11.1.14) puede oxidar compuestos aromáticos con alto potencial redox, mientras que MnP (EC.1.11.1.13) oxida Mn (II) a Mn (III) el cual degrada compuestos fenólicos posteriormente (18). Se ha reportado que la oxidación del índigo, esta mediada por la enzima lacasa (EC 1.10.3.2), donde por sustracción de dos electrones se oxida a dihidroíndigo y por sustracción de 4 electrones se oxida completamente a isatín, que posteriormente con una hidrólisis se convierte en ácido antranílico, producto final de la oxidación (anexo 3) (19). Del mismo modo, en cuanto a las peroxidasas, estas catalizan la decoloración del índigo formando ácido isatín sulfónico además de un producto estable de oxidación color rojo observado cuando fue usada una MnP de Phanerochaete chrysosporium (20). Además del mecanismo de degradación basado en la producción de enzimas, los hongos de podredumbre blanca hacen uso de un proceso llamado biosorción, el cual se basa en la unión de los solutos a la biomasa, mediante procesos que no implican la energía metabólica o de transporte, por lo tanto, puede ocurrir tanto en biomasa viable como inactiva (8). Este proceso se genera debido a la capacidad de adsorción de la pared celular, compuesta en un 70% por polisacáridos cargados negativamente como la quitina y el quitosano, a los que se pueden unir por intercambio iónico una gran variedad de colorantes, además por la existencia de grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular, que corresponden a partes de moléculas componentes de la pared celular, como lo son grupos carboxilo, amino, hidroxilo, fosfato y sulfhidrilo (21). Actualmente existen numerosos estudios donde reportan a los hongos, principalmente los de podredumbre blanca, como organismos con gran capacidad de degradación, entre los cuales se destacan: Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus sajor-caju, P. ostreatus, Coriolus versicolor y

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Trametes versicolor. Además, se reportan las enzimas producidas por estos y otros microorganismos, que al mismo tiempo participan en los procesos de remoción de colorantes textiles (5,8) (anexo 4). Doralice S y colaboradores en su estudio, compararon cuatro cepas de hongos, Phellinus gilvus, Pleurotus sajor-caju, Pycnoporus sanguineus y Phanerochaete chrysosporium, en cuanto a la degradación del colorante índigo usando medio líquido con este, como única fuente de carbono, encontrando que la decoloración inició a los pocos minutos y la mejor actividad (decoloración) fue evidenciada luego de los cuatro días por Phellinus gilvus con un porcentaje de remoción del 100%, seguido por Pleurotus sajor-caju con un 94%, Pycnoporus sanguineus con un 91% y Phanerochaete chrysosporium 75%. El control estéril no mostró remoción del colorante (10). Por otro lado, en un estudio donde evaluaron la degradación de índigo por medio de la enzima lacasa (EC 1.10.3.2) purificada a partir Trametes hirsuta y Sclerotium rolfsii, reportaron que todas las lacasas oxidaron el índigo a isatín, como intermediario, y posteriormente descompuesto a ácido 2-aminobenzoico, como el producto final de la reacción. Además, encontraron que la evolución en la degradación de índigo fue similar para las lacasas de T. hirsuta (THL1 y THL2), mientras que la reacción se hace más lenta en presencia de la lacasa de S.rolfsii. (22)

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2. OBJETIVOS

2.1 GENERAL Evaluar in vitro la decoloración de índigo mediante el uso del hongo de podredumbre blanca, Pleurotus ostreatus. 2.2 ESPECÍFICOS

Realizar pruebas de decoloración en medio agarizado, evaluando la relación entre el crecimiento de Pleurotus ostreatus y la decoloración bajo dos condiciones nutricionales.

Realizar estudios de adsorción empleando biomasa viable e inactiva de Pleurotus ostreatus.

Seleccionar y mejorar las condiciones de operación y nutricionales que favorecen la remoción del colorante índigo a escala de laboratorio mediante un proceso discontinuo.

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3. METODOLOGÍA

3.1 Reactivación de la cepa 3.1.1 Origen de la cepa La cepa del hongo Pleurotus ostreatus, fue proporcionada por el cepario del laboratorio de Microbiología Ambiental y Suelos de la Pontificia Universidad Javeriana (Bogotá, Colombia). Este se reactivó en agar extracto de salvado de trigo (anexo 5) y se incubó durante 8 días a 30°C (23). 3.1.2 Preservación de la cepa a mediano plazo El hongo de podredumbre blanca, Pleurotus ostreatus, se conservó inoculando un disco de agar, con el microorganismo previamente crecido, en eppendorf con medio salvado de trigo. Se conservó a -18ºC con la finalidad de mantener la viabilidad de la cepa (23). 3.2 Caracterización del colorante y estudios de adsorción a la biomasa fúngica 3.2.1 Preparación del colorante índigo En un balón aforado de 500 ml, se colocaron 50 ml de agua y 0.05 g de dispersante cecanol; se calentó en baño termostatado a 30ºC hasta su completa disolución. Posteriormente, se adicionaron 2.44 g de NaOH al 50% m/v y 3.36 g de hidrosulfito de sodio (agitando constantemente), finalmente se agregaron 4 g de índigo y se aforó con agua destilada a 500 ml (18). Dicha reacción, se mantuvo durante 30 minutos, a la temperatura mencionada previamente. 3.2.2 Barrido de absorción

Con el fin de determinar la longitud de onda a la cual el colorante presentó la mayor absorción, se tuvo en cuenta el protocolo y los resultados obtenidos en estudios previos (24,25). Dicha evaluación, se realizó a una concentración de 20 y 40 ppm de índigo, dando cumplimiento con la ley de Lambert-Beer. 3.2.3 Curva de calibración Teniendo en cuenta la concentración inicial del colorante (8000 ppm), se prepararon diferentes concentraciones (180, 160, 140, 120, 100, 80, 60, 40, 20, 10 ppm) con un volumen final de 200 ml. En estas concentraciones, la medición espectrofotométrica, se realizó a la longitud de onda de mayor absorción del colorante (24), empleando como blanco agua destilada. 3.2.4 Estandarización del porcentaje de humedad y peso seco de biomasa Para dicha determinación, se tomó del banco de preservación de la cepa, 5 viales y se reactivaron en agar extracto de salvado de trigo (23); posteriormente, se incubó a 30º C durante 8 días. Una vez transcurrido ese tiempo, se realizó un cultivo en caldo extracto de salvado de trigo, empleando como inóculo 8 discos de agar (con el microorganismo crecido) por cada 100 ml de

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medio, se incubó en agitación a 120 rpm durante 8 días. Finalizado este periodo, se pesaron 6 g de biomasa (pelletizada) previamente lavada (agua destilada estéril) y filtrada en papel Whatman Nº 1 y se realizó el protocolo descrito por Manzano y colaboradores (25) para la determinación del peso seco por triplicado. Para la determinación de humedad, se tuvo en cuenta el peso de la biomasa húmeda y el peso seco, reemplazando los valores en la siguiente ecuación.

100%PesoHumedo

PesoSecoPesoHumedoHumedad

(1)

3.2.5 Estudios de adsorción La concentración de colorante evaluado fue 160 ppm. Para esto, se realizó una cinética de adsorción de 6 y 12 horas con biomasa libre, viable e inactiva (121ºC, 15 lb, 20 minutos), con intervalos de muestreo de 30 y 60 minutos respectivamente, realizando por triplicado, mediciones espectrofotométricas (667 nm) y de pH. Las condiciones del ensayo fueron: 120 rpm, 30ºC, pH inicial de 8, volumen efectivo de trabajo (VET) de 20 ml y 0.52 g de biomasa húmeda. Los resultados de los estudios de adsorción, se transformaron para obtener el modelo descrito por Langmuir (ecuación 2). Donde Cs, es la cantidad de soluto adsorbido por gramo de adsorbente; K1, es la constante de equilibrio de Langmuir y Cs (max) es la máxima capacidad de adsorción del adsorbente (12,26). A partir de la ecuación 2, se obtuvo la ecuación 3, por inversión en los términos (26) y finalmente, multiplicando por C (concentración en condiciones de equilibrio) en la ecuación 3, se obtuvo la ecuación 4, la cual, es la forma lineal de la ecuación 2. A partir de la ecuación 4, se dedujo, que la variable dependiente fue C/Cs (eje Y) y C, la variable independiente, (eje X). Una vez graficado, se determinó la ecuación de la línea recta, despejando a partir del intercepto K1 y a partir de la pendiente Cs (max).

)1( 1

(max)1

CK

CCKC

s

s (2)

(max)(max)1

111

sss CC

CKC (3)

(max)(max)1

1

sss C

C

CKC

C (4)

3.3 Pruebas de decoloración en medio agarizado Tomando como medio de preparación base el agar Radha (23,27), se realizaron estudios de decoloración durante 11 días a 30ºC, bajo dos condiciones nutricionales: concentración de índigo (160 ó 320 ppm) y suplemento o no de glucosa. Durante esta cinética, se evaluó diariamente el crecimiento (mm) del hongo Pleurotus ostreatus y la decoloración realizada por este (tomando como 100%, la totalidad de la caja petri, sin el disco de agar empleado como inóculo).

6

3.4 Diseño experimental multifactorial Plackett Burman (28) Con el fin de seleccionar las condiciones de operación y factores nutricionales que favorecen la decoloración, se realizó un diseño de Plackett Burman, evaluando 10 factores a dos niveles (Tabla 1). Las variables dependientes fueron el porcentaje de decoloración y remoción de DQO. Adicionalmente, se cuantificaron otras variables como la actividad Lacasa, MnP, LiP y pH. Este diseño experimental, se realizó con un volumen efectivo de trabajo de 50 ml con respecto a un erlenmeyer de 100mL y por triplicado.

Tabla 1. Matriz Diseño experimental Plackett Burman.

Tto Concentración (ppm)

pH T % ino.

Cu µmol/L

Agitación rpm

Tiempo (h)

Glu (g/L)

N (g/L)

Mn µmol/L

Ciego

1 + - + - - - + + + - +

2 + + - + - - - + + + -

3 - + + - + - - - + + +

4 + - + + - + - - - + +

5 + + - + + - + - - - +

6 + + + - + + - + - - -

7 - + + + - + + - + - -

8 - - + + + - + + - + -

9 - - - + + + - + + - +

10 + - - - + + + - + + -

11 - + - - - + + + - + +

12 - - - - - - - - - - -

3.4.1 Cuantificación enzimática: Las enzimas ligninolíticas producidas por el hongo de

podredumbre blanca, se cuantificaron, teniendo en cuenta lo descrito por otros investigadores (29, 30, 31,32) (anexo 6).

3.4.2 Porcentaje de decoloración: Se realizaron mediciones espectrofotométricas iniciales y finales, evaluando de esta manera, la decoloración debida al microorganismo.

3.4.3 Determinación de DQO: La determinación se realizó teniendo en cuenta el protocolo de Standard Methods (33) (anexo 7).

3.4.4 Una vez finalizado el diseño experimental, se realizó un análisis estadístico (ANOVA), con el fin de determinar el/los factores con efecto significativo sobre las variables de respuesta (decoloración y DQO) y un análisis de comparación de medias, para determinar las diferencias mínimas significativas entre los tratamientos evaluados.

3.5 Diseño experimental de paso ascendente para los factores significativos Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el diseño experimental Plackett Burman, se seleccionaron el ó los factores con efecto significativo sobre las variables de respuesta, mejorándolas mediante un diseño de paso ascendente. Realizando además, una modificación (descensos) en las concentraciones de glucosa (Tabla 2).

7

Tomando el tratamiento seleccionado como punto central, se realizaron ascensos (delta de 0.5) y descensos (delta de 0.25) a partir de este, dejando estáticas las variables sin efecto significativo sobre la decoloración y DQO. Finalmente, se realizó un análisis de comparación de medias entre los ascensos formulados.

Tabla 2. Diseño experimental de paso ascendente para el tratamiento 11.

Tto ppm pH T (ºC)

% ino Cu SO4 (µMol/L)

rpm Tiempo (h)

Glu (g/L)

N (g/L) MnSO4

(µMol/L)

11 (punto

medio) 160 8.0 30 1 0 120 12 10 0 160

Δ1 160 8.0 30 1 0 180 12 7.5 0 160

Δ2 160 8.0 30 1 0 240 12 5 0 160

Δ3 160 8.0 30 1 0 300 12 2.5 0 160

3.6 Cinética de decoloración de índigo a escala de laboratorio Una vez optimizados los factores (paso ascendente/descendente), se realizó una cinética de decoloración de índigo a escala de laboratorio. Esta cinética, tuvo 3 tratamientos: Tratamiento biológico (biomasa viable), tratamiento abiótico o control de adsorción (biomasa inactiva) y un control absoluto (colorante). Se desarrolló durante 3 días en erlenmeyer de 100 ml con un VET de 50 ml y biomasa libre. Durante el cultivo, se realizaron muestreos (retirando en cada uno 7 erlenmeyer : 3 correspondientes al tratamiento biológico, 3 del tratamiento abiótico y 1 del control absoluto) a las 3, 6, 12 horas y finalmente muestreo diario hasta el tercer día, evaluando las siguientes variables: Porcentaje de decoloración, remoción de DQO, pH, enzimas (lacasa, manganeso y lignino peroxidasa), barrido UV/VIS y biomasa en peso seco.

8

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

4.1 Reactivación de la cepa Con objeto de poder desarrollar la metodología propuesta, se realizó la reactivación de la cepa Pleurotus ostreatus en agar extracto de salvado de trigo. En relación a la caracterización morfológica, macroscópicamente presentó micelio algodonoso, blanco con formación de anillos concéntricos (fig.1A) y microscópicamente se evidenciaron hifas hialinas, septadas con presencia de esporas (fig.1C).

Fig. 1. Reactivación en agar extracto salvado de trigo. Crecimiento en placa: (A) Pleurotus ostreatus (anverso), (B) Pleurotus ostreatus (reverso), (C) microscopía óptica 100 X. A 30°C

durante 8 días. 4.2 Caracterización del colorante y estudios de adsorción a la biomasa fúngica 4.2.1 Elaboracion del colorante

Teniendo en cuenta, las condiciones de solubilidad del colorante (mencionadas anteriormente), su preparación se realizó, teniendo en cuenta lo descrito en estudios previos (18), lo cual se asemeja con la elaboración en la industria textil para la tinción de telas o hilos de algodón (34). En dicha prepación, se hizo necesaria la adición de un agente reductor (hidrosulfito de sodio) y álcali (NaOH), los cuales favorecieron la conversión de la forma oxidada del índigo a su forma leuco, la cual es incolora y soluble en agua en las condiciones de alcalinidad mencionadas (35) (anexo 8).

4.2.2 Barrido de Absorción UV/VIS.

Se realizó con el fin de establecer, la longitud de onda a la cual el índigo presentó su mayor absorción en el espectro visible. Según reportes, el colorante, presentó dicha absorción a una longitud de onda de 610 nm (15,36). Aunque en otro estudio, la determinación se realizó en longitudes de onda diferentes (580 y 680 nm) (7).

Realizada la exploración en el rango UV/ VIS, se encontró, que la longitud de onda en la region visible con mayor absorción fue a 667 nm (anexo 9).

9

4.2.3 Curva de calibración. Para determinaciones posteriores de la concentración del colorante (ppm) se realizó una curva de calibración, obteniendo la ecuación de la recta con un coeficiente de correlación lineal de 0.99 (anexo 10).

0642.00044.0 xy (5)

4.2.4 Porcentaje de humedad y peso seco de la biomasa

Los microorganismos, presentan requerimientos nutricionales y ambientales para un óptimo desarrollo. En este último requerimiento, los hongos, en este caso Pleurotus ostreatus, necesita de una humedad de aproximadamente el 88% (37), lo cual se ve directamente relacionado con su composición. Lo anterior, se asemeja, con lo reportado en la presente investigación, donde se obtuvo, una humedad del 91%.

Esta determinación, se realizó con el fin de garantizar, que en etapas posteriores de la investigación, se adicionara siempre la misma cantidad expresada como %p/p (peso húmedo y seco) de biomasa, ya que teniendo en cuenta el mecanismo adsortivo empleado por el microorganismo, la adición de diferentes cantidades de este, podría generar variación entre réplicas.

4.2.5 Estudios de adsorción. Para evaluar uno de los mecanismos de remoción del indigo, se realizaron estudios de adsorción, tanto para biomasa viable como inactiva. Durante la cinética, se reportó una adsorción rápida del colorante, con valores de 55.2mg del colorante/g de biomasa viable y 80mg de colorante/g de biomasa inactiva al cabo de las 6 y 12h respectivamente, debido a que se encontraban muchos sitios disponibles para su adsorción, como por ejemplo el radical indoxilo, parte de la estructura química del colorante, el cual posee en α un grupo carbonilo aceptor de electrones y un grupo amino donador de electrones (37,38). Esta propiedad adsortiva, es debida a la capacidad de adsorción de la pared celular, compuesta en un 70% por polisacáridos cargados negativamente como la quitina y el quitosano, a los que se pueden unir por intercambio iónico una gran variedad de colorantes, además por la existencia de grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular, que corresponden a partes de moléculas componentes de la pared, como lo son grupos carboxilo, amino, hidroxilo, fosfato y sulfhidrilo (39). No obstante, el uso de biomasa muerta o inactiva, supone que el mecanismo de biosorción se atribuye a mecanismos adsortivos independientes metabólicamente, así la interacción adsorbato-adsorbente será mediada por fuerzas tanto físicas como químicas (40). Por otro lado, el estudio inició bajo un pH de 8, lo cual favoreció la adsorción del colorante debido posiblemente a la carga superficial del biosorbente, reportada como negativa, a causa de grupos funcionales como la quitina y el quitosano (21). Con un aumento en el pH, la electronegatividad neta del biosorbente aumenta debido a la deprotonación de diferentes grupos funcionales, por lo tanto, hay un aumento de la fuerza electrostática de atracción entre el biosorbente (cargado negativamente) y los iones del colorante (cargados positivamente) (21). Efecto similar fue reportado por Maurya N y colaboradores donde evaluaron la biosorción de colorantes, Azul de

10

metileno y rodamina, usando biomasa inactiva de Fomes fomentarius y Phellinus igniarius encontrando que al presentarse un aumento en el pH de 3 a 11 se evidenció un aumento en el consumo del 18 al 75% para el azul de metileno y del 16 al 79% para la rodamina. Por otro lado, al implementar el modelo de Langmuir se obtuvieron las constantes de saturación (K1), las cuales se refieren a la energía de adsorción (26) y la máxima capacidad de adsorción del adsorbente (Cs máx.) (Tabla 3). En un estudio realizado por Aksu Z y Karabayır G en el 2008 donde evaluaron 3 hongos filamentosos, (Rhizopus arrhizus, Trametes versicolor, Aspergillus niger) y su habilidad para adsorber el gryfalan, un colorante compuesto por un complejo negro RL-metal, en función de pH, temperatura y concentración del tinte, reportaron un máximo de adsorción para Rhizopus arrhizus de 666.7 mg/g, Trametes versicolor 434.7 mg/g y para Aspergillus niger de 416.6 mg/g con unas constantes de saturación de 1.55, 0.62 y 0.46 (l/mg) respectivamente, concluyendo que R. arrhizus fue el biosorbente más efectivo para la remoción de este colorante, esto confirma lo reportado en el presente estudio donde a mayor capacidad de adsorción de la biomasa, esta requiere una mayor energía para adherir el colorante a su pared celular, como en el caso de la biomasa inactiva, la cual se satura con 80mg/g y un K1 de 0.44 (1/mg), en comparación con la biomasa viable con 55,2 mg/g y un K1 de 0.33 (1/mg). Al mismo tiempo, entre más alto sea el valor de Cs máx, mayor será la remoción del colorante, por ende se reduce la carga de este en los efluentes y se disminuye la contaminación en los cuerpos de agua. A pesar de que la prueba refleja una mayor cantidad de colorante removido por la biomasa inactiva, debido posiblemente a un aumento de la superficie de contacto causado por la ruptura de las células durante la inactivación (7), es de mayor utilidad el uso de biomasa viable debido a que esta realiza una mineralización del colorante lo que permite una mejora en los procesos de biorremediación de aguas residuales. Tabla 3. Concentraciones máximas adsorbidas de colorante/g soporte y constantes de Langmuir

Biomasa Cs max (mg/g) K1 (1/mg)

Viable 55.2 0.33

Inactiva 80 0.44

11

C

0 10 20 30 40 50

C/C

s

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

C

0 10 20 30 40 50 60 70

C/C

s

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Fig.2. Estudio de adsorción biomasa viable. Fig. 3. Estudio de adsorción biomasa inactiva a 160 ppm de índigo durante 6h. a 160ppm de índigo durante 12h. 4.3 Pruebas de decoloración en medio agarizado Los hongos de podredumbre blanca, requieren de ciertos metales para su metabolismo (cobre, hierro, manganeso, molibdeno, zinc y níquel), pero estos, pueden llegar a ser tóxicos cuando están presentes en concentraciones superiores a las requeridas (41,42). Debido a este requerimiento y a la presencia de estos y otros metales en efluentes de industrias textiles (Resolución 3957), se empleó como medio base para las pruebas de decoloración bajo dos condiciones nutricionales (índigo y glucosa), el agar Radha (43). La cinética, se llevó a cabo durante 11 días a 30ºC, en los cuales, se realizaron mediciones diarias del crecimiento micelial (mm) y decoloración (%). Obteniendo un crecimiento total (> 80 mm) en aquellos medios con suplemento de glucosa (2 g/L) al cabo de 8 días y en aquellos medios sin suplemento de la fuente de carbono, al cabo de 10 días (Fig. 4). Teniendo en cuenta los requerimientos nutricionales, se observó, que en aquellos medios sin suplemento (glucosa), el micelio del microorganismo fue delgado y poco abundante, mientras que los medios con dicho suplemento, presentaron micelio abundante y aéreo, lo cual confirma, la necesidad de un co-sustrato en el proceso, ya que los microorganismos son incapaces de metabolizar un sustrato complejo (índigo) como única fuente de carbono y energía, pero pueden transformarlo si se les aporta un sustrato de crecimiento alternativo (co-metabolismo) (18,44), al igual que lo reporta Khelifi E y colaboradores, donde evaluaron la decoloración de índigo (150 ppm) y otro colorante por Aspergillus alaiaceus con diferentes fuentes de carbono y nitrógeno durante 9 días. Con respecto a la fuente de carbono, los autores reportan una relación directamente proporcional entre esta, el crecimiento micelial y la decoloración, pero sólo hasta una concentración de 12,5 mM (2.25 g/L) del co-sustrato, lo cual, comprobó lo obtenido, con la concentración de índigo a 160 ppm, donde se evidenció, una decoloración mayor al 90% (Fig. 5). Según reportes, esta decoloración, es mediada por la producción de la enzima Lacasa, la cual en la oxidación del colorante hasta un producto estable como el acido antranílico (anexo 3) (22), favoreció la ruptura del grupo cromóforo responsable del color azul (anexo 11) (34), igualmente, la enzima MnP, con la degradación de compuestos monoaromáticos (ácido antranílico), favoreció la destrucción del grupo cromóforo y la estructura del colorante (16).

Csmax= 55.2 mg/g

K1= 0.33

R2 = 0.9903

Csmax= 80 mg/g

K1= 0.44

R2 = 0.9927

12

Teniendo en cuenta, que altas dosis de contaminante, pueden generar un efecto tóxico sobre el metabolismo de los organismos vivos, la decoloración de índigo a una concentración de 320 ppm, mostró este efecto, donde la decoloración, se manifestó al cabo de 5 días de evaluación y al finalizar la cinética (11 días), esta fue mayor al 70 % (Fig. 5). Tabla 4. Fotografías de la decoloración in vitro en Radha bajo dos condiciones nutricionales con el hongo Pleurotus ostreatus. 30ºC, 11 días

MEDIO Radha con Glucosa y 320 ppm de índigo

Radha sin Glucosa y 320 ppm de índigo

Radha con Glucosa y 160 ppm de índigo

Radha sin Glucosa y 160 ppm de índigo

INICIAL

FINAL

Fig. 4. Crecimiento micelial libre de P. ostreatus Fig. 5. Decoloración (%) de índigo mediado por

bajo dos condiciones nutricionales P. ostreatus bajo dos condiciones nutricionales.

Tiempo (días)

0 2 4 6 8 10 12

Cre

cim

ien

to (

mm

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Radha + Glu 320ppm

Radha - Glu 320ppm

Radha + Glu 160ppm

Radha - Glu 160ppm

Tiempo (días)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

% D

ecolo

ració

n

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Radha + Glu 320ppm

Radha - Glu 320ppm

Radha + Glu 160ppm

Radha - Glu 160ppm

13

4.4 Plackett Burman A partir de la preparación de un agua residual sintética, con composición y concentración conocida, se realizó el diseño experimental multifactorial Plackett Burman a dos niveles, en donde se evaluó el efecto de las condiciones de operación y factores nutricionales que favorecieron la remoción del colorante índigo. De acuerdo con los resultados del análisis de varianza con un nivel de confianza del 95%, el factor que afectó significativamente la decoloración y la remoción de DQO fue la velocidad de agitación o factor F (% DEC: p=0.0382 y %DQO: p=0.0494) en su nivel alto a 120rpm. Por lo tanto las ecuaciones de primer orden que describieron los modelos fueron:

FDEC 42.086 (6) y FDQO 31.256.42 (7)

Al encontrar elevados porcentajes de remoción para uno u otro parámetro en algunos tratamientos, se realizó una comparación de medias para establecer diferencias mínimas significativas entre los 12 tratamientos.

Con respecto a la decoloración, se presentaron diferencias altamente significativas entre tratamientos (p<0.0001), siendo los mejores el 8, 10 y 11 con porcentajes de 86, 96 y 83% respectivamente.

Adicionalmente, con respecto al porcentaje de remoción de DQO, también se observaron diferencias altamentes significativas (p<0.0001) entre tratamientos. No obstante los tratamientos 11 y 12 entre si no presentaron diferencias (p>0.0001) con valores de 78 y 89 %, determinando que cualquiera podría ser utilizado.

Con el objeto de seleccionar el mejor tratamiento que permita cumplir, tanto remoción de color como de DQO, la normativa que rige los vertimientos de las industrias textiles, se analizaron los valores obtenidos para cada parámetro. Así, en los tratamientos 8,10,11 y 12 se encontraron valores de decoloración del 86, 96, 83 y 67% y de DQO de 23, 39, 78 y 89% respectivamente (fig. 6). Teniendo en cuenta esto, se observó que si bien unos tratramientos presentan altos porcentajes de remoción para un parámetro, para otro no, por esta razón, se determinó que el tratamiento a elegir era el 11 el cual presentó valores decoloración del 83% con una remoción de DQO de 78%. Con respecto a las actividades enzimáticas para este tratamiento fueron de 21.1 U/L Lacasa y 0.13 U/L para LiP (fig. 6). Determinando que la remoción del colorante indigo se favoreció cuando se utilizó una concentración inicial de 160 ppm de índigo, pH 8.0, 30º C, sin adición de cobre, 120 rpm, 12 h, 10g/L de glucosa, sin suplemento de nitrógeno y 160 µMol/L de MnSO4. Tomando como referencia estos factores, en cuanto a la concentración inicial del colorante (160ppm) se evidenció, al igual que en la prueba de decoloración en sólido, que no presentó toxicidad sobre el crecimiento celular y su metabolismo (27) lo que facilitó el proceso de degradación por P. ostreatus. Por otro lado, el pH (8.0), como se mencionó previamente, presentó un efecto benéfico para la remoción de color ya que se observó un porcentaje alto de remoción de color (83%), como lo demuestra Sarnthima y colaboradores donde encontraron que el pH óptimo para la decoloración del índigo carmín es de 9 (45). Ahora bien, a medida que la decoloración aumenta el pH disminuye, efecto atribuido posiblemente al metabolismo del co-

14

sustrato (glucosa), con la producción de ácidos que generen cambios en el pH de la solución mejorando así la degradación del índigo. Según lo reportado por Chávez N y colaboradores, la disminución en el pH es debida también a que la mayoría de las enzimas presentan sus pH óptimos en rangos de acidez (46) Ahora bien, la adición de glucosa como co-sustrato, facilita la remoción ya que los microorganismos son incapaces de metabolizar un sustrato complejo como única fuente de carbono y energía y con este, pueden transformarlo ya que actúa como un sustrato de crecimiento alternativo (co-metabolismo) (18,44). La temperatura (30°C), igualmente tuvo efectos positivos frente a la remoción de color, debido a que más allá de la temperatura óptima, las actividades de degradación de los microorganismos disminuyen a causa de un bajo crecimiento, una baja tasa de reproducción y a la inactivación de las enzimas responsables de la degradación. Por lo tanto, el rendimiento de biodegradación de los microorganismos será mejor a la temperatura óptima necesaria para su crecimiento y reproducción, como es el caso de P. ostreatus cuya temperatura óptima se encuentra entre 20 y 30°C (27). Según Chávez y colaboradores, la temperatura óptima para la biodegradación del colorante índigo por P. ostreatus fue a 32°C. Por ultimo, la agitación (120rpm) presentó efectos benéficos en cuanto a la decoloración debido a que se mejora la tranferencia de oxígeno y distribución de nutrientes en comparación con cultivos estáticos (27). Sobre la actividad enzimática, se genera una disminución en los valores de estas cuando el cultivo se encuentra en agitación, en contraste con el cultivo estático como se puede observar al comparar la actividad de lacasa entre el tratamiento 11(agitado) y 5 (estático) con valores de 21.1 y 98.93 U/L respectivamente. De manera similar, Novotny y colaboradores al estudiar el efecto del cultivo líquido en la síntesis de enzimas ligninolíticas encontraron que en cultivo estático la máxima actividad enzimática de MnP, Lac y LiP fue de 76, 2 y 1.1 U/L respectivamente, mientras que en cultivo agitado, la máxima actividad fue de 0.2, 1 y 0 U/L respectivamente (47).

15

Tratamientos

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

% D

ec

y U

/L L

ac

asa

0

20

40

60

80

100

120

U/L

Mn

P y

LiP

0

2

4

6

% R

em

oc

ión

DQ

O

0

20

40

60

80

100

Decoloración (%)

U/L Lacasa

U/L Mn P

U/L LiP

Remoción (%) DQO

Fig.6. Diseño experimental Plackett Burman

4.5 Diseño experimental de paso ascendente Este diseño experimental, tenía como objetivo, evaluar los factores con efecto significativo sobre las variables de respuesta (Decoloración y Remoción de DQO) (48), para esto, se evaluó la máxima velocidad de agitación y la mínima concentración de glucosa que mostrara la máxima remoción de color y DQO con respecto al punto central.

Tomando como referencia el diseño experimental Plackett Burman, se seleccionó el tratamiento 11, el cual se operó bajo las siguientes condiciones: Concentración inicial de índigo a 160 ppm, pH 8.0, 30º C, 1% de inóculo, 120 rpm, 10g/L de glucosa, 160 µMol/L de MnSO4 y sin suplemento de cobre y nitrógeno. A partir de la formulación mencionada, se realizaron 3 ascensos con delta de 0.5 para el factor significativo (agitación) y 3 descensos con delta de 0.25 para la glucosa. Esta última modificación, se realizó por decisión no estadística, con el fin de evaluar si a concentraciones menores, se mantenía o mejoraba el proceso de remoción (color y DQO), tratando de limitar o anular la suplementación del agua residual sintética, que a futuro podría ser una restricción del tratamiento. Con respecto a la decoloración, con una confianza del 95%, se evidenciaron diferencias altamente significativas (p < 0.0001) entre los tratamientos formulados y a su vez, no se encontraron diferencias significativas (p >0.0001) entre el punto central y el primer

16

ascenso/descenso (77.96 y 76.88%) y el segundo y tercer ascenso/descenso (56.63 y 57.69 %) (fig. 7). En cuanto a la remoción de DQO, con una confianza del 95%, se evidenciaron diferencias altamente significativas (p < 0.0001) entre los tratamientos formulados y a su vez, no se encontraron diferencias significativas (p > 0.0001) entre el punto central y el tercer ascenso/descenso (51.23 y 48.83 %) (fig. 7). Teniendo en cuenta lo anterior, un ascenso en la velocidad de agitación y una disminución en la concentración de glucosa, no favorece la remoción del índigo, debido al estrés mecánico, el cual provoca daño celular en la larga y delgada estructura de las hifas (49), además de aumentos en los costos de operación y la necesidad de un sustrato de crecimiento alternativo (co-metabolismo) (50), debido a la incapacidad de los microorganismos de metabolizar un sustrato complejo (índigo) como única fuente de carbono y energía (18,44). Finalmente, la máxima respuesta bajo las condiciones evaluadas, se obtuvo en el punto central, por lo cual, se determinó que las curvas de remoción a escala de laboratorio, se debían realizar con una concentración inicial de índigo a 160 ppm, pH 8.0, 30º C, 1% de inóculo, 120 rpm, 10g/L de glucosa, 160 µMol/L de MnSO4 y sin suplemento de cobre y nitrógeno.

.

Ascensos

11 (pto medio) 11 (180 rpm) 11 (240 rpm) 11 (300 rpm)

De

co

lora

ció

n y

Rem

oc

ión

DQ

O (

%)

0

20

40

60

80

100

U/L

Mn

P y

LiP

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

U/L

La

cas

a

0

5

10

15

20

Decoloración (%)

Remocion (%) DQO

U/L MnP

U/L LiP

U/L Lacasa

Fig. 7 Diseño de optimización de paso ascendente.

(Índigo 160ppm, pH 8, 30°C durante 12h)

17

4.6 Cinética de decoloración de índigo a escala de laboratorio 4.6.1 DQO y decoloración

Como parámetro de evaluación en la remoción de compuestos persistentes en efluentes industriales, se determinó la demanda química de oxígeno, lo cual mostró un valor estimado del contenido de materia orgánica presente en la muestra de análisis, la cual inició el tratamiento con 71380 mg O2/L y según la normatividad vigente (anexo 2), se encontró en más de un 100 % por encima de los límites de vertimiento permitidos (1500 mg O2/L), siendo un gran contaminante de los cuerpos de agua a los cuales puede ser depositado. Teniendo en cuenta el grado de contaminación, se hace indispensable el tratamiento fúngico, ya que debido a la transformación del colorante (22) y al consumo de co-sustratos presentes en el agua de tratamiento, se favorece la reducción del color y del contenido de materia orgánica. Según se ha reportado en la literatura, la decoloración de un efluente está estrechamente relacionada con la remoción de DQO (50), mediante degradación biológica (10), de lo que puede inferirse que gran parte de la carga orgánica degradada por el hongo es aportada por compuestos coloreados (50). En cuanto a decoloración y DQO, se evidenció un aumento progresivo a través del tiempo, encontrando una remoción de 87.92 y 61.92% para biomasa viable y 23 y 15 % para biomasa inactiva al cabo de 48 horas de evaluación (fig. 8), observando diferencias altamente significativas (p < 0.0001) entre los tratamientos evaluados, que demuestran que la biomasa viable fue más eficiente que la inactiva. Estudios con este microorganismo, revelan, que la mayor remoción de color y DQO, se da durante los primeros días de evaluación, lo cual coincide con la mayor actividad de la enzima extracelular lacasa (50), así como ocurre en el tratamiento evaluado en esta investigación, obteniendo mayor decoloración, remoción de DQO y actividad de la enzima Lacasa en el transcurso de los dos primeros días de seguimiento, presentando una correlación positiva significativa entre estos 3 factores.

18

Tiempo (horas)

0 20 40 60 80

Deco

lora

ció

n (

%)

trata

mie

nto

bio

lóg

ico

0

20

40

60

80

100

Lacasa U

/L

0

1

2

3

4

5

6

Bio

masa e

n p

eso

seco

(m

g)

trata

mie

nto

bio

lóg

ico

0

5

10

15

20

25

30

Deco

lora

ció

n (

%)

co

ntr

ol

de a

dso

rció

n

0

20

40

60

80

100

pH

0

2

4

6

8

Rem

oció

n D

QO

(%

)

0

20

40

60

80

100

Decoloración (%) tratamiento biológico

Lacasa U/L

Biomasa en peso seco (mg). Tratamiento biológic

Decoloración (%) control de adsorción

pH tratamiento biológico

pH control de adsorción

Remoción DQO (%)

Fig. 8. Perfil de decoloración, pH y biomasa. Tratamiento biológico y control de adsorción. (Índigo a 160ppm, pH de 8, a 30°C, 120rpm, durante 3 días)

4.6.2 Biomasa y pH. Teniendo en cuenta, los mecanismos de remoción empleados por los hongos de podredumbre blanca y la alta capacidad del micelio fúngico de adsorber colorante (10), se favoreció la decoloración del tratamiento. Pero a su vez, se comprobó dicha adsorción, por el color presentado en la biomasa, una vez se realizaban los muestreos (anexo 12). La determinación del peso seco, se fundamenta en la evaluación del posible crecimiento fúngico por el metabolismo de los sustratos (simples o complejos), presentes en el agua residual sintética. Lo cual se comprueba en la presente investigación, con el aumento del peso seco en la biomasa del tratamiento biológico a partir de las 12 horas de tratamiento (12 mg), mostrando un máximo registro (17 mg) al cabo de 48 horas (Fig. 8), lo cual probablemente se debió al consumo de glucosa disponible en el medio. Por otra parte, tomando como referencia, la condición de pH inicial (alcalino: 8) y la generación de productos del metabolismo fúngico, como el ácido oxálico y otros agentes quelantes (51), por vía glicolítica y glioxalato (52) se evidenció un descenso en este parámetro físico-químico hasta 3,51 (Fig. 8).

19

4.6.3 Cuantificación de enzimas.

Durante la cinética, se realizaron mediciones de las enzimas lacasa, manganeso peroxidasa (MnP) y lignina peroxidasa (LiP) en cada tiempo de muestreo, obteniendo valores máximos de 4.21 U/L, 0.05 U/L y 0.02 U/L respectivamente (Fig. 9). La lacasa, luego de alcanzar su máximo valor (evidenciado a las 6h), empezó a decrecer, lo cual se puede atribuir a la acumulación de subproductos que la inhiben, como el ácido pícrico, producidos durante el metabolismo del hongo. Existe además, cierta correlación entre la producción de esta enzima por Pleurotus spp. y la decoloración de residuos con tintes, además de la existencia de otros sistemas enzimáticos como la citocromo P-450 o peroxidasas que contribuyen a la reducción del color, empleando como organismos para el tratamiento este y otros hongos de podredumbre blanca (53). Por otro lado, se encontró que en las primeras horas de la cinética al presentarse una expresión ascendente de la lacasa, la decoloración del índigo también presentaba un aumento significativo, es así como en la hora de mayor expresión de la enzima se alcanzo un 51.21% de decoloración (Fig. 8 y 9).

Tiempo (horas)

0 20 40 60 80

La

ca

sa

U/L

0

2

4

6

8

Mn

P U

/L

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

LiP

U/L

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

pH

0

2

4

6

8

Lacasa U/L

MnP U/L

LiP U/L

pH

Fig. 9 Perfiles de la producción de enzimas (Lac, MnP y LiP) y pH a través del tiempo. (Índigo a 160ppm, pH de 8, a 30°C y120rpm, durante 3 días)

En el posible mecanismo de transformación del índigo por parte de la enzima lacasa, se generan ciertos intermediaros, primero, por sustracción de 2 electrones se oxida a dihidroíndigo y por

20

sustracción de 4 electrones se oxida completamente a el ácido isatín sulfónico (ISA) ó isatín, que posteriormente con una hidrólisis se convierte en ácido antranílico, el cual es el producto estable al final de la oxidación (19). Así se deduce que la función de la lacasa puede consistir en aumentar la susceptibilidad del medio de contraste hacia el ataque hidrolítico por el agua (54). Ahora bien, compuestos más simples pueden ser producidos por la degradación del índigo, estos son el ácido pícrico y la anilina.

Así mismo, en cuanto a las peroxidasas, estas catalizan la decoloración del índigo, se forma el ISA y a diferencia del proceso anteriormente descrito para la Lac, se ha evidenciado la formación de un producto estable rojo de oxidación cuando interactúa la enzima MnP, producto que no se evidencia cuando la LiP actúa como catalizador (55). Al realizar el barrido UV/VIS (200-800nm) para la confirmación del proceso de degradación del índigo, se encontró que a través del tiempo, el pico característico de este colorante (entre 600 y 700nm) se vió disminuido y simultáneamente aparecieron varios picos en el rango ultravioleta sugiriendo que hubo transformación de este en nuevos productos. Teniendo en cuenta que uno de los subproductos es el ISA, y que este tiene su longitud de mayor adsorción a 235nm (55) se puede atribuir a los picos formados a partir de las 24h en los ensayos con biomasa viable e inactiva (Fig. 10). Por otro lado, el ácido antranílico, absorbe a una longitud de onda aproximada de 240nm al igual que el ácido pícrico.

Fig. 10. Barrido UV/VIS del colorante inicial, y de la cinética a las 24h para biomasa viable e

inactiva.

200 300 400 500 600 700 8000,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

200 220 240 260 2800,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Ab

so

rba

nc

ia

Longuitud de onda (nm)

Inicial

24h vivo

24h muerto

206nm=1.62

212nm=2,08

215nm=1.5

Ab

so

rba

nc

ia

Longuitud de onda (nm)

215nm=1.2

Longitud de onda

Longitud de onda

21

5. CONCLUSIONES - En la prueba de decoloración en medio agarizado, P. ostreatus mostró crecimiento total bajo

las dos condiciones nutricionales, presentando una decoloración mayor al 90% y al 70% a concentraciones del colorante de 160 y 320 ppm respectivamente.

- Durante los estudios de adsorción, P. ostreatus fue capaz de retener 55.2 mg de colorante/g

de biomasa viable y 80 mg de colorante/g de biomasa inactiva, mostrando mayor eficiencia en la remoción de índigo con el uso de biomasa inactiva al presentarse un aumento en la superficie de contacto debida a la ruptura celular.

- P. ostreatus bajo condiciones de operación de 160ppm de índigo, pH 8, 30°C, 120rpm

durante 12h presentó las mejores respuestas frente a las variables evaluadas, remoción de color y de DQO, con valores de 83 y 78% respectivamente, además de una actividad lacasa de 21.1U/L y LiP de 0.13U/L, lo cual favorece el cumplimiento de la normatividad vigente y disminuye el impacto ambiental en los cuerpos de agua donde puede ser vertido.

- En la cinética a escala erlenmeyer se obtuvo un porcentaje de decoloración del 87.92%

(hongo viable) y 22.72% (hongo inactivo) y un porcentaje de remoción de DQO del 61.92 % (hongo viable) y 15% (hongo inactivo) a las 48 horas de evaluación, además de una actividad lacasa de 4,21U/L a las 6 horas, obteniendo mayor beneficio con la biomasa viable ya que el agua residual sintética se decolora y remueve DQO por la transformación del colorante y el uso del co-sustrato para dicho fin.

22

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26

7. ANEXOS

Anexo 1. Formación del colorante índigo

Fig. 11. Formación del colorante índigo

Fieser Louis. Química orgánica fundamental. Editorial Reverté S.A. 1964, 373 p. Anexo 2. Normatividad vigente.

Resolución 3957 Por la cual se establece la norma técnica, para el control y manejo de los vertimientos realizados a la red de alcantarillado público en el Distrito Capital

Tabla 5. (A) Valores de referencia para los vertimientos realizados a la red de alcantarillado.

Parámetro Unidades Valor

Aluminio total mg/l 10

Arsénico total mg/l 0.1

Bario total mg/l 5

Boro total mg/l 5

Cadmio total mg/l 0.02

Cianuro mg/l 1

Cinc total mg/l 2

Cobre total mg/l 0.25

Compuestos fenólicos

mg/l 0.2

Cromo hexavalente mg/l 0.5

Cromo total mg/l 1

Hidrocarburos totales mg/l 20

Hierro total mg/l 10

Litio total mg/l 10

Manganeso total mg/l 1

27

Mercurio total mg/l 0.02

Molibdeno total mg/l 10

Níquel total mg/l 0.5

Plata total mg/l 0.5

Plomo total mg/l 0.1

Selenio total mg/l 0.1

Sulfuros totales mg/l 5

Los valores de referencia para las sustancias de interés sanitario no citadas en la presente tabla serán tomados de conformidad con los parámetros y valores establecidos en el decreto 1594 de 1984 o el que lo indique o sustituya

Tabla 6. (B) Valores de referencia para los vertimientos realizados a la red de alcantarillado.

Parámetro Unidades Valor

Color Unidades Pt-co 50 unidades en dilución 1/20

DBO5 mg/l 800

DQO mg/l 1500

Grasas y aceites mg/l 100

pH Unidades 5.0-9.0

Sólidos sedimentables ml/l 2

Sólidos suspendidos totales

mg/l 600

Temperatura ºC 30

Tensoactivos (SAAM) mg/l 10

28

Anexo 3. Degradación del colorante índigo mediado por la enzima lacasa

Fig. 12. Degradación del índigo catalizado por la enzima Lacasa Tomado de Campos et al 2001.

Anexo 4. Enzimas y cepas fúngicas que las producen

Tabla 7. Enzimas producidas por diferentes cepas de Hongos y sus actividades

Hongo Colorante Enzima Actividad (colorante)

Irpex lacteus Remazol brillante Azul R (150 mg/l)

Lacasa MnP LiP

1 U/l 0.2 U/l

No detectado

T. versicolor Amaranto (20 μM), remazol

Azul brillante R (19.2 μM) (6 mg/l; 5.76 mg/l)

Lacasa MnP

1200 U/l 50 U/l

Phanerochaete chrysosporium

Azul directo 15 (120 mg/l)

MnP 50 U/l

Aislamientos de hongos y bacterias no filamentosas a partir de pilas de compostaje

Remazol azul brillante R, poli R-478, poly S-

119, (200 mg/l)

LiP Lacasa Tirosina Oxidasa

polifenoloxidasa.

29

A. ochraceus Azul reactivo 25 (100 mg/l)

Lacasa LiP

tirosina

10 U/l 5 U/l 10 U/l

Lentinula edodes (CCB 554)

Azure B (0.1 mM) (or 30 mg/l)

Lacasa MnP.

0.3 U/ml 0.5 U/ml

Perennipora medullapanis (ATCC 42463)

Azure B (0.1 mM)

Lacasa MnP.

0.4 U/ml 0.7 U/ml

Trametes versicolor Azure B (0.1 mM)

Lacasa MnP.

0.6 U/ml 1.1 U/ml

Funalia trogii Remazol azul brillante royal,

Azul drimarene CL-BR; (100 mg/l)

Lacasa 130 CU/mg

Coriolus versicolor do Lacasa 70 CU/mg

Pleurotus ostreatus do Lacasa 40 CU/mg

Phanerochaete chrysosporium

Azul metileno (2.4 mg/l)

LiP 240 U/l

Trametes pubescens Remazol azul brillante R (133 mg/l),

Verde metil (33 mg/l)

Lacasa 1570 U/l

Pycnoporus sanguineus

Azul acido 62 (1.6 mM) (or 480 mg/l)

Lacasa 850 U/l

Schizophyllum commune

Amarillo oro solar R (100 mg/l)

MnP Lacasa

LiP

850 U/l 179 U/ml 96 U/ml

Irpex lacteus Naranja reactivo 16, remazol Azul brillante

R (150 mg/l)

Lacasa 1.7 U/l

Consorcio de Trametes versicolor, Bjerkandera adusta, B. fumosa

Poli R-478 (200 mg/l) Lacasa 663 IU/l

Tomado de Kaushik y Malik 2009. Anexo 5. Composición y preparación del Medio extracto de Salvado de Trigo. Composición (g/L) Glucosa 10 Extracto de Levadura 2 Peptona Universal 5 Fosfato de Potasio monobásico (KH2PO4) 0.1 Sulfato de Magnesio Heptahidratado (MgSO4. 7 H2O) 0.05 Sulfato de Manganeso Monohidratado (MnSO4. H2O) 0.076 Salvado de Trigo 175

30

Cloranfenicol 0.1 Agar- Agar 18 Preparación Introducir en un recipiente, 175 g de salvado de trigo, adicionar 1L de agua destilada y dejar en reposo durante 1 hora. Pasado este tiempo, exprimir en colador, recuperando la mayor cantidad de extracto posible. Adicionar los demás componentes a excepción del cloranfenicol y aforar a 1 L con agua destilada. Ajustar el pH a 6. Llevar a esterilizar a 121ºC, 15 lb de presión durante 15 minutos. Adicionar el antibiótico luego de esterilización. Anexo 6. Cuantificación de la actividad enzimática 1. Lacasa Preparación de reactivos

Acetato de sodio: Pesar 16.33 g y disolver en 100 ml de agua destilada. Almacenar en frasco ámbar a 4ºC.

Ácido acético glacial: Medir 7.07 ml y disolver en 100 ml de agua destilada. Almacenar en frasco ámbar a 4ºC.

Buffer lacasa (100 mM): Medir 24.5ml de acetato de sodio y 25.5 ml de ácido acético glacial. Aforar a 100 ml con agua destilada y ajustar el pH a 4.5. Almacenar en frasco ámbar a 4ºC.

ABTS: Pesar 274.35 mg y disolver en 100 ml de agua destilada. Almacenar en frasco ámbar a 4ºC. Cuantificación enzimática

La reacción se lleva a cabo durante 3 minutos (cinética) a una longitud de onda de 436 nm.

Blanco: En un tubo de reacción adicionar 900 l de muestra y 100 l de buffer lacasa.

Agitar y ajustar en el espectrofotómetro.

Determinación: En un tubo de reacción adicionar 800 l de muestra, 100 l de buffer

lacasa y 100 l de ABTS. Agitar y leer. Registrar el primer y último valor de la cinética y

reemplazar en la siguiente ecuación para determinar U Lac/L.

fdml

Abs

L

Ulac 6108.029300min3

(8)

31

2. Manganeso peroxidasa Preparación de reactivos

Rojo de fenol: Pesar 0.05 g y disolver en 100 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7.5 con NaOH 2N con agitación constante a temperatura ambiente. Almacenar en frasco ámbar a 4ºC.

Lactato de sodio: Medir 3.638 ml y disolver en 100 ml de agua destilada. Almacenar en frasco ámbar a 4ºC.

Sulfato de manganeso: Pesar 45.52mg y disolver en 500 ml de agua destilada. Almacenar en frasco ámbar a 4ºC.

Albúmina de huevo: Pesar 12.5 mg y disolver en 125 ml de agua destilada. Almacenar en frasco ámbar a 4ºC.

Ácido succínico: Pesar 0.236 g y disolver en 100 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 4.5 con NaOH 2N. Almacenar en frasco ámbar a 4ºC.

Peróxido de hidrógeno 0.1mM: Medir 6.94 l de H2O2 al 30% y disolver en 10 ml de agua

destilada. Almacenar en frasco ámbar a 4ºC. Se recomienda preparar el reactivo antes de realizar la medición enzimática. Cuantificación enzimática

Para esta determinación, se preparan tres (3) blancos, de los cuales, se ajusta en el espectrofotómetro el blanco Nº 3 y los blancos restantes, son leídos como muestra. Este procedimiento, se realiza con el fin de evidenciar la presencia / ausencia de interferentes en los reactivos. La reacción se lleva a cabo durante 10 min (cinética) a una longitud de onda de 610 nm.

Blanco 3: En un tubo de reacción adicionar 300 l de ácido succínico y 700 l de muestra.

Agitar y ajustar en el espectrofotómetro.

Blanco 1: En un tubo de reacción adicionar 50 l de rojo de fenol, 50 l de lactato de

sodio, 50 l de sulfato de manganeso, 50 l de albúmina de huevo, 100 l de ácido

succínico y 700 l de muestra. Agitar y leer. Registrar el primer y último valor de la cinética.

Blanco 2: En un tubo de reacción adicionar 50 l de rojo de fenol, 50 l de lactato de

sodio, 50 l de sulfato de manganeso, 50 l de albúmina de huevo, 750 l de ácido

succínico y 50 l de peróxido de hidrógeno 0.1mM. Agitar y leer. Registrar el primer y

último valor de la cinética.

Determinación: En un tubo de reacción adicionar 50 l de rojo de fenol, 50 l de lactato de

sodio, 50 l de sulfato de manganeso, 50 l de albúmina de huevo, 50 l de ácido

succínico, 700 l de muestra y 50 l de peróxido de hidrógeno 0.1mM. Agitar y leer.

Registrar el primer y último valor de la cinética y reemplazar en la siguiente ecuación. En

caso de encontrar interferencia, se resta el valor ( Abs) del blanco 2 y el obtenido en la determinación.

32

fdml

Abs

L

UMnP 6107.04460min10

(9)

3. Lignino peroxidasa Preparación de reactivos

Ácido tartárico: Pesar 0.84 g y disolver en 100 ml de agua destilada. Almacenar en frasco ámbar a 4ºC.

Tartrato de sodio: Pesar 4.46 g y disolver en 100 ml de agua destilada. Almacenar en frasco ámbar a 4ºC.

Buffer tartratos: Medir 50 ml de ácido tartárico y 50 ml de tartrato de sodio y ajustar el pH a 3.5. Almacenar en frasco ámbar a 4ºC.

Alcohol veratrílico: Medir 30.28 l y disolver en 100 ml de agua destilada. Almacenar en

frasco ámbar a 4ºC.

Peróxido de hidrógeno 4mM: Medir 0.28 ml de H2O2 al 30% y disolver en 10 ml de agua destilada. Almacenar en frasco ámbar a 4ºC. Se recomienda preparar el reactivo antes de realizar la determinación enzimática. Cuantificación enzimática

Para esta determinación, se preparan tres (3) blancos, de los cuales, se ajusta en el espectrofotómetro el blanco Nº 3 y los blancos restantes, son leídos como muestra. Este procedimiento, se realiza con el fin de evidenciar la presencia / ausencia de interferentes en los reactivos. La reacción se lleva a cabo durante 3 min (cinética) a una longitud de onda de 310 nm.

Blanco 3: En un tubo de reacción adicionar 290 l de buffer tartratos y 710 l de muestra.

Agitar y ajustar en el espectrofotómetro.

Blanco 1: En un tubo de reacción adicionar 40 l de alcohol veratrílico, 250 l de buffer

tartratos y 710 l de muestra. Agitar y leer. Registrar el primer y último valor de la cinética.

Blanco 2: En un tubo de reacción adicionar 40 l de alcohol veratrílico, 910 l de buffer

tartratos y 50 l de peróxido de hidrógeno 4mM. Agitar y leer. Registrar el primer y último

valor de la cinética.

Determinación: En un tubo de reacción adicionar 40 l de alcohol veratrílico, 200 l de

buffer tartratos, 710 l de muestra y 50 l de peróxido de hidrógeno 4mM. Agitar y leer.

Registrar el primer y último valor de la cinética y reemplazar en la siguiente ecuación. En caso de encontrar interferencia, se resta el valor ( Abs) del blanco 2 y el obtenido en la determinación.

fdml

Abs

L

ULiP 31071.0165min3

(10)

33

Anexo 7. Curva de Calibración DQO Preparación de reactivos

Dicromato de potasio: Pesar 10.216g de dicromato de potasio previamente secado (100ºC durante 24 horas) y aforar a 1L con agua destilada.

Biftalato de potasio: Pesar 400 mg de biftalato de potasio y aforar a 50 ml con agua destilada, preparando de esta manera una solución stock de 8000 ppm.

Para la elaboración de la curva de calibración, se tuvo en cuenta la concentración inicial de la solución stock de biftalato de potasio (8000 ppm), preparando diferentes concentraciones con un volumen final de 10 ml. Tabla 8. Preparación de los patrones de biftalato a partir de una solución stock de 8000 mg/L

Concentración mg O2 /L

Solución biftalato de potasio (8000 mg/L)

Agua destilada (ml)

10 12.5 l 9.9875

25 31.25 l 9.96875

50 62.5 l 9.9375

100 125 l 9.875

200 250 l 9.75

500 625 l 9.375

1000 1.25 ml 8.75

2000 2.5 ml 7.5

3000 3.75 ml 6.25

4000 5 ml 5

6000 7.5 ml 2.5

8000 10 ml -

Para la determinación de DQO se tuvo en cuenta el siguiente procedimiento, empleando un tubo de digestión Hach Adicionar 1 perla de vidrio, 1 ml de dicromato de potasio, 2.5 ml de muestra (concentraciones preparadas) ó agua destilada y 3.5 ml de H2SO4 concentrado. Agitar suavemente y llevar al termodigestor durante 2 horas a 150ºC. Dejar enfriar y medir la absorbancia a 600 nm. Nota: El blanco se prepara de la misma manera, sustituyendo la muestra por agua destilada. Finalmente, se graficaron las concentraciones evaluadas (eje x) y las absorbancias correspondientes (eje y) a la longitud de onda evaluada.

34

Concentración (ppm)

0 2000 4000 6000 8000 10000

Ab

so

rba

ncia

a 6

00

nm

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Fig. 13. Curva de Calibración DQO

Anexo 8. Modificación química del colorante índigo durante su elaboración

Fig. 14. Modificación química del colorante índigo durante su elaboración

y = 6E-05x + 0,0301 R² = 0,9901

Forma oxidada: índigo

Forma reducida:

Leuco-índigo

35

Anexo 9. Barrido UV/VIS del colorante.

Longitud de onda

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Ab

so

rban

cia

a 6

67 n

m

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

20 ppm

40 ppm

Fig. 15. Barrido adsorción UV/VIS Colorante

Anexo 10. Curva de calibración del colorante.

Concentración (ppm)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Ab

so

rba

ncia

66

7 n

m

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Fig. 16 Curva de calibración del índigo.

Anexo 11. Estructura grupo cromóforo presente en el índigo.

y = 0,0044x + 0,0642

R² = 0,9962

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Fig. 17. Grupo cromóforo presente en el índigo

Anexo 12. Adsorción de colorante por la biomasa

Fig. 18. Adsorción del colorante por la biomasa

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