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Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus pluvialis en un
fotobiorreactor tipo airlift.
Daniel Mauricio Ramírez Landínez, Ing. Qco.
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería Química y Ambiental
Bogotá, Colombia
2013
Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus pluvialis en un
fotobiorreactor tipo airlift.
Daniel Mauricio Ramírez Landínez
Tesis de investigación presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ingeniería Química
Director:
Ph. D. M. Sc. Ing. Qco. Rubén Darío Godoy Silva
Codirector:
Dr . M.Sc. Biólogo Luis Carlos Montenegro Ruiz
Línea de Investigación:
Procesos Bioquímicos - Cultivo de microalgas
Grupo de Investigación:
Grupo de investigación en procesos Químicos y Bioquímicos
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería Química y Ambiental
Bogotá, Colombia
2013
A mi esposa por haber estado en los
momentos difíciles y apoyarme cuando más
lo necesitaba. A mi padre que ya partió y a mi
madre por todos los esfuerzos por traerme
hasta aquí.
Agradecimientos Quiero iniciar agradeciendo a los profesores Rubén Darío Godoy y Luis Carlos
Montenegro por su dirección y por permitirme ser parte de esta experiencia llena de
aprendizajes y buenos momentos.
Agradezco a la Dirección de investigación de la sede Bogotá de la Universidad Nacional
de Colombia por su apoyo económico para el desarrollo de la investigación, al
Departamento de Ingeniería química por facilitar los recursos físicos y humanos, así
como al Laboratorio de cultivo de microalgas del departamento de Biología por ser mi
escuela y facilitarme el desarrollo de mi tesis.
Un agradecimiento a todas las personas que directa o indirectamente me apoyaron y
guiaron para alcanzar las metas que había establecido, especialmente a mis compañeros
y amigos Luis Miguel Serrano, Liliana Ardila, Marisol Herrera, Ana Isabel Ramos y Fredy
Gómez.
Al personal del Ingenio Providencia S.A. por su comprensión durante la última fase del
proyecto.
Resumen y Abstract IX
Resumen Haematococcus pluvialis ha ganado gran interés comercial por su capacidad de
acumular altos niveles de astaxantina comparado con otras fuentes. El principal
problema para su escalamiento industrial es su elevado costo de producción comparado
con la astaxantina sintética. Actualmente las investigaciones han sido encaminadas a
optimizar las variables del proceso de crecimiento de la microalga y la acumulación de
este metabolito, evaluando parámetros como la intensidad de luz, diferentes medios de
cultivo, el efecto del nitrógeno, fósforo, minerales, temperatura, entre otros. Además se
ha propuesto el uso de diferentes fotobiorreactores, para reducir el estrés hidrodinámico,
así como los procesos posteriores de separación y purificación. En el presente
investigación se presenta una revisión de diferentes trabajos, evaluando el potencial que
tiene Haematococcus pluvialis para la producción industrial de astaxantina.
En la primera fase de la investigación se estudió el efecto de cinco medios de cultivo en
el crecimiento de una cepa nativa de la microalga Haematococcus pluvialis, encontrando
que no existe diferencia significativa entre los medios evaluados, mostrando velocidades
de crecimiento de 0,463 - 0,536 días-1, con una densidad celular máxima de 4,02 - 4,16 x
105 cel/mL. Al someter las células en fase estacionaria a estrés, se encontró que una
concentración de sal superior al 0,025 % es letal para la microalga y no genera
acumulación de astaxantina, mientras que las células sometidas a irradiaciones inferiores
a 55500 Lux no fueron inhibidas, logrando una acumulación de 32,99 g/mL y una
productividad de 1,434 mg L-1día-1. Por ultimo se encontró que al concentrar primero las
células en fase estacionaria y luego someterlas a estrés por irradiación se consigue una
acumulación 59,23 g/mL y una productividad de 3,484 mg L-1día-1, mostrando gran
potencial para la producción industrial de astaxantina a partir de esta microalga nativa.
En la segunda fase se evaluó el efecto del porcentaje de dióxido de carbono en la
aireación, de la intensidad de luz y de la concentración de nitrógeno y de fósforo, en la
X Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
velocidad específica de crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
utilizando la metodología de superficie de respuesta y ajustando los parámetros a un
polinomio de segundo orden. Se encontró una velocidad máxima de crecimiento para los
límites evaluados de 0.825 días -1, utilizando 0.51% de CO2, 3,28x10-3 M de nitrógeno
(NaNO3), 2,58x10-3 M de fósforo (K2HPO4 y KH2PO4) y 11000 Lux de iluminancia, como
parámetros de cultivo. De estos parámetros la intensidad de luz y la concentración de
fósforo tuvieron un efecto positivo en el crecimiento de la microalga, mientras que el %
CO2 presento un efecto negativo; la concentración de nitrógeno no tuvo efecto
significativo en la velocidad específica de crecimiento.
Por último se diseñó y construyó un fotobioreactor tipo airlift para el crecimiento de la
microalga nativa Haematococcus pluvialis. Se realizó una caracterización hidrodinámica
encontrando tiempos de mezclado de 130 a 240 s, retenciones de gas inferiores al 6 %
del volumen del reactor, y coeficientes de transferencia de masa para el oxigeno y el
dióxido de carbono de 9,8 y 8,6 h-1 respectivamente. Se encontró una velocidad máxima
de crecimiento de 0.597 días -1, utilizando las condiciones óptimas encontradas en las
fases anteriores de la investigación.
Palabras clave: Haematococcus pluvialis, fotobioreactores, astaxantina, estrés
hidrodinámico, velocidad específica de crecimiento, medios de cultivo, irradiación,
salinidad.
Abstract Haematococcus pluvialis has gained great commercial interest for their ability to
accumulate high levels of astaxanthin with respect to other sources. The high production
cost compared to synthetic astaxanthin is the main problem for industrial scaling.
Currently, research has been focused to optimizing the process variables for microalga
growth and metabolite accumulation, evaluating parameters as irradiance, culture media,
nitrogen, phosphorus, minerals, temperature, etc. They have also proposed the use of
different photobioreactors for hydrodynamic stress reduction as well as the subsequent
separation processes and purification. This investigation presents a review of various
researches, evaluating the potential of Haematococcus pluvialis for industrial astaxanthin
production.
Contenido XI
In the first part of the investigation, five different culture media were effect in the native
microalgae Haematococcus pluvialis was studied finding no significant differences
between evaluated media, showing growing rates of 0,463 - 0,536 days-1 with a maximum
cellular density of 4,02 - 4,16 x 105 cel/mL. When stationary phase cells are stressed, a
more than 0,025 % salt concentration is lethal for the microalgae and does not produce
astaxanthin accumulation, while the cells under less than 55500 Lux irradiation were not
inhibited, achieving a 32,99 g/mL accumulation and a 1,434 mg L-1day-1 production.
Finally, to concentrate the stationary cells first and later to stress them by irradiation is
suggested, to get a 59,23 g/mL accumulation and a 3,484 mg L-1day-1production,
showing a big potential for the industrial astaxanthin production from this native
microalgae.
In the second part, the effect of carbon dioxide concentration in the aeration, the nitrogen
and phosphorus concentration and the light intensity, in the specific growth rate of native
microalgae Haematococcus pluvialis were evaluated through a response surface
methodology, adjusting the parameters to a second order polynomial. The maximum
growth rate, for evaluated limits, was 0.825 days-1, using 0.51% of CO2, 3,28x10-3 M of
nitrogen (NaNO3), 2,58x10-3 M of Phosphorus (K2HPO4 and KH2PO4) and 11000 Lux of
luminance, as culture parameters. Light intensity and phosphorus concentration had a
positive effect in the specific growth rate of the microalgae while the carbon dioxide
percentage had a negative effect; the nitrogen concentration had no significant effect in
the specific growth rate.
An airlift photobioreactor was designed and built growing the native microalgae
Haematococcus pluvialis. A hydrodynamic characterization of the bioreactor was
developed, finding a mixing time of 130 and 240 s, gas retention of less than 6%, oxygen
mass transfer coefficient of 9,8 h-1 and carbon dioxide one of 8,6 h-1. The specific growth
rate for aeration of 0,5 vvm was 0.597 day -1, using the same conditions found in the last
stage of this research.
Keywords: Haematococcus pluvialis, photobioreactors, specific growth rate, astaxanthin,
hydrodynamic stress, culture media, irradiation, salinity, microalgae.
Contenido XIII
Contenido
Pág.
Resumen ................................................................................................................................... IX
Lista de figuras........................................................................................................................ XVI
Lista de tablas ....................................................................................................................... XVIII
Lista de Símbolos y abreviaturas ............................................................................................... XX
Introducción ............................................................................................................................... 1
Objetivos .................................................................................................................................... 1
1. Una revisión de la microalga Haematococcus pluvialis como fuente de Astaxantina natural.2 Resumen ...................................................................................................................... 2 Abstract ........................................................................................................................ 2 1.1 Introducción ....................................................................................................... 3 1.2 Astaxantina ....................................................................................................... 4
1.2.1 Aplicaciones ........................................................................................... 5 1.2.2 Fuentes .................................................................................................. 6
1.3 Haematococcus pluvialis ................................................................................... 7 1.4 Condiciones de crecimiento ............................................................................ 10
1.4.1 Medios de cultivo .................................................................................. 10 1.4.2 Iluminancia, CO2, temperatura y sales en el medio de cultivo ............. 11 1.4.3 Factores hidrodinámicos y de diseño ................................................... 13
1.5 Métodos de separación y purificación ............................................................. 14 1.6 Fotobiorreactores ............................................................................................ 15
1.6.1 Sistemas abiertos ................................................................................. 15 1.6.2 Sistemas cerrados ................................................................................ 16
1.7 Mercado de Haematococcus pluvialis ............................................................. 18 1.7.1 Producción de astaxantina a nivel industrial ........................................ 19
2. Efecto de las condiciones de cultivo en el crecimiento y acumulación de astaxantina en una cepa nativa de Haematococcus pluvialis ................................................................................... 21
Resumen .................................................................................................................... 21 Abstract ...................................................................................................................... 21 2.1 Introducción ..................................................................................................... 22 2.2 Materiales y métodos ...................................................................................... 23
2.2.1 Microorganismo y condiciones de cultivo ............................................. 23
XIV Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
2.2.2 Evaluación de medios de cultivo ........................................................... 24 2.2.3 Evaluación de estrés por intensidad lumínica ....................................... 24 2.2.4 Evaluación de estrés por alta salinidad en el medio de cultivo ............. 25 2.2.5 Evaluación de estrés por concentración celular .................................... 25 2.2.6 Medición de variables ........................................................................... 26 2.2.7 Ajuste cinéticas de crecimiento ............................................................. 28
2.3 Resultados y discusión .................................................................................... 29 2.3.1 Efecto del medio de cultivo ................................................................... 29 2.3.2 Efecto de la intensidad de luz y concentración de sal en la acumulación de astaxantina. .................................................................................................... 32 2.3.3 Efecto de la concentración celular y la elevada iluminación en la acumulación de astaxantina. ............................................................................... 36
3. Optimización de las condiciones de cultivo en el crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis ........................................................................................................... 41
Resumen .................................................................................................................... 41 Abstract ....................................................................................................................... 41 3.1 Introducción ..................................................................................................... 42 3.2 Materiales y métodos ....................................................................................... 43
3.2.1 Microorganismos y condiciones de cultivo ............................................ 43 3.2.2 Diseño experimental y análisis de datos ............................................... 45 3.2.3 Medición del crecimiento ....................................................................... 47 3.2.4 Ajuste de cinéticas de crecimiento ........................................................ 47
3.3 Resultados y discusión .................................................................................... 49
4. Diseño, montaje y evaluación de un fotobiorreactor para el crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis ................................................................................................ 57
Resumen .................................................................................................................... 57 Abstract ....................................................................................................................... 57 4.1 Introducción ..................................................................................................... 58 4.2 Materiales y métodos ....................................................................................... 59
4.2.1 Microorganismos y condiciones de cultivo ............................................ 59 4.2.2 Descripción del fotobioreactor airlift ...................................................... 61 4.2.3 Caracterización hidrodinámica .............................................................. 63 4.2.4 Tiempo de Mezclado ............................................................................. 64 4.2.5 Retención de gas .................................................................................. 64 4.2.6 Velocidad del gas en la zona de ascenso ............................................. 64 4.2.7 Velocidad del líquido en la sección de descenso .................................. 65 4.2.8 Coeficiente volumétrico global de transferencia de masa ..................... 65 4.2.9 Medición del crecimiento ....................................................................... 66 4.2.10 Ajuste de cinéticas de crecimiento ........................................................ 66
4.3 Resultados y discusión .................................................................................... 66 4.3.1 Tiempo de Mezclado ............................................................................. 66 4.3.2 Retención del gas ................................................................................. 68 4.3.3 Velocidad de descenso del líquido ........................................................ 68 4.3.4 Coeficientes globales de transferencia de masa .................................. 69 4.3.5 Evaluación del crecimiento de la microalga .......................................... 71
5. Conclusiones y recomendaciones ...................................................................................... 75 5.1 Conclusiones ................................................................................................... 75
Contenido XV
5.2 Recomendaciones .......................................................................................... 76
A. Anexo: Composición de los medios de cultivo empleados ................................................. 77
B. Anexo: Superficies de respuesta ........................................................................................ 79
C. Anexo: Planos de diseño fotobioreactor tipo airlift ........................................................... 81
D. Anexo: Curvas de aireación y desgasificación- Oxígeno disuelto ...................................... 119
Bibliografía ............................................................................................................................. 123
Contenido XVI
Lista de figuras
Pág. Figura 1-1: Estructura molecular de la Astaxantina (Sánchez & Flores, 1999).................. 5 Figura 1-2: Fases de crecimiento de Haematococcus pluvialis (Hagen et al., 2002) ........ 8 Figura 1-3: Ruta de síntesis de astaxantina en la microalga Haematococcus pluvialis (Zhu et al., 2009) ................................................................................................................. 9 Figura 2-1 Esquema del montaje de trabajo para evaluar estrés por concentración celular .......................................................................................................................................... 28 Figura 2-2: Curvas de crecimiento de la microalga Haematococcus pluvialis en los medios de cultivo BBM (◊), BG11 (□), OHM (×), F1 (○), BBM: BG11 (1:1) (∆) ................. 30 Figura 2-3 Velocidad específica de crecimiento para los medios de cultivo evaluados. Barra error: desviación estándar. ...................................................................................... 31 Figura 2-4 Efecto de la salinidad del medio de cultivo en la acumulación de astaxantina en H. pluvialis .................................................................................................................... 33 Figura 2-5: Efecto de la intensidad de luz en la acumulación de astaxantina en H. pluvialis ............................................................................................................................. 34 Figura 2-6: Efecto de la salinidad del medio de cultivo en la producción de biomasa ..... 35 Figura 2-7 Efecto de la intensidad lumínica en la producción de biomasa ...................... 36 Figura 2-8: Seguimiento fotográfico al estrés por concentración y elevada iluminancia en la acumulación de astaxantina en H. pluvialis. ................................................................. 37 Figura 2-9: Efecto de la concentración celular y la intensidad de luz en la acumulación de astaxantina g/mL. ............................................................................................................ 38 Figura 3-1: Fotografía biorreactores utilizados en la experimentación ............................ 44 Figura 3-2: Sistema de iluminación por LED’s ................................................................. 44 Figura 3-3: Sistema de control de temperatura ............................................................... 45 Figura 3-4: Esquema de mezclado de aire y dióxido de carbono .................................... 46 Figura 3-5: Diagrama de Pareto estandarizado para el efecto de los parámetros ajustados sobre la velocidad específica de crecimiento. .................................................. 52 Figura 3-6: Efecto de los parámetros sobre la velocidad específica de crecimiento ....... 53 Figura 3-7: Superficie de respuesta para la velocidad específica de crecimiento, 3,28 mM NaNO3 y 2,58 mM de K2HPO4 y KH2PO4 .......................................................................... 53 Figura 4-1: Iluminación con cintas LED tipo SMD del fotobiorreactor tipo airlift .............. 60 Figura 4-2: Esquema de mezclado de aire y dióxido de carbono, control de flujo de aire y nitrógeno ........................................................................................................................... 61 Figura 4-3 Fotobiorreactor tipo airlift para el cultivo de microalgas.................................. 63
Contenido XVII
Figura 4-4 Respuesta ante impulsos ácidos del electrodo de pH .................................... 67 Figura 4-5 Tiempos de mezclado en función del flujo de aireación ................................. 67 Figura 4-6 Retención de gas en función del flujo de aireación ......................................... 68 Figura 4-7 Velocidad de descenso del medio líquido ....................................................... 69 Figura 4-8 Perfil de concentración de Oxígeno disuelto para una flujo de 0,25 vvm ....... 69 Figura 4-9 Linealización de los perfiles de concentración para el oxígeno disuelto para un flujo de aireación de 0,25 vvm .......................................................................................... 70 Figura 4-9 Coeficientes globales de transferencia de masa en función del flujo de aireación ............................................................................................................................ 71 Figura 4-11 Curva de crecimiento de la microalga H. pluvialis en un fotobioreactor tipo airlift ................................................................................................................................... 73 Figura B-1: Superficie de respuesta para la velocidad específica de crecimiento, 1% CO2 y 8500 Lux ......................................................................................................................... 79 Figura B-2: Superficie de respuesta para la velocidad específica de crecimiento, 1% CO2 y 1,72 mM de K2HPO4 y KH2PO4 ..................................................................................... 79 Figura B-3: Superficie de respuesta para la velocidad específica de crecimiento, 2,94 mM NaNO3 y 8500 Lux ...................................................................................................... 80
XVIII Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Lista de tablas Pág.
Tabla 1-1: Principales aplicaciones de la astaxantina .................................................... 5 Tabla 1-2: Densidad celular y velocidad específica de crecimiento para diferentes medios de cultivo autotróficos ........................................................................................... 10 Tabla 1-3: Comparación de las propiedades de diferentes sistemas para el cultivo de microalgas a gran escala (Borowitzka, 1999). .................................................................. 17 Tabla 1-4: Información industrial de producción de astaxantina natural (Domínguez et al. (2006); Rosenberg et al. (2008)). ................................................................................. 20 Tabla 2-1: Parámetros de estrés para acumulación de astaxantina en la microalga H. pluvialis ......................................................................................................................... 26 Tabla 2-2: Comparación de la concentración celular máxima obtenida por diferentes autores. ............................................................................................................................. 29 Tabla 2-3 Matriz de coeficientes del modelo logístico ajustado para los diferentes medios de cultivo según la Ecuación 2.1. Desviación estándar (DE) y coeficiente de determinación R2, Xmax y X0 en Células·mL-1 y μ en día-1 .............................................. 31 Tabla 2-4 Análisis de varianza (ANOVA) del efecto del medio de cultivo en la velocidad específica de crecimiento de la microlaga Haematococcus pluvialis............................... 32 Tabla 2-5 Análisis de varianza (ANOVA) del efecto del medio de cultivo en la producción de biomasa de la microlaga Haematococcus pluvialis ..................................................... 32 Tabla 2-4: Tasa de aumento en la acumulación de astaxantina ...................................... 39 Tabla 3-1: Niveles e intervalos de variación de los parámetros ....................................... 46 Tabla 3-2: Diseño de experimentos rotacional para optimizar la velocidad específica de crecimiento de H. pluvialis ................................................................................................ 48 Tabla 3-3: Análisis de varianza (ANOVA) para los parámetros ajustados ....................... 51 Tabla A-1: Composición de los medios de cultivo empleados, cantidades para 1 L ....... 78
Contenido XIX
Contenido XX
Lista de Símbolos y abreviaturas Símbolos con letras latinas Símbolo Término Unidad SI Definición A Área m2 a Coeficientes de ajuste polinomio de segundo
grado
C Concentración de oxígeno disuelto Kg/m3 Ec. 4.3 D Difusividad DF E Energía J m·L2·t-2 f frecuencia Hz t-1 KLa Coeficiente global de transferencia de masa t-1 Ec. 4.4 I Irradiancia Lux E·A-1·t-1 L Longitud m DF M Molaridad Mol L-1 DF m Masa kg DF n Cantidad de materia mol DF Pbio Productividad de biomasa kg·m-2·s-1
m·A-1·t-1 Q Caudal del gas L h-1 DF r Radio m DF t Tiempo s DF T Temperatura K DF U Velocidad del gas m/s M t-1 V Volumen m3
X Densidad celular Nº células·m-
3
Ec. 2.1
X0 Densidad celular inicial Nº células ·m-3
Ec. 2.1
Xmax Densidad celular máxima Nº células ·m-3
Ec. 2.1
Símbolos con letras griegas Símbolo Término Unidad SI Definición λ Longitud de onda m DF μ Velocidad específica de crecimiento
media s-1 Ec. 2.1
Error Ec. 3.1
Contenido XXI
Subíndices Subíndice Término bio Biomasa Max Máximo 0 Valor inicial L Medio líquido O2 Oxígeno CO2 Dióxido de carbono
Superíndices Superíndice Término n Exponente, potencia * saturación
Abreviaturas Abreviatura Término DE Desviación Estándar EE Error estándar HL Horas de luz diarias LO Ciclo de luz oscuridad n Número de repeticiones p-valor Valor probabilístico t Estadístico t de Student vvm Volumen de gas por volumen de líquido por minuto
LED Diodo de emisión de luz Cel Células
Introducción Las microalgas son microrganismos fotosintéticos que tiene un alto valor industrial debido
a su gran aplicabilidad, ya que son útiles en la producción de biodiesel, el tratamiento de
aguas residuales y la producción de proteína para la alimentación animal y humana,
entre otras. Además de las aplicaciones anteriores, estos microrganismos, presentan
como característica especial la capacidad de acumular metabolitos de interés
biotecnológico como los ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga y los
carotenoides (Cardozo et al., 2007).
El carotenoide de mayor importancia a nivel industrial es el -caroteno, el cual es
producido utilizando la microalga marina unicelular Dunaliella salina (Prieto et al., 2011).
Desde entonces, se han desarrollado diversas investigaciones en torno a carotenoides
derivados del -caroteno, que presentan mejores propiedades antioxidantes como la
astaxantina.
La microalga Haematococcus pluvialis es uno de los mejores productores del carotenoide
rojo astaxantina, ya que tiene la capacidad de acumular más del 3% en peso seco de
pigmento (Hagen et al., 2001); sin embargo, esta microalga presenta una baja
productividad de astaxantina, debido a factores como un lento crecimiento, baja
concentración celular y alta susceptibilidad a daños hidrodinámicos.
La producción de este metabolito secundario está fuertemente relacionada con los
cambios morfológicos producidos en la microalga desde un estado vegetativo verde en el
que se da el crecimiento, hasta un estado rojo de alta acumulación de astaxantina. Estos
cambios son inducidos por diversos factores como la deficiencia de nutrientes (nitrato,
fosfato, sulfato), la intensidad lumínica, la salinidad del medio y las altas temperaturas,
entre otros (Tripathi et al., 2002).
2 Introducción
La separación y purificación de este carotenoide también son de gran importancia para
su utilización industrial. Se han propuesto métodos de extracción con solventes orgánicos
como el diclorometano, la acetona y el hexano, entre otros, pero algunos de ellos pueden
ser tóxicos, lo que restringe su uso para aplicaciones comerciales en alimentos y
productos farmacéuticos (Krichnavaruk et al., 2008). Esto hace necesario plantear otros
métodos de separación, que no alteren las propiedades físico-químicas del producto.
La astaxantina es ampliamente utilizada en la acuicultura como aditivo para la
pigmentación de salmón, trucha, camarón, algunos peces ornamentales y muchos
crustáceos (Lorenz & Cysewski, 2000). Estudios recientes señalan otras propiedades de
la astaxantina con potencial aplicación en las industrias farmacéutica y cosmética tales
como su elevada actividad antioxidante, excelentes propiedades como agente
fotoprotector (luz UV), propiedades para la salud ocular, de la piel, del corazón y a nivel
celular y otros usos potenciales como anti-inflamatorio, anti-cancerígeno, desintoxicante,
en enfermedades neurodegenerativas y en la respuesta inmune (Guerin et al., 2003).
Las industrias anteriormente mencionadas han encontrado numerosas ventajas en la
utilización de astaxantina natural frente a la sintética en sus aplicaciones, lo que ha
generado un aumento en la demanda de este producto natural e impulsado el uso de
microorganismos capaces de sintetizar astaxantina. Por este motivo, es necesario
realizar diferentes investigaciones encaminadas a utilizar la cepa nativa de
Haematococcus pluvialis para la producción del pigmento a nivel industrial.
Kaewpintong et al. (2007) evaluaron el efecto de diferentes medios de cultivo y la adición
de vitamina B12 en la producción de biomasa, identificando el medio F1 con una
concentración de vitamina B12 de 12 mg/L, como el que genera la máxima densidad
celular de 8,4 x 104 Cel mL-1. También evaluaron la concentración de CO2 en el aire
burbujeado, y encontraron que al aplicar una concentración del 1% en volumen en el aire
se optimiza el crecimiento para el medio de cultivo, obteniendo una densidad celular de
79,5 4 x 104 Cel mL-1 y una velocidad especifica de crecimiento de 0,45 d-1.
Sin embargo, los medios de cultivo no son el único factor determinante en el diseño de
este tipo procesos; otros autores proponen el estudio de los efectos hidrodinámicos
evaluando los efectos del flujo de aire en el daño celular. La velocidad superficial del gas
Introducción 3
en el dispersor (variando el flujo de aire) y en la velocidad de entrada de gas (para
diferentes aspersores) de un fotobioreactor tipo airlift de pared plana, sobre el
crecimiento de H. pluvialis, fue evaluado por Vega-Estrada et al. (2005), encontrando que
los daños celulares por efectos hidrodinámicos son reducidos cuando el biorreactor es
operado con una velocidad superficial y de entrada de 12 mm/s y 22.8 m/s
respectivamente. Los autores calcularon el coeficiente volumétrico de transferencia de
masa para el fotobioreactor, y encontraron que es de 10 h-1 y 32 h-1 para una velocidad
superficial de 6 y 24 mm/s respectivamente.
Además de los factores ya mencionados, es importante definir el método de separación y
purificación más adecuado. Krichnavaruk et al. (2008) proponen la extracción con dióxido
de carbono supercrítico como método de separación de astaxantina en Haematococcus
pluvialis, evaluando los aceites de soya y de oliva como co-solventes, con un flujo
constante de 3 mL/min de CO2 a 70 ºC y 40 MPa. La utilización de 10% de aceite de
soya incrementa la eficiencia de separación a 36,6%, mejorando en un 30% la eficiencia,
comparada con el uso de CO2 sin co-solvente; en cambio el uso de 10% de aceite de
oliva incrementa la eficiencia separación a un 51,03%.
El aporte que este trabajo buscó hacer al área de investigación en el cultivo de
microalgas estuvo centrado en la producción de carotenoides respondiendo a la siguiente
pregunta de investigación: ¿Cuáles son las condiciones óptimas de crecimiento y
producción de astaxantina en la microalga Haematococcus pluvialis en un fotobioreactor
tipo airlift?
Objetivos Objetivo general Determinar las condiciones óptimas de crecimiento y producción de astaxantina en la
microalga Haematococcus pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift a nivel de laboratorio.
Objetivos específicos
1. Estandarizar las condiciones de cultivo de la microalga Haematococcus pluvialis
para optimizar la acumulación de astaxantina en la célula a nivel laboratorio (100
mL).
2. Evaluar el efecto de la concentración celular y alta intensidad lumínica en la
acumulación de astaxantina en la microalga nativa de Haematococcus pluvialis
3. Diseñar y construir un fotobiorreactor tipo airlift a nivel laboratorio (1 L).
4. Evaluar el crecimiento y la acumulación de astaxantina en la microalga
Haematococcus pluvialis en el fotobiorreactor tipo airlift a nivel laboratorio (1 L).
1. Una revisión de la microalga Haematococcus pluvialis como fuente de Astaxantina natural.
Resumen La astaxantina es un pigmento carotenoide de color rojizo, soluble en lípidos y con una
potente actividad antioxidante, que se usa como suplemento en dietas animales para
impartir coloración y en la alimentación humana como antioxidante. El interés comercial
en Haematococcus pluvialis radica en su capacidad de acumular altos niveles de
astaxantina natural comparada con otras fuentes. El principal problema para su
escalamiento industrial es su elevado costo de producción comparado con el de la
astaxantina sintética. Para intentar resolver estos problemas, muchas investigaciones
han buscado optimizar algunas de las variables más importantes del proceso de
crecimiento de la microalga y la acumulación del carotenoide, incluyendo la intensidad de
luz, diferentes medios de cultivo, el efecto del nitrógeno, fósforo, minerales y la
temperatura, entre otros. Además se ha propuesto el uso de diferentes fotobiorreactores
para reducir el estrés hidrodinámico, así como diferentes procesos posteriores de
separación y purificación de la astaxantina. En el presente capitulo se hará una revisión
de la literatura científica relacionada con el potencial de Haematococcus pluvialis para la
producción industrial de astaxantina.
Palabras claves: Haematococcus pluvialis, fotobiorreactores, astaxantina, estrés
hidrodinámico.
Abstract Astaxanthin is a lipid-soluble, reddish carotenoid pigment with a potent antioxidant
activity. It is used as food supplement for both animal feed to impart coloration and human
food as antioxidant. The commercial interest in Haematococcus pluvialis lies on its ability
Capítulo 1 Una revisión de la microalga Haematococcus pluvialis como fuente
de Astaxantina natural.
3
to accumulate high levels of natural astaxanthin compared to other sources. The high
production cost compared to synthetic astaxanthin is the main problem for industrial
scaling-up. In an attempt to solve this problem, research has been focused to optimize
some of the most important process variables for microalga growth and carotenoid
accumulation, including irradiance, culture media, nitrogen, phosphorus, minerals and
temperature, among others. It also has been proposed the use of different
photobioreactors for hydrodynamic stress reduction as well as different separation and
purification processes. This chapter reviews scientific reports related to the potential of
Haematococcus pluvialis for industrial production of natural astaxanthin.
Keywords: Haematococcus pluvialis, photobioreactors, astaxanthin, hydrodynamic
stress.
1.1 Introducción
Las microalgas son microrganismos fotosintéticos con enorme potencial en la producción
de biodiesel, el tratamiento de aguas residuales y la producción de proteína para la
alimentación animal y humana, entre otros. Estos microorganismos, presentan como
característica especial la capacidad de acumular metabolitos de interés biotecnológico
como los ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga y los carotenoides (Cardozo et
al., 2007).
El carotenoide de mayor importancia a nivel industrial es el -caroteno, el cual es
producido utilizando la microalga marina unicelular Dunaliella salina (Prieto et al., 2011).
Desde entonces, se han desarrollado diversas investigaciones en torno a carotenoides
derivados del -caroteno, que presentan mejores propiedades antioxidantes como la
astaxantina. Por ejemplo (O’Connor & O’Brien, 1998) muestran en su investigación que
se requiere utilizar una cantidad menor de astaxantina (0,01 mM) frente a la utilización de
caroteno (1 mM) o luteína (1mM), para reducir el estrés oxidativo, sometiendo ratas a
exposición de luz UVA por 4 horas.
4 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
La astaxantina es un carotenoide rojo liposoluble de gran capacidad antioxidante, es
ampliamente utilizado en la acuicultura como aditivo para la pigmentación de salmón,
trucha, camarón, algunos peces ornamentales y muchos crustáceos (Lorenz & Cysewski,
2000). Además, las industrias farmacéutica y cosmética han realizado estudios, que
detacan su elevada actividad antioxidante, excelentes propiedades como agente
fotoprotector (luz UV), propiedades para la salud ocular, de la piel, del corazón y a nivel
celular y otros usos potenciales como anti-inflamatorio, anti-cancerígeno, desintoxicante,
en enfermedades neurodegenerativas y en la respuesta inmune (Guerin et al., 2003).
Las industrias anteriormente mencionadas han encontrado numerosas ventajas en la
utilización de astaxantina natural frente a la sintética en sus aplicaciones, lo que ha
generado un aumento en la demanda de este producto natural e impulsado el uso de
microorganismos capaces de sintetizar astaxantina (Lorenz & Cysewski, 2000)Por este
motivo, es necesario realizar diferentes investigaciones encaminadas a mejorar la
producción del pigmento aprovechando cepas nativas de microalgas que permita
incrementar la rentabilidad del proceso
La microalga Haematococcus pluvialis es uno de los mejores productores del carotenoide
rojo astaxantina, ya que tiene la capacidad de acumular más del 3% en peso seco de
pigmento (Hagen et al., 2001); sin embargo, esta microalga puede presentar baja
productividad de astaxantina dificultando su uso comercial, si no se optimizan las
condiciones de cultivo, debido a factores como un lento crecimiento, baja concentración
celular y alta susceptibilidad a daños hidrodinámicos. El presente documento hace una
revisión sobre el potencial que tiene la microalga Haematococcus pluvialis para la
producción de astaxantina, abarcando temas como las condiciones de cultivo, métodos
de estrés celular, cultivo en fotobiorreactores y diferentes métodos de extracción.
1.2 Astaxantina
La astaxantina (3,3'–dihidroxi–4,4'–diceto– –caroteno) se distingue por tener una
cadena poliénica de once dobles enlaces conjugados, responsables del intenso color rojo
brillante del cromóforo. Presenta un anillo cíclico en cada extremo de la molécula, un
Capítulo 1 Una revisión de la microalga Haematococcus pluvialis como fuente
de Astaxantina natural.
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grupo funcional hidroxílico en cada uno de los carbones 4 y 4' (Figura 1-1). La existencia
de dichos radicales oxigenados en los extremos lo caracteriza entre los carotenoides
como un oxicarotenoide o xantofila (Sánchez & Flores, 1999).
Figura 1-1: Estructura molecular de la Astaxantina (Sánchez & Flores, 1999)
1.2.1 Aplicaciones Los pigmentos carotenoides son de gran importancia para diferentes sectores, entre los
que se destacan la acuicultura, la ornitología y la industria farmacéutica, desempeñando
funciones vitales en la fisiología y la salud de diferentes especies biológicas. En la Tabla
1-1 se muestra un resumen de las principales aplicaciones de la astaxantina.
Tabla 1-1: Principales aplicaciones de la astaxantina
Sector Aplicación Función Fuente
Acuicultura
Salmón y Trucha Pigmentación (Domínguez et al., 2005; Lawlor & O'Brien, 1995; Lorenz & Cysewski, 2000)
Etapas del crecimiento Peces Marinos- Besugo
Pigmentación
Peces ornamentales
Pigmentación
Cultivos de camarón
Pigmentación
Ornitología Gallinas Color yema de los
huevos (Inborr, 1998)
Pollos Pigmentación
Farmacéutica
Radicales libres Antioxidante (Barros et al., 2001; Guerin et al., 2003; Kamath et al., 2008; Mortensen et al., 1997; Naguib, 2000; Pashkow et al., 2008)
Peroxidación Antioxidante Salud humana Anti-cancerígeno Piel, ADN y retinas Foto-protector
6 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
1.2.2 Fuentes
Sintética
Actualmente las más importantes empresas que producen y comercializan la astaxantina
sintética son DSM (DSM Carophyll ® Pink 10% CWS) (Mayer & Muller, 1981) y BASF
The Chemical Company (BASF Lucantin® Pink) (Wolfgang et al., 1997).
Mayer & Muller (1981) describen un proceso de producción patentado para la producción
de astaxantina a partir de compuestos como 3-acetoxi-4-oxo- -ionona o 3-hidroxi-4-oxo-
-ionona, los cuales son disueltos en solventes derivados del petróleo (tetrahidrofurano,
etilenglicol, metanol, etc.) y enfriados a temperaturas que van desde -5 ºC hasta – 75 ºC,
terminando con un proceso de extracción y cristalización utilizando éter y hexano.
Wolfgang et al. (1997) en su invención muestran un proceso de producción de
astaxantina a partir de la reacción de una sal de trifenilfosfonium con un dialdehido de 10
carbonos. La reacción se da en etanol o metanol a una temperatura entre 40 ºC hasta 60
ºC, finalizando con la adición de agua para la precipitación de la astaxantina.
Natural
En la naturaleza, la astaxantina es producida por el plancton y algunos tipos de algas, los
cuales son ingeridos por diversas especies acuáticas, incluyendo a los crustáceos, entre
los que se encuentran los langostinos, que almacenan el pigmento en su cubierta, dando
lugar a su color rojizo externo. A su vez, los crustáceos son ingeridos por los peces
(como el salmón o la trucha) o por las aves (flamingos, ibis rojo) (Cohen, 1999).
Industrialmente solo se han utilizado algunos crustáceos, algas y levaduras para la
producción de este carotenoide. Los crustáceos se han utilizado para la pigmentación de
salmón, pero no solo contienen una baja concentración de astaxantina, sino que además
contiene una alto nivel de cenizas, quitina y humedad lo que ocasiona problemas
técnicos en la formulación de las dietas (Domínguez, 2003).
Capítulo 1 Una revisión de la microalga Haematococcus pluvialis como fuente
de Astaxantina natural.
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Phaffia rhodozyma es una levadura que gracias a su capacidad de sintetizar astaxantina,
ha sido considerada como un desarrollo comercial interesante para la industria de los
carotenos. Esta levadura puede crecer en fermentadores con una alta densidad celular (>
50 g/L). La principal limitación que presenta P. rhodozyma es la pequeña acumulación de
astaxantina que se encuentra en su pared celular, por lo cual la industria está utilizando
células genéticamente modificadas capaces de producir mas de 10 mg/g de astaxantina
(Fang & Wang, 2002; Johnson, 2003).
Si se analiza la productividad del pigmento se ha observado para H. pluvialis valores
entre 290 g g-1 día-1 y 471 g g-1 día-1 y para P. rhodozyma valores entre 170 g g-1 día-1
y 370 g g-1 día-1, dependiendo de las condiciones de crecimiento, mostrando una
ventaja comercial de la microalga sobre la levadura (Domínguez-Bocanegra et al., 2007).
1.3 Haematococcus pluvialis Haematococcus pluvialis es alga unicelular de agua dulce, con un tamaño celular entre 8
y 50 m, que se caracteriza por presentar dos flagelos con los que se desplaza.
Usualmente se encuentra en las regiones templadas alrededor del mundo, con una
coloración rojiza, debido a la producción de astaxantina como medio de protección frente
a los rayos ultravioletas provenientes del sol, pero sus esporas pueden volver al estado
vegetativo verde de la célula después de un tiempo de inactividad en condiciones
favorables para el crecimiento (Dore & Cysewski, 2003).
H. pluvialis se puede encontrar en diferentes estados o fases de crecimiento a durante su
ciclo de vida; en la primera forma, donde se da el crecimiento, la célula es verde,
presenta flagelos denominándose célula vegetativa; una forma sin flagelos y verde se
denomina palmella, y otra forma roja, en donde se da la acumulación de astaxantina, se
denomina aplanóspora (Figura 1-2), En esta última fase se produce la acumulación de
astaxantina en grandes cantidades, adquiriendo una coloración rojiza (Domínguez et al.,
2006; Kobayashi et al., 1997). Los cambios de fase en el crecimiento de H. pluvialis están
caracterizados por la pérdida de los flagelos y la formación de una matriz extracelular
gelatinosa, siendo más grande y resistente la célula como aplanóspora (Hagen et al.,
2002).
8 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Figura 1-2: Fases de crecimiento de Haematococcus pluvialis (Hagen et al., 2002)
A. Célula vegetativa. B. Palmella. C. Aplanóspora.
1.3.1 Ruta de síntesis de Astaxantina La fracción de carotenos en las células vegetativas está compuesta principalmente por
luteína (75-80%) y -caroteno (10-20%). Una vez la célula es estresada y llega a la fase
aplanóspora su composición se transforma prácticamente en el caroteno astaxantina
(Lorenz, 1999). El - caroteno es convertido en astaxantina por la adición de grupos
carbonilos en la posición 4 y 4’, y grupos hidroxil en la posición 3 y 3’. Estas reacciones
son catalizadas por -caroteno cetolasa (4,4’- oxigenasa; CRTW, BKT o CRTO) y -
caroteno hidroxilasa (3,3’- oxigenasa; BCH o CRTZ), respectivamente. La presencia de
echinenona y cantaxantina en los microorganismos muestra que es prioritaria la
formación de los grupos carbonilos frente a la hidroxilación. La formación de estos grupos
es catalizada por -caroteno cetolasa (BKT) con el intermediario mono cetocarotenoide
(echinenona), mientras que la formación de grupos hidroxílicos esta catalizada por una
hidrolasa para formar la astaxantina (Figura 1-3) (Zhu et al., 2009).
Capítulo 1 Una revisión de la microalga Haematococcus pluvialis como fuente
de Astaxantina natural.
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Figura 1-3: Ruta de síntesis de astaxantina en la microalga Haematococcus pluvialis (Zhu et al., 2009)
10 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
1.4 Condiciones de crecimiento
1.4.1 Medios de cultivo Se han reportado diferentes medios de cultivo para el crecimiento autotrófico de H.
pluvialis entre los que se destacan los medios OHM (Fábregas et al., 2001), F1
(Issarapayup et al., 2009) y Basal (Vega-Estrada et al., 2005) por su alta productividad.
Kaewpintong et al. (2007) han realizado diversos estudios, en los que se hace una
comparación entre los medios F1 y Basal, con otros medios utilizados en la literatura por
diferentes autores como los medios M1, M6, Hong Kong, BG-11 y una mezcla de
Basal:BG-11 (1:1) (la composición de cada uno de estos medios se muestra en el Anexo
A); estos autores han encontrado una alta dependencia del crecimiento de H. pluvialis
con relación al medio de cultivo utilizado, reportando un bajo crecimiento en los medios
M1 y M6, y una alta densidad celular en el medio F1. El medio de cultivo Hong-Kong
muestra resultados muy similares a los medios de cultivo BG11 y Basal:BG11 (Tabla
1-2).
Densidad celular máxima Cel/mL Medio de Cultivo (Kaewpintong
et al., 2007) (Fábregas et
al., 2001) (Tripathi et al.,
2002) (Issarapayup et al., 2009)
M1 0,5 x 104 Basal 0,9 x 104 1,5 × 105 F1 5,5 x 104 1,8 × 105 BG-11 3,5 x 104 Hong Kong 3,1 x 104 M6 0,5 x 104 Basal:BG-11 3,3 x 104 OHM 6,25 x 105 Z8 0.8 × 105
Velocidad especifica de crecimiento máxima d-1 Medio de Cultivo (Kaewpintong
et al, 2007). (Fábregas et
al 2001) (Tripathi et al,
1999). (Issarapayup et al, 2009).
M1 0,010 Basal 0,032 --- F1 0,200 0,225 BG-11 0,130 Hong Kong 0,110 M6 0,010 Basal:BG-11 0,125 OHM 0,130 Z8 ---
Tabla 1-2: Densidad celular y velocidad específica de crecimiento para diferentes
medios de cultivo autotróficos
Capítulo 1 Una revisión de la microalga Haematococcus pluvialis como fuente
de Astaxantina natural.
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Fábregas et al. (2001) han reportado una alta densidad celular con un medio de cultivo
óptimo para el crecimiento de Haematococcus pluvialis (OHM), de 6,25 x 105 cel/mL. Por
otro lado Tripathi et al. (1999), desarrollan un estudio con los medios de cultivo Basal y
Z8, encontrando una mayor densidad celular en el medio basal. Issarapayup también
realiza un estudio con el medio F1, encontrando una alta velocidad específica de
crecimiento (Issarapayup et al., 2009) (Tabla 1-2). Todos los autores utilizaron
condiciones de cultivo diferentes, en algunos casos en biorreactores y en otros los
medios de cultivo son optimizados para una cepa específica, lo que dificulta encontrar
una correlación entre los medios de cultivo y el crecimiento de la microalga.
1.4.2 Iluminancia, CO2, temperatura y sales en el medio de cultivo
La intensidad lumínica es uno de los factores más importantes tanto en el crecimiento de
la célula como en la acumulación de astaxantina. Se ha encontrado que se pueden
obtener gran cantidad de biomasa y una alta tasa de supervivencia de las células de
Haematococcus al usar bajas intensidades de luz (< 37 mol/m2s) (Cohen, 1999). Harker
y colaboradores, han encontrado altas tasas de crecimiento cuando se usa una
intensidad de luz de 2 y de 37 mol/m2s, e inhibición del crecimiento a 89 mol/m2s
(Harker et al., 1996); al igual que Harker, Katsuda et al. (2004) muestran un alta densidad
celular al usar 8 mol/m2s para diferentes fuentes de luz (LEDs y lámparas
fluorescentes).
Por otro lado Choi et al. (2003) han encontrado un 15% más de crecimiento a 90
mol/m2s comparado con la exposición a 40 y 140 mol/m2s. Zhang et al. (2009)
muestran velocidades de crecimiento incluso por encima de los 100 mol/m2s, en ambos
casos se hace un aumento progresivo de la intensidad lumínica, obteniendo crecimiento
celular y acumulación de astaxantina en el mismo proceso. Estos resultados demuestran
que la intensidad de luz está directamente relacionada con la cepa, mostrando en
algunas investigaciones inhibición de crecimiento y en otras altas velocidades de
crecimiento a elevadas intensidades de luz con diferentes fuentes de irradiación.
12 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Cuando H. pluvialis es cultivada en medios con limitaciones de nitrógeno, el crecimiento
del alga se ve restringido y la síntesis de astaxantina es estimulada. Se tienen efectos
similares cuando el alga es sometida a altas concentraciones de hierro, bajas
concentraciones de fosfatos y a medios salinos. Harker et al. (1996), han observado que
se obtiene el máximo crecimiento de la microalga cuando ésta es sometida a una
concentración de inicial en el medio de cultivo de nitrógeno (NaNO3) de 3 mM, de fosfato
(K2HPO4 y KH2PO4) de 3,4 mM y 18 M de hierro (FeSO4.7H20), mientras que se obtiene
la máxima acumulación de astaxantina en ausencia total de nitrógeno, una concentración
de fosfato de 0,85 mM y 72 M de hierro.
García-Malea et al. (2005), evalúan la producción de células vegetativas de H. pluvialis
determinando el efecto de la irradiación y la deficiencia de nutrientes en cultivos
discontinuos. Los cultivos no fueron fotoinhibidos hasta una irradiación máxima de 2500
mol/m2s, y se observó una velocidad específica de crecimiento de 0,57 d-1 con una
concentración de nitrógeno en el medio de 10 mM de nitrato. Solo se observó
acumulación de astaxantina cuando la deficiencia de nitrógeno llegó a 0,2 mM.
Sarada et al. (2002b) encontraron que concentraciones por encima del 1% w/v de NaCl
son letales para el crecimiento de la microalga, mientras que una concentración de 0,5%
favorece la acumulación de astaxantina. En el mismo estudio se muestra la máxima
densidad celular a un pH de 7, mientras que no se observa crecimiento a pH de 5 y muy
baja densidad celular a pH de 9.
Kaewpintong et al. (2007) evalúan la concentración de CO2, como fuente de carbono
encontrando que al aplicar una concentración del 1% en volumen en el aire se optimiza el
crecimiento de H. pluvialis. Algunos autores como Jeon et al. (2006) y Hata et al. (2001),
proponen el uso de medios de cultivo heterótrofos, utilizando acetato de sodio como
fuente de carbono; mostrando que la concentración óptima para el crecimiento de la
microalga es de 38 mM y 30 mM de acetato respectivamente, e inhibición del crecimiento
a altas concentraciones (>50 mM).
Capítulo 1 Una revisión de la microalga Haematococcus pluvialis como fuente
de Astaxantina natural.
13
1.4.3 Factores hidrodinámicos y de diseño Las condiciones de cultivo no son el único factor determinante en el diseño de este tipo
procesos; otros autores proponen el estudio de los efectos hidrodinámicos, evaluando los
efectos del flujo de aire en el daño celular. La velocidad superficial del gas en el dispersor
y en la entrada de un fotobioreactor tipo airlift de pared plana, sobre el crecimiento de H.
pluvialis fue evaluado por Vega y colaboradores (Vega-Estrada et al., 2005), encontrando
que los daños celulares por efectos hidrodinámicos son reducidos cuando el biorreactor
es operado con una velocidad superficial y de entrada de 12 mm/s y 22,8 m/s
respectivamente. Los autores calcularon el coeficiente volumétrico de transferencia de
masa para el fotobiorreactor, y encontraron que es de 10 h-1 y 32 h-1 para una velocidad
superficial de 6 y 24 mm/s respectivamente.
Kaewpintong et al. (2007) muestran que la aireación es un parámetro crucial en el
crecimiento apropiado de H. pluvialis en los bioreactores airlift, pero es preferible la
utilización de bajos niveles de aireación para reducir el estrés hidrodinámico. La
velocidad superficial del aire que mostró mejores resultados fue 0,4 cm/s y el menor
diámetro del dispersor tiene una influencia positiva en el crecimiento de la célula. Las
condiciones que presentaron el mejor crecimiento fueron el 1% de CO2 y 20 mol/m2s,
respectivamente.
Harker et al. (1996) estudiaron la producción de astaxantina en Haematococcus pluvialis
en un reactor airlift de 30 L. Los autores desarrollaron el cultivo en dos etapas en
discontinuo, en donde la primera fase se cultiva con las condiciones constantes de luz,
nitrógeno y fosfato, que proporcionan el máximo crecimiento celular, y en la segunda
fase, se toman las células en estado estacionario y se adiciona NaCl para generar estrés
y acumular astaxantina, produciendo el 2,7 % en peso de este carotenoide con mas del
95% de la astaxantina esterificada.
Otros autores han investigado el efecto del crecimiento de H. pluvialis en diferentes
biorreactores, García-Malea López et al. (2006) compararon un fotobioreactor tubular con
una columna de burbujeo, encontrando una mayor concentración de biomasa y mayor
productividad global de biomasa en los fermentadores tubulares (7,0 g/L y 0,41 g/l día
14 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
respectivamente), que los encontrados en la columna de burbujeo (1,4 g/L y 0,06 g/Ldía).
Además la acumulación de astaxantina solo fue observada en los fotobioreactores
tubulares cuando la deficiencia de nitrógeno estaba por debajo de los 5,0 mM. De igual
manera Ranjbar et al. (2008a) encontraron mayor rendimiento al utilizar un fotobioreactor
tipo airlift comparado con una columna de burbujeo, alcanzando 4,8 g/L y 4,4 g/L de
biomasa respectivamente.
Además se ha intentado que el crecimiento de las células vegetativas vaya acompañado
de la acumulación de astaxantina, utilizando un único birreactor, por ejemplo Suh et al.
(2006) diseñan un fotobioreactor con dos regiones, en la que la región exterior recibe la
intensidad de luz de forma directa y una superficie interior absorbe solo la luz restante de
la primera región. De esta manera se optimiza la irradiación y se permite que los cultivos
por lotes (exterior e interior) del reactor presenten crecimiento y acumulación de
astaxantina simultáneamente, obteniendo una concentración celular de 4,0 x 105 Cel /mL
en el interior y 5,79% en peso seco de astaxantina.
1.5 Métodos de separación y purificación La astaxantina es insoluble en soluciones acuosas, pero soluble en diclorometano (30
g/L), en cloroformo (10 g/L), acetona (0.2 g/L), dimetilsulfóxido (0.5 g/L) y otros solventes
polares. Es sensible a la luz, a la temperatura, a los ácidos, al oxígeno, a la presencia de
álcalis y en condiciones de saponificación sufre una conversión a astaceno (Meléndez-
Martínez et al., 2007). Las operaciones de separación por extracción con solventes
orgánicos no pueden emplearse ya que los residuos no son permitidos en aplicaciones
alimenticias.
El método propuesto para la separación de la astaxantina en la mayoría de las
investigaciones es la separación por fluidos supercríticos utilizando dióxido de carbono,
ya que es una metodología ampliamente utilizada con elevados rendimientos de
extracción de cafeína, metabolitos de diferentes plantas algas y microalgas (Herrero et
al., 2006; Moreno et al., 2007; Mustafa & Turner, 2011; Ordóñez et al., 2006; Reverchon
& De Marco, 2006), pero su aplicación puede ser costosa a nivel industrial siendo
rentable solo para productos de alto valor agregado.
Capítulo 1 Una revisión de la microalga Haematococcus pluvialis como fuente
de Astaxantina natural.
15
Krichnavaruk et al. (2008) proponen la extracción con dióxido de carbono supercrítico,
evaluando los aceites de soya y de oliva como co-solventes, con un flujo constante de
3mL/min de CO2 a 70 ºC y 40 MPa. La utilización de 10% de aceite de soya incrementa
la eficiencia de separación a 36,6%, mejorando en un 30% la eficiencia, comparada con
el uso de CO2 sin co-solvente; similarmente, el uso de 10% de aceite de oliva incrementa
la eficiencia a un 51,03%.
Los resultados de Valderrama et al. (2003) para la extracción de astaxantina con fluidos
supercríticos muestran que el rompimiento de la pared celular tiene un efecto importante
en la eficiencia de separación y la adición de etanol como co-solvente tiene un efecto
poco significativo, alcanzando un rendimiento en la extracción del 1,7 % en masa.
Lim et al. (2002) realizan una investigación sobre la extracción de astaxantina en la
levadura Phaffia rhodozyma mediante la extracción por fluidos supercríticos, mediante el
rompimiento de la pared celular y el secado de las células, evaluando los efectos de la
presión (100-500 bar), la temperatura (40-80 °C), velocidad superficial de CO2 (0,27-0,54
cm/min) y el uso de etanol como co-solvente (1-15%) determinando que la eficiencia de
separación fue del 90% a 40 °C y 500 bar. Sun & Temelli (2006) encontraron que el
rendimiento de la separación de carotenoides en la zanahoria se duplica mediante la
utilización de aceite de canola como co-solvente frente al uso de CO2 puro.
1.6 Fotobiorreactores
1.6.1 Sistemas abiertos Aunque la gran mayoría de los cultivos industriales en el mundo están enfocados a el uso
de fotobioreactores cerrados, gran cantidad de sistemas están usando fotobioreactores
abiertos gracias a su gran economía; los sistemas cerrados son muy costosos y la
mayoría de ellos son muy difíciles de escalar (Tabla 1-3). Entre los sistemas más
utilizados para estos cultivos se encuentran los grandes estanques de poca profundidad,
tanques, estanques rectangulares y estanques tipo raceway.
16 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
El principal problema con este tipo de sistemas es la baja productividad comparada con
la esperada teóricamente, además de una alta dificultad para controlar las condiciones
del cultivo. Los estanques profundos se deben diseñar para asegurar una adecuada
iluminación en las células y la necesidad de mantener un nivel adecuado de agua para
mezclar y evitar los cambios de composición en el medio por evaporación. La
profundidad recomendada para los estanques tipo raceway está comprendida entre 20 y
30 cm, y un área de cultivo muy grande (250 ha). En este tipo de sistemas los
rendimientos que se obtienen gracias a estas dificultades están entre 0,1 y 0,5 g/L
(Borowitzka, 1999)
1.6.2 Sistemas cerrados A pesar del éxito de los sistemas abiertos, los futuros avances para el cultivo en masa de
las microalgas van a requerir del uso de sistemas cerrados, para evitar el crecimiento de
contaminantes como metales pesados y otros microorganismos, sin embargo los altos
costos no han permitido su utilización. Las algas pueden ser cultivadas en sistemas
fotoautotróficos, mixotróficos o heterotróficos. Los cultivos heterotróficos usan como
fuente de carbono acetatos o glucosa, pero los costos de producción son muy altos y los
productos no tienen las mismas características que los cultivos fotoautotróficos. A pesar
de estos inconvenientes, estos cultivos pueden alcanzar una densidad celular de 20 a
100 g/L (Borowitzka, 1999).
Los reactores cerrados presentan grandes ventajas, como una mayor esterilidad del
cultivo, una alta eficiencia en la utilización de la luz, control de temperatura, y la
posibilidad de utilizar la luz del día. Lo que significa que diferentes especies pueden ser
cultivadas libres de contaminantes, el reactor pueden ser operado a diferentes
condiciones climáticas y la facilidad para controlar las condiciones de cultico dan un
producto final de mejor calidad y composición. Esto resulta una mayor producción celular
y una menor utilización de la tierra, pero se deben hacer estudios para reducir el costo de
fabricación de estos reactores para hacerlos económicamente competitivos (Borowitzka,
1999).
Capítulo 1 Una revisión de la microalga Haematococcus pluvialis como fuente
de Astaxantina natural.
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Comercialmente se tiene una serie de fotobioreactores cerrados, entre los que se
encuentra los fotobioreactores de pared plana, los fotobioreactores tubulares, de columna
vertical y con iluminación interna (Ugwu et al., 2008). Diferentes autores han demostrado
la factibilidad económica en la utilización de fotoboreactores para el cultivo de microalgas
como Chlorococum littorale y Chaetoceros calcitrans (Krichnavaruk et al., 2005;
Krichnavaruk et al., 2007; Sato et al., 2006), así como para el cultivo de Haematococcus
pluvialis, con productividades de 0,06 g L -1 día-1 en una columna de 55 L (García-Malea
López et al., 2006) y 0,052 g L -1 día-1 en un reactor exterior de 25000 L (Olaizola, 2000).
Así mismo García-Malea et al. (2006) logran aumentar la productividad de biomasa a
0,68 g L -1 día-1 utilizando un reactor tubular externo operado en forma continua y
Boussiba (2000) una productividad de 0,6-0,7 g L -1 día-1 utilizando un panel alveolar
vertical.
Tipo de reactor Mezclado Utilización
de la Luz Control de
temperatura Transferencia
del gas estrés
hidrodinámico control
de especies
esterilidad Escalado
Estanques muy pobre pobre ninguno pobre muy bajo difícil ninguna muy difícil
Tanques pobre muy pobre ninguno pobre muy bajo difícil ninguna muy difícil
Estanques circulares razonable Aceptable ninguno pobre Bajo difícil ninguna muy difícil
estanques raceway Aceptable Aceptable ninguno pobre Bajo difícil ninguna muy difícil
Tanque de mezclado
la mayor parte
uniforme Aceptable Excelente medio Alto fácil fácil difícil
reactores airlift Uniforme bueno Excelente alto Bajo fácil fácil difícil
Reactores planos Uniforme excelente Excelente alto Medio fácil factible difícil
Reactores tubulares
(tipo serpentín)
Uniforme excelente Excelente medio Medio fácil factible fácil
Tabla 1-3: Comparación de las propiedades de diferentes sistemas para el cultivo de
microalgas a gran escala (Borowitzka, 1999).
18 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
1.7 Mercado de Haematococcus pluvialis El mayor consumo de astaxantina en la actualidad es como fuente de pigmentación en
acuicultura, especialmente en salmón y trucha. La astaxantina es comercializada con un
costo de US$2000 a US$2500/Kg, con un mercado mundial anual estimado de US$200
millones. Sin embargo, el 95% de este mercado consume astaxantina sintética
desplazando la producción de astaxantina natural (Li et al., 2011; Lorenz & Cysewski,
2000).
Actualmente la astaxantina natural no es competitiva comercialmente, ya que se requiere
alcanzar un costo de producción de biomasa y de separación y purificación de la
astaxantina menor a US$30/Kg de biomasa (considerando un 3% de acumulación de
astaxantina en Haematococcus) para competir con los costos de producción de
astaxantina sintética que son de US$1000/Kg de astaxantina. Bajo estas condiciones, la
astaxantina natural solo será rentable como complemento alimenticio, si la tecnología de
producción es optimizada, o si los consumidores de salmón y trucha son concientes de
los beneficios de usar productos naturales y están dispuestos a pagar un valor más alto
por este tipo de productos, tal como sucedió en los mercados de la vitamina E y el -
caroteno (Olaizola, 2003).
Desde 1990 se estableció la gran capacidad antioxidante de la astaxantina, lo que abre
una oportunidad en el mercado de los productos nutracéuticos para consumo humanos.
El precio en el mercado de la astaxantina grado nutracéutico es de US$100000/Kg, el
cual justifica los altos costos de producción de astaxantina natural. Actualmente este
mercado es de unos pocos millones de dólares al año, pero ha tenido un rápido
crecimiento (Olaizola, 2003).
Li et al. (2011) muestran en su investigación que un proyecto de producción de
astaxantina natural tiene rentabilidad frente a la astaxantina sintética, ya que los costos
de producción de biomasa y astaxantina pueden llegar a ser de US$22/kg y US$882/kg
respectivamente, mientras que la producción sintética se estima en un valor de
US$1000/Kg y para otras industrias con producción natural en un valor de US$3000/Kg.
Estos bajos costos de producción son posibles dado que se estima una elevada
Capítulo 1 Una revisión de la microalga Haematococcus pluvialis como fuente
de Astaxantina natural.
19
velocidad de crecimiento, la utilización de fotobiorreactores tipo raceway abiertos y bajos
costos salariales, ubicando la planta en China.
1.7.1 Producción de astaxantina a nivel industrial
Actualmente diferentes empresas tienen producción de astaxantina a partir de H. pluvialis
a nivel industrial, entre ellas se destaca Cyanotech y Parry Nutraceuticals por la
utilización de tanques de agua a cielo abierto. Otras empresas como Mera
Pharmaceuticals prefieren el uso de fotobioreactores tubulares interiores para la
producción de células verdes y exteriores para el estrés de las microalgas. De igual
manera la empresa Algatech, aprovechando las fuertes intensidades de luz solar que se
producen en el desierto de Israel para inducir la síntesis del pigmento. Recientemente,
Yamaha Motor inició la producción de astaxantina de Haematococcus pluvialis utilizando
un sistema interior cerrado con fotobioreactores planos, aprovechando los gases
producidos por sus fábricas como fuente de CO2 reduciendo así también sus emisiones a
la atmósfera y obteniendo un producto de alto valor. Toda la biomasa algal producida es
destinada prácticamente al consumo humano como suplemento dietético o producto
cosmético (Tabla 1-4) (Domínguez et al., 2006).
20 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Empresa Ubicación Tipo de
fotobiorreactor Sistema Aplicación Producto
Cyanotech 1997-Presente
Kailua Kong Hawái Tanques Abierto-
Exterior
Acuicultura Consumo
humano Ind. cosmética
NatuRose ® BioAstin ®
Parry Nutraceuticals 2003-Presente
Conaiyur India Tanque Abiertos-
Exterior
Consumo humano
Ind. cosmética
Parry’s natural Astaxanthin Astanatural Zanthin
Mera Pharmaceuticals
2003-Presente
Kailua Kong Hawái,
fotobioreactores tubulares
Cerrados- Artificial-Exterior
Consumo humano
Ind. cosmética Astafactor
Alga technologies
LTDA 1998-Presente
Kibbutz Ketura Israel
fotobioreactores tubulares
Cerrados- Exterior
Consumo humano
Ind. cosmética Astapure
Fuji 1997-2011
Mawi Hawái Tanques de
mezclado Cerrado- Exterior
Consumo humano
Ind. cosmética Astaxin Astareal BioReal
(Swedden) 1994-Presente
Sweden Suecia
Yamaha Motor 2006-2010 Japón fotobioreactores
planos Cerrado- Artificial
Consumo humano
Ind. cosmética Astivo Puresta
Tabla 1-4: Información industrial de producción de astaxantina natural (Domínguez et
al. (2006); Rosenberg et al. (2008)).
2. Efecto de las condiciones de cultivo en el crecimiento y acumulación de astaxantina en una cepa nativa de Haematococcus pluvialis
Resumen Se estudió el efecto de cinco medios de cultivo (BBM, BG11, OHM, F1 BBM:BG11 (1:1))
en el crecimiento de una cepa nativa de la microalga Haematococcus pluvialis,
encontrándose que no existe diferencia significativa entre los medios evaluados (α = 5%),
mostrando velocidades de crecimiento de 0,463 - 0,536 días-1, con una densidad celular
máxima de 4,02 - 4,16 x 105 cel/mL. Al someter células en fase estacionaria a estrés
salino, se encontró que una concentración de NaCl superior al 0,025 % es letal para la
microalga y no genera acumulación de astaxantina, mientras que células en fase
estacionaria sometidas a irradiaciones inferiores a 55500 Lux no fueron inhibidas,
logrando una acumulación de 32,99 g/mL y una productividad de 1,434 mg L-1día-1 de
astaxantina. Por último se concentró primero las células en fase estacionaria y luego se
sometieron a estrés por irradiación, consiguiendo una acumulación 59,23 g/mL y una
productividad de 3,484 mg L-1día-1 de astaxantina, mostrando gran potencial para la
producción industrial de astaxantina a partir de esta microalga nativa.
Palabras claves: Haematococcus pluvialis, astaxantina, medios de cultivo, irradiación,
salinidad.
Abstract The five culture media effect in the native microalgae Haematococcus pluvialis was
studied finding no significant differences between evaluated media (α = 5%), showing
growing rates of 0,463 - 0,536 days-1 with a maximum cellular density of 4,02 - 4,16 x 105
22 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
cel/ml. When stationary phase cells are stressed, a more than 0,025 % salt concentration
is lethal for the microalgae and does not produce astaxanthin accumulation, while the
cells under less than 55500 Lux irradiation were not inhibited, achieving a 32,99 g/mL
accumulation and a 1,434 mg L-1day-1 production. Finally, to concentrate the stationary
cells first and later to stress them by irradiation is suggested, to get a 59,23 g/mL
accumulation and a 3,484 mg L-1day-1 astaxanthin production, showing a big potential for
the industrial astaxanthin production from this native microalgae.
Keywords: Haematococcus pluvialis, astaxanthin, culture media, irradiation, salinity.
2.1 Introducción En la búsqueda de metabolitos de alto valor industrial, se han destacado las microalgas
por su alta aplicabilidad, ya que son útiles en la producción de biodiesel, el tratamiento de
aguas residuales y la producción de proteína para la alimentación animal y humana,
entre otras. Además, estos microrganismos, presentan como característica especial la
capacidad de acumular metabolitos de interés biotecnológico como los ácidos grasos
poli-insaturados de cadena larga y los carotenoides (Cardozo et al., 2007).
La microalga Haematococcus pluvialis es uno de los mejores productores naturales del
carotenoide rojo astaxantina, ya que tiene la capacidad de acumular más del 3% en peso
seco del pigmento (Hagen et al., 2001); sin embargo, esta microalga puede presentar
baja productividad de astaxantina dificultando su uso comercial, si no se optimizan las
condiciones de cultivo, debido a factores como un lento crecimiento, baja concentración
celular y alta susceptibilidad a daños hidrodinámicos.
La astaxantina es ampliamente utilizada en la acuicultura como aditivo para la
pigmentación de salmón, trucha, camarón, algunos peces ornamentales y muchos
crustáceos (Lorenz & Cysewski, 2000). Además, la industria farmacéutica y la industria
cosmética han realizado avances importantes en sus estudios, los cuales han mostrado
su elevada actividad antioxidante, excelentes propiedades como agente fotoprotector (luz
UV), propiedades para la salud ocular, de la piel, del corazón y a nivel celular y otros
Capítulo 2 Efecto de las condiciones de cultivo en el crecimiento y acumulación de astaxantina en una cepa nativa de Haematococcus pluvialis
23
usos potenciales como anti-inflamatorio, anti-cancerígeno, desintoxicante, en
enfermedades neurodegenerativas y en la respuesta inmune (Guerin et al., 2003).
La producción de este metabolito secundario está fuertemente relacionada con los
cambios morfológicos producidos en la microalga desde un estado vegetativo verde en el
que se da el crecimiento, hasta un estado rojo de alta acumulación de astaxantina. Estos
cambios son inducidos por diversos factores como la deficiencia de nutrientes (nitrato,
fosfato, sulfato), la intensidad lumínica, la salinidad del medio y las altas temperaturas,
entre otros (Tripathi et al., 2002).
El objetivo del presente capitulo fue la evaluación de cinco medios de cultivo para el
crecimiento de Haematococcus pluvialis, así como el efecto de la irradiación y la alta
concentración de NaCl en la producción de astaxantina en la célula. Además se
muestran los resultados de la aplicación de un método innovador, utilizando la
deshidratación de la célula y posterior irradiación, para una mayor acumulación de
astaxantina, reduciendo costos de producción.
2.2 Materiales y métodos
2.2.1 Microorganismo y condiciones de cultivo La microalga H. pluvialis (LAUN 029) fue suministrada por el Laboratorio de microalgas
del Departamento de Biología de la Universidad Nacional de Colombia. La microalga fue
mantenida en medio líquido BBM estándar (Anexo A) (Andersen, 2005) esterilizado en
autoclave a 121°C durante 30 minutos. La temperatura del cultivo fue mantenida en 24 ±
2 °C. Se utilizaron lámparas fluorescentes Sylvania Daylight F48T12/D de 39W como
fuente de iluminación artificial con iluminancia de 2500 ± 50 Lux, fotoperiodo de 18 horas
de luz y 6 de oscuridad (18:6 LO), aireación de 0,5 vvm empleando aire atmosférico
filtrado con una membrana de 0,22 μm. El mantenimiento se realizó en botellas de vidrio
de paredes planas de 4,5 cm de espesor y capacidad de 330 mL con volumen de cultivo
de 200 mL. Se realizó resiembra semanalmente empleando inóculo del 10% v/v.
24 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
2.2.2 Evaluación de medios de cultivo
Para evaluar el efecto del crecimiento de Haematococcus, se investigó 5 de los medios
de cultivo (BBM, BG11, OHM, F1, BBM: BG11 (1:1) -Anexo A), que han sido reportados
en la literatura con mayor tasa específica de crecimiento. Todos los medios de cultivo se
llevaron a cabo simultáneamente por triplicado, utilizando un inóculo inicial del 4x104
Cel/mL en botellas de vidrio de 330 mL con un volumen de cultivo de 200 mL, para un
total de 15 ensayos. El crecimiento se determinó por conteo celular diario empleando la
cámara Neubauer. Los parámetros de cultivo fueron los mismos que los descritos en el
numeral 2.2, excepto que el fotoperiodo fue 12:12 (Horas de luz: horas de oscuridad)
2.2.3 Evaluación de estrés por intensidad lumínica
Para evaluar el efecto del estrés lumínico sobre la acumulación de astaxantina, se
sometieron las células en fase estacionaria a elevadas intensidades de luz. Para ello se
tomó un inóculo y se cultivó en 1L de medio BBM en un recipiente cilíndrico de vidrio de
1,5 L de capacidad por un periodo de 8 días hasta alcanzar la fase estacionaría,
manteniendo los mismos parámetros de cultivo descritos en el numeral 2.2.2. Una vez el
cultivo alcanzó la fase estacionaria se dividió en botellas de vidrio de 330 mL con un
volumen de cultivo de 200 mL y se sometió el cultivo a tres diferentes intensidades
lumínicas (18500, 37000, 55500 (± 50 Lux)) por triplicado, utilizando un montaje de LED’s
tipo SMD P96WN2-12-001 blancos con un regulador de potencia que permitió variar la
intensidad lumínica. La variable de respuesta fue la cantidad de astaxantina, medida en
porcentaje peso/volumen. Los parámetros de cultivo permanecieron constantes
(Temperatura de cultivo: 24 ± 2ºC- fuente lumínica: LED’s blancos- fotoperiodo: 12:12-
aireación: 0,5 vvm- 0,033% CO2 concentración atmosférica). Como control negativo se
realizó un blanco, tomando 200 mL del cultivo en fase estacionaría en botellas de 330
mL, y se sometió a una intensidad de luz de 2500 Lux y 0% de NaCl, realizando el
experimento por también triplicado.
Capítulo 2 Efecto de las condiciones de cultivo en el crecimiento y acumulación de astaxantina en una cepa nativa de Haematococcus pluvialis
25
2.2.4 Evaluación de estrés por alta salinidad en el medio de cultivo
Para evaluar el efecto de la salinidad sobre la acumulación de astaxantina se sometieron
células en fase estacionaria a diferentes concentraciones de sal. Para ello se tomó un
inóculo y se cultivó en 1L de medio BBM en un recipiente cilíndrico de vidrio de 1,5 L de
capacidad por un periodo de 8 días hasta alcanzar la fase estacionaría, manteniendo los
mismos parámetros de cultivo descritos en el numeral 2.2.2. Una vez el cultivo alcanzó la
fase estacionaria se dividió en botellas de vidrio de 330 mL con un volumen de cultivo de
200 mL y se sometió el cultivo a tres diferentes concentraciones de NaCl (0.025, 0.100,
0.250 %) por triplicado, ajustando la concentración de sal por medio de la adición de una
cantidad apropiada de una solución acuosa de 100 g NaCl L-1, esterilizada en autoclave a
121°C durante 30 minutos. Se seleccionó 0.250 % como la concentración máxima para
los experimentos, basados en estudios exploratorios realizados en donde se encontró
que para concentraciones superiores de sal, no se presenta crecimiento de la microalga y
se observa muerte por rompimiento de la membrana celular. La variable de respuesta fue
la cantidad de astaxantina, medida en porcentaje peso/volumen. Los parámetros de
cultivo fueron descritos en el numeral 2.2.2. Como control negativo se realizó un cultivo
tomando 200 mL de la muestra en fase estacionaría en botellas de 330 mL, los cuales
fueron sometidos a una intensidad de luz de 2500 Lux y 0% de NaCl, realizando el
experimento también por triplicado.
2.2.5 Evaluación de estrés por concentración celular Para evaluar el efecto del estrés por concentración celular sobre la acumulación de
astaxantina se sometieron las células en fase estacionaria a estrés, concentrándolas y
sometiéndolas a irradiación de luz. Para ello se tomó un inóculo y se cultivó en 1L de
medio BBM en un recipiente cilíndrico de vidrio de 1,5 L de capacidad por un periodo de
8 días hasta alcanzar la fase estacionaría, manteniendo los mismos parámetros de
cultivo descritos en el numeral 2.2.2. Una vez alcanzó la fase estacionaria se centrifugó
la muestra a 2000 rpm en centrifuga Hettich Zentrifugen ROTOFIX 32 de 14 cm de radio
(2500×g) durante 30 min, retirando el sobrenadante de tal manera que el volumen final
del precipitado fue el 10 % del inicial. El volumen final de concentrado se agitó utilizando
un Vortex a 2000 rpm por 30 s.
26 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
La solución concentrada se dividió en 6 cajas de Petri de vidrio de 5 cm de diámetro, 3
cajas con un volumen de 5 mL y 3 cajas con 2,5 mL, de tal manera que se tuviera dos
diferentes alturas del medio en los experimentos (1,3 y 2,5 mm, ver Figura 2-1). Las cajas
de Petri se dividieron en 3 grupos, de dos alturas diferentes cada grupo, y fueron
sometidas a diferentes condiciones. En la primera se utilizó un montaje de LED’s tipo
SMD P96WN2-12-001 blancos con una intensidad lumínica de 11000 ± 50 lux; en la
segunda se utilizaron lámparas fluorescentes marca Sylvania Daylight F48T12/D de 39W
con una intensidad lumínica de 5000 ± 50 lux, En ambos casos la iluminación se realizó
por la parte inferior de las cajas de Petri para obtener la mayor área de iluminancia. El
tercer grupo no se iluminó para tomarlo como control (Tabla 2-1). Todas las cajas de
Petri se taparon para evitar la contaminación y se mantuvieron a 25 °C en una
incubadora En todos los casos se realizó seguimiento fotográfico y a los 9 días se
determinó la concentración de astaxantina.
Tabla 2-1: Parámetros de estrés para acumulación de astaxantina en la microalga H.
pluvialis
# Cel/mL cultivo inicial 5,0E+05 Intensidad lumínica lámparas Fluorescentes 5000 Lux Intensidad lumínica LED’s 11000 Lux Volumen experimento mL # Células # Células/ mm2 Espesor de irradiación mm
2,5 1,3E+07 6366,2 1,3 5 2,5E+07 12732,4 2,5
2.2.6 Medición de variables
Medición del crecimiento
El crecimiento fue monitoreado tanto por conteo celular, como por peso seco. El conteo
se realizó utilizando una cámara de Neubauer. El peso seco se determinó al final de los
cultivos tomando 50 mL de muestra y centrifugándola a 3000 rpm en una centrifuga
Hettich Zentrifugen ROTOFIX 32 de 14 cm de radio (2500×g) durante 20 min,
resuspendiendo el precipitado en agua destilada, agitándola con Vortex a 2000 rpm por
Capítulo 2 Efecto de las condiciones de cultivo en el crecimiento y acumulación de astaxantina en una cepa nativa de Haematococcus pluvialis
27
30 s, y centrifugando de nuevo las muestras a 2500 g por 20 min. El precipitado se secó
a 60°C hasta obtener peso constante.
Medición de Astaxantina
Se realizó la extracción de los carotenos utilizando metanol como solvente y analizando
las muestras en un espectrofotómetro Thermo Scientific Genesys 20, empleando celda
de absorbancia plástica de 2 mL de capacidad y trayectoria de luz de 1 cm. Se tomó una
muestra de 1 mL de medio de cultivo, y se centrifugó a 7000 rpm por 5 min utilizando una
centrífuga para EPPENDORF modelo 5415C de 7,3 cm de radio (4000xg), realizando
conteo celular en simultáneo. Se retiró el sobrenadante utilizando una micro-pipeta y se
le adicionó al precipitado 1 mL de metanol y 0,4 g de partículas de sílica (silica gel 60
200-500 Merck, KGaA, Darmstadt, Alemania EM-7733-1); se realizó el rompimiento
celular agitando la muestra con un Vortex a 2000 rpm por 10 min (Ranjbar et al., 2008b).
Las muestras fueron centrifugadas a 7000 rpm por 5 min, retirando el sobrenadante y
repitiendo el procedimiento hasta que no se observó color rojo en la extracción. Se
mezclaron los sobrenadantes y se determinó la absorbancia a 477 nm, utilizando un
coeficiente másico de extinción, A 1% de 2306,6 mL g-1 cm-1 por el método de Davies
(1976), descrito por Tripathi et al. (2002) y Aquasearch-Inc. (1999), manteniendo las
muestras en completa oscuridad.
28 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Figura 2-1 Esquema del montaje de trabajo para evaluar estrés por concentración celular
Control de variables
Para medir la intensidad de la luz se utilizó un medidor de luz marca VWR Scientific
21800-014 y el fotoperiodo se fijó empleando una temporizador digital marca Steren. Se
construyó una cabina con control de temperatura, y se utilizaron membranas de 0,22 m
para esterilizar el aire.
2.2.7 Ajuste cinéticas de crecimiento A cada cultivo se le ajustó el modelo de crecimiento logístico descrito en la Ecuación 2.1
(Ecuación 2.1)
En la Ecuación 2.1, X es la densidad celular (células·mL-1), X0 y Xmax son las densidades
celulares inicial y máxima, respectivamente (células·mL-1), μ es la velocidad específica de
crecimiento aparente (día-1) y t es el tiempo de cultivo (día). Para el ajuste se empleó el
software TableCurve 2D® (Systat Software Inc., San Jose, California, USA).
Capítulo 2 Efecto de las condiciones de cultivo en el crecimiento y acumulación de astaxantina en una cepa nativa de Haematococcus pluvialis
29
2.3 Resultados y discusión
2.3.1 Efecto del medio de cultivo En las curvas de crecimiento de la microalga H. pluvialis (Figura 2-2) se puede observar
que la fase exponencial en todos los medios de cultivo fue de 8 días con 1 día de fase de
adaptación; el medio de cultivo con la mayor velocidad específica de crecimiento es el
medio OHM (0,536 días-1), con una densidad celular máxima de 4,16 x 105 cel/mL,
mientras que el medio BG11 solo alcanzó una velocidad especifica de crecimiento de
0,463 y una densidad celular de 4,02 x 105 cel/mL, con aumento de producción de
biomasa entre 11 y 19 veces la población inicial (Figura 2-3,Tabla 2-3).
Las densidades celulares obtenidas se encuentran acordes con las reportadas por
Fábregas et al. (2001) para el medio de cultivo OHM y de Issarapayup et al. (2009) para
el medio F1, ya que la investigación de Kaewpintong et al. (2007) muestran
concentraciones celulares máximas de inferiores a las reportadas por la presente
investigación (Tabla 2-2). Concentración celular máxima Cel mL-1
Medio Fábregas et al.
(2001)
Issarapayup et al.
(2009)
Kaewpintong et al.
(2007)
Presente trabajo
OHM 6,25 x 105 3,9 × 105
F1 1,8 × 105 5,5 x 104 3,5 × 105
M1 0,5 x 104
Basal 0,9 x 104 4,5 × 105
BG-11 3,5 x 104 3,5 × 105
Basal: BG11 (1:1) 2,7 × 105
Hong Kong 3,1 x 104
M6 0,5 x 104
Tabla 2-2: Comparación de la concentración celular máxima obtenida por diferentes
autores.
30 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Figura 2-2: Curvas de crecimiento de la microalga Haematococcus pluvialis en los
medios de cultivo BBM (◊), BG11 (□), OHM (×), F1 (○), BBM: BG11 (1:1) (∆)
Para la velocidad específica de crecimiento, se encontró que están por encima de las
reportadas por otros autores entre 2,5 y 50 veces, ya que mientras los valores
encontrados en la presente investigación se encuentran entre 0,470 y 0,530 días-1 (Figura
2-3 y Tabla 2-3), la investigación de Fábregas et al. (2001) para el medio de cultivo OHM
reporta 0,130 días-1, la investigación de Issarapayup et al. (2009) reporta 0,225 días-1
para el medio F1, y la investigación de Kaewpintong et al. (2007) muestran velocidades
especificas de crecimiento de 0,010- 0,032- 0,200 -0,130- 0,110- 0,010- 0,125 días-1 para
los medios de cultivo M1, Basal, F1, BG-11, Hong Kong, M6, respectivamente. Estos
valores muestran que la cepa nativa de Haematococcus pluvialis tiene un gran potencial
para la producción de biomasa y su utilización industrial.
1,0E+04
1,0E+05
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0
Dens
idad
Cel
ular
#C
el m
L-1
Tiempo [días]
Capítulo 2 Efecto de las condiciones de cultivo en el crecimiento y acumulación de astaxantina en una cepa nativa de Haematococcus pluvialis
31
Figura 2-3 Velocidad específica de crecimiento para los medios de cultivo evaluados.
Barra error: desviación estándar.
Tabla 2-3 Matriz de coeficientes del modelo logístico ajustado para los diferentes medios
de cultivo según la Ecuación 2.1. Desviación estándar (DE) y coeficiente de
determinación R2, Xmax y X0 en Células·mL-1
y μ en día-1
Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de un factor (velocidad específica de
crecimiento) para los 5 tratamientos (medios de cultivo) y 3 réplicas de cada tratamiento,
encontrando que para una confianza del 95% no existe diferencia estadística entre los
diferentes medios de cultivo evaluados Tabla 2-4). Adicionalmente se realizó un análisis
de varianza (ANOVA) de un factor (Producción de biomasa) para los mismos
tratamientos anteriormente mencionados, encontrando diferencia significativa entre los
medios de cultivo evaluados para una confianza del 95% (Tabla 2-5), se puede observar
que el medio de cultivo con la menor productividad de biomasa es el medio BG11:BBM
(1:1) y que los medios de cultivo de mayor rendimiento son el BBM y el OHM. El medio
de cultivo BBM se seleccionó para las siguientes etapas de experimentación ya que es
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
BBM BG11 BBM + BG11 OHM F1
Velo
cida
d es
pecí
fica
de c
reci
mie
nto
[día
s-1]
Medio de cultivo
Medio de cultivo Xo DE Xo Xmax DE Xmax DE R2 Xmax/Xo BBM 2,57E+04 1,04E+03 4,88E+05 4,47E+04 0,511 0,0071 97,9% 1,90E+01 BG11 2,68E+04 2,25E+03 4,02E+05 4,73E+04 0,463 0,0274 93,1% 1,50E+01 BG11+BBM (1:1) 2,70E+04 3,93E+03 3,01E+05 1,89E+04 0,517 0,0654 95,8% 1,11E+01 OHM 2,14E+04 8,63E+02 4,16E+05 4,81E+04 0,536 0,0164 94,3% 1,94E+01 F1 2,68E+04 4,18E+03 3,80E+05 2,18E+04 0,509 0,0939 96,3% 1,42E+01
32 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
un medio estándar y autotrófico, a diferencia del medio OHM que requiere del uso de
citrato de hierro; además no se requiere el uso de vitaminas facilitando su aplicación
industrial.
Tabla 2-4 Análisis de varianza (ANOVA) del efecto del medio de cultivo en la velocidad
específica de crecimiento de la microlaga Haematococcus pluvialis
Tabla 2-5 Análisis de varianza (ANOVA) del efecto del medio de cultivo en la producción
de biomasa de la microlaga Haematococcus pluvialis
2.3.2 Efecto de la intensidad de luz y concentración de sal en la acumulación de astaxantina.
En la (Figura 2-4) se puede observar los resultados de la medición de astaxantina en
función de la concentración de sal, para tres diferentes niveles (0,25 – 1,00 – 2,50 g L-1),
en donde se puede observar que a concentraciones superiores a 0,250 % se presenta
inhibición del crecimiento, y una reducción en la acumulación de astaxantina de 6 a 1,2
g/mL. Para las concentraciones de 0,025 y 0,100 % se observa un pequeño aumento de
la concentración de astaxantina, pasando de valores iniciales de 4,5 y 5 g/mL a 5 y 6,5
g/mL, respectivamente, representando un aumento del 1,1 %.
ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las variaciones
Suma de cuadrados
Grados de libertad
Promedio de los cuadrados F Probabilidad
Valor crítico para F
Medios de cultivo 0,00604 4 0,001509 0,5326 0,71505 3,4780 Error 0,02834 10 0,002834 Total 0,03438 14
ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de
las variaciones
Suma de cuadrados
Grados de libertad
Promedio de los cuadrados F Probabilidad
Valor crítico para F
Medios de cultivo 139,787 4 34,946 7,8337 0,003969 3,47804 Error 44,610 10 4,461 Total 184,397 14
Capítulo 2 Efecto de las condiciones de cultivo en el crecimiento y acumulación de astaxantina en una cepa nativa de Haematococcus pluvialis
33
A diferencia de investigaciones como la de Sarada et al. (2002b), donde han encontrado
que para concentraciones por encima del 1% w/v de NaCl son letales para el crecimiento
de la microalga, y que concentraciones de 0,5% favorece la acumulación de astaxantina
(10 y 12 g/mL de astaxantina respectivamente), se pudo concluir que para la cepa
nativa de Haematococcus pluvialis no tiene efecto en la acumulación de astaxantina las
concentraciones de sal por encima de 0,025 %.
La alta iluminación mostró resultados diferentes a los obtenidos por la salinidad en el
medio, ya que se pudo evidenciar una relación directa entre la intensidad de luz y la
acumulación de astaxantina (Figura 2-5). Se consiguió acumular en las células 34 g/mL
al cabo de 15 días, siendo mayor 5,8 veces al control.
Figura 2-4 Efecto de la salinidad del medio de cultivo en la acumulación de astaxantina
en H. pluvialis
0123456789
0 5 10 15 20
Asta
xant
ina
mg/
mL
Tiempo (días)
Efecto de la salinidad en el medio
0 g/L
0,25 g/L
1,00 g/L
2,50 g/L
34 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Figura 2-5: Efecto de la intensidad de luz en la acumulación de astaxantina en H.
pluvialis
La intensidad lumínica ha sido ampliamente estudiada, se ha encontrado que se pueden
obtener gran cantidad de biomasa y una alta tasa de supervivencia de las células al usar
intensidades de luz por debajo de 37 mol/m2s (60000 Lux) (Cohen, 1999) y para Harker
et al. (1996) se obtienen altas tasas de crecimiento cuando se usa una intensidad de luz
de 2 y de 37 mol/m2s (3300 a 60000 Lux), e inhibición del crecimiento a 89 mol/m2s
(140000 Lux), en ambos casos, así como para otras investigaciones en las que no se
obtienen inhibición por debajo de los 90 y 100 mol/m2s (140000 – 180000 Lux) (Choi et
al., 2003; Zhang et al., 2009). García-Malea et al. (2005) han encontrado que la
acumulación de astaxantina esta relacionado en mayor medida con la deficiencia de
nutrientes comparada con las elevadas irradiaciones de luz, encontrando que para una
iluminancia de 2500 mol/m2s y duplicando los nutrientes del medio BBM logran obtener
3 g/L de biomasa y utilizando la misma irradiación 2500 mol/m2s, pero con la tercera
parte de los nutrientes del medio BBM obtienen 15 g/mL de astaxantina. Por otro lado
Kang et al. (2006) han obtenido hasta 83,9 g/mL utilizando en los cultivos en fase
estacionaria 5 % de CO2 en la aireación y 200 mol/m2s (360000 Lux). Los resultados
obtenidos se ajustan a los esperados, ya que no se presentó inhibición por debajo de los
55500 Lux y se logró obtener 34 g/mL de astaxantina, mostrando gran potencial para la
0
5
10
15
20
25
30
35
0 5 10 15 20
Asta
xant
ina
mg/
mL
Tiempo (días)
Efecto de la intensidad de luz
2500 Lux
18500 Lux
37000 Lux
55500Lux
Capítulo 2 Efecto de las condiciones de cultivo en el crecimiento y acumulación de astaxantina en una cepa nativa de Haematococcus pluvialis
35
producción industrial de este carotenoide a partir de la microalga nativa Haematococcus
pluvialis.
En las Figura 2-6 y Figura 2-7 se muestra el efecto de la salinidad y la intensidad de luz
en la producción de biomasa, en la primera se puede observar claramente la inhibición
por salinidad a una concentración de 0,25 %, además hay una reducción de la población
a concentraciones de 0,025 y 0,100 % comparadas con el control. En la Figura 2-7 se
puede observar el caso contrario, ya que la biomasa aumenta proporcionalmente al
aumento de la intensidad de luz, esto debido a que un mayor número de células fueron
estresadas pasando de la fase vegetativa a la fase Aplanóspora donde se da el
crecimiento, presentando mayor tamaño celular y peso. Para los resultados obtenidos,
las mejores condiciones para el estrés de la microalga son a una intensidad de luz mayor
a 55500 Lux y 0% de concentración de sal, obteniendo 0,774 g/L de biomasa y 32,98
g/mL de astaxantina, siendo estos valores superiores a los reportados por otros
autores.
Figura 2-6: Efecto de la salinidad del medio de cultivo en la producción de biomasa
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0 0,5 1 1,5 2 2,5
g de
Bio
mas
a /L
Concentración de NaCl g/L
Efecto de la salinidad
36 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Figura 2-7 Efecto de la intensidad lumínica en la producción de biomasa
2.3.3 Efecto de la concentración celular y la elevada iluminación en la acumulación de astaxantina.
En la Figura 2-8 se muestra el seguimiento fotográfico de la microalga Haematococcus
pluvialis al ser sometidas a estrés por concentración y alta iluminación; en ellas se puede
observar que en las muestras sometidas a una fuente lumínica presencia de astaxantina,
mientras que las muestras que se mantuvieron en la oscuridad no lo hicieron. También
se puede destacar que los experimentos con 2,5 mL fueron estresados con mayor
rapidez comparadas con las muestras de 5 mL, esto quiere decir que el número de
células/ unidad de área es un parámetro fundamental en el diseño.
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 10000 20000 30000 40000 50000 60000
g de
Bio
mas
a/ L
Intensidad Lumínica Lux
Efecto de la Intensidad Lumínica
Capítulo 2 Efecto de las condiciones de cultivo en el crecimiento y acumulación de astaxantina en una cepa nativa de Haematococcus pluvialis
37
Figura 2-8: Seguimiento fotográfico al estrés por concentración y elevada iluminancia en
la acumulación de astaxantina en H. pluvialis.
Utilizando la metodología propuesta se logró obtener una acumulación de astaxantina de
59,2 g/mL, siendo superior a los obtenidos en los métodos convencionales de estrés
evaluados en la presente investigación así como en otras (Figura 2-9). El estrés con luz
fluorescente presento mayor acumulación que la iluminación con LED’s, así mismo, a
38 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
pesar de que las muestras con 2,5 mL presentaron rápida acumulación de astaxantina, el
experimento con luz fluorescente y 5 mL de volumen presentó la mayor acumulación. Las
muestras sin iluminación alcanzaron valores similares a los iniciales de escasamente 3,9
y 4,0 g/mL.
Figura 2-9: Efecto de la concentración celular y la intensidad de luz en la acumulación de
astaxantina g/mL.
En la Tabla 2-6 se hace la comparación de los diferentes métodos de estrés para la
acumulación de astaxantina en H. pluvialis probados en el presente trabajo, en ella se
puede observar que al concentrar las células y someterlas a elevada intensidad de luz se
puede aumentar entre 10 y 13 veces la concentración de astaxantina en las células,
siendo superior a los resultados obtenidos para los métodos convencionales, en donde
se encontró un aumento máximo de 6,5 veces. La productividad de astaxantina medida
por el tiempo total del cultivo y de estrés, mostró valores entre 2,8 y 3,5 mg L-1día-1,
duplicando la productividad de los métodos convencionales en donde se encontraron
valores entre 0,05 y 1,4 mg L-1día-1, de igual manera este procedimiento mostró
productividades superiores a las reportadas por otras investigaciones, por ejemplo Kang
et al. (2006) reporta valores entre 1,65 y 3,23 mg L-1día-1, utilizando en los cultivos en
fase estacionaria 5 % de CO2 en la aireación y 200 mol/m2s (360000 Lux), García-Malea
et al. (2005) logran una productividad de 1,6 mg L-1día-1 utilizando una alta irradiación de
0
10
20
30
40
50
60
70
Asta
xant
ina
g/m
L
Acumulaciónde astaxantinaValor inicial
Capítulo 2 Efecto de las condiciones de cultivo en el crecimiento y acumulación de astaxantina en una cepa nativa de Haematococcus pluvialis
39
2500 E/m2s en las células, Fábregas et al. (2001) han reportado una productividad de
3,2 mg L-1día-1 utilizando un cultivo por lote alimentado, con presencia de acetato e
irradiación continua.
Astaxantina g/mL
Experimento Valor inicial Valor final Tasa de
aumento Productividad
mg/L-día
LED's 2,5 mL 4,43 54,46 12,28 3,204 LED's 5 mL 4,43 47,50 10,71 2,794 Fluorescentes 2,5 mL 4,43 56,27 12,69 3,310 Fluorescentes 5 mL 4,43 59,23 13,36 3,484 Sin iluminación 2,5 mL 4,43 4,03 0,91 0,237 Sin iluminación 5 mL 4,43 3,90 0,88 0,229 0,025 % NaCl 4,44 6,50 1,47 0,283 0,100 % NaCl 5,10 5,77 1,13 0,251 0,250 % NaCl 6,10 1,19 0,20 0,052 18500 Lux 4,44 11,09 2,50 0,482 37000 Lux 6,10 19,58 3,21 0,851 55500 Lux 5,10 32,99 6,46 1,434
Tabla 2-6: Tasa de aumento en la acumulación de astaxantina
El método que consiste en concentrar las células y someterlas a estrés por alta
irradiación generó gran acumulación de astaxantina, elevadas tasas de aumento en la
concentración del caroteno y productividades superiores, comparadas con los métodos
tradicionales de estrés; Adicionalmente al utilizar esta metodología en el escalamiento del
proceso se obtendrá un ahorro de energía en el transporte, ya que solo será necesario el
10% del flujo comparado con otras metodologías, reduciendo la capacidad y los costos
de los equipos, así como la utilización de sistemas de aireación o burbujeo, tampoco se
requiere de un método de separación costosa, ya que las células rojas tienen tamaños
promedio de 25 a 50 m que facilitan su precipitación o el uso de telas filtrantes.
Finalmente se puede decir que en la microalga nativa de Haematococcus pluvialis no se
presenta ninguna diferencia significativa entre los medios de cultivo evaluados, por lo
cual se recomienda el uso del medio de cultivo BBM por ser un medio autotrófico
estándar. De igual manera se recomienda concentrar las células en fase estacionaria y
someterlas a estrés por elevada irradiación, ya que al modificar la salinidad del medio las
40 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
células son inhibidas y la alta irradiación del sistema burbujeado alcanza apenas la mitad
de la acumulación y la productividad de astaxantina.
3. Optimización de las condiciones de cultivo en el crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
Resumen Se evaluó el efecto del porcentaje de dióxido de carbono en la aireación, la intensidad de
luz, la concentración de nitrógeno y de fósforo, en la velocidad específica de crecimiento
de la microalga nativa Haematococcus pluvialis utilizando la metodología de superficie de
respuesta, ajustando los parámetros a un polinomio de segundo orden. Se encontró una
velocidad máxima de crecimiento para los límites evaluados de 0.825 días -1, utilizando
0.51% de CO2, 3,28x10-3 M de nitrógeno (NaNO3), 2,58x10-3 M de fósforo (K2HPO4 y
KH2PO4) y 11000 Lux de iluminancia, como parámetros de cultivo. De estos parámetros
la intensidad de luz y la concentración de fósforo tuvieron un efecto positivo en el
crecimiento de la microalga, mientras que el % CO2 presentó un efecto negativo; la
concentración de nitrógeno no tuvo efecto significativo en la velocidad específica de
crecimiento
Palabras claves: Haematococcus pluvialis, velocidad específica de crecimiento, CO2,
nitrógeno, fósforo, intensidad lumínica.
Abstract The effect of carbon dioxide percentage in the aeration, the nitrogen and phosphorus
concentration and the light intensity, on the specific growth rate of a native strain of the
microalgae Haematococcus pluvialis were evaluated through a response surface
methodology; the effect of the variable was fitted to a second order polynomial. The
maximum growth rate, within evaluated limits, was 0.825 days-1, at 0.51% of CO2,
3,28x10-3 M of nitrogen (NaNO3), 2,58x10-3 M of Phosphorus (K2HPO4 y KH2PO4) and
42 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
11000 Lux of luminance. The light intensity and the phosphorus concentration had a
positive effect in the microalgae growth while the carbon dioxide percentage had a
negative effect; the nitrogen concentration had no significant effect in the specific growth
rate.
Keywords: Haematococcus pluvialis, specific growth rate, CO2, Nitrogen, Phosphorus,
light intensity.
3.1 Introducción Las microalgas son microorganismos fotosintéticos que tiene un alto valor industrial; la
microalga Haematococcus pluvialis es uno de los mejores productores de astaxantina, ya
que tiene la capacidad de acumular más del 3% en peso del pigmento (Hagen et al.,
2001); sin embargo, esta microalga puede presentar baja productividad de astaxantina si
no son optimizados los parámetros de cultivo, dificultando su uso comercial, debido a
factores como un lento crecimiento, baja concentración celular y alta susceptibilidad a
daños hidrodinámicos, comparada con la microalga unicelular Chlorococcum sp.: ésta
última microalga presenta, sin embargo, una muy baja acumulación de astaxantina
(Zhang & Lee, 1997).
La intensidad lumínica es uno de los factores más importantes tanto en el crecimiento de
la célula como en la acumulación de astaxantina, en diversas investigaciones se han
encontrado valores de inhibición y estrés para la microalga, así como irradiancia que
presenta óptimo en la acumulación de biomasa (Cohen, 1999; Choi et al., 2003; Harker
et al., 1996; Katsuda et al., 2004). De igual manera cuando H. pluvialis es cultivada en
medios con limitaciones de nitrógeno, el crecimiento del alga se ve restringido y la
síntesis de astaxantina es estimulada. Se tienen efectos similares cuando el alga es
sometida a altas concentraciones de hierro, bajas concentraciones de fosfatos y a
medios salinos (García-Malea et al., 2005; Harker et al., 1996).
Otro parámetro fundamental en el crecimiento de la microalga es la fuente de carbono;
diferentes autores han propuesto el uso de CO2 en la aireación, encontrando óptimos
cercanos al 1 % (Kaewpintong et al., 2007), así mismo se han evaluado medios de cultivo
Capítulo 3 Optimización de las condiciones de cultivo en el crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
43
heterótrofos utilizando acetato de sodio (Hata et al., 2001; Jeon et al., 2006). La gran
dependencia del crecimiento de H. pluvialis de diferentes parámetros ha motivado la
presente investigación, en la que se evaluaron la fuente de nitrógeno y de fósforo, así
como la irradiación y la concentración de CO2 en la velocidad específica de crecimiento,
encontrando el optimo de estas variables.
3.2 Materiales y métodos
3.2.1 Microorganismos y condiciones de cultivo La microalga H. pluvialis (LAUN 029) fue suministrada por el Laboratorio de microalgas
del Departamento de Biología de la Universidad Nacional de Colombia. La microalga fue
mantenida en medio líquido BBM estándar (Anexo A) (Andersen, 2005) esterilizado en
autoclave a 121°C durante 30 minutos. La temperatura del cultivo fue de 24 ± 2 °C,
utilizando lámparas fluorescentes Sylvania Daylight F48T12/D 39W como fuente de
iluminación artificial con iluminancia de 2500 ± 50 Lux1, fotoperiodo de 18 h horas de luz
y 6 de oscuridad (18:6 LO), aireación de 0,5 vvm empleando aire atmosférico filtrado a
0,22 μm. El mantenimiento se realizó en botellas de vidrio planas de 4,5 cm de espesor y
capacidad de 330 mL con volumen de cultivo de 200 mL, se realizó resiembra
semanalmente empleando inóculo del 10% v/v.
Todos los experimentos fueron realizados en biorreactores de vidrio con capacidad para
100 mL con volumen de cultivo de 80 mL ± 0,5 mL, se construyeron con botellas de tapa
roscada, la cual se perforó y se le acopló un tapón de silicona tipo RTV con tres
mangueras de silicona para permitir en ingreso y la salida de aire, así como un puerto
toma muestra que permite mantener la esterilidad del sistema (Figura 3-1). Se utilizó el
medio líquido BBM (Anexo A) (Andersen, 2005) con diferentes concentraciones de
nitrógeno (NaNO3) y fósforo (K2HPO4 y KH2PO4). Se ajustó el inóculo para una
concentración inicial de 4,0 x 104 Cel/mL en todos los cultivos y se aplicaron diferentes
concentraciones de CO2 en la aireación, así como diferentes intensidades de luz. En
todos los casos se usó 0,5 vvm de aireación, temperatura de 25 ± 0,5 °C, fotoperiodo de
12 horas de luz y 12 horas e oscuridad (12:12 LO) y la iluminación se realizó por la parte
inferior de las botellas, por tener mayor área de aplicación (Figura 3-2). Para ello se
44 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
construyó un sistema cerrado con control de temperatura y fotoperiodo (Figura 3-3),
utilizando un montaje de LED’s blancos con un regulador de potencia que permitió variar
la intensidad lumínica, la cual se midió empleando un luxómetros marca VWR Scientific
21800-014 y el fotoperiodo se fijó empleando una temporizador digital marca Steren.
Figura 3-1: Fotografía biorreactores utilizados en la experimentación
Figura 3-2: Sistema de iluminación por LED’s
Capítulo 3 Optimización de las condiciones de cultivo en el crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
45
Figura 3-3: Sistema de control de temperatura
Para la mezcla de los gases de aireación se construyó un mezclador compuesto por un
manómetro y un regulador de presión para cada una de los gases, así como rotámetros
marca AALBORG Instruments 112-02 de 0 a 150 mm para CO2 y Dwyer Instruments VFB
de 4 L para aire (Figura 3-4). El suministro de CO2 se realizó con un cilindro de gas grado
industrial, fijando la presión de salida igual que la del aire en 8 psig, la mezcla se
humidificó para evitar la evaporación del medio de cultivo. Adicionalmente se construyó
un distribuidor de aire para garantizar la correcta aplicación a cada biorreactor,
verificando su flujo con un rotámetro marca AALBORG Instruments 112-02 de 0 a 150
mm.
3.2.2 Diseño experimental y análisis de datos Se empleó un diseño de experimentos de segundo orden ortogonal (Lazic, 2006),
evaluando cuatro variables con cinco niveles en cada variable, realizando 6 réplicas al
punto central. Las variables independientes seleccionadas fueron la concentración de
nitrógeno X1 (NaNO3), la concentración de fósforo X2 (K2HPO4 y KH2PO4), el porcentaje
de CO2 en la aireación X3 y la intensidad de luz X4. Los niveles y los intervalos de
variación de los parámetros se muestran en la Tabla 3-1; La decodificación y los niveles
evaluados de cada variable se muestran en la Tabla 3-2.
46 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Número Descripción Número Descripción
1 Entrada de aire 8 Manómetro para aire
2 Entrada de CO2 9 Regulador de presión para aire
3 Salida de mezcla 10 Rotámetro para CO2
4 Cilindro de CO2 11 Rotámetro para aire
5 Humidificador de aire 12 Distribuidor de aire
6 Manómetro para CO2 13 Mangueras con filtros de 0,22 m
7 Regulador de presión para CO2
Figura 3-4: Esquema de mezclado de aire y dióxido de carbono
Factores Niveles de Variación Intervalos de variación -2 -1 0 1 2 X
X1 - Nitrógeno (M) 0,00E+00 1,47E-03 2,94E-03 4,41E-03 5,88E-03 1,47E-03
X2 - Fósforo (M) 0,00E+00 8,61E-04 1,72E-03 2,58E-03 3,44E-03 8,61E-04
X3 - CO2 % 0,000% 0,500% 1,000% 1,500% 2,000% 5,00E-03
X4 - Lux 3500 6000 8500 11000 13500,00 2500
Tabla 3-1: Niveles e intervalos de variación de los parámetros
Capítulo 3 Optimización de las condiciones de cultivo en el crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
47
Las ecuaciones que relacionan las variables reales con las codificadas son:
Nitrógeno:
Fósforo:
CO2:
Intensidad de Luz:
La respuesta fue la velocidad específica de crecimiento de la microalga (Y), ajustando los
datos a un polinomio de segundo orden (Ecuación 3.1) (Sarada et al., 2002a), utilizando
el software Statgraphics Centurion XV® (StatPoint Technologies, Warrenton, VA, USA)
con una significancia del 5%.
(Ecuación 3.1)
Donde n representa el número de variables, i, j son subíndices de las variables y los
coeficientes de ajuste del polinomio están representados por a.
3.2.3 Medición del crecimiento El crecimiento fue monitoreado por conteo celular diario hasta alcanzar la fase
estacionaria (8 días), utilizando una cámara de Neubauer.
3.2.4 Ajuste de cinéticas de crecimiento A cada cultivo se le ajustó el modelo de crecimiento logístico descrito en la Ecuación 3.2
(Ecuación 3.2)
En la Ecuación 3.2, X es la densidad celular (células·mL-1), X0 y Xmax son las densidades
celulares inicial y máxima respectivamente (células·mL-1), μ es la velocidad específica de
crecimiento aparente (día-1) y t es el tiempo de cultivo (día). Para el ajuste se empleó el
software TableCurve 2D® (Systat Software Inc., San Jose, California, USA).
48 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Exp. # X1 - Nitrógeno (M) X2 - Fósforo (M) X3 - CO2 % X4 – Lux Nivel Valor Nivel Valor Nivel Valor Nivel Valor
1 1 4,41E-03 -1 8,61E-04 -1 0,500% -1 6000 2 0 2,94E-03 0 1,72E-03 0 1,000% 0 8500 3 -1 1,47E-03 1 2,58E-03 1 1,500% 1 11000 4 0 2,94E-03 2 3,44E-03 0 1,000% 0 8500 5 -1 1,47E-03 1 2,58E-03 -1 0,500% 1 11000 6 1 4,41E-03 -1 8,61E-04 1 1,500% -1 6000 7 -1 1,47E-03 -1 8,61E-04 -1 0,500% 1 11000 8 0 2,94E-03 0 1,72E-03 0 1,000% 0 8500 9 -1 1,47E-03 1 2,58E-03 1 1,500% -1 6000 10 0 2,94E-03 0 1,72E-03 0 1,000% 0 8500 11 1 4,41E-03 1 2,58E-03 1 1,500% 1 11000 12 0 2,94E-03 0 1,72E-03 0 1,000% 0 8500 13 0 2,94E-03 0 1,72E-03 0 1,000% 0 8500 14 0 2,94E-03 -2 0,00E+00 0 1,000% 0 8500 15 1 4,41E-03 -1 8,61E-04 -1 0,500% 1 11000 16 0 2,94E-03 0 1,72E-03 -2 0,000% 0 8500 17 1 4,41E-03 1 2,58E-03 1 1,500% -1 6000 18 1 4,41E-03 1 2,58E-03 -1 0,500% 1 11000 19 -1 1,47E-03 1 2,58E-03 -1 0,500% -1 6000 20 0 2,94E-03 0 1,72E-03 2 2,000% 0 8500 21 0 2,94E-03 0 1,72E-03 0 1,000% 0 8500 22 -1 1,47E-03 -1 8,61E-04 1 1,500% 1 11000 23 1 4,41E-03 -1 8,61E-04 1 1,500% 1 11000 24 -2 0,00E+00 0 1,72E-03 0 1,000% 0 8500 25 2 5,88E-03 0 1,72E-03 0 1,000% 0 8500 26 -1 1,47E-03 -1 8,61E-04 -1 0,500% -1 6000 27 1 4,41E-03 1 2,58E-03 -1 0,500% -1 6000 28 0 2,94E-03 0 1,72E-03 0 1,000% -2 3500 29 0 2,94E-03 0 1,72E-03 0 1,000% 2 13500 30 -1 1,47E-03 -1 8,61E-04 1 1,500% -1 6000 31 0 2,94E-03 0 1,72E-03 0 1,000% 0 8500
Tabla 3-2: Diseño de experimentos rotacional para optimizar la velocidad específica de crecimiento de H. pluvialis
Capítulo 3 Optimización de las condiciones de cultivo en el crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
49
3.3 Resultados y discusión En la Tabla 3-3 se muestran los resultados del ajuste de los parámetros evaluados en
una matriz de varianza (ANOVA), donde se puede ver que el polinomio de segundo
orden describe el 93,5% de la variación de los datos experimentales de velocidad
especifica de crecimiento lo que se consideró satisfactorio. La velocidad específica de
crecimiento queda ajustada por la Ecuación 3.3, la cual se encuentra descrita por
variables codificadas en el intervalo (-2, 2). En la Figura 3-5 se muestra el diagrama de
Pareto para los parámetros evaluados, mostrando que el nitrógeno, al igual que las
interacciones Fósforo – CO2, Nitrógeno – Intensidad lumínica, Nitrógeno – Fósforo,
Nitrógeno – CO2 y Fósforo – intensidad lumínica, no tienen efecto significativo en la
velocidad específica de crecimiento con una confianza del 95%.
(Ecuación 3.3)
El parámetro que presentó mayor efecto en la velocidad específica de crecimiento fue el
porcentaje de CO2 en el aire de burbujeo, mostrando un efecto negativo o inhibitorio en el
crecimiento de la microalga nativa. Este resultado difiere con el encontrado por Sarada et
al. (2002a), ya que ellos encontraron un efecto positivo de esta variable y un óptimo de
aplicación en 1,54 %; de igual manera en la investigación de Kaewpintong et al. (2007)
se muestra un óptimo de crecimiento al utilizar 1% de CO2. Las microalgas son
microrganismos capaces de tolerar elevadas concentraciones de CO2, presentando
óptimos de producción de biomasa a niveles muy inferiores a los máximos tolerables, por
ejemplo especies tolerantes como Euglena gracilis puede crecer al ser sometida a
concentraciones entre 5 y 45 % de CO2 con un crecimiento óptimo a una concentración
de 5 %, comportamiento similar al obtenido en la presente investigación. Otras
microalgas como Chlorella sp. producen la máxima biomasa al ser sometidas a aireación
con 10 % de concentración de CO2 y se ha reportado crecimiento hasta un 40 % de
concentración (Salih, 2011).
La presencia de oxigeno también es importante en la asimilación del dióxido de carbono,
se ha encontrado que a bajas concentraciones de oxigeno disuelto se aumenta la
50 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
eficiencia fotosintética en un 14 %, mientras que la saturación genera un decaimiento en
un 35% de la eficiencia (Salih, 2011). Para la remoción del oxígeno se aireo el medio de
cultivo, lo cual puede llegar a saturarlo y reducir su eficiencia de absorción de CO2; se
puede utilizar otros gases paa la desorción del oxígeno generado, pero no solo se
aumentarían los costos de producción sino que se reduce la disponibilidad mínima de
oxígeno que se requiere para los procesos de fotorespiración.
The presence of oxygen plays a role in controlling the efficiency of CO2 uptake. Becker
[51] calculated that a concentration of CO2, as low as 10–6 mol/l (30 ppm) is sufficient to
maintain unlimited photosynthesis of the algae. On the other hand, experiments with
different O2 concentrations in the medium have shown the photosyn-thetic efficiency is
increased by 14% if almost no O2 is present in the medium but is reduced to about 35%
when the medium is saturated with 100% O2. However, an-other study showed that
oxygen concentrations ranging from 10 to 200% of ambient had no significant effects on
daily net carbon gain or total wet biomass production rates in this particular seaweed [40].
Generally speaking, the effects of
El segundo parámetro de mayor influencia en el crecimiento de H. pluvialis es la
intensidad de luz, mostrando un efecto positivo en la velocidad específica de crecimiento.
Sarada et al. (2002a) han encontrado por el contrario un efecto negativo de esta variable
en la producción de biomasa, mostrando un valor óptimo a bajas iluminancias; este
parámetro ha mostrado gran diferencia en las diferentes investigaciones, ya que en los
resultados de Cohen (1999), Harker et al. (1996) y Katsuda et al. (2004) se muestra
crecimiento y supervivencia de las células hasta niveles de baja irradiación, entre 2 y de
37 mol/m2s, para diferentes fuentes de luz (LEDs y lámparas fluorescentes), mientras
que las investigaciones de Choi et al. (2003) y Zhang et al. (2009) han mostrado óptimos
de crecimiento a irradiaciones de 90 mol/m2s y 100 mol/m2s respectivamente, en
ambos casos se realizó un aumento progresivo de la intensidad lumínica, obteniendo
crecimiento celular y acumulación de astaxantina en el mismo proceso.
Capítulo 3 Optimización de las condiciones de cultivo en el crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
51
Fuente de variación Coeficiente Valor estimado
Suma de cuadrados
Grados de libertad
Media suma de cuadrados F-Valor P-Valor
Constante ao 0,57339
X1:Nitrógeno a1 0,03148 0,02379 1 0,02379 3,33 0,0866
X2:Fósforo a2 0,03874 0,03601 1 0,03601 5,05 0,0391
X3:CO2 a3 -0,19534 0,91576 1 0,91576 128,33 0,0000 X4:Intensidad lumínica a4 0,10294 0,25434 1 0,25434 35,64 0,0000
X12 a11 -0,04425 0,05598 1 0,05598 7,85 0,0128
X1X2 a12 -0,01745 0,00487 1 0,00487 0,68 0,4209
X1X3 a13 0,01386 0,00308 1 0,00308 0,43 0,5208
X1X4 a14 0,01848 0,00546 1 0,00546 0,77 0,3945
X22 a22 -0,03690 0,03894 1 0,03894 5,46 0,0328
X2X3 a23 -0,03157 0,01595 1 0,01595 2,23 0,1544
X2X4 a24 0,01010 0,00163 1 0,00163 0,23 0,6390
X32 a33 -0,08548 0,20896 1 0,20896 29,28 0,0001
X3X4 a34 -0,05691 0,05182 1 0,05182 7,26 0,0159
X42 a44 -0,06203 0,11002 1 0,11002 15,42 0,0012
Total error 0,11418 16 0,00714
Total (corr.) 1,75514 30
R2 = 93,495 %
Tabla 3-3: Análisis de varianza (ANOVA) para los parámetros ajustados
52 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Figura 3-5: Diagrama de Pareto estandarizado para el efecto de los parámetros
ajustados sobre la velocidad específica de crecimiento.
La concentración de nitrógeno (NaNO3) y la concentración de fósforo (K2HPO4 y KH2PO4)
mostraron un efecto positivo en el crecimiento de Haematococcus pluvialis, pero el
nitrógeno no presentó diferencia significativa en la velocidad especifica de crecimiento.
Estos parámetros son de gran importancia en la acumulación de astaxantina en las
células, dado que las bajas concentraciones en el medio de cultivo genera estrés y bajas
tasas de crecimiento, pero autores como Harker et al. (1996) han observado que se
obtiene el máximo crecimiento de la microalga cuando ésta es sometida a una
concentración de nitrógeno (NaNO3) de 3 mM y de fósforo (K2HPO4 y KH2PO4) de 3,4
mM, mientras que se obtiene la máxima acumulación de astaxantina en ausencia total de
nitrógeno, una concentración de fosfato de 0,85 mM y 72 M de hierro. García-Malea et
al. (2005) alcanzaron una velocidad específica de crecimiento de 0,57 d-1 con una
concentración de nitrógeno en el medio de 10 mM de nitrato y acumulación de
astaxantina cuando la deficiencia de nitrógeno llegó a 0,2 mM.
Todos los efectos cuadráticos mostraron un efecto negativo en el crecimiento de la
microalga, así como la interacción entre la fuente de nitrógeno y la fuente de fósforo,
siendo todos los efectos significativos con 95 % de confianza. En las Figura 3-6, Figura
3-7 y el Anexo B se puede ver con mayor facilidad estos efectos en las superficies de
respuesta.
Capítulo 3 Optimización de las condiciones de cultivo en el crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
53
Figura 3-6: Efecto de los parámetros sobre la velocidad específica de crecimiento
Figura 3-7: Superficie de respuesta para la velocidad específica de crecimiento, 3,28 mM
NaNO3 y 2,58 mM de K2HPO4 y KH2PO4
Para el análisis el óptimo de la concentración de nitrógeno se tomó la derivada de la
54 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
(Ecuación 3.3 con respecto a
X1 manteniendo las otras variables constantes, llegando a la siguiente ecuación:
(Ecuación 3.4)
Igualando a 0 la (Ecuación
3.4 y despejando X1 se puede calcular el óptimo de la concentración de nitrógeno como:
(Ecuación 3.5)
Remplazando los parámetros de la ecuación y siguiendo el mismo procedimiento para la
concentración de fósforo, el porcentaje de CO2 en la aireación y la iluminancia se llega a
las siguientes expresiones:
Las concentraciones de nitrógeno y fósforo óptimas se encuentran, de acuerdo a estas
relaciones, cuando se tienen los más altos valores de CO2 en la aireación y de
irradiación, pero estas variables son inversamente proporcionales, es decir que el óptimo
de la concentración de nitrógeno es cuando se tiene la menor concentración de fósforo y
viceversa. Utilizando X2=-1, X3=1 y X4=1, el valor de la concentración de nitrógeno que
optimiza la velocidad de crecimiento es 0,919 (4,3 mM), y para el fósforo (X1=-1, X3=1 y
X4=1) es 1,278 (2,82 mM) (fuera del rango de investigación), estos valores están de
acuerdo a los encontrados por Harker et al. (1996) en donde obtiene el máximo
crecimiento de la microalga cuando es sometida a una concentración de nitrógeno
(NaNO3) de 3 mM y de fósforo (K2HPO4 y KH2PO4) de 3,4 mM, además en la
investigación de García-Malea et al. (2005) alcanzaron la máxima velocidad específica de
crecimiento con una concentración de nitrógeno de 10 mM.
Tanto para el porcentaje de CO2 en la aireación y la irradiación de luz, los valores
óptimos se encuentran cuando se tiene la más alta concentración de nitrógeno y la más
baja concentración de fósforo, pero el porcentaje de CO2 en la aireación tiene su óptimo
a elevadas irradiaciones, mientras que la irradiación lo presenta a bajos porcentajes de
Capítulo 3 Optimización de las condiciones de cultivo en el crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
55
CO2 en la aireación. Utilizando X1=-1, X2=1 y X4=1, el valor del porcentaje de CO2 que
optimiza la velocidad de crecimiento es -0,544 (0,728%), y para el fósforo (X1=-1, X2=1 y
X3=1) es 1,519 (12300 Lux) (por fuera del intervalo evaluado). Este resultado difiere al
encontrado por Sarada et al. (2002a), 1,54 %; pero es similar al reportado por
Kaewpintong et al. (2007) quienes muestran un óptimo de crecimiento al utilizar 1% de
CO2 en la aireación. El valor óptimo de la irradiación es similar a los publicados por
Cohen (1999), Harker et al. (1996) y Katsuda et al. (2004) donde muestran crecimiento y
supervivencia de las células hasta niveles de irradiación entre 2 y de 37 mol/m2s (3600
y 66000 Lux)
Estos resultados sugieren que el experimento puede reevaluarse en intervalos más
amplios para la concentración de fósforo así como para la irradiación, ya que estos
parámetros se encuentran por fuera del intervalo evaluado.
En el proceso de optimización se encontró que la máxima velocidad específica de
crecimiento predicha, para los límites evaluados entre el intervalo de confianza, fue de
0,825 días -1, con los siguientes valores de los parámetros evaluados: Dióxido de carbono
0,51%, nitrógeno (NaNO3) 3,28x10-3 M, fósforo (K2HPO4 y KH2PO4) 2,58x10-3 M,
Intensidad de luz 11000 Lux, superando los valores encontrados en el capítulo 2 de 0,52
días -1 en la comparación de diferentes medios de cultivo. Además, este valor es superior
a los reportados en investigaciones como la de Fábregas et al. (2001) con una velocidad
específica de crecimiento de 0.13 días-1 utilizando el medio de cultivo OHM, la
investigación de Kaewpintong et al. (2007) donde reportan valores de 0,20 días -1 para el
medio de cultivo F1 o el reporte de Issarapayup et al. (2009) en el que se muestran
velocidades de crecimiento de 0,225 días -1 para el medio F1.
Las elevadas velocidades de crecimiento predichas por el modelo en la presente
investigación, sumadas a los elevados porcentajes de acumulación de astaxantina
obtenidos por el método de concentración e irradiación de luz descritos en el capítulo 2,
muestran el potencial que tiene la cepa nativa de Haematococcus pluvialis para producir
este caroteno a nivel industrial utilizando una metodología de dos pasos para el
crecimiento y el estrés de la microalga.
56 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
4. Diseño, montaje y evaluación de un fotobiorreactor para el crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
Resumen Se diseñó y construyó un fotobioreactor tipo airlift para el crecimiento de una cepa nativa
de la microalga Haematococcus pluvialis. Se realizó una caracterización hidrodinámica
reactor encontrando tiempos de mezclado de 130 a 240 s, retenciones de gas inferiores
al 6 % del volumen del reactor, y coeficientes de transferencia de masa para el oxígeno y
el dióxido de carbono de 9,8 y 8,6 h-1 respectivamente. Se encontró una velocidad
máxima de crecimiento, para una aireación de 0,05 vvm, de 0,597 días-1, utilizando las
condiciones óptimas encontradas anteriormente: Dióxido de carbono 0,51%, nitrógeno
(NaNO3) 3,28x10-3 M, fósforo (K2HPO4 y KH2PO4) 2,58x10-3 M, Intensidad de luz 11000
Lux.
Palabras claves: Haematococcus pluvialis, velocidad específica de crecimiento,
retención de gas, tiempos de mezclado, coeficientes globales de transferencia de masa.
Abstract An airlift photobioreactor was designed, built and used for growing a native strain of the
microalgae Haematococcus pluvialis. A hydrodynamic characterization of the bioreactor
was performed, finding a range of mixing times between 130 and 240 s, gas retention of
less than 6% of the reactor volume, oxygen mass transfer coefficient of 9,8 h-1 and carbon
dioxide mass transfer coefficient of 8,6 h-1. The specific growth rate of the algae for
aeration of 0,5 vvm was 0.597 day -1, using the same conditions for the last experiment:
carbon dioxide 0,51%, nitrogen (NaNO3) 3,28x10-3 M, phosphor (K2HPO4 y KH2PO4)
2,58x10-3 M, irradiance 11000 Lux.
58 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Keywords: Haematococcus pluvialis, specific growth rate, gas hold up, mixing time,
mass transfer coefficient.
4.1 Introducción Las microalgas son microorganismos fotosintéticos que tiene un alto valor industrial; la
microalga Haematococcus pluvialis es uno de los mejores productores de astaxantina, ya
que tiene la capacidad de acumular más del 3% en peso del pigmento (Hagen et al.,
2001); sin embargo, esta microalga presenta una baja productividad de astaxantina que
impiden su uso comercial, debido a factores como un lento crecimiento, baja
concentración celular y alta susceptibilidad a daños hidrodinámicos, comparada con la
microalga unicelular Chlorococcum sp.: ésta última microalga presenta, sin embargo, una
muy baja acumulación de astaxantina (Zhang & Lee, 1997).
La astaxantina ha adquirido gran interés industrial, ya que ha sido ampliamente utilizada
en la acuicultura como aditivo para la pigmentación de salmón, trucha, camarón, algunos
peces ornamentales y muchos crustáceos (Lorenz & Cysewski, 2000), así como en la
industria farmacéutica y la industria cosmética han realizado avances importantes en sus
estudios, mostrando su elevada actividad antioxidante, excelentes propiedades como
agente fotoprotector (luz UV), propiedades para la salud ocular, de la piel, del corazón y a
nivel celular y otros usos potenciales como anti-inflamatorio, anti-cancerígeno,
desintoxicante, en enfermedades neurodegenerativas y en la respuesta inmune (Guerin
et al., 2003).
Para células de bajo crecimiento y alta sensibilidad como H. pluvialis, es recomendado el
uso de biorreactores agitados neumáticamente frente a los reactores agitados
mecánicamente, gracias a la simplicidad de su diseño y al bajo estrés hidrodinámico
(Kaewpintong et al., 2007). Ejemplos de estos reactores neumáticos son las columnas de
burbujeo y los reactores airlift, los cuales han sido usados en numerosas aplicaciones en
procesos biotecnológicos.
Capitulo 4 Diseño, montaje y evaluación de un fotobiorreactor para el
crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
59
Se han reportado daños celulares en la microalga, como pérdida de los flagelos y muerte
celular a elevados flujos de aireación, por ejemplo Vega-Estrada et al. (2005) muestran el
efecto de la velocidad superficial del gas a la salida del dispersor (utilizando diferentes
tipos de aspersores) y la velocidad de entrada de gas (medida en función del flujo
volumétrico de entrada), sobre el crecimiento de H. pluvialis, en un fotobioreactor tipo
airlift de pared plana, encontrando que los daños celulares por efectos hidrodinámicos
son reducidos cuando el biorreactor es operado con una velocidad superficial y de
entrada de gas de 12 mm/s and 22.8 m/s respectivamente. Los autores calcularon el
coeficiente volumétrico de transferencia de masa para el fotobioreactor, y encontraron
que es de 10 h-1 y 32 h-1 para velocidades superficiales de 6 y 24 mm/s respectivamente.
En el presente trabajo de investigación se muestra la caracterización hidrodinámica de un
fotobioreactor tipo airlift, el cual fue diseñado y construido para el cultivo vegetativo de la
microalga nativa de Haematococcus pluvialis. Se presenta los coeficientes de
transferencia de masa para el oxígeno y el dióxido de carbono para diferentes flujos de
aireación, medida en vvm, en cultivos por lotes.
4.2 Materiales y métodos
4.2.1 Microorganismos y condiciones de cultivo La microalga H. pluvialis (LAUN 029) fue suministrada por el Laboratorio de microalgas
del Departamento de Biología de la Universidad Nacional de Colombia. La microalga fue
mantenida en medio líquido BBM estándar (Anexo A) (Andersen, 2005) esterilizado en
autoclave a 121°C durante 30 minutos. La temperatura del cultivo fue de 24 ± 2 °C,
utilizando lámparas fluorescentes Sylvania Daylight F48T12/D 39W como fuente de
iluminación artificial con iluminancia de 2500 ± 50 Lux, fotoperiodo de 18 h horas de luz y
6 de oscuridad (18:6 LO), aireación de 0,5 vvm empleando aire atmosférico filtrado con
membranas de 0,22 μm. El mantenimiento se realizó en botellas de vidrio planas de 4,5
cm de espesor y capacidad de 330 mL con volumen de cultivo de 200 mL; se realizó
resiembra semanalmente empleando inóculo del 10% v/v.
60 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Los inóculos fueron realizados en botellas de vidrio con capacidad para 330 mL con
volumen de cultivo de 200 mL ± 0,5 mL, utilizando el medio líquido BBM (Anexo A)
(Andersen, 2005) modificado de acuerdo con los valores óptimos de crecimiento
obtenidos en el capítulo 3 nitrógeno (NaNO3) 3,28x10-3 M y fósforo (K2HPO4 y KH2PO4)
2,58x10-3 M). Se ajustó el inóculo para una concentración inicial de 4,0 x 104 Cel/mL, y se
realizaron dos curvas de crecimiento por conteo diario a 0,5 vvm y 1 vvm; en los cultivos
se aplicó 0,51 % de CO2 en la aireación y una intensidad de luz de 11000 Lux. Se fijó la
temperatura de 25 ± 0,5 °C, fotoperiodo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad
(12:12 LO). Para la iluminación se utilizaron 5 cintas de LED’s de referencia SMD3528 de
luz blanca rodeando la pared externa del biorreactor, conectados a un regulador de
potencia que permitió variar la intensidad lumínica, la cual se midió empleando un
luxómetro marca VWR Scientific 21800-014 y el fotoperiodo se fijó empleando una
temporizador digital marca Steren ver figura 4-1.
Figura 4-1: Iluminación con cintas LED tipo SMD del fotobiorreactor tipo airlift
Para la mezcla de los gases de aireación se construyó un mezclador compuesto por un
manómetro y un regulador de presión para cada una de los gases, así como rotámetros
marca AALBORG Instruments 112-02 de 0 a 150 mm para CO2 y Dwyer Instruments VFB
de 4 L para aire (Figura 4-2). El suministro de CO2 se realizó con un cilindro de gas grado
industrial, fijando su presión igual que la del aire en 5 psi; la mezcla se humidificó para
evitar la evaporación del medio de cultivo. Se instaló en la entrada de aire una válvula de
conexión rápida para realizar el cambio entre aire y nitrógeno según su necesidad. Para
la inyección de nitrógeno se utilizó un cilindro de nitrógeno grado industrial.
Capitulo 4 Diseño, montaje y evaluación de un fotobiorreactor para el
crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
61
4.2.2 Descripción del fotobioreactor airlift Se construyó un fotobioreactor de 1,8 L de capacidad con un volumen de 1,5 L útiles de
trabajo, en vidrio borosilicato para permitir la entrada de luz (1). El vidrio cilíndrico se
construyó con una expansión del diámetro en la parte superior para reducir la velocidad
del medio de cultivo en la zona de desgasificación. El reactor cuenta con puertos para
sensores de oxígeno disuelto (2) y pH (3), así como un puerto para entrada de
termocupla (4), regulando la temperatura por medio del ingreso de agua a 25 ± 0,5 °C a
través de un intercambiador de calor interno (5).
Número Descripción Número Descripción
1 Entrada de aire 8 Manómetro para aire- nitrógeno
2 Entrada de CO2 9 Regulador de presión para aire nitrógeno
3 Salida de mezcla 10 Rotámetro para CO2
4 Cilindro de CO2 11 Rotámetro para aire
5 Humidificador de aire 12 Cilindro de Nitrógeno
6 Manómetro para CO2
7 Regulador de presión para CO2
Figura 4-2: Esquema de mezclado de aire y dióxido de carbono, control de flujo de aire y
nitrógeno
62 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Se incorporó un muestreador en la parte baja de la zona de descenso del reactor, para
obtener muestras representativas (6). De igual manera se instaló un tubo de ingreso de la
aireación (7), con un agujero distribuidor de 1,97 mm2 de área (8); el sistema permite
intercambiar diferentes tipos de distribuidores de gas para permitir su evaluación. Para el
control de pH se cuenta con un puerto de inyección de tres entradas para el ingreso de
ácido y base cuyo flujo se regula (9), mediante un controlador de pH conectado a 2
bomba peristálticas. Por último se construyó un intercambiador de calor para condensar
el agua evaporada o arrastrada por el aire de salida del reactor (10) el cual es refrigerado
por agua fría (Figura 4-3).
El tubo central se construyó en vidrio borosilicato (11), y se aseguró a la tapa por medio
de un tubo roscado que permite modificar la altura de trabajo de la zona de ascenso (12),
permitiendo variar el área de flujo de líquido en la parte superior e inferior del reactor; el
área de flujo de la zona de ascenso es de 2,03 x10-3 m2 y la relación de áreas
transversales de la zonas de ascenso y descenso es de 0,187. El área de iluminación
para un volumen de trabajo de 1,5 L es de 556 cm2. Todas las partes del reactor se
construyeron en acero inoxidable 316 y se utilizó el software Solid Edge v18 ® (Siemens
PLM Software) para la realización de los planos de diseño, los cuales son presentados
en el Anexo C.
Capitulo 4 Diseño, montaje y evaluación de un fotobiorreactor para el
crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
63
Figura 4-3 Fotobiorreactor tipo airlift para el cultivo de microalgas
4.2.3 Caracterización hidrodinámica Para la caracterización hidrodinámica se evaluaron los parámetros tiempo de mezclado,
retención del gas, velocidad del gas en la zona de ascenso, velocidad del líquido en la
64 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
zona de descenso y el coeficiente global de transferencia de masa tanto para el oxígeno
como para el CO2 disueltos. Se evaluaron 4 distintos flujos de aireación, medidos en
función de la relación de aire de entrada y el volumen del reactor (0.25, 0.5, 0.75 y 1 vvm)
4.2.4 Tiempo de Mezclado El tiempo de mezclado se determinó usando la técnica del trazador ácido (Cristi, 1989):
se inyectaron 0,3 mL de una solución de ácido sulfúrico 6N en la parte central de la zona
de ascenso del fotobioreactor. La señal de pH se registró con un electrodo de pH marca
Mettler Toledo, modelo InPro 3253/225/Pt1000, en la parte inferior de la zona de
descenso, a una altura de 3 cm sobre la base del reactor. Se determinó el tiempo de
mezclado como el tiempo necesario para alcanzar el 99% de la concentración final de la
solución, utilizando agua destilada y manteniendo la temperatura en 25 ± 0.5 °C.
4.2.5 Retención de gas La retención de gas (εG ) fue determinada por la técnica de expansión de volumen (Chisti
& Moo-Young, 1987) descrita por (Díaz, 2008), se determinó a partir de la diferencia
entre los niveles de líquido no gaseado y gaseado:
(Ecuación 4.1)
Donde h representa la altura del líquido y los subíndices G y L representan al líquido
gaseado y no gaseado respectivamente. Para ello se tomaron videos donde se
obtuvieron entre 5 y 8 repeticiones de las medidas.
4.2.6 Velocidad del gas en la zona de ascenso La velocidad del gas en la zona de ascenso se calculó con el área transversal de flujo y
el caudal de aire alimentado de acuerdo con la siguiente ecuación:
(Ecuación 4.2)
Donde UGR es la velocidad del gas a la entrada, en m/s, QG es el caudal de gas a la
entrada del dispersor, en m3/s y AR es el área transversal del tubo de ascenso o zona de
ascenso (2,03 x10-3 m2).
Capitulo 4 Diseño, montaje y evaluación de un fotobiorreactor para el
crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
65
4.2.7 Velocidad del líquido en la sección de descenso La velocidad de descenso del medio de cultivo se determinó mediante la técnica visual
del trazador sólido, determinando la longitud y tiempo de un polímero de igual densidad
al agua en la zona de descenso (Díaz, 2008). Se determino el tiempo necesario para que
la partícula esférica de 1 mm de diámetro cruce dos límites establecidos, este
procedimiento se repitió 10 veces.
4.2.8 Coeficiente volumétrico global de transferencia de masa El coeficiente volumétrico global de transferencia de masa (kLa) se evaluó por la técnica
dinámica de desgasificación (Cristi, 1989). Se utilizó el medio líquido BBM y se aireó por
2 horas hasta alcanzar la concentración máxima de oxígeno, se cerró el ingreso de aire y
se permitió la entrada de nitrógeno para desairear el sistema hasta una concentración de
oxigeno baja (Aproximadamente 50%); luego, se permitió 1 minuto para desalojar todas
las burbujas de nitrógeno restantes y se reinició el burbujeo con aire a un caudal
determinado por las vvm evaluadas, hasta alcanzar de nuevo alta concentración de
oxígeno disuelto. Se hizo seguimiento a la concentración de oxígeno disuelto en ppm
cada 15 segundos, hasta alcanzar el equilibrio, utilizando un sensor multi-parámetro
HI9828 marca HANNA instruments, ubicado en la zona de descenso a la mitad de la
altura del biorreactor. Para todos los experimentos la temperatura se fijó en 25 ± 0.5 °C.
La velocidad de transferencia de oxígeno está relacionada con el coeficiente global de
transferencia de masa kLaL, por medio del siguiente balance de oxígeno en la fase
líquida:
(Ecuación 4.3)
Donde CL y C* son la concentración instantánea y de saturación de oxígeno disuelto
respectivamente. Suponiendo estado estacionario y que el coeficiente global de
transferencia de masa es invariante con el tiempo se puede integrar la ecuación:
(Ecuación 4.4)
66 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Se calcula el aprovechamiento fraccional del equilibrio (E), y se grafica el Ln(1-E) vs el
tiempo, donde la pendiente es el coeficiente global de transferencia de masa; CLO es la
concentración inicial de oxígeno disuelto en el instante donde reinicia la aireación.
El coeficiente global de transferencia de masa para el dióxido de carbono se calculó por
medio de la correlación de la difusividad de las dos fases, de acuerdo a la teoría de la
penetración (Talbot et al., 1990), utilizando la siguiente ecuación:
(Ecuación 4.5)
Utilizando las correlaciones de Wilke y Chang para el agua destilada a 25 °C el factor
[DCO2/DO2]0,5 es 0,884 (Treybal, 1987).
4.2.9 Medición del crecimiento El crecimiento fue determinado por conteo celular diario hasta alcanzar la fase
estacionaria (8 días), utilizando una cámara de Neubauer.
4.2.10 Ajuste de cinéticas de crecimiento A cada cultivo se le ajustó el modelo de crecimiento logístico descrito en la Ecuación 4.6
(Ecuación 4.6)
En la Ecuación 4.6 X es la densidad celular (células·mL-1), X0 y Xmax son las densidades
celulares inicial y máxima respectivamente (células·mL-1), μ es la Velocidad específica de
crecimiento aparente (día-1) y t es el tiempo de cultivo (día). Para el ajuste se empleó el
software TableCurve 2D® (Systat Software Inc., San Jose, California, USA).
4.3 Resultados y discusión
4.3.1 Tiempo de Mezclado Los tiempos de mezclado obtenidos se encuentran entre 100 y 250 s, valores que se
encuentran entre los rangos reportados en otras investigaciones. Díaz (2008) muestra
tiempos de mezclado entre 100 y 420 s, para flujos entre 10,8 y 60 L/min, en un
Capitulo 4 Diseño, montaje y evaluación de un fotobiorreactor para el
crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
67
biorreactor tipo airlift de 20 L para medios de cultivo con viscosidad similar a la del agua.
Se observó una disminución en los tiempos de mezclado a medida que aumenta el flujo
de aireación, ajustándose a un modelo exponencial con un 97,9 %.
Figura 4-4 Respuesta ante impulsos ácidos del electrodo de pH
Figura 4-5 Tiempos de mezclado en función del flujo de aireación
2,503,003,504,004,505,005,506,006,507,00
0 200 400 600 800 1000
pH
Tiempo (s)
0,25 vvm
0,75 vvm
0,5 vvm
1 vvm
y = 292,16e-0,51x R² = 0,979
0
50
100
150
200
250
300
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 1,75
Tiem
po d
e M
ezcl
ado
(s)
Caudal de gas (L/min)
68 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
4.3.2 Retención del gas Se observó un aumento progresivo de la retención del gas a medida que aumenta el flujo
de aireación al reactor; el máximo valor obtenido no supera el 6 % del volumen del
reactor (1,590 L/min), siendo este volumen inferior al volumen total del equipo (1,8 L),
evitando problemas de arrastre del medio de cultivo en la corriente de salida de la
aireación. Este parámetro es de gran importancia ya que describe el volumen de gas que
es capaz de retener el medio de cultivo, permitiendo la transferencia de materia entre las
fases. Los resultados se muestran en la Figura 4-6.
4.3.3 Velocidad de descenso del líquido Se observó aumento progresivo de la velocidad de descenso en función de la velocidad
de flujo de gas en la zona de ascenso, esto se debe a que la velocidad de circulación del
líquido depende de la diferencia en la retención de gas entre la sección de ascenso y de
descenso, el tiempo de mezclado y el área interfacial, principalmente (Díaz, 2008). Se
ajustaron los datos a una ecuación potencial, que describe con un 99,64 %, los datos
experimentales; este modelo muestra que al incrementar la velocidad del gas en la zona
de ascenso se obtiene un incremento en la velocidad de descenso del líquido, ya que se
reduce la densidad en la zona de ascenso (oxígeno disuelto), impulsando así el líquido
desairado en la zona de descenso.
Figura 4-6 Retención de gas en función del flujo de aireación
y = 0,0024x + 0,0224 R² = 0,9919
0,000,010,020,030,040,050,060,07
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0
Rete
nció
n de
l gas
Velocidad de aireación (mm/s)
Capitulo 4 Diseño, montaje y evaluación de un fotobiorreactor para el
crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
69
Figura 4-7 Velocidad de descenso del medio líquido
4.3.4 Coeficientes globales de transferencia de masa La Figura 4-8 muestra la curva de desgasificación y gasificación de la concentración de
oxígeno disuelto para un flujo de 0,25 vvm (las otras curvas se pueden ver en el Anexo
D). Los datos obtenidos se linealizaron por medio de la Ecuación 4,4 y se calculó la
pendiente para cada uno de los flujos, obteniendo en todos los casos un ajuste superior
al 98 % (Figura 4-9 –Anexo D).
Figura 4-8 Perfil de concentración de Oxígeno disuelto para una flujo de 0,25 vvm
y = 1,7071x0,4636 R² = 0,9964
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,000 0,005 0,010 0,015
Velo
cida
d de
dec
enso
del
liqu
ido
(m/s
)
Velocidad del gas en la zona de ascenso m/s
40
50
60
70
80
90
100
0 500 1000 1500
Oxi
geno
dis
uelto
%
Tiempo (s)
70 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Figura 4-9 Linealización de los perfiles de concentración para el oxígeno disuelto para un
flujo de aireación de 0,25 vvm
Los coeficientes globales de transferencia de masa obtenidos para el oxígeno están entre
el rango de 4 y 10 h-1, valores similares a los obtenidos por otras investigaciones. Vega-
Estrada et al. (2005) muestran en su trabajo que para velocidades de aireación de 5 y 25
mm/s de gas, se obtienen coeficientes globales de transferencia de oxígeno de 10 y 32 h-
1, mientras que (Díaz, 2008) muestra coeficientes globales mayores utilizando flujos de 9
a 42 L/min en un biorreactor de 20 L, con valores de 25 y 100 h-1 respectivamente. Estas
grandes diferencias son causadas principalmente por el uso de diferentes difusores de
aire, lo que permite que el tamaño de las burbujas tengan mayor área de transferencia.
Los coeficientes de transferencia de CO2 fueron menores en todos los experimentos
comparados a los del oxígeno, dado que la difusivad del dióxido de carbono es menor
que la del oxigeno en agua a 25 C̊.
y = 0,00114x - 0,37982 R² = 0,98704
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
-Ln(
1-E)
Tiempo (s)
Capitulo 4 Diseño, montaje y evaluación de un fotobiorreactor para el
crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
71
Figura 4-10 Coeficientes globales de transferencia de masa en función del flujo de
aireación
4.3.5 Evaluación del crecimiento de la microalga En la Figura 4-11 se muestran las curvas de crecimiento de la cepa nativa de
Haematococcus pluvialis a dos flujos de aireación, 0.5 y 1 vvm. Se pudo observar lento
crecimiento para el flujo de 1 vvm. Autores como Krichnavaruk et al. (2005) reportan
para Chaetoceros calcitrans reducción en el crecimiento para velocidades de aireación
superiores a 40 mm/s y Vega-Estrada et al. (2005) han encontrado inhibición para la
microalga Haematococcus pluvialis para velocidades de gas en la zona de ascenso
superiores a 12 mm/s, la misma velocidad evaluada en el presente trabajo (1 vvm).
La velocidad especifica de crecimiento de la microalga fue de 0,597 días-1, siendo inferior
al óptimo encontrado en el capítulo 3 de 0,825 días -1, utilizando las mismas condiciones
de cultivo, medio BBM, concentración de nitrógeno (NaNO3) 3,28x10-3 M, concentración
de fósforo (K2HPO4 y KH2PO4) 2,58x10-3 M, porcentaje de dióxido de carbono en la
aireación 0,51%, Intensidad de luz 11000 Lux, temperatura 25 ± 0,5 °C y fotoperiodo de
12 horas de luz y 12 horas e oscuridad (12:12 LO). Esto puede explicarse porque la
0
2
4
6
8
10
12
0 2 4 6 8 10 12 14
kLa
(h-1
)
Velocidad de gas (mm/min)
Oxígeno
CO2
72 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
disponibilidad de luz en el reactor es menor que la disponible en los ensayos a nivel de
laboratorio, en los biorrectores a de 100 mL la distancia promedio que debió pasar la luz
fue de 5 cm, mientras que en reactor airlift la distancia promedio fue de 12 cm, además
las células que se encuentran en la zona de ascenso no tienen la misma intensidad que
las células en la zona de descenso, ya que se encuentran más cerca de la fuente de luz y
el tubo central del reactor genera una resistencia adicional al paso de luz. Otro efecto
importante fue la presión atmosférica, los experimentos a nivel de laboratorio se
realizaron a una presión atmosférica de 560 mmHg y los experimentos en el reactor airlift
se realizaron a una presión atmosférica de 670 mmHg, lo que representa una mayor
solubilidad del oxigeno y del dióxido de carbono. Al aumentar la concentración de
oxigeno disuelto se promueven las reacciones de fotorespiración reduciendo la
producción de biomasa, además al aumentar la concentración de dióxido de carbono se
producirá un efecto inhibitorio del crecimiento de acuerdo a los resultados encontrados
en el capitulo 2 de la presente investigación.
Vega-Estrada et al. (2005) reportan 5 x104 y 1,1 x 106 Cel mL-1 como la concentración
inicial y máxima obtenida, para un flujo de 0,5 vvm y fotoperiodo de 12 horas de luz y 12
de oscuridad en un periodo de 18 días, obteniendo una productividad de 5,8 Cel mL-1día-1
superando la productividad de 2,41 Cel mL-1día-1 encontrada en el presente trabajo (
Figura 4-11).
0,0E+002,0E+044,0E+046,0E+048,0E+041,0E+051,2E+051,4E+051,6E+051,8E+052,0E+05
0 2 4 6 8 10
# Ce
l/ m
L
Tiempo (días)
0,5 vvm
1 vvm
Capitulo 4 Diseño, montaje y evaluación de un fotobiorreactor para el
crecimiento de la microalga nativa Haematococcus pluvialis
73
Figura 4-11 Curva de crecimiento de la microalga H. pluvialis en un fotobioreactor tipo
airlift
5. Conclusiones y recomendaciones
5.1 Conclusiones La microalga nativa de H. pluvialis no presentó diferencia significativa en el crecimiento
cuando es sometida a diferentes medios de cultivo (BBM, BG11, OHM, F1 y BBM:BG11),
por lo cual se recomienda utilizar el medio BBM por ser de mayor facilidad y economía
siendo un medio de cultivo estándar. Cuando las células se sometieron estrés por
salinidad en el medio no se presentó acumulación significativa de astaxantina y se
observo muerte celular a una concentración de 2,5 g/L; por el contrario al utilizar altas
intensidades de luz, las células fueron capaces de acumular 32,99 m/mL de
astaxantina.
Sin embargo si las células son concentradas e iluminadas por altas irradiaciones se
puede lograr una acumulación de 59,23 m/mL de astaxantina, evitando airear 15 días
más el medio de cultivo como se realiza en los otros métodos de estrés celular, siendo la
opción más rentable y llamativa para su implementación industrial.
Al evaluar los efectos del nitrógeno y de fósforo en el medio de cultivo, se encontró un
efecto positivo en el crecimiento, al igual que al aumentar la intensidad de luz. Caso
contrario sucedió con la concentración de CO2 que produjo efectos inhibitorios sobre el
crecimiento, dado que su valor óptimo se encuentra en el límite inferior evaluado por la
presente investigación. Se encontró las condiciones óptimas de cultivo de dióxido de
carbono 0.51%, nitrógeno (NaNO3) 3,28x10-3 M, fósforo (K2HPO4 y KH2PO4) 2,58x10-3 M,
Intensidad de luz 11000 Lux.
Las elevadas velocidades de crecimiento obtenidas en la presente investigación,
sumadas a los elevados porcentajes de acumulación de astaxantina obtenidos por el
método de concentración e irradiación de luz, muestran el potencial que tiene la cepa
76 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus
pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
nativa de Haematococcus pluvialis para producir este caroteno a nivel industrial utilizando
una metodología de dos pasos para el crecimiento y el estrés de la microalga.
El fotobiorreactor que se diseñó y construyó presenta una retención del gas para los
flujos evaluados menor al 6% del volumen total del reactor permitiendo un volumen de
trabajo de 1.5 litros. Los coeficientes de transferencia de masa para el oxígeno y para el
dióxido de carbono se encontraron dentro de los valores utilizados en otros biorreactores
permitiendo la disponibilidad de dióxido de carbono en el medio de cultivo.
Se encontró que los altos flujos de aireación generan bajo crecimiento de la microalga (1
vvm), mientras que al utilizar flujos intermedios la velocidad específica de crecimiento es
de 0.597 días -1, que a pesar de ser inferior al óptimo encontrado a nivel de laboratorio,
es superior al encontrado en otras investigaciones.
5.2 Recomendaciones Se recomienda evaluar diferentes tipos de distribuidores de aire en el biorreactor tipo
airlift, así como diferentes flujos de aireación (vvm) para encontrar la velocidad de
crecimiento óptima en el reactor.
Se recomienda además, evaluar diferentes intensidades de luz y encontrar una función
de transferencia de luz dado que el diámetro del reactor puede generar gradientes de
crecimiento.
Otro factor importante a evaluar en investigaciones futuras es la extracción de
astaxantina de la célula; se recomienda el uso de fluidos supercríticos.
Evaluar a nivel de laboratorio el punto óptimo encontrado por la regresión estadística
sobre las condiciones de crecimiento, así como su evaluación en el biorreactor por lote
alimentado y el crecimiento y la acumulación de Astaxantina como variables simultáneas
en el reactor airlift
A.
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l 2· 2
H2O
18
3.8
mg
25 m
g 9.
78 m
g 36
mg
73 m
g 3.
676
g 0.
11 g
KN
O3
0.5
g 10
mg
0.41
g
0.
3 g
0.
41 g
NaN
O3
1.
5 g
Na 2
HPO
4
0.
03 g
30 m
g 1.
5 g
0.03
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195
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g 1.
778
g
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12 m
g
12
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mg
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75
mg
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mg
0.
031
g K
H2P
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17
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2.
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30.8
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g
H
2SO
4
0.99
mg
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5FeO
7 ·5H
2O
2.21
mg
2.
62 m
g
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4 ·7H
2O
20.9
mg
4.97
6 m
g
8.
3 m
g 0.
417
g
M
gSO
4 ·7H
2O
61.6
mg
4 m
g 16
.41
mg
75 m
g 24
.6 m
g 1.
231
g 0.
246
g 0.
024
g Zn
SO4
0.72
mg
8.82
7 g
0.01
4 m
g 71
.89
mg
CuS
O4 ·
5H2O
0.
62 m
g 1.
572
g 0.
008
mg
0.07
9 m
g 0.
012
mg
62.4
2 m
g 0.
012
mg
N
a 2M
oO4·
2H
2O
0.07
mg
0.
08 m
g 0.
39 m
g 0.
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mg
7.26
mg
0.12
mg
C
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·2H
2O
0.05
mg
0.
0078
mg
0.
0005
mg
4.67
mg
H3B
O3
10
.948
mg
2.
86 m
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mg
C
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3
0.
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g
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g
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0.
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mg
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L
B. Anexo: Superficies de respuesta
Figura B-1: Superficie de respuesta para la velocidad específica de crecimiento, 1% CO2
y 8500 Lux
Figura B-2: Superficie de respuesta para la velocidad específica de crecimiento, 1% CO2
y 1,72 mM de K2HPO4 y KH2PO4
80 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Figura B-3: Superficie de respuesta para la velocidad específica de crecimiento, 2,94
mM NaNO3 y 8500 Lux
C. Anexo: Planos de diseño fotobioreactor tipo airlift
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Títu lo Reactor airlift
A4 Plano Rev
Archivo: reactor airlift.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DANIEL RAMÍREZDibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Aireador 1
A4 Plano Rev
Archivo: Aireador 1.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
1/4
9 7/8
1 1/2
Soldadura aireador 2
90°
1 1/83/8
#10-32 UNFInterna
O 1/8O 1/4
#10-32 UNF
Conexión para manguera
1/8
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Aireador 2 (realizar 2 piezas)
A4 Plano Rev
Archivo: Aireador 2.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
A
A
CORTE A-A
3/8-24 UNF 1/4
3/4 1/32 X 45°
1/2
1/8
A
A CORTE A-A
1/4
15/16
7/8
#10-32 UNF#10-32 UNFExterna
#10-32 UNFInterna
1/8
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en milímetrosángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Aireador 3
A4 Plano Rev
Archivo: Aireador 3.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
1 5/16
90°
3/8
3/8
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en milímetrosángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Aireador 3
A4 Plano Rev
Archivo: Aireador 4.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
A
A
CORTE A-A
#10-32 UNF
3/8
1/8
1/4
1/16
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Ajuste 2-1 ( 2 piezas)
A4 Plano Rev
Archivo: Ajuste 2-1.dft
Escala Peso Hoja 1 de 1
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
A
A
CORTE A-A 3/4
3/16 3/161/4
1/161/16
13/41 3/161/2
1/16
13/16
3/4-16 UNF
B
DETALLE B
1/16
1/32
O 1
O 7/8
1
1-12 UNF
Grafilado
1/32 X 45° A
A
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Títu lo Ajuste 2-2 (3 piezas)
A4 Plano Rev
Archivo: Ajuste 2-2.dft
Escala Peso Hoja 1 de 1
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
A
ACORTE A-A
3/41 3/16
9/16
1/8
1/32 X 45°
1-12 UNF
1/32 X 45v
Grafilado
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Ajuste 2-3 (2 piezas)
A4 Plano Rev
Archivo: Ajuste 2-3.dft
Escala Peso Hoja 1 de 1
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
A
ACORTE A-A
5/16
1/8
3/47/8
1/32 X 45°
7/8 13/16 1/2
1/81/16
1/8
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Cierre central 2
A4 Plano Rev
Archivo: cierre central 2.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
A
A CORTE A-A
1/4-28 UNF
O 1/8 O 1/8
5/8 1/4 5/8
4 1/163 13/16
1/4
1/4
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Cierre central 1
A4 Plano Rev
Archivo: cierre central.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
A
ACORTE A-A
1 7/8
1/41/8
1/4
1/4-28 UNFInterna
1 1/4-12 UNF
1 5/8
B
DETALLE B
1/16
1/32
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Control de pH 2
A4 Plano Rev
Archivo: Control pH 2.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
1/8 1/16
1 1/2
Control de pH 2
Control de pH
5/8
Soldadura piezacontrol de pH y 3 piezas de control de pH 2
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Control de pH
A4 Plano Rev
Archivo: Control pH.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
1 1/4
O 1/8
O 7/16120°
3/16
3/16
1/32
A
DETALLE A
1/16
Grafilado
1/32
3/4-16 UNF
GrafiladoLos 3 agujeros van soldados a la pieza control de pH 2
1
O 1O 7/8
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Pieza Enfriamiento 1-1
A4 Plano Rev
Archivo: Enfriaminto 1-1.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
1/32
O 11/16
1/32
11/16
Soldadura Tapa fondo enfriamiento
Soldadura Enfriamiento 1-18
Soldadura PiezaEnfriamiento 1-3
TAPA FONDO ENFRIAMIENTO
5/8
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Enfriamiento 1-3
A4 Plano Rev
Archivo: Enfriaminto 1-3.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
1 1/4
1/4
O 1/4
5/32
7/16
1
A DETALLE A
1/16
1/32
3/4-16 UNF
3/4
3/16
3/4-16 UNF
Grafilado
Soldadura PiezaEnfriamiento 1-1
Soldadura PiezaEnfriamiento 1-4
Soldadura PiezaEnfriamiento 1-5
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Enfriamiento 1-4
A4 Plano Rev
Archivo: Enfriaminto 1-4.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
8 7/16
1/4
8 1/16A
DETALLE A
1/4
3/16
Soldadura PiezaEnfriamiento 1-3
45°1
Conexión para manguera
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±0,5 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título
A4 Plano Rev
Archivo: Enfriaminto 1-5.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
1/4
1/321
1
11/16
Soldadura PiezaEnfriamiento 1-3 45°
Conexión para manguera
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Soldaduras piezas Enfriamiento
A4 Plano Rev
Archivo: Enfriaminto Soldadura.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
Soldadura Tapa fondo enfriamiento
Soldadura PiezaEnfriamiento 1-1
Soldadura PiezaEnfriamiento 1-5
Soldadura PiezaEnfriamiento 1-4
5/16
Ajuste 2-2
Intercambiador 4
Intercambiador 3
Intercambiador 1
Intercambiador 2
Ajuste 2-2
Ajuste 2-3
Ajuste 2
oring 7/8 in
oring 11/16 in
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Inoculación
A4 Plano
Rev
Archivo: Inoculación.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
9 1/2
8
Soldaduraaireador 2
Conexión para manguera
1/4
1/8
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Intercambiador 1
A4 Plano Rev
Archivo: Intercambiador 1.dft
Escala Peso Hoja 1 de 1
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
5 3/16
1
1/16
5/16 1/25/8
1/16
1 1/8 15/16
3/4
3 11/167/16
1/32 X 45°
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Intercambiador 2
A4 Plano Rev
Archivo: Intercambiador 2.dft
Escala Peso Hoja 1 de 1
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
1 15/16
O 1/4 ( X 2)
3 5/8
PIEZA 23/16
1/4Soldadura PiezaIntercambiador 2
Soldadura Pieza 2Intercambiador 2
Soldadura Pieza 2Intercambiador 2
1
Conexión para manguera
Soldadura Intercambiador 1
5/16 3/8 Soldadura Intercambiador 1
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Intercambiador 3
A4 Plano Rev
Archivo: Intercambiador 3.dft
Escala Peso Hoja 1 de 1
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
#12-28 UNF
3 3/8
3/8
1/16
1/4
9/161/4
5/32 X 45°
3/8 3/8 3/8 3/8
3/8 3/8 3/83/8
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Intercambiador 4
A4 Plano Rev
Archivo: Intercambiador 4.dft
Escala Peso Hoja 1 de 1
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
#12-28 UNF
3/8
O 1/8
A ACORTE A-A
#12-28 UNF1 5/8
1/4
O 1/4
O 7/8
Pieza 2
1/163/16
Soldadura Pieza 2Intercambiador 4
Soldadura PiezaIntercambiador 4
1 1/8
1/8
1/32
O 13/16
O 11/16
O 5/8
7/85/813/16 1/4
Conexión para manguera
B
DETALLE B
1/16
1/32
1
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DANIELDibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Intercambiador conjunto
A4 Plano Rev
Archivo: Intercambiador conjunto.dft
Escala Peso
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Sensor de pH
A4 Plano Rev
Archivo: Sensor pH.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
A
ACORTE A-A
1/8
3/4-16 UNF
3/4-16 UNF
7/8
3/4-16 UNF
1/4
1/4
1/8
1
B
DETALLE B
1/16
1/32
12 mm
1/32 X 45°
1/32 X 45°
1/4
1/32 X 45°
Superficiegrafilada
1 3/16
15°15°
15°
15°
O 1/4 ( X4)
A
A CORTE A-A
3/83/163/32
R 3 5/16R 2 3/4
R 2 17/32
R 2 7/1660°
1/32 X 45°
1/32 X 45°
O 6
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Soporte inferior (2 piezas en aluminio)
A4 Plano Rev
Archivo: Soporte inf.dft
Escala Peso Hoja 1 de 2
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Soporte inferior (2 piezas en aluminio)
A4 Plano Rev
Archivo: Soporte inf.dft
Escala Peso Hoja 2 de 2
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Soporte Inferior
A4 Plano Rev
Archivo: Soporte inf2.dft
Escala Peso Hoja 1 de 1
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en milímetrosángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Títu lo Soporte superior (2 piezas en Aluminio)
A4 Plano Rev
Archivo: soporte sup.dft
Escala Peso Hoja 1 de 2
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
10°10° 10°
O 1/4 ( X4)
R 3R 3 13/32
R 4
O 7 3/8
R 3 3/32
3/8
3/16
3/32
3/32
60°
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en milímetrosángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Títu lo Soporte superior (2 piezas en Aluminio)
A4 Plano Rev
Archivo: soporte sup.dft
Escala Peso Hoja 2 de 2
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Tapa inferior
A4 Plano Rev
Archivo: Tapa inferior.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
A A
CORTE A-A
3/16
O 6 5/8
O 5
60°
6 5/8
O 1/4 ( X 6)
BDETALLE B
1/8
3/32
O 4 3/4O 6
* Los agujeros de 1/4 van soldados a tornillosde 1/4 unc de 3/4 de longitud
Soldadura tornillos 1/4 unc x 3/4
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en milímetrosángulos en grados
tolerancias ±0,5 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título
A4 Plano Rev
Archivo: Tapa superior 2.dft
Escala Peso Hoja 1 de 1
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Tapa superior
A4 Plano Rev
Archivo: Tapa superior(nueva).dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
O 3/8 ( X 4)
1/8
O 8
A A
CORTE A-A
3/16
O 6
45°
3/4-16 UNF ( X 5)
1 1/4-12 UNF
O 7 3/8
O 1/4 ( X 8)
1/8
3/32
60°
O 3 5/8
30°
45°
*
* Los agujeros de 1/4 van soldados a tornillosde 1/4 unc de 3/4 de longitud
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Termopozo
A4 Plano Rev
Archivo: termopozo.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
O 3/4
O 3/8
1/16 1/8
1/16 X 45°
soldadura Termopozo
soldadura pieza 3
O 3/8
1/16 soldadura Termopozo
8
1/8 7/16
3/8-24 UNF
Soldadura pieza 2
3/8
5/16
Pieza 2
Pieza 3
Termopozo
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Tornillo (realizar 2 piezas)
A4 Plano Rev
Archivo: tornillo.dft
Escala Peso
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
A
ACORTE A-A
3/8-24 UNF
1/2 1/8
1/32 X 45°
3/4
Revisiones
Rev Descripción Fecha Aprobado
DibujadoComprobadoAprobado 1Aprobado 2
Salvo indicación contrariacotas en pulgadasángulos en grados
tolerancias ±1/64 y ±1º
Nombre Fecha SOLID EDGEEDS-PLM SOLUTIONS
Título Reactor en vidrio
A4 Plano Rev
Archivo: vidrio.dft
Escala Peso Hoja 1 de 1
DANIEL RAMÍREZDANIEL RAMÍREZRUBEN GODOY
Marzo-2010Junio 2010Sept. 2010
6 13/16
5 15/32
8 13/16
5 5/8
3/16
4 1/24 7/8
13/16
D. Anexo: Curvas de aireación y desgasificación- Oxígeno disuelto
Figura D-1: Perfil de concentración de Oxígeno disuelto para un flujo de 0,25 vvm
Figura D-2 Perfil de concentración de Oxígeno disuelto para un flujo de 0,5 vvm
40
50
60
70
80
90
100
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Oxi
geno
dis
uelto
%
Tiempo (s)
40
50
60
70
80
90
100
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Oxi
geno
dis
uelto
%
Tiempo (s)
120 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Figura D-3 Perfil de concentración de Oxígeno disuelto para un flujo de 0,75 vvm
Figura D-4 Perfil de concentración de Oxígeno disuelto para un flujo de 1 vvm
40
50
60
70
80
90
100
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Oxi
geno
dis
uelto
%
Tiempo (s)
40
50
60
70
80
90
100
0 200 400 600 800 1000 1200
Oxi
geno
dis
uelto
%
Tiempo (s)
Anexo D Curvas de aireación y desgasificación- Oxígeno disuelto 121
Figura D-5 Linealización de los perfiles de concentración para el oxígeno disuelto para
un flujo de aireación de 0,25 vvm
Figura D-8 Linealización de los perfiles de concentración para el oxígeno disuelto para
un flujo de aireación de 0,5 vvm
y = 0,00114x - 0,37982 R² = 0,98704
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
-Ln(
1-E)
Tiempo (s)
y = 0,00149x - 0,45233 R² = 0,99364
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Ln(1
-E)
Tiempo (s)
122 Evaluación del crecimiento y producción de astaxantina por Haematococcus pluvialis en un fotobiorreactor tipo airlift.
Figura D-7 Linealización de los perfiles de concentración para el oxígeno disuelto
para un flujo de aireación de 0,75 vvm
Figura D-8 Linealización de los perfiles de concentración para el oxígeno disuelto para
un flujo de aireación de 1 vvm
y = 0,00197x - 0,89235 R² = 0,98660
0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0
0 200 400 600 800 1000
Ln(1
-E)
Tiempo (s)
y = 0,00272x - 0,94030 R² = 0,99224
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Ln(1
-E)
Tiempo (s)
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