Evaluación de actividad antibacterial de extracto de ajo frente a Clostridium perfringes y E.Coli

Según la organización Mundial de la Salud más del 30% de las personas en países industrializados sufren de enfermedades asociadas con los alimentos;

Esta misma organización está impulsando una política del no uso de sal como conservante de alimentos para tratar de disminuir los casos de enfermedad cardiovascular en el mundo;

El interés por cambiar los conservantes tradicionales como los nitritos en los productos cárnicos, ha despertado la inquietud en los procesos para la obtención de aceites esenciales y extractos vegetales de diversas plantas.

En el proceso de los cárnicos el nitrito juega un papel importante como agente de curado y conservante, ya que aporta características de color y textura y como agente inhibidor de microorganismos como Clostridium perfringens.

Más de la mitad de todos los brotes epidémicos de enfermedades transmitidas por los alimentos son causados por carne y productos cárnicos que son los que más se asocian con la tóxico infección producida por C. perfringens y E.Coli, pues ofrecen condiciones ideales para su desarrollo.

Escherichia coli Clostridium perfringes

Halladas en el intestino de los seres humanos y animales. Es una bacteria en forma de bacilo gram negativo, anaerobio facultativo, la temperatura óptima de crecimiento es de 37°C a un pH casi neutro aunque puede crecer a un pH inferior a 4 y a una actividad acuosa mínima de 0,95.Su presencia en los alimentos sirve como indicador de contaminación por manipuladores. Alimentos asociados: Carnes picadas de vaca y aves sin cocción completa (ej.: hamburguesas), salame, arrollados de carne, leche y jugos sin pasteurizar, productos lácteos elaborados a partir de leche sin pasteurizar, aguas contaminadas, lechuga, repollo y otros vegetales que se consumen crudos

El Clostridium Perfringes es un bacilo gram positivo esporulado, la temperatura óptima de crecimiento varía entre 43 y 47°C con un pH mínimo de 5 y un ideal entre de 6 a 7,5.La aw está entre 0,95 y 0,97, no crece en presencia de sal de mas de 6% de concentración. La espora puede resistir temperaturas de 100°C durante 38 minutos. Cuando las células vegetativas de Clostridium perfringens llegan al intestino y esporulan, producen la enterotoxina que es la responsable del cuadro clínico, una toxico infección.Alimentos asociados: Las carnes y derivados y los caldos de carne son los más peligrosos. La preparación de alimentos para colectividades (como escuelas, cafeterías, hospitales, alojamientos, penitenciarías, etc.) es la causa más común de intoxicación por Cl. perfringens, y ocurre cuando una gran cantidad de alimentos se preparan con mucha anticipación.

El ajo (Allium sativum), del cual se realiza la extracción del disulfuro de alilo (C6H10S2),trisulfuro de alilo y tetrasulfuro de alilo, tiene un efecto bactericida, acción que se ha atribuido a los componentes sulfurosos y fenólicos. Dado la presencia de estos componentes activos en el aceite esencial de ajo es importante estudiar su efecto frente a microorganismos patógenos transmitidos por alimentos como Clostridium perfringens y E.coli. que se encuentran entre los patógenos mas importantes.

Ajo deshidratado .Su manipulación origina una pérdida casi totalpulverizado y encapsulado de aliína.

Aceite de ajo (esencia de ajo)

.Se obtiene por destilación y carece de alicinay de compuestos hidrosolubles, pero contienecompuestos solubles en medio oleoso(disulfuro de dialilo y trisulfuro de dialilo)

Macerado oleoso de ajo

• Es el producto obtenido por maceraciónde ajo machacado en aceite vegetal• Se presenta encapsulado• Contiene aliína y alicina• La alicina se descompone instantáneamenteen numerosos compuestos organosulfurados(sulfuros, ajoenos y ditiínas)

Extracto envejecido de ajo

• Es el extracto obtenido por maceración(AGE) de láminas de bulbo de ajo en soluciónhidroalcohólica (15-20%) durante 20 meseso más, a temperatura ambiente(posteriormente se filtra y concentra a bajatemperatura y presión reducida)• Este extracto es rico en derivados azufradossolubles en agua, especialmenteS-alil-mercapto-cisteína• También contiene alil-sulfuros liposolublesestables, flavonoides, compuestos fenólicos,saponinas y otros nutrientes esenciales• Carece de compuestos liposolubles inestables(alicina)

Beneficios y propiedades del aceite de ajo El aceite de ajo es antiséptico y antibacteriano,

actuando de gran forma sobre el intestino y los pulmones, principalmente.

A su vez, es antiespasmódico, colagogo y diurético.

El aceite de ajo puede resultar bueno para limpiar la sangre, ayudando con sus propiedades a todo el sistema cardiovascular, además de resultar antioxidante.

El aceite de ajo puede emplearse para adelgazar. De hecho, suele consumirse en formas de cápsulas para perder peso.

Este trabajo de investigación está basado en cuanto al método de evaluación de actividad antibacterial y concentración inhibitoria mínima en el ensayo preliminar de la actividad antibacteriana de extractos de allium sativum, coriandrum sativum, eugenia caryophyllata, origanum vulgare, rosmarinus officinalis y thymus vulgaris frente a clostridium perfringens de Biosalud, Volumen 8, pero con modificaciones en cuanto al método de extracción del aceite volátil y que además en este proyecto se investigará el efecto antibactericida no solo frente al clostridium perfringens sino también frente a E.coli.

Objetivo Objetivo General: * Estudiar la posibilidad de obtener métodos

alternativos, que sean orgánicos para la conservación de alimentos cárnicos.

Objetivos específicos: * Estudiar el efecto inhibitorio del aceite esencial

obtenido de los bulbos de Allium sativum (ajo) frente a Clostridium perfringens (gram positivo) y Escherichia Coli (gram negativo).

* Determinar la Concentración Mínima Inhibitorio (CMI) del aceite esencial obtenido de los bulbos de Allium sativum (ajo) al crecimiento de Clostridium perfringens y Escherichia Coli.

Ventajas de Extractos 1- Permiten disponer de un producto

homogéneo; 2- Desde el punto de vista microbiológico,

los extractos ofrecen la ventaja de hallarse prácticamente libres de gérmenes;

3- Son especialmente útiles para la preparación de conservas a partir de productos muy sensibles al calor, como por ejemplo el pescado;

4- La mezcla de extractos y sacarosa o glucosa son muy convenientes para el curado de la carne y pueden emplearse con la sal de cocina y los aceites vegetales.

Hipótesis El aceite esencial de ajo posee

propiedades antibacteriales contra Clostridium Perfringes y Escherichia coli.

De ser demostrada esta hipótesis el extracto puede ser considerado como posible conservante alternativo en alimentos cárnicos.

Sin embargo también hay que considerar y realizar estudios acerca de la efectividad, inocuidad y poca capacidad de modificación de las condiciones organolépticas de los alimentos para poder establecer

este extracto como alternativa viable de conservación.

Identificación de variables Variable independiente El uso del aceite esencial de ajo Variable dependiente El efecto en el crecimiento de colonias de

Clostridium Perfringes y Escherichia Coli. Variables intervinientes Cambio de pH Cambio de temperatura Tiempo de incubación Composición y concentración del extracto

(componentes activos)

Paradigma y Sistema de investigación Un paradigma es el marco a través del cual una persona

percibe (y filtra) la realidad y actúa en consecuencia. El paradigma a seguir será el Positivista el cual se

fundamenta en la cuantificación y está soportado por el sistema de investigación Hipotético-Deductivo ya que el método de difusión en disco a utilizar nos permitirá determinar el % de inhibición del extracto con respecto a un antibiótico (control +) y la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de ajo, lo que requiere de observación, descripción medición, interpretación de resultado etapas que principales de este sistema de investigación.

La estrategia a utilizar será de tipo experimental. A partir de la información que se recopiló, se analizó y expuso en el marco teórico, se plantea la hipótesis que da cuenta de una causa y efecto, en nuestro caso, el aceite esencial de ajo y su efecto antibactericida frente a Clostridium perfringes y E.coli.,esto se pretende comprobar mediante la experimentación controlada, la cual se detallará en la siguiente sección. Finalmente, a partir de la experiencia se podrá demostrar o refutar la hipótesis que se planteó previamente.

Muestra y experimentación

LABORATORIO MICROBILOGIC

O

Antibiótico

Cepas de clostridium perfringens y E.coli

Extracto de ajo

Equipamiento de laboratorio Medios de

cultivo

Reactivos

Material descartable

Evaluación de actividad antibacterial y concentración mínima inhibitoria de aceite esencial de ajo frente a clostridium perfringens y E.coli.

Hipoteca de emisiones: Proveedor de material descartable: Residuos

plásticos, contaminación atmosférica, uso de recursos no renovable, ocupación de espacio.

Proveedor de equipamiento: equipos de acero (autoclave, estufa, espátula…etc), material eléctrico, ocupación y contaminación ambiental.

Proveedor de reactivos: Desechos de producción, contaminación, ocupación.

Proveedor de de antibiótico: Desgaste de energía, residuos microbiológico.

Laboratorio microbiológico: Residuos bacteriológicos, contaminación del ambiente, gasto de energía.

Etapas de Experimentación

1) Obtención del aceite esencial de ajo 2) Evaluación de actividad antibacterial 3) Evaluación de concentración mínima

inhibitoria

Muestra de ajo

Limpieza, pelado picado

Extracción deaceite

%Efecto inhibitorioConcentración

Mínima inhibitoria

Agua, molino de cuchilla

Vapor de aguaProducto químico

Residuosorgánicos

AguaResiduo químico y

orgánicos

Productos para cultivoResiduos

biológicos

EnergíaMaterial de

VidrioMaterial de

acero

1)PREPARACIÓN DEL ACEITE ESENCIAL

Limpieza: retirado de impurezas, pelado y lavado con abundante agua y se desdenta manualmente.

Retirado de piel. Picado utilizando molino de

cuchillas.

Método de extracción

Extracción de aceite esencial

Solventes volátiles

Arrastre con vapor de agua

Expresión

Extracción por arrastreCon vapor de agua

Destilación por arrastre de vapor

Método directo

Hidrodestilación

Hidrodestilación

Aceite esencial puro

Hidrodestilación

Equipo dehidrodestilación

vapor de agua,calor, Na2SO4(anhidro)

Muestra de ajo

agua, calor desprendido, Na2SO4(hidratado),residuo orgánico.

Enfoque sistémicoExtracción por vapor de agua

2) EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIAL Método de difusión en disco(Bauer, Kirby ): El antibiograma disco-placa consiste en depositar,

en la superficie de agar de una placa de petri previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los diferentes antibióticos. Tan pronto el disco impregnado de antibiótico se pone en contacto con la superficie húmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antibiótico difunde al agar. El antibiótico difunde radialmente a través del espesor del agar a partir del disco formándose un gradiente de concentración. Transcurridas 18-24 horas de incubación los discos aparecen rodeados por una zona de inhibición.

Cepas de microorganismo. Las cepas utilizadas en el ensayo de actividad antimicrobiana están depositadas en el American Type Culture Collection (ATCC), son de referencia internacional y forman parte de una batería mínima de cepas que se emplean para este tipo de estudio: Escherichia coli (ATCC 25922), Clostridium perfringens (ATCC 13124).

Medios de cultivo. Los medios de cultivo a utilizar son medios ricos que permiten el crecimiento del microorganismo sin dificultad. Para Escherichia coli se utiliza agar eosina azul de metileno (EMB), y para Clostridium Perfringens agar SPS, esterilizados en autoclave a 121 °C y una atmósfera durante 20 min.

Controles. Como control negativo se utilizó una solución de etanol al 40 %. En el caso de los controles positivos se empleó vancomicina para C.perfringes y estreptomicina para E.coli.

Etapas de método de difusión de disco a) Preparación de inóculo b) Inoculación de placas c) Lectura de placas e interpretación

de resultados

a) Preparación de inóculoSelección de 3-5 colonias

Colonias de la cepa en agar

Caldo de cultivo

Incubación a 35°C y comparación con estándar de 0,5 McFarland

Suspensión de 1-2 x 108 UFC/ml

Enfoque sistémico

-Caldo de cultivo-Solución salina estéril-tubos de ensayo-asa

i

Incubación (ajuste de turbidez)

-tubos de ensayos, material sucio material no utilizado

Inoculo108UFC/ml

Estándar de McFarland

Esterilización,lavado y secado de material de vidrio, conservación (refrigeración) de caldos, solución salina, cepas y almacenamiento de estándar de McFarland.

Cepas de E.coli yClostridium perfringes

Procedimiento parapreparación de cepas

Incineración de residuo bacteriológico

b) Inoculación de placas

20ml de medio(agar)

Nitrito de sodio

Aceite esencial

1ml de inoculo(108 UFC/ml

Control +

INCUBACIÓN A 37°C, 18-24 Hs.

LECTURA DE PLACAS

Enfoque sistémico

%Inhibición de

microorganismos

Inoculo de 108UFC/m

Incubación

-Medio agar-Antibiótico-NaNO2

-Placas-Estufa-pipeta

Aceite esencial de ajo

Método de difusión en disco (Kirby Bauer)

-Material sucio o no utilizado,

residuo microbiológico

Incineración de residuo

microbiológico

Esterilización, lavado y secado de material de vidrio y plástico, conservación de antibiótico y NaNO2.

c) Lectura de placas e interpretación de resultados Después de 18 horas de incubación, cada placa

es examinada. Los diámetros de la zona de inhibición completa son medidos en mm pasando por el centro del disco.

Se compara el diámetro con el obtenido en el antibiótico (control positivo); se consideró que un determinado extracto tenía acción antibacteriana cuando produjo una inhibición igual o mayor al 50% de inhibición con respecto al antibiótico.

Cálculo de efecto inhibitorio

100% positivocontroldeloinhibitorihalodediámetro

extractodeloinhibitorihalodediámetrooinhibitoriefecto

3) Evaluación de concentración mínima inhibitoria La Concentración mínima inhibitoria (CMI),

en microbiología, es la concentración más baja de un antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo después de su incubación.

Método a utilizar de Kirby Bauer

Control +

Control –(etanol)

Diluciones de aceite esencial

INCUBACION24Hs-37°C

Repique,Incubación

Microorganismo

Medio para confirmació

n

Tiempo y temperatur

a de incubación

Ausencia de crecimiento

E.coliCaldo EC con

campanita de Durhan

48hs,44-45°CAusencia de gas.Sin viraje de

indicador.

Clostridium perfringes SPS en tubo

24hs, 37°CEn condiciones

anaeróbicas

Ausencia de turbidez.

Ausencia de gas.Ausencia de

color oscuro.

La inhibición se corrobora mediante repiques de la zona de inhibición en medio SPS en tubo y EC(para E.coli), confirmándose de esta manera la inhibición obtenida en aquellas diluciones que así la presentaron en el ensayo inicial.

Enfoque sistémico

CMI

Inoculo de 108UFC/m

Incubación

-Medio agar-Antibiótico-Placas-Estufa-pipetaDiluciones

de Extracto de ajo

Método de difusión en disco (Kirby Bauer)

-Material no utilizado, residuo

microbiológicoIncineración de residuo

microbiológico

Lavado y secado de material de vidrio y plástico, conservación de antibiótico en ambiente adecuado(refrigeración).

Índice Analítico tentativo

1. Investigación previa del problema 2. Determinación de recursos humanos y

materiales 5. Determinación de costos 6. Recolección de datos 7-Financiamiento 8-Análisis e Interpretación de resultados

CronogramaActividades Tiempo

1-Investigación de

problema

2-Asesoría

metodológica

3-Diseño del

proyecto

4-Observaciones

5-Proyecto

6-Observaciones

7-Tratamiento de

Información

8-Análisis e

interpretación

Semanas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20