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Faculté des Sciences de la nature et de la vie Département de Biologie
Laboratoire Réseau de Surveillance Environnementale
Thèse présentée par
Mme KHELIL-RADJI Fatima Zohra Amel
Pour obtenir le diplôme de Doctorat en Biologie
Spécialité: Sciences de l’Environnement
Intitulée
Membres de jury :
Mr. HAMOU Ahmed Professeur Université d’Oran Président
Mr.ER-RAIOUI Hassen Professeur Université de Tanger (Maroc) Examinateur
Mr. AOUES Abdelkader Professeur Université d’Oran Examinatrice
Mr. HADJEL Mohammed Professeur Université de l’USTO Oran Examinateur
Mr. KERFOUF Ahmed Professeur Université de Sidi Bel Abbès Examinateur
Mr. BOUTIBA Zitouni Professeur Université d’Oran Encadreur
Evaluation du potentiel hydrocarbonoclaste des bactéries
marines isolées de la côte oranaise
Année universitaire 2014-2015
remerciements
Je tiens tout d’abord à exprimer mes plus sincères remerciements et toute ma
gratitude à mon Professeur BOUTIBA Zitouni, Directeur du laboratoire Réseau de
Surveillance Environnementale (LRSE), Université d’Oran, de m’avoir fait confiance
et pour l’intérêt qu’il a porté à ce travail en acceptant de le diriger. Au-delà de votre
rôle de directeur de thèse, le temps que vous m’avez consacré, vos critiques
pertinentes et votre esprit de synthèse ont été des éléments déterminants dans la
valorisation de cette thèse.
Mes remerciements s’adressent également à Mr HAMOU Ahmed Professeur à
l’Université d’Oran qui a honoré ce travail en acceptant de présider le jury. Je l’en
remercie profondément.
Le Professeur ER-RAIOUI Hassen de l’Université de Tanger (Maroc) qui nous
fait aujourd’hui le grand honneur de participer à ce jury malgré ses diverses
activités. Qu’il nous soit permis de lui exprimer notre profonde reconnaissance.
Le Professeur HADJEL Mohammed de l’Université de l’USTO Oran, pour avoir
accepté de juger ce travail en qualité d’examinateur. Nous sommes reconnaissants
pour l’intérêt qu’il a porté à ce travail et nous tenons à luit exprimer à cet égard nos
sincères remerciements.
Le Professeur AOUES Abdelkader de l’Université d’Oran, nous tenons à vous
exprimer nos respectueux remerciements pour le temps consacré à examiner ce
travail, malgré vos occupations.
Le Professeur KERFOUF Ahmed de l’Université de Sidi Bel Abbès, qui a bien
voulu faire partie du jury en qualité d’examinateur. Je vous prie de croire en mon
éternel respect et ma sincère gratitude.
Je remercie chaleureusement mon oncle le Professeur KHELIL Abdelbacet
pour son aide précieuse et sa présence à chaque fois que j’en avais besoin.
J’exprime toute ma gratitude à Madame Mme MERZOUG.D, et Mme
BOUTIBA- MATALLAH Amaria qui avec beaucoup d’amabilité et de compréhension,
n’ont pas ménagé leurs efforts ni leurs temps pour me prodiguer de constants
encouragements et de précieux conseils. Qu’elles trouvent ici toute ma
reconnaissance et mon estime.
Je remercie également mes amis HADDOU Aouicha, et KHERRAZ-Chemlal.
Djazia pour leurs encouragements et soutien moral dans toutes les situations.
Mes Vifs remerciements vont également à toute l’équipe du Laboratoire(LRSE)
pour leur gentillesse, leurs conseils et leur disponibilité. Merci tout particulièrement
à Leila pour ta bonne humeur et ton aide.
Je remercie également les personnes qui ont contribué scientifiquement à cette
thèse. Je pense en particulier à ADDOU Amine pour tout son aide.
Merci à mon mari Youcef qui a tenu bon jusqu’au bout, est resté à mes côtés,
m’a dorloté, motivée, soutenue, écouté et encouragé.
Je n’aurais pas pu mener cette Thèse jusqu’au bout sans le soutien de ceux qui
me sont le plus proche. J’adresse donc mes derniers (et forcément les meilleurs!)
remerciements à mes parents, ma familles et ma belle-famille et surtout mes enfants :
Mohamed Houari et Aya.
Et puis je finirai par une pensée pour mon père, Yahia,
qui aurait adoré lire cette thèse
Table des matières
Liste des tableaux ………………………………………………………………………..
Liste des figures ……………………………………………………………………….....
Liste des abréviations ……………………………………………………………………
Résumé…………………………………………………………………………………...
Summary…………………………………………………………………………………
..……………………………………………………………………………………ملخص
Introduction ……………………………………………………………………………..
I
II
VI
VII
VIII
IX
1
Partie I Synthèse bibliographique
Chapitre I : Généralité sur les hydrocarbures…………………………………………….
1. Définition des hydrocarbures………………………………………………………….
2. Origine des hydrocarbures…………………………………………………………….
2.1. Les hydrocarbures naturels………………………………………………………….
2.2. Les hydrocarbures fossiles……………………………………………….................
3. Les Familles des hydrocarbures……………………………………………………….
3.1. Les hydrocarbures aliphatiques……………………………………………………...
3.1.1. Les hydrocarbures aliphatiques saturés……………………………………………
3.1.2. Les hydrocarbures aliphatiques insaturés………………………………………….
3.1.3. Les hydrocarbures aliphatiques cycliques…………………………………………
3.2.Les hydrocarbures aromatiques………………………………………………………
3.3. Les asphaltènes………………………………………………………………………
3.4. Les composés polaires (résines)……………………………………………………..
4. Le pétrole brut ………………………………………………………………………...
4.1.La formation du pétrole ……………………………………………………………...
4.2. Classification des bruts pétroliers……………………………………………………
5. Les hydrocarbures en Algérie………………………………………………………….
I.5.1 Présentation du complexe d’Arzew…………………………………………………
6. Toxicité des hydrocarbures…………………………………………………………….
7. Contaminations pétrolières des environnements marins ……………………………..
8. Problématique liée à la pollution marine par les hydrocarbures pétroliers en Algérie
9. Impact des hydrocarbures sur l’environnement……………………………………….
10. Pénétration des hydrocarbures dans la chaîne alimentaire…………………………...
11. Devenir des hydrocarbures en milieu marin………………………………………….
9.1. Evaporation………………………………………………………………………….
9.2. Solubilisation………………………………………………………………………..
9.3.Emulsification…………………………………………………………….................
9.4. Sédimentation……………………………………………………………………..…
9.5. Photo-oxydation………….………………………………………………………….
9.6. Biodégradation……………………………………………………………………….
12. Les opérations menées en cas de déversement de pétroleen milieu marin………
10.1. La bioaugmentation………………………………………………………..….……
10.2. La biostimulation…………………………………………………………………..
10.3. Les biosurfactants/bioémulsifiants…………………………………………………
13. Règlementation nationale…………………………………………………………….
14. Règlementation internationale………………………………………………………..
Chapitre II : Ecologie des bactéries marines totales et hydrocarbonoclastes…………….
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1. La biodégradation des hydrocarbures……………………………………....................
1.1. Définition…………………………………………………………………………….
1.2. Principe de biodégradation…………………………………………………………..
1.3. Mécanismes de biodégradation des hydrocarbures………………………………….
1.4. Le cométabolisme……………………………………………………………………
2. Micro-organismes aptes à biodégrader les hydrocarbures…………………………….
3. Mode d’accession aux hydrocarbures…………………………………………………
3.1. La solubilisation……………………………………………………………………..
3.2. L’accession interfaciale……………………………………………………………..
3.3. L’accession interfaciale facilitée (émulsification) ………………………………….
3.4. Le transfert micellaire ………………………………………………………………
4. La biodégradation aérobie……………………………………………………………..
4.1. Les oxygénases………………………………………………………………………
4.2. Les micro-organismes aérobies et les n-alcanes…………………………………….
4.3. Les micro-organismes aérobies et les isoalcanes…………………………………...
4.4.Les micro-organismes aérobies et les alcènes………………………….....................
4.5. Les micro-organismes aérobies et les alcènes les cycloalcanes…………………….
4.6. Le métabolisme des hydrocarbures aliphatiques……………………………………
4.6.1. Les oxydations monoterminal et diterminale…………………………..................
4.6.2. L’oxydation subterminale…………………………………………………………
4.7. Le métabolisme des hydrocarbures aromatiques……………………………………
4.7.1. Les bactéries impliquées ………………………………………………………….
4.7.2. Les levures et les champignons……………………………………………………
4.7.3. Les voies cataboliques…………………………………………………………….
5. La biodégradation anaérobie…………………………………………………………..
II.5.1 Les hydrocarbures aliphatiques…………………………………………………….
II.5.2 Voies de biodégradation anaérobie des hydrocarbures aromatiques……………...
6. Facteurs physiques et chimiques affectant la biodégradation des hydrocarbures……..
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Partie II : Matériels & méthodes
1. Zone d’échantillonnage……………………………………………………………….
2. Échantillonnage……………………………………………………………………….
3. Dénombrement de la microflore totale....................................................................
3.1 Préparation des dilutions…………………………………………………….............
3.2 Ensemencement par étalement sur gélose marine……………………………………
4. Isolement des souches susceptibles de dégrader les hydrocarbures………….............
4.1 Purification…………………………………………………………………………..
5. Conservation des souches isolées……………………………………………………..
6. Identification des souches purifiées…………………………………………..............
6.1 Etude morphologique………………………………………………………………...
a. Aspect macroscopique……………………………………………………
b. Aspect microscopique……………………………………………………
6.2 Etude biochimique…………………………………………………………………..
6.2.1 Métabolisme énergétique…………………………………………………………..
a. Recherche de la catalase……………………………………………………
b. Recherche de l’oxydase…………………………………………...............
c. Recherche de la nitrate réductase…………………………………............
6.2.2 Métabolisme glucidique……………………………………………………………
6.2.2.1 Étude de la voie d’attaque des glucides…………………………………………
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59
6.2.2.2 Étude des différentes voies fermentatives intermédiaires……………………….
6.2.2.3 Recherche de la β-galactosidase…………………………………………………
6.2.2.4 Utilisation des sucres…………………………………………………………….
6.2.2.5 Utilisation du citrate comme source de carbone…………………………………
6.2.2.6 Réaction de Voges- Proskauer (VP)…………………………………………….
6.2.2.7 Test Mannitol mobilité…………………………………………………………..
6.2.3 Métabolisme protéique…………………………………………………………….
6.2.3.1 Recherche des décarboxylases………………………………………….............
6.2.4 Recherche de l’uréase……………………………………………………..............
6.2.5 Production d’H2S………………………………………………………..............
6.2.6 Production d’indole………………………………………………………………
6.2.7 Recherche de la tryptophane-désaminase (TDA)………………………………..
6.2.8 Recherche de gélatinase (Collagénase)…………………………………………..
6.3 Sélection des bactéries par utilisation de milieux de culturespécifiques…………….
6.3.1 Croissance sur Cétrimide agar……………………………………………………..
6.3.2 Croissance sur milieu King (King A et King B)…………………………………
6.3.3 Utilisation des galeries API………………………………………………………
7. Le suivie de la cinétique de croissance des bactéries isolées………………………….
7.1 Méthode analytique…………………………………………………………………..
7.1.2 Préculture…………………………………………………………………………
7.1.2 Culture……………………………………………………………………………..
7.1.3 Mesure de la concentration microbienne…………………………………...……
8. Etude de l’optimum detempérature……………………………………………………
9. Etude de l’optimum de pH……………………………………………………………
10. Tolérance des souches au pétrole……………………………………………………
11. Profils de la résistance aux antibiotiques…………………………………………….
12. Profils de la résistance aux métaux lourds……………………………………..…….
13. Le suivie de labiodégradation………………………………………………………..
13.1 Détermination de l’index d’émulsion E24…………………………………………..
13.2 Détermination de tension superficielle…………………………………………….
13.3 Evaluation de la biodégradation par spectroscopie moyen infrarouge……………..
13.3.1 Principe de la méthode……………………………………………………………
13.3.2 La spectroscopie moyen infrarouge………………………………………………
13.3.3 Acquisition des spectres………………………………………………………….
13.4 Evaluation de la biodégradation par spectroscopie ultraviolette (UV)……………..
13.4.1 Principe……………………………………………………………………………
13.4.2 Mode opératoire…………………………………………………………...............
13.4.3 Choix du solvant : l’acétonitrile…………………………………………………..
14. L’étude de l’antagonisme entre les bactéries de consortium…………………………
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Partie III : Résultats et discussion
1. Dénombrement de la microflore totale……………………………………………….
2. Isolement et purification des espèces bactérienne……………………………………
3. Identification des souches isolées et purifiées…………………………………………
3.1 L’examen macroscopique…………………………………………………………….
3.2 L’examen microscopique…………………………………………………………….
3.3 Les résultats des tests biochimiques………………………………………………….
3.4 Caractérisation des souches isolées…………………………………………………..
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75
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4. Le suivie de la cinétique de croissance des bactéries isolées………………………….
5. Etude de l’optimum de température…………………………………………………..
6. Etude de l’optimum de pH……………………………………………………………
7. Tolérance des souches au pétrole……………………………………………………..
8. La résistance aux Antibiotiques ………………………………………………………
9. La résistance des isolats aux métaux lourds…………………………………………...
10. Le suivi de la biodégradation du pétrole brut par les isolats…………………………
10.1 Evolution de la concentration bactérienne………………………………………….
10.2 Evolution du pH …………………………………………………………………….
10.3 Index d’émulsification (E24)………………………………………………………...
10.4 La tension superficielle……………………………………………………………..
10.5 Le suivi de biodégradation par spectroscopie infrarouge…………………………..
10.6 Le suivi de biodégradation par spectroscopie UV………………………………….
Conclusion & Perspectives……………………………………………………………….
Références bibliographiques……………………………………………………………
Annexes………………………………………………………………………………….
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105
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161
I
Liste des tableaux
Tableau 01 :
Tableau 02 :
Tableau 03 :
Tableau 04 :
Tableau 05 :
Tableau 06 :
Tableau 07 :
Tableau 08 :
Tableau 09 :
Tableau 10:
Tableau 11 :
Tableau 12 :
Tableau 13:
Tableau 14 :
Tableau 15 :
Tableau 16 :
Propriétés physiques de quelques alcanes linéaires………………………
Les seize HAP répertoriés dans la liste de polluants prioritaires établie par
l’Agence pour la Protection de l’Environnement Américaine………...….
Propriétés des différentes classes de produits pétroliers (Raymond, 2008)...
Classification des pétroles en fonction de la densité (Claude, 2011)……….
Liste des bactéries capable de dégrader les hydrocarbures…………………
Classements et concentrations des antibiotiques utilisés ………………...
Observations macroscopiques des colonies………………………………
Résultats de l’étude microscopique des souches isolées……………………
Résultats des tests biochimiques des souches isolées…………………….
Paramètres des cinétiques des croissances des souches isolées…………..
Profils des résistances aux antibiotiques des six souches………………...
La résistance des six bactéries sélectionnées aux métaux lourds…………...
Fréquences d’absorption caractéristiques de quelques groupements
Organiques (Jacob, 2010) ………………………………………………....
Nouveaux pics et leurs groupements appropriés……………………………
Nouveaux pics et leurs groupements appropriés……………………………
Nouveaux pics et leurs groupements appropriés……………………………
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II
Liste des figures
Figure 01 :
Figure 02 :
Figure 03 :
Figure 04 :
Figure 05 :
Figure 06 :
Figure 07 :
Figure 08:
Figure 09 :
Figure 10 :
Figure 11 :
Figure 12 :
Figure 13 :
Figure 14 :
Figure 15 :
Figure 16 :
Figure 17 :
Figure 18 :
Figure 19 :
Figure 20 :
Figure 21 :
Figure 22 :
Composés hydrocarbonés et non hydrocarbonés présents dans
les pétroles bruts ………………………………………………….…….
Composition d’un pétrole brut et relation point d’ébullition/masse
molaire/structure…………………………………………………….…..
Les structures de 16 HAP définis comme polluants prioritaires
par l’US-EPA, 2008……………………………………………………..
Principaux accident pétroliers de 1970 à 2010………………….............
Le devenir d’une marée noire……………………………………………
Les émulsions formées par le pétrole dans l’eau de mer………………..
Métabolismes impliqués dans l’utilisation des hydrocarbures par
les micro-organismes…………………......................................................
Mécanisme général de dégradation aérobie des hydrocarbures par les
microorganismes …………………………………………………….….
Activité de la mono-oxygénase ……………..............................................
Voies de dégradation des n-alcanes les plus fréquents (oxydation
terminale et subterminale) ……………………………………………...
Rôle des oxygénases dans le catabolisme des composés aromatiques ….
Voies de dégradation anaérobie des alcanes ……………………………..
Exemples de réactions initiales de dégradation anaérobie
d’hydrocarbures aromatiques ……………………………………..…….
Facteurs affectant l’efficacité de biodégradation………………………...
Site d’échantillonnage (port d’arzew, Oran)…………………….............
Spectromètre infra-rouge à transformée de Fourier Alpha Bruker………
Le spectrophotomètre UV de type OPTIZEN 2120UV…………………..
Aspect macroscopique de la souche S1sur milieu Chapman……………..
Aspect microscopique de la souche S1après coloration de Gram
(Gr x 1000)……………………………………………………………...
Aspect macroscopique de La souche S2 sur milieu……………………....
Aspect microscopique de la souche S2 après coloration de Gram
(Gr x 1000) ……………………………………………………………...
Identification biochimique de la souche S2 par galerie Api 20 NE…….
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80
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III
Figure 23 :
Figure 24 :
Figure 25 :
Figure 26 :
Figure 27 :
Figure 28 :
Figure 29 :
Figure 30 :
Figure 31 :
Figure 32 :
Figure 33 :
Figure 34 :
Figure 35 :
Figure 36 :
Figure 37 :
Figure 38 :
Figure 39 :
Figure 40 :
Figure 41 :
Figure 42 :
Figure 43 :
Figure 44 :
Aspect macroscopique de La souche S3 sur milieu Chapman………….
Aspect microscopique de la souche S3 après coloration de Gram
(Gr x1000)……………………………………………………………...
Identification biochimique de la souche S3 par galerie Api 20 NE……...
Aspect macroscopique de La souche S4 sur Gélose nutritive…………...
Aspect microscopique de la souche S4 après coloration de Gram
(Gr x 1000) ……………………………………………………………....
Aspect macroscopique de La souche S5 sur gélose au sang……………..
Aspect microscopique de la souche S5 après coloration de Gram
(Gr x 1000) ……………………………………………………………....
Identification biochimique de la souche S5par galerie Api 20 NE……..
Aspect macroscopique de La souche S6 sur milieu Hektoen…………….
Aspect microscopique de la souche S6 après coloration de Gram
(Gr x 1000).……………………………………………………………...
Aspect macroscopique de la souche S7 sur milieu Hektoen……………..
Aspect microscopique de la souche S7 après coloration de Gram
(Gr x 1000).……………………………………………………………...
Identification biochimique de la souche S7 par galerie Api 20 NE……..
Aspect macroscopique de La souche S8 sur Gélose nutritive……………
Aspect microscopique de la souche S8 après coloration de Gram
(Gr x 1000) ……………………………………………………………...
Identification biochimique de la souche S8 par galerie……….……….
Aspect macroscopique de La souche S9 sur Gélose nutritive……………
Aspect microscopique de la souche S9 après coloration de Gram
(Gr x 1000……………………………………………………………...
Identification biochimique de la souche S9 par galerie Api 20 NE……..
Cinétique de croissance des souches bactériennes isolées, cultivées sur
milieu BH additionné de 2% de pétrole brut……………………………
Effet de la température sur la croissance des isolats sur milieu BH
additionné de 2% de pétrole, à différentes valeurs de température aprés
24 heures d’incubation……………………………………………….…
Effet des différentes valeurs de pH sur la croissance des isolats sur
milieu BH additionné de 2% de pétrole, après 24 heures d’incubation…
81
81
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92
IV
Figure 45 :
Figure 46 :
Figure 47 :
Figure 48 :
Figure 49 :
Figure 50 :
Figure 51 :
Figure 52 :
Figure 53 :
Figure 54 :
Figure 55 :
Figure 56 :
Figure 57 :
Figure 58 :
Figure 59 :
Figure 60 :
Figure 61 :
Figure 62 :
Effet des différentes concentrations de pétrole sur la croissance des
isolats sur milieu BH aprés 48h d’incubation…………………………...
Antibiogramme de Pseudomonas aeruginosa sur milieu Mueller-
Hinton..……………………………………………………………….....
Antibiogramme de Burkholderia cepacia sur milieu Mueller-
Hinton…………………………………………………………………....
Antibiogramme de Staphylococcus aureus sur milieu Mueller-
Hinton…………………………………………………………………....
Antibiogramme de Pseudomonas luteola sur milieu Mueller-Hinton….
Effet des métaux lourds sur Burkholderia gladioli sur milieu Mueller-
Hinton…………………………………………………………………...
Effet des métaux lourds sur Staphylococcus aureus sur milieu Mueller-
Hinton…………………………………………………………………….
Effet des métaux lourds sur Pseudomonas aeruginosa sur milieu
Mueller-Hinton ..........................................................................................
Effet des métaux lourds sur Pseudomonas luteola sur milieu Mueller-
Hinton…………………………………………………………………….
Effet des métaux lourds sur Burkholderia cepacia sur milieu Mueller-
Hinton…………………………………………………………………...
Suivi de la concentration bactérienne au cours de la biodégradation de
pétrole brut……………………………………………………………...
Suivi de changement de pH au cours de la biodégradation de pétrole
brut………………………………………………………………………
Évolution temporelle de l’index d’émulsion……………………………..
Évolution temporelle de la tension superficielle……………………….
Spectre infrarouge de pétrole brut…………………………………..….
Spectre infrarouge de la souche S2 et sa superposition avec celui du
pétrole brut………………………………………………………….......
Spectre infrarouge de la souche S3 et sa superposition avec celui du
pétrole brut………………………………………………………………
Spectre infrarouge de la souche S5 et sa superposition avec celui du
pétrole brut………………………………………………………………
93
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103
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V
Figure 63 :
Figure 64 :
Figure 65 :
Figure 66 :
Figure 67 :
Figure 68 :
Spectre infrarouge de la souche S7 et sa superposition avec celui du
pétrole brut……………………………………………………………...
Spectre infrarouge de la souche S8 et sa superposition avec celui du
pétrole brut……………………………………………………...............
Spectre infrarouge de la souche S9 et sa superposition avec celui du
pétrole brut……………………………………………………………….
Spectre infrarouge de consortium et sa superposition avec celui du
pétrole brut……………………………………………………...............
Spectres UV de pétrole brut et celui de consortium bactérien………....
Spectres UV des isolats sélectionnés (S2, S3, S5, S7, S8 et S9)…….....
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VI
Liste des abréviations
bar : Unité de mesure de pression (équivaut à 105 pascals)
Bcc : Complexe Burkholderia cepacia
BH : Bushnell-Haas medium
HOC : Composés organiques hydrophobes
HAP : Hydrocarbure aromatique polycyclique
LDC : Lysine décarboxylase
MOD : Matière organique dissoute
NADH/NAD+ : Nicotinamide adénine dinucléotide
NADPH : Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
ODC : Ornithine décarboxylase
ONPG : Orthonitrophényl- b-D- galactopyranoside
TDA : Tryptophane désaminase
TIA : Transfert interfacial assisté par les biosurfactants
UFC : Unité formant colonie
IRTF : Spectromètre infra-rouge à transformée de Fourier
E24 : Index d’émulsification
MH : Müeller - Hinton
VII
Résumé
Ce travail a pour but de fournir de nouvelles approches méthodologiques pour caractériser les
communautés microbiennes en milieu marin pollué par les hydrocarbures, d’évaluer
l’influence de certains facteurs abiotique sur l’activité de biodégradation des pétroles par les
bactéries et de mesurer leurs activités.
Les micro-organismes sont isolés à partir de l’eau de mer contaminée par les rejets de la
raffinerie d’Arzew au Nord-Ouest de l’Algérie par la technique d’enrichissement sélectif.
Toutes les souches ont été cultivées dans des milieux liquides avec du pétrole brut en tant que
seule source de carbone.
La première partie a donné lieu à la collecte de 09 espèces distinctes, dont 06 souches ont été
sélectionnées, pour leurs meilleures capacités à se développer en présence de pétrole brut.
L’identification phénotypique de ces souches a permis de les rapprocher à
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Providentia rettgiri, Pseudomonas luteola,
Burkholderia cepacia, et Burkholderia gladioli.
Afin de vérifier la capacité de ces souches à dégrader le pétrole, l’étude de l’évolution de
certains paramètres comme la concentration microbienne, le pH, la température et le suivi de
la tolérance des souches isolées au pétrole a été abordée, ainsi que l’effet des métaux lourds et
des antibiotiques sur les isolats. Les résultats obtenus révèlent que Pseudomonas a un large
spectre de croissance à un pH proche de la neutralité (6 et 8), alors que l’optimum de
croissance chez la majorité des espèces est observé à un pH alcalin (10). L’optimum de
température de croissance est observé à 25°C. On peut constater que les bactéries marines
hydrocarbonoclastes isolées peuvent tolérer jusqu’à 20% de pétrole. Leur capacité à dégrader
le pétrole brut est associée à une résistance multiple aux métaux lourds et /ou antibiotiques.
L’évaluation de la biodégradation par Spectroscopie infrarouge et UV a confirmé l’efficacité
de l’utilisation d’un consortium concernant l’attaque des différentes classes d’hydrocarbures,
mais le rendement était toujours plus important avec Pseudomonas aeruginosa et
Burkholderia cepacia.
Mots clés : biodégradation, pétrole brut, eau de mer, Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Pseudomonas luteola, Burkholderia cepacia, Burkholderia gladioli,
Providentia rettgiri.
VIII
Summary
This work aims at providing new methodological approaches to characterize microbial
communities in marine pollution by hydrocarbons, to evaluate the influence of some abiotic
factors on the activity of biodegradation activity of oils by bacteria and measuring their
activities.
Micro-organisms were isolated from contaminated sea water by discharges of the Arzew
refinery in northwestern Algeria by selective enrichment technique. All strains were
cultivated in liquid media with the crude oil as the only source of carbon.
The first part, resulted in the collection of 09 distinct species, including 06 strains of them
were selected for their best ability to develop in presence of the crude oil.
The phenotypic identification of these strains make them closer to Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas luteola, Burkholderia cepacia, Burkholderia gladioli
and Providentia rettgiri.
To test the ability of these strains to degrade the oil, the study of the evolution of certain
parameters like microbial concentration, pH, temperature and safety monitoring oil isolated
strains was discussed as well as effect heavy metals and antibiotic on the isolates. The results
show that Pseudomonas growth of a broad spectrum to a pH close to neutrality (6 to 8), while
the optimum growth in the majority of species is observed at alkaline pH (10), the optimum
temperature growth is observed at 25°C. We can see that the marine hydrocarbonoclastes
bacteria isolated can tolerate up to 20% oil. The ability of our strains to degrade crude oil is
associated with multiple resistances to heavy metals and/ or antibiotics.
The biodegradability evaluation in infrared and UV spectroscopy confirmed the efficiency of
using a consortium for the attack of the various hydrocarbons classes, but the yield was
always higher with Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.
Keywords: biodegradation, crude oil, sea water, Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Pseudomonas luteola, Burkholderia cepacia, Burkholderia gladioli,
Providentia rettgiri.
IX
ملخص
التلوث البحري الناجم عن حیث المیكروبیة المجتمعات للتعرف على الجدیدة األسالیب المنھجیة توفیر إلىعملنا یھدف
.أنشطتھا وقیاس البكتیریا بواسطة تحلل الزیوت على نشاط غیر الحیویة بعض العوامل تأثیر، وتقییم المحروقات
عن طریق الجزائر في شمال غرب أرزیو مصفاة مة عنبالمحروقات الناج الملوثة میاه البحر من تم عزلھا الكائنات الدقیقة
امنھ سالالت 06 تم اختیارحیث ،من البكتیریا البحریة مختلفة أنواع 09 جمعإلى بنا أدىمما .انتقائیة تخصیب تقنیة
.النفط الخام في وجود أفضل كاثرت لقدرتھا على
Staphylococcus aureus ،Pseudomonas aeruginosa إلىھا كل من بإسناد سمح ھذه السالالتل الظاھري الشكل
، Pseudomonas luteola، gladioli Burkholderia، cepacia Burkholderia وProvidentia rettgiri.
درجة ، الجراثیم مثل تركیزعوامل ال بعض أثیرتتم متابعة و دراسة ،النفط على تحلیل ھذه السالالت قدرة الختبار
.على تكاثر البكتیریا المعزولةالمضادات الحیویة المعادن الثقیلة و فضال عنالحموضة، ودرجة الحرارة
في حین (8-6)الحیاد قرب إلىاأل درجة الحموضة یكون أحسن فيPseudomonas aeruginosa نمو بینت النتائج أن
المثلى لنموھم الحرارة أما درجة (10)القلویة درجة الحموضةفي یكون األنواع البكتیریة لمعظم األمثل نموأن ال لوحظ
ى تحلیل الھیدروكربونات القادرة عل البحریة البكتیریا .یمكننا أن نرى أن درجة مئویة 25 معتدلة
)hydrocarbonoclastes (على سالالت الرتبط قدرة توالنفط الخام. من ٪20إلى ما یصل یمكن أن تتحمل معزولةال
مع مقاومة متعددة للمعادن الثقیلة و / أو المضادات الحیویة. التحلیل
مجموعة استخدام فعالیة واألشعة فوق البنفسجیة أكد باألشعة تحت الحمراء التحلیل الطیفي التحلل البیولوجي باستعمال تقییم
الھیدروكربونات، ولكن كان منفئات مختلفة تحلیل نیحسفي تالسالالت المختارة مزیج من التي تحتوي على البكتیریا من
.cepacia Burkholderiaو Pseudomonas aeruginosa مع دائما العالي العائد
.
,Pseudomonas aeruginosa التحلیل الطبیعي ,النفط الخام ,میاه البحر : الكلمات المفتاحیة
Staphylococcus aureus, Pseudomonas luteola, Burkholderia cepacia, Burkholderia gladioli,
Providentia rettgiri.
Introduction
Introduction
1
Introduction
Les eaux de toutes natures et les sols sont des ressources essentiels à la vie en général
(biodiversité) et aux sociétés humaines, en particulier (alimentation en eau potable et
autre usages, sols agricoles et urbains), dont il faut protéger la qualité en prévenant les
pollutions de toutes natures et en restaurant si nécessaire les compartiments pollués,
sans nuire de façon excessive au développement économique.
Les substances xénobiotiques susceptibles de contaminer les eaux sont extrêmement
nombreuses et diverses en raison des activités humaines multiples qui peuvent en être
la source. Si la toxicologie moderne est infiniment plus nuancée et plus fine, bien
qu’encore loin de la perfection dans ses prévisions, il reste que les hydrocarbures
occupent une position particulière en raison de la toxicité et de l’effet cancérigène de
certains d’entre eux (Bocard, 2006).
Le phénomène de pollution par les hydrocarbures a une importance de plus en plus
grande sur les plans environnemental, sanitaire et économique. Cette pollution peut
avoir un impact soit direct ou indirect, sur la santé humaine et l’équilibre des
écosystèmes, aussi bien marins que continentaux (Mbonigaba et al ., 2009).
Avec un volume de 137 x 106 km3 (71%), les océans constituent le plus grand
écosystème sur la Terre, et est exploité par l’homme pour des buts variés. De par son
volume important et sa vaste superficie, l’influence de l’océan sur le climat est
importante. L’océan est considéré comme étant un large réservoir de carbone
organique sous forme essentiellement de matière organique dissoute (MOD) (Benner
et al., 1992). La MOD, dans les écosystèmes oligotrophes, est produite en grande
partie par le zooplancton (65 %), puis par le phytoplancton (35 %) (Jumars et al.,
1989; Nagata, 2000).
En milieu marin, les processus de recyclage de la matière organique sont en partie
contrôlés par l’activité des bactéries hétérotrophes qui dominent la colonne d’eau
océanique par leur abondance, leur diversité et leur activité métabolique (Azam et
Malfatti, 2007).
Introduction
2
Le pétrole est une source de pollution des environnements aquatiques qui peut
largement influencer les équilibres écologiques et par extension les activités
économiques des régions sinistrées. En effet, de nombreux dégâts réels ont été
constatés lors d’accidents (par exemple fuite de pétrole), de rejets ou de déversements
volontaires, pouvant entraîner des catastrophes écologiques irréversibles (Gabet,
2004).
Dans l’environnement marin, plusieurs processus de désagrégation contribuent à
l’atténuation normale du pétrole déchargé, y compris l’évaporation extérieure, la
dissolution de l’hydrocarbure des films et des gouttelettes d’huile (la solubilisation), la
photooxydation, l’émulsion, la dispersion, la sédimentation et la biodégradation, et
plusieurs de ces processus sont influencés par la température de l’eau (Brakstad et
Bonaunet, 2006).
Les micro-organismes sont restés très longtemps les plus ignorés de la biosphère.
Lorsque leur existence a été reconnue, elle a été perçue surtout comme une menace
liée à l’existence de pathogènes. Pourtant, la réalité est résumée dans un titre de
Whitman et al., (1998) : « Procaryotes : the unseen majority » la majorité invisible.
Les chiffres présentés dans cet ouvrage sont impressionnants : une population
atteignant 4-6.1030 cellules sur la planète, soit une quantité de carbone de 300-500.1015
grammes, voisine de celle contenue dans les plantes. Cette immensité a une
implication à sa mesure, à savoir son rôle crucial dans le fonctionnement de la
biosphère, même si la reconnaissance de ce rôle est sans doute encore incomplète.
Les micro-organismes jouent un rôle crucial dans le devenir des polluants, notamment
dans la dégradation des hydrocarbures pétroliers (Leahy et Colwell, 1990). De
nombreuses études ont montré que des micro-organismes hydrocarbonoclastes étaient
sélectionnés suite à la contamination (Yakimov et al., 2005, Head et al., 2006). L’effet
des hydrocarbures sur les communautés microbiennes fait intervenir des mécanismes
complexes dépendant de leurs capacités métaboliques, influencées par les paramètres
environnementaux et la durée d’exposition aux polluants (Roling et al., 2002,
Yakimov et al., 2004 , Bordenav et al., 2007).
Introduction
3
La connaissance du devenir des polluants dans l’environnement est essentielle pour
définir des actions efficaces et réalistes en réponse aux problèmes complexes posés.
Elle est indispensable pour évaluer l’acceptabilité des produits vis-à-vis de
l’environnement. Elle l’est aussi pour apprécier les perspectives et les possibilités de
restauration de sites pollués.
C’est dans ce contexte que s’insère notre travail qui a pour objectif l’étude des
communautés bactériennes impliquées dans la dégradation du pétrole qui nécessite la
mise en place de techniques biologiques impliquant des méthodologies appropriées.
Il s’agit en effet d’évaluer à la fois l’abondance des micro-organismes, leur diversité,
mais aussi et surtout leur activité, le challenge étant d’arriver à suivre spécifiquement
les espèces bactériennes ayant la capacité fonctionnelle de biodégradation des
hydrocarbures.
Deux approches sont adoptées :
La première approche : les relations pouvant exister entre le degré de pollution des
eaux de mer par les hydrocarbures et la distribution des bactéries marines autochtones
susceptibles de les dégrader sont recherchées (Biodétection).
La seconde approche concerne l’évaluation de la capacité des bactéries détectées à
dégrader les hydrocarbures lorsqu’elles sont intégrées dans l’un des procédés de
traitement (Bioremédiation).
Ce document comporte quatre chapitres :
Le premier chapitre présente un rappel des principales données bibliographiques
concernant des généralités sur les hydrocarbures et leurs origines dans le milieu
marin, ainsi que les solutions possibles pour minimiser les dégâts.
Le deuxième chapitre expose quelques éléments relatifs aux bactéries marines
hydrocarbonoclastes et leurs voies métaboliques impliquées dans la biodégradation des
hydrocarbures.
Introduction
4
Le troisième chapitre est consacré à L’ensemble du matériel et des méthodes utilisés
pour l’isolement par enrichissement sélectif, la purification et l’identification des
bactéries marines hydrocarbonoclastes. Ensuite, le suivi de la biodégradation du
pétrole brut par les isolats, ainsi que l’influence de certains paramètres abiotiques sur
la croissance des souches isolées.
Dans le quatrième et dernier chapitre, nous exposons et discutons l’ensemble des
résultats relatifs aux différents points relevés dans la partie matériel et méthodes. Cette
partie s’intéresse à la fois à l’impact de quelques contraintes environnementales sur les
bactéries hydrocarbonoclastes isolées, mais aussi l’évaluation de leur rôle dans le
«service rendu par les micro-organismes».
Une conclusion générale et une bibliographie complètent cette rédaction. Enfin, deux
annexes, la première décrit les milieux de cultures et les réactifs utilisés, tandis que la
seconde rassemble les tableaux des résultats bruts.
Partie I
Synthèse
bibliographique
Chapitre I
Généralités sur les
hydrocarbures
Synthèse bibliographique
5
I. Généralité sur les hydrocarbures
1. Définition des hydrocarbures
Les hydrocarbures sont des composés organiques dont la formule chimique comprend
uniquement des atomes de carbone (C) et d’hydrogène (H), ils ont pour formule brute
CnHm où n et m sont deux entiers naturels (Franennecet al., 1998).
D’après Standards et Pancanadiens (2008), le terme « hydrocarbure pétrolier » (HCP)
est un terme générique qui désigne les mélanges de composés organiques présents
dans des matières géologiques comme l’huile, le bitume et le charbon ou dérivés
de ces matières.
Le pétrole brut est constitué d’un mélange de milliers de composés organiques formés
à partir de différents matériaux organiques. Ces matériaux subissent des
transformations chimiques sous l’effet de diverses conditions géologiques qui ont lieu
pendant de longues périodes de temps (Wang et Fingas, 2003).
2. Origine des hydrocarbures
2.1. Les hydrocarbures naturels :
Ils résultent principalement de processus biogéochimiques (diagenèse) qui induisent la
formation de gaz naturel et de pétrole qui, par la suite, peut suinter au travers de failles
dans les formations géologiques. La majorité du méthane qui est libérée par ces
mécanismes dans le milieu marin est oxydée par les micro-organismes dans la colonne
d’eau et seulement 1 à 10 % atteint l’atmosphère (Mau et al., 2007).
Une autre partie des hydrocarbures naturels est produite par les plantes, animaux et
micro-organismes qui synthétisent des composés dont la structure chimique varie en
fonction des organismes considérés. Par exemple, le phytoplancton marin synthétise
des alcanes linéaires (n-alcanes) avec une prédominance des n-C15, n-C17 et n-C21
alors que des micro-organismes photosynthétiques, des bactéries hétérotrophes
et certaines espèces de zooplancton et de macrophytes produisent du pristane
et du phytane, des alcanes terpénoïdes saturés (Blumer et al., 1971 ;
Bícego et al., 2006).
Synthèse bibliographique
6
L’hydrocarbure formé par dégradation biologique le plus abondant sur Terre est sans
aucun doute le méthane (CH4), dont la formation (la méthanogènese) est un processus
exclusivement réalisé par un groupe d’archées anaérobies (Forterre et al., 2002).
De nombreux hydrocarbures aromatiques peuvent également provenir de la
combustion incomplète de la matière organique pendant l’activité volcanique
(Doyle et al., 2008).
2.2. Les hydrocarbures fossiles, proviennent de la décomposition d’une grande
quantité de matière organique. Ces hydrocarbures se forment à partir de débris
d’algues, de résidus de la faune marine et de plancton. Alors le vieillissement,
la température et la pression (qui s’exerce sur les fonds marins) transforment
cette substance organique en hydrocarbures (Bocard, 2006). Cela demande
des caractéristiques géologiques passées spécifiques, ce qui explique la faible quantité
de ressources disponibles.
Les pétroles sont des mélanges extrêmement complexes de composés hydrocarbonés
qui peuvent être regroupés dans les familles suivantes :
Les hydrocarbures insaturés, ils possèdent une à plusieurs double-liaison(s) (alcènes)
ou triple-liaison(s) (alcynes), (ii) saturés, ils ne possèdent pas de double ou de triple
liaison et peuvent être linéaires (n-alcanes exp. hexadécane), ramifiés (exp. pristane)
ou alicycliques (exp. stèranes) et (iii) aromatiques, parmi lesquels on distingue
les alkylbenzènes (BTEX) et les HAPs (hydrocarbures aromatiques polycycliques)
dont la structure comprend au moins 2 cycles aromatiques fusionnés
(Heider et al., 1999).
Parmi ces composés, les hydrocarbures saturés et aromatiques sont les principaux
constituants du pétrole (Holliger et Zehnder, 1996 ; Widdel et Rabus, 2001).
La genèse des pétroles explique pourquoi ils ne sont pas constitués uniquement
d’hydrocarbures vrais au sens chimique du terme, mais aussi des molécules
hydrocarbonées contenant d’autres éléments qu’on appelle hétéroatome
principalement le soufre, l’azote et l’oxygène, en proportions variables. On trouve
aussi des éléments métalliques, principalement le vanadium et le nickel mais aussi
le fer, le cuivre et l’uranium sont présents à l’état de traces (Bocard, 2006).
Synthèse bibliographique
7
En revanche, on est amené à considérer deux autres familles : les résines regroupent
essentiellement les composés contenant un ou plusieurs hétéroatomes (Bocard, 2006).
Les asphaltènes sont constitués par des composés hétérocycliques lourds et complexes,
dont certains contiennent en particulier le vanadium et le nickel (Bocard, 2006).
Dans ce qui suit, on va présenter les caractéristiques des différentes classes
d’hydrocarbures, ainsi que leurs abondances dans un brut pétrolier.
3. Les Familles des hydrocarbures
3.1. Les hydrocarbures aliphatiques
3.1.1. Les hydrocarbures aliphatiques saturés: paraffines normales dites
N-paraffines (alcanes linéaires) ou iso-paraffines (alcanes ramifiés), de formule
générale CnH2n+2. Leur nom vient du grec aleiphar qui signifie huile ou graisse. Cette
nomenclature vient du fait que les graisses sont des composés à chaine ouverte
(Lefebvre, 1978). Ils constituent 10 à 40% des hydrocarbures totaux
d’un brut pétrolier.
Sous 1 atmosphère, les alcanes sont sous l’état gazeux jusqu’au C4 (butane), liquide
(jusqu’à C17) et solide au-delà. Ils se présentent alors comme une huile lourde et leur
point de fusion n’excède pas les 100°C (Tableau 1). Il faut noter que les molécules
ramifiées sont plus volatiles que les linéaires.
Tableau 1. Propriétés physiques de quelques alcanes linéaires
Etat, à 25°C,
sous 1atm T ebu / °C sous 1 atm
T fus / °C Densité Nombre de
C
Méthane gazeux -161,5 -183 - 1
Ethane gazeux - 89 -172 - 2
Propane gazeux - 42 - 188 - 3
n-Butane gazeux - 0,5 - 135 - 4
n-Pentane liquide 36,1 -130 0,626 5
n-Hexane liquide 68,7 - 95 0,659 6
n-Heptane liquide 98,4 - 91 0,684 7 7
C20 solide 342 37 - 20
C30 solide 446 66 - 30
ébu : ébullition; fus : Fusion ; atm : atmosphère
Synthèse bibliographique
8
3.1.2. Les hydrocarbures aliphatiques insaturés : oléfines (alcènes) de formule
générale CnH2n, qui ne se rencontrent pas ou très peu dans le pétrole brut du fait
de leur réactivité. Cependant, les oléfines peuvent être produites lors des procédés
de raffinage et notamment lors de procédés de conversion des coupes lourdes
(Laxalde, 2012)
3.1.3. Les hydrocarbures aliphatiques cycliques saturés: naphtènes qui sont
des composés carbonés de 5 ou 6 atomes pouvant comporter un ou plusieurs cycles
et des chaînes ramifiées (Laxalde, 2012).
3.2 Les hydrocarbures aromatiques : composés cycliques polyinsaturés présents
en forte quantité dans les coupes les plus lourdes. Ils peuvent contenir un ou plusieurs
cycles aromatiques (Laxalde, 2012). De formule générale CnH2n-6, ils sont caractérisés
par la présence d’au moins un cycle à six atomes de carbone, présentant un système
particulier de liaison, qui confère à la molécule une grande stabilité, ainsi que certaines
propriétés chimiques spécifiques très recherchées, dans les industries des parfums,
des colorants et pharmaceutiques (Lauwerys, 2000).
En général, les hydrocarbures aromatiques sont moins abondants que les alcanes
et ne représentent que 10 à 30 % des hydrocarbures totaux d’un brut pétrolier
(Soltani, 2004).
Figure 1 : Composés hydrocarbonés et non hydrocarbonés présents dans les pétroles
bruts (Bianchi et al. 1988).
Synthèse bibliographique
9
3.3. Les asphaltènes
Les asphaltènes représentent la fraction la plus lourde du pétrole. Bien que ces produits
soient souvent en faible quantité, ils ont une influence considérable sur les propriétés
physico-chimiques du brut. Leur capacité à floculer, à s’adsorber sur des surfaces
et à former des dépôts solides, est à l’origine de nombreux problèmes, aussi bien
du point de vue exploitation des gisements, que du raffinage (Boukherissa, 2008).
Les asphaltènes sont constitués de molécules polycycliques à haut poids moléculaire,
contenant d’hétéroatomes tels que l’azote, le soufre et l’oxygène (Boukherissa, 2008).
Les métaux sont également présents, mais à l’état de traces. Les plus abondants
sont le vanadium et le nickel, mais du fer, du sodium, du cuivre et de l’uranium
ont également été détectés (Bocard, 2006).
3.4. Les composés polaires (résines)
Les résines contiennent des structures aromatiques (polycondensées ou non) dont
le nombre de cycles est supérieur à 6, ainsi qu’une partie des hétéro-éléments
et des métaux (Speight, 2004).
Elles jouent un rôle essentiel dans la stabilité du pétrole en prévenant la démixtion
des asphaltènes. La fraction résine est considérée comme moins aromatique que
la fraction asphaltène. Cependant, la polarité globale des résines n’est qu’un peu plus
faible que celle des asphaltènes (Speight, 2004).
4. Le pétrole brut
Le pétrole brut est un fluide constitué principalement d’hydrocarbures; il contient
également des composés organiques soufrés, oxygénés et azotés. On le rencontre dans
les bassins sédimentaires, où il occupe les vides de roches poreuses appelées réservoirs
(Hirschberg et al., 1984). Il peut être extrait et raffiné pour produire des combustibles
comme l’essence, le kérosène, le diesel, etc (Burke et al., 1990).
La Figure 2 représente la composition des pétroles bruts en fonction de la température
d’ébullition et de la masse molaire. La masse molaire est estimée à partir du nombre
d’atomes de carbone sur la base de la formule brute des paraffines CnH2n+2 (alcanes).
Synthèse bibliographique
10
Figure 2 : Composition d’un pétrole brut et relation point d’ébullition/masse
molaire/structure (McKenna et al., 2010).
Cette figure 2 illustre le fait que les matrices pétrolières sont très complexes
et poly-dispersées. En effet, le nombre d’isomères augmente de manière exponentielle
avec le nombre d’atomes de carbone. Par conséquent, plus les valeurs de températures
d’ébullition et de masses molaires augmentent, plus les molécules présentes sont
hétérogènes en termes déstructures. Si on se place, par exemple, à la température
d’ébullition de 427°C, le nombre d’atomes de carbone peut varier de 10 à plus de 25,
et les structures des molécules correspondantes couvrent aussi bien les paraffines
(alcanes) que les composés polycycliques. Les différents constituants du pétrole sont
classés par familles chimiques : hydrocarbures, composés hétéro atomiques, composés
métallique (Wauquier, 1994).
Synthèse bibliographique
11
4.1. La formation du pétrole
La formation du pétrole est le résultat de la dégradation progressive de la matière
organique déposée dans les bassins sédimentaires. Cette dégradation se fait
en trois étapes:
1) La diagénèse: produite à pression et à température modérées : elle correspond
à un réarrangement chimique de la matière organique, qui aboutit à la formation
du kérogène.
2) La catagénèse : est dûe à un enfouissement progressif du kérogène sur des
échelles de temps géologiques sous pression et température plus élevées. Ceci
entraîne la transformation des molécules de kérogène en pétrole par craquage
thermique.
3) La métagénèse : cette étape n’intervient que dans certains bassins caractérisés
par des températures très élevées à de plus grandes profondeurs. Elle consiste
en une polycondensation de la structure du kérogène et parallèlement en la
production de gaz (Burke et al., 1990 ; Andersen, 1994).
4.2. Classification des bruts pétroliers
Si la composition élémentaire globale des pétroles est relativement fixe, la structure
chimique de leurs constituants varie plus largement, ce qui entraîne une grande
diversité des propriétés physiques (densité, viscosité), ainsi que des teneurs très
variables dans les différents types de produits obtenus par raffinage (Djelti, 2012).
Les bruts lourds (Boscan, Sofania) contiennent des proportions importantes de
résines et d’asphaltènes par rapport aux hydrocarbures saturés.
Les bruts légers au contraire sont très riches en hydrocarbures saturés et très
pauvres en asphaltènes (Arabian light) (Syati, 2004).
5. Hydrocarbures en Algérie
Les hydrocarbures algériens ont été nationalisés juste après l’indépendance
(14 février 1971), ils occupent une place importante par rapport à l’économie
nationale. L’Algérie dispose de potentialités importantes en pétrole et gaz naturel
lesquels ne sont pas exploités sous forme de matières premières, mais transformés en
partie sur place, selon une stratégie et une planification rigoureuse. Le transport, la
transformation et la commercialisation des hydrocarbures ont été confiés
Synthèse bibliographique
12
à la Société Nationale des Hydrocarbures SONATRACH dont les principaux sièges
se trouvent à Hassi-Messaoud, Alger, Arzew et Skikda.
Arzew (wilaya d’Oran) représente un pôle important de transformation des
hydrocarbures. Elle renferme l’un des plus grands complexes d’industrie
pétrochimique en Afrique (Guermouche, 2014).
5.1. Présentation du complexe
La raffinerie d’Arzew est la troisième raffinerie du pays après celles d’Alger
et de Hassi-Messaoud. Elle occupe 170 héctares sur le plateau d’El Mahgoun
à 2 kilomètres de la ville d’Arzew et environ 40 kilomètres de la wilaya d’Oran.
Elle a été construite dans le cadre du premier plan 1970-1974 par la société japonaise
(Japon Gazoline Corporation). Le complexe se situe au voisinage du port d’Arzew
qui lui permet des enlèvements par bateaux des produits finis et semi-finis
(Bouharis, 2005). Les enlèvements se font aussi par camions, pipes et par wagons.
La raffinerie traite 2.5 millions de tonnes/an de pétrole brut acheminé du Sahara
par pipeline, et plus de 280.000 tonnes/an de brut réduit importé. Elle est divisée
d’une manière générale en trois grandes unités ; de production, de stockage et zone
administrative, qui assurent les fonctions suivantes :
- Traitement de pétrole brut de Hassi-Messaoud;
- Satisfaction des besoins de consommation du marché national en carburant,
lubrifiants, et bitumes ;
- Exploitation des produits excédentaires ; naphta kérosène, fuel, gas-oil, huile,
GPL (Gaz de pétrole Liquéfié), essence, lubrifiants et bitumes.
Plus de la moitié de la production est destiné au marché local et le reste à l’exportation
(Europe, USA) qui sont de grands consommateurs de fuel léger à basse teneur en
soufre et de naphta utilisés comme charge pour les unités pétrochimiques produisant
des gaz, essences et gas-oils (Bouharis, 2005).
La raffinerie approvisionne la région Ouest et Sud-Ouest du pays par 62% de sa
production. Les fuels basse teneur en soufre (BTS) et Haute teneur en soufre (HTS) et
naphta pétrochimique sont exportés à partir du port d’Arzew (Bouharis, 2005).
Synthèse bibliographique
13
6. Toxicité des hydrocarbures
Dans l’environnement, les hydrocarbures aliphatiques peuvent être présents sous
différentes formes qui induisent des modes de contamination différentes. Par ordre
d’importance, on notera l’inhalation, la pénétration à travers la peau, puis la digestion
(Boudou et al., 2002).
Une fois dans l’organisme, ces composés hautement liposolubles rejoignent la
circulation sanguine, puis sont répartis dans les tissus avec une localisation
préférentielle au niveau des tissus adipeux. Du fait de leur caractère lipophile, ces
polluants ont une tendance à la bioaccumulation via les réseaux trophiques
(Fent, 2004). De nombreux hydrocarbures aliphatiques présentent des risques
toxicologiques, mutagènes, voire même cancérigènes pour de nombreux organismes
dont l’Homme (Spencer et al., 2002).
Les hydrocarbures aliphatiques chlorés (éthènes chlorés,…) sont les plus étudiés, car
ce sont des composés chimiques qui sont largement utilisés pour leurs propriétés de
solvant, et dont la toxicité est avérée (Ruder, 2006). En effet, le contact avec ces
contaminants peut entraîner des dommages, pouvant aller jusqu’au développement de
cancers, au niveau de nombreux organes (foie, reins, système cardio-vasculaire,
système reproductif, système nerveux) (Spencer et al., 2002; Ruder, 2006).
Il est cependant difficile de dissocier leurs effets propres, car ils sont souvent présents
en mélange avec d’autres hydrocarbures, tels les HAPs, qui sont largement étudiés
(Guermouche, 2014).
Le caractère toxique du pétrole ne s’applique pas qu’aux organismes supérieurs. En
effet, de nombreuses études ont permis de mettre en évidence le caractère toxique de
certains hydrocarbures chez les bactéries (Shiri, 1987). Selon ce dernier auteur, ces
molécules agissent principalement en s’accumulant au niveau de la bicouche lipidique
de la membrane plasmique bactérienne. Par la suite, la modification de la structure et
l’intégrité membranaire.
Synthèse bibliographique
14
Les HAP sont des composés organiques hydrophobes fréquemment retrouvés dans
l’environnement (Samanta et al., 2002). Ils sont récalcitrants et leur persistance dans
l’environnement augmente généralement avec leur poids moléculaire, et donc
avec le nombre de cycles aromatiques présents dans leurs molécules (Liu et al., 2007 ;
Haritash et Kaushik, 2009).
Le coefficient de partage octanol – eau (Kow) traduit la répartition d’une molécule
d’un soluté entre la phase lipophile (octanol) et la phase hydrophile (eau).
Ce coefficient donne une indication sur sa capacité à s’adsorber sur des surfaces
hydrophobes. Il est aussi un bon indicateur de la capacité des polluants à pénétrer les
membranes biologiques, et donc à s’accumuler dans les organismes vivants
(Mackay et al., 1992).
Pour les HAP, les logs Kow varient de 3,4 à 6,8. Les Kow sont relativement élevés, ce
qui indique un fort potentiel d’adsorption. De plus, les HAP sont des molécules
biologiquement actives qui, une fois absorbées par les organismes, se prêtent à des
réactions de transformation sous l’action d’enzymes conduisant à la formation
d’époxydes et/ou de dérivés hydroxylés (Ould Rabah-Alouane, 2012).
Les époxydes réagissent très facilement avec l’ADN, ce qui peut entraîner des
mutations génétiques menant parfois au cancer. Outre leurs propriétés cancérigènes,
les HAP présentent également un caractère mutagène dépendant de la structure
chimique des métabolites formés. Ils peuvent aussi entraîner une diminution de la
réponse du système immunitaire augmentant, ainsi, les risques d’infection et affecter la
reproduction ou le développement fœtal (Gabet, 2004).
Les plus communs sont les seize HAP répertoriés dans la liste de polluants prioritaires
(Figure 3) pour la remédiation établie par l’Agence pour la Protection de
l’Environnement Américaine (US-EPA) (Keith et Telliard, 1979).
Le centre international de recherche sur le cancer (CIRC) a réévalué les HAP en 2006
et en a classé 15 parmi les substances cancérogènes, probablement et /ou possiblement
cancérogène pour l’Homme (Ould Rabah-Alouane, 2012).
Synthèse bibliographique
15
Tableau 2 : Les seize HAP répertoriés dans la liste de polluants prioritaires établie par
l’Agence pour la Protection de l’Environnement Américaine (2008).
HAP Formule
brute
Nombre
de Cycle
Poids
Moléculaire
(g/mol)
Solubilité
à 20 °C
(mg/L)
Pression
de Vapeur
Saturante
à 20°C
(Pa)
Log (Kow)
à 20 °C
Naphtalène C10H8 2 128.2 31 36.8 3.37
Acénaphtène C12H10 3 154.2 3.8 1.52 3.92
Acénaphtyène C12H8 3 152.2 16.1 4.14 4
Anthracène C14H10 3 178.2 0.045 0.0778 4.54
Fluorène C13H10 3 166.2 1.9 0.715 4.18
Phénanthrène C14H10 3 178.2 1.1 0.113 4.57
Benzo(a)anthracène C18H12 4 228.3 0.011 6.06.10-4 5.91
Chrysène C18H12 4 228.3 0.002 8.4.10-7 5.6
Fluoranthène C16H10 4 202.3 0.26 8.72.10-3 5.22
Pyrène C16H10 4 202.3 0.132 0.0119 5.18
Benzo(a)pyrène C20H12 5 252.3 0.0038 2.13.10-5 6.04
Benzo(b)fluoranthène C20H12 5 252.3 0.0015 6.7.10-5 5.8
Benzo(k)fluoranthène C20H12 5 252.3 0.0008 4.12.10-6 6
Dibenzo(h)anthacène C22H14 5 278.3 0.0006 9.16.10-6 6.75
Benzo(g,h,i)pépylène C21H12 6 264.3 0.062 1.3.10-8 6.6
Indeno(1,2,3-cd)pyrène C22H12 6 276.3 0.062 1.3.10-8 6.6
Kow : le coefficient de partage Octanol-Eau.
Synthèse bibliographique
16
Figure 3 : Les structures de 16 HAP définis comme polluants prioritaires
par l’US-EPA, (2008)
Enfin, l’exposition prolongée aux hydrocarbures aromatiques monocycliques peut
altérer la mémoire et certaines capacités psychiques. Ils ont aussi une toxicité prouvée
sur l’oreille interne pouvant entraîner une diminution de l’audition, leur contact
prolongé avec la peau ou les muqueuses aura une action dégraissante et desséchante
se traduisant par des irritations ou des dermatoses (Battaz, 2009).
Le benzène est le plus toxique des composés mono-aromatiques. Il se distingue par sa
grande toxicité pour les cellules sanguines et les organes qui les produisent.
Les affections en résultant vont de la simple anémie à la survenue du cancer
du sang (Battaz, 2009).
Synthèse bibliographique
17
7. Contaminations pétrolières des environnements marins
L’environnement marin est le compartiment le plus touché par la pollution aux
hydrocarbures (Prince et al., 2003). Ces composés pétroliers constituent le polluant
organique le plus abondant dans les mers et les océans (Spormann et Widdel, 2000),
qui induit une contamination des écosystèmes, qu’elle soit ponctuelle (accidents de
marées noires) ou chronique (rejets industriels et urbains, apports agricoles,
combustion de produits pétroliers, charbon, bois).
L’abondance des hydrocarbures, ainsi que leur utilisation dans l’industrie en font l’un
des groupes de composés chimiques les plus importants. Ils sont également les
principaux constituants des pétroles (Holliger et Zehnder, 1996), qui sont estimés
comme étant la principale source mondiale d’énergie primaire avec 33,6% du total
(données 2010, BP Statistical Review of World Energy, 2011).
Le littoral méditerranéen est notamment le siège d’une pollution récurrente inquiétante
par les hydrocarbures pétroliers, puisque le quart des rejets pétroliers mondiaux
(environ 80 000 tonnes an-1) concernent cette mer quasi-fermée, dont le taux
de renouvellement des eaux est de 90 ans. Ce chiffre équivaut à une quantité de pétrole
cumulée équivalente à environ 11 catastrophes du Prestige par an (Ghiglione, 2012).
A titre d’exemple, il a été estimé qu’1,3 million de tonnes de pétrole sont déversées
chaque année dans l’environnement marin (McGenity et al., 2012). Par conséquent, les
activités anthropiques conduisent à leur dispersion dans les environnements marins,
provoquant des modifications de l’environnement aquatique, ainsi que des
conséquences graves sur les écosystèmes et la santé humaine (Head
et Swannell, 1999).
Le transport maritime : il représente une des plus grosses sources d’hydrocarbures
et de pollution pétrolière des océans. Depuis 1970, environ 700 incidents ont été
recensés dans 99 pays, les plus médiatisés étant l’Exxon Valdez (1989), l’Erika
(1999), le Prestige (2002), Hebei Spirit (2007) et dernièrement l’Event Horizon (2010)
et le Réna (2011) (sauret, 2011).
Synthèse bibliographique
18
Figure 4 : Principaux accident pétroliers de 1970 à 2010 (Jernelöv 2010).
Bien que les statistiques montrent clairement une tendance à la baisse du nombre
de déversements de grande ampleur (> 700 Mt), le nombre d’accidents annuels reste
constant (environ 20 à 25 par an) (Renken, 2010). Par conséquent, la nécessité
de mettre en œuvre des moyens de réponse à ces pollutions demeure d’actualité.
Le problème majeur posé par les hydrocarbures pétroliers vient du fait que même si les
environnements marins ayant été contaminés paraissent propres, des composés
toxiques tels que les HAPs (hydrocarbures aromatiques polycycliques) de haut poids
moléculaire, massivement produits par l’incinération des déchets, le trafic et le
chauffage domestique au fioul (Johnsen et al., 2005), restent enfouis et sorbés sur des
particules sédimentaires et peuvent être relargués à tout moment par la bioturbation ou
par les activités humaines, comme le dragage (Venosa et al., 2010).
Synthèse bibliographique
19
8. Problématique liée à la pollution marine par les hydrocarbures pétroliers
en Algérie
Le Littoral algérien recèle un potentiel biologique important, une flore et une faune
riches et variées, des sites naturels exceptionnels. Un tel littoral devrait faire l’objet
d’un soin minutieux. Les hydrocarbures représentent la plus importante source
de pollution des eaux de mers et d’océans. Cette pollution résulte de plusieurs activités
liées surtout à l’extraction du pétrole, à son transport et en aval à l’utilisation
des produits finis dans les raffineries.
En effet, de nombreuses études ont permis d’observer l’apparition de problèmes
de santé lors de la baignade ou de pratique de sports aquatiques en eau contaminées.
Les plus fréquents sont des troubles digestifs et des infections cutanées
(Guermouche, 2014).
En 1980, l’accident du pétrolier Juan Lavelleja a déversé plus de 40 000 de tonnes de
pétrole dans les eaux territoriales algériennes. Un Plan d’Action Algérien National
(PAN) pour la réduction de la pollution marine dûe à des activités industrielles menées
à terre a été élaboré sous l’égide de Ministère de l’aménagement du territoire et de
l’environnement MED. (POL/MED, 2005).
9. Impact des hydrocarbures sur l’environnement
Les déversements d’hydrocarbures pétroliers sont une sérieuse menace pour la stabilité
de l’environnement marin. Ils peuvent causer des impacts sévères sur la biodiversité
présente sur les côtes (Kottaet al., 2008). Elles génèrent de graves dégradations au
niveau biotique et de l’écosystème, ce qui causera l’asphyxie totale du milieu
(Soltani, 2004). Selon les circonstances et l’emplacement des milieux touchés, les
impacts négatifs d’un déversement pétrolier peuvent soit être brêfs (Tableau 3),
soit durer quelques années ou encore s’échelonner sur des décennies (Dauvin, 1998).
Synthèse bibliographique
20
Tableau 3 : Propriétés des différentes classes de produits pétroliers (Raymond, 2008).
Produits à faible
viscosité
Produits
à viscosité
moyenne
Produits à haute
viscosité
Produits solides/semi-
solides
Produits
-Essence
-Kérosène
-Diesel
-Huile à
chauffage
- Bruts légers
-Mazout
intermédiaire
-Bruts lourds
-Mazout lourd
(Bunker C)
-Produits à plus
faible
viscosité ayant
vieilli
-Produits à plus faible
viscosité ayant
beaucoup vieilli
-Produits ayant atteint
leur point d’écoulement
Caractéristiques
-Faible viscosité
(semblable à
l’eau)
-Très volatils
-Viscosité
moyenne
(du lait à la
peinture)
-Volatilité
moyenne
-Haute viscosité
(semblable à
la mélasse)
-Peu ou pas
volatils
Semi-solides
Comportement
-Évaporation très
rapide
-Étalement rapide
-Biodégradation
rapide
-Évaporation
partielle rapide
(jusqu’à 40 %)
-Fractions
lourdes formant
une émulsion
-Infiltration
dans les
sédiments
(diminuant
avec l’émulsion)
-Très peu
d’évaporation
-Formant une
émulsion
-Faible pénétration
dans les sédiments
-Étalement presque nul
-Pénétration nulle dans les
sédiments
Toxicité
-Fractions légères
toxiques
-Toxicité plus
faible que les
produits à faible
viscosité
-Faible toxicité -Toxicité très faible
Contaminants Certains métaux peuvent être présents surtout dans les pétroles lourds (ex: le zinc, le
plomb, le cuivre, le nickel, le vanadium, le mercure, etc)
Synthèse bibliographique
21
10. Pénétration des hydrocarbures dans la chaîne alimentaire
Les produits pétroliers rejetés dans l’environnement ont des répercussions sur les
plantes, animaux et êtres humains. Les conséquences de la contamination dépendent
des organismes eux-mêmes et de la structure chimique des hydrocarbures. Certaines
espèces éprouvent des changements de comportement à peine perceptibles ou des
problèmes de santé à court terme. Certaines d’entre elles éprouvent des effets toxiques
instantanés et aigus parfois mortels, tandis que chez d’autres espèces, les répercussions
se manifestent lentement à long terme (Agence Française de Sécurité Sanitaire des
Aliments, communique de presse, 6 Janvier 2000).
Les bactéries, nourriture de nombreuses espèces aquatiques, peuvent être des vecteurs
de contamination par lesquels les hydrocarbures peuvent entrer dans la chaîne
alimentaire (Bertrand et Mille, 1989).
Les connaissances les plus nombreuses portent sur les hydrocarbures aromatiques
polycycliques (HAPs) dont la toxicité la plus souvent rapportée correspond à leur
potentiel carcinogène (Bertrand et Mille, 1989).
11. Devenir des hydrocarbures en milieu marin
Bien que la formation du pétrole résulte de processus naturels de transformation de la
matière organique (MO) (Seewald, 2003). Il est également un polluant majeur. Une
pollution est définie comme une introduction dans l’environnement (air, eau, sol) de
substances portant atteinte à la santé humaine et aux écosystèmes
(O'Rourke et Connolly, 2003).
Elle est essentiellement liée aux activités humaines. Les pollutions liées aux
hydrocarbures entraînent un nombre considérable d’effets négatifs sur la santé
humaine, la qualité de l’air et de l’eau, la détérioration des écosystèmes terrestres
et marins, la biodiversité, la contamination des chaînes alimentaires (O’Rourke
et Connolly, 2003).
Le devenir du pétrole déversé en mer est influencé par de nombreux facteurs
abiotiques et biotiques (Payne et al., 2003) (Figure 5).
Synthèse bibliographique
22
Figure 5 : Le devenir d’une marée noire (McGenity et al., 2012).
1) Dispersion et évaporation des fractions volatiles (alcanes de faibles poids moléculaires
et hydrocarbures mono-aromatiques)
2) Dispersion des gouttelettes de pétrole dans la colonne d’eau, dissolution des fractions solubles
dans l’eau.
3) Formation d’émulsions de pétrole dans l’eau.
4) Photo-oxydation : les hydrocarbures réagissent avec l’oxygène en présence de la lumière
du soleil pour subir des changements structuraux qui augmentent leur solubilité dans l’eau
ou leur récalcitrance à la biodégradation.
5) Sédimentation (adsorption sur des particules).
11.1. Evaporation : Ce phénomène touche les fractions de faible poids moléculaire et
dépend des conditions atmosphériques (vent, vagues, houles, courent, température,).
Les hydrocarbures les plus légers, ayant de 4 à 12 atomes de carbone (Tableau 4), qui
représentent généralement près de 50 % des hydrocarbures totaux d’un brut moyen,
sont éliminés rapidement dès les premiers jours, pouvant conduire à une pollution de
l’atmosphère (Claude, 2011).
Synthèse bibliographique
23
Tableau 4 : Classification des pétroles en fonction de la densité (Claude, 2011).
Densité Provenance ou Catégorie
Groupe I <0.8 Essence, Kérosène
Groupe II 0.8-0.85 Gazole, Pétrole brut d’Abu Dhabi
Groupe III 0.85-0.95 Pétroles bruts arabiques légers et mers du Nord (Forties)
Groupe IV >0.95 Fuel lourd, Pétrole brut du Venezuela
11.2. Solubilisation : La solubilité des hydrocarbures dans l’eau est très faible.
Un hydrocarbure est d’autant plus soluble que sa masse moléculaire est faible et que sa
polarité est élevée. Il est important de noter que ces hydrocarbures solubles sont parmi
les plus dangereux pour l’environnement. Ils sont difficiles à éliminer et sont adsorbés
par la faune et la flore (Bouchezet al., 1995).
11.3. Emulsification : Deux types d’émulsions peuvent se former : eau-dans-huile
appelée "mousse au chocolat" et huile-dans-eau (Figure 6). Les émulsions
eau-dans-huile sont constituées par des hydrocarbures de haut poids moléculaires.
Ces émulsions difficilement dégradables sont les précurseurs des résidus goudronneux
retrouvés sur les plages. Leur formation et leur stabilisation dépendent essentiellement
de la composition chimique du pétrole et en particulier d’une teneur élevée
en composés polaires, en résines et en asphaltènes. Elles sont très stables, leur
dégradation est alors considérablement ralentie et elles sont extrêmement
dommageables pour les zones côtières qui sont impactées (Asia, 2012).
Les émulsions huile dans eau, quant à elles facilitent l’élimination des hydrocarbures,
leur formation est favorisée par la présence de substances tensioactives naturelles.
Parallèlement, la biodégradation s’accompagne d’une production de substances
émulsifiantes (bio-surfactants) qui vont favoriser la dispersion/dissolution
(Asia, 2012).
Synthèse bibliographique
24
Figure 6 : Les émulsions formées par le pétrole dans l’eau de mer
(D’après Bertrand et al., 2012a)
11.4. Sédimentation : La sédimentation est le passage du pétrole de la surface vers le
fond. Ce phénomène concerne les résidus goudronneux constitués de la fraction
pétrolière la plus lourde et dont la densité est supérieure à celle de l’eau de mer.
Les hydrocarbures adsorbés préférentiellement sur les particules en suspension sont
entraînés gravitairement vers le sédiment marin. Ce phénomène est d’ailleurs capital
en termes d’exportation de la surface vers le fond, notamment en eau océanique
profonde (Dachs et al., 2002 ; Deyme, 2011).
La sédimentation conduit à la constitution d’agrégats de haute densité difficilement
dégradable par voie naturelle (Morgan et Watkinson, 1989 ; Mazouz et Smail, 1996).
11.5. Photo-oxydation : La photo-oxydation est observée au niveau de la surface
de l’eau où l’air (oxygène) et la lumière (radiations solaires) sont présents pour
la transformation des hydrocarbures (Payne et Phillips, 1985). L’efficacité
de ce phénomène dépend de la nature des hydrocarbures et de la présence de composés
non hydrocarbonés (Bertrand et Mille, 1989). Ainsi, la photo-oxydation touche plus
particulièrement les composés aromatiques qui sont plus photosensibles que
les composés aliphatiques (Rontani et Giusti, 1987 ; Soltani, 2004). Parmi ces derniers,
les composés ramifiés sont plus facilement photo-oxydés que les n-alcanes.
Ce phénomène est d’ailleurs favorisé par la présence de photo-sensibilisateurs naturels
dans l’eau de mer (Ehrhardt et Petrick, 1985 ; Lurot, 1995 ; Jacquot et al.,
1996; Boukir et al., 2001 ;Asia, 2012). La photo-oxydation conduit à la formation de
composés solubles dans l’eau (acides, alcools, cétones, peroxydes et sulfoxydes)
Synthèse bibliographique
25
et certains travaux de recherche ont montré leur toxicité pour les communautés
microbiennes (Larson et al., 1979; Payne et Phillips,1985; Maki et al., 2001 ; Soltani,
2004), alors que Rontani et al. (1987, 1992), ont montré l’existence d’interactions
entre la photo-oxydation et la biodégradation pour l’élimination des alkylbenzènes et
de l’anthracène. L’action simultanée de ces deux phénomènes permet une élimination
plus rapide de ces deux familles de composés.
11.6. Biodégradation des hydrocarbures
Parmi les différents processus impliqués dans le devenir des hydrocarbures,
la biodégradation des hydrocarbures pétroliers par les micro-organismes est considérée
comme un processus majeur (Leahy et Colwell, 1990).
La biodégradation est le processus naturel le plus important dans la dépollution
de l’environnement. Les micro-organismes en sont responsables, en particulier
les bactéries (Vogel et Ballerini, 2001).
12. Les opérations menées en cas de déversement accidentel de pétrole
en milieu marin.
Il est possible d’intervenir à différents moments dans ce processus pour favoriser
l’élimination des polluants. En premier lieu, il s’agit de limiter la dérive de la nappe
vers le littoral à l’aide de barrages flottants gonflables et de pomper au maximum
le pétrole en surface, voire de « l’écrémer » à l’aide d’un tapis roulant, ou encore
de ramasser manuellement les boulettes de goudrons déjà échouées sur les plages
(Sauret, 2011).
Dans un deuxième temps, l’objectif est de disperser et/ou de faire couler la nappe
de pétrole à l’aide de produits de coulage ou de dispersants. Ce procédé permet
d’augmenter les surfaces de contact eau/pétrole où ont lieu les réactions physico-
chimiques et de biodégradation. Il a aussi un intérêt sociétal majeur, puisqu’il fait
«disparaître » visuellement la pollution, mais les produits dispersants peuvent être eux
même toxiques pour l’environnement (Steiner, 2010).
Une alternative intéressante à ces méthodes physico-chimiques est la stimulation des
bactéries impliquées dans la dégradation du pétrole.
Synthèse bibliographique
26
La biodégradation a pour avantage indéniable qu’elle est naturelle, qu’elle n’implique
aucune intervention humaine, et donc aucun effet supplémentaire sur la flore
aquatique, et surtout qu’elle ne coûte rien. Son inconvénient majeur est qu’elle peut
être très lente. Le challenge est donc d’accélérer ce processus naturel
(Megharaj et al., 2011).
Il existe pour cela deux principales méthodes :
12.1. La bioaugmentation :
C’est l’addition de micro-organismes hydrocarbonoclastes cultivés en laboratoire dans
le milieu pollué, appelé bioaddition. La plupart des expériences de bioaugmentation
ont porté sur des pollutions dans le sol, la technique étant plus compliquée encore à
mettre en œuvre dans les milieux aquatiques en raison de la forte dilution des micro-
organismes ajoutés (Tagger et al., 1983; El Fantroussi et al., 2005).
Dans l’optique de l’améliorer, certains ont eu l’idée d’utiliser des supports comme
niche protectrice pour les inoculas bactériens pouvant offrir à la fois une surface
d’accrochage et un réservoir nutritionnel pour les bactéries d’intérêt (Van Veen et al.,
1997; Gertler et al., 2009).
Dans leur revue, Gentry et al., (2004) ont proposé d’autres solutions possibles pour
améliorer l’efficacité des expériences de bioaugmentation, dont certaines adaptables au
milieu aquatique : utilisation de cellules encapsulées dans un support de type alginate
ou addition directe de gènes d’intérêt dans le but de transférer aux bactéries
autochtones des capacités métaboliques pour la dégradation des hydrocarbures qu’elles
n’avaient pas ou peu.
I.12.2. La biostimulation (Fertilisation organique et inorganique) :
La biostimulation consiste à ajouter des nutriments organiques et/ou inorganiques aux
environnements pollués par les hydrocarbures pour stimuler les bactéries autochtones
de manière à éliminer le problème de leur limitation par les ressources nutritives
(Swannell et al., 1996).
De manière générale, la biostimulation stimule la croissance et l’activité bactérienne,
permettant ainsi une meilleure biodégradation des hydrocarbures (Prince, 1993;
Coulon et al., 2003). Elle provoque également, la plupart du temps, des changements
dans la structure des communautés bactériennes en promouvant certaines bactéries
Synthèse bibliographique
27
plutôt que d’autres en fonction de leurs besoins nutritionnels respectifs et leurs
capacités de compétition pour la ressource (Smith et al., 1998; Head et al., 1999;
Evans et al., 2004; Coulon et al., 2007).
12.3. Les biosurfactants/bioémulsifiants naturels sont également utilisés pour la
bioremédiation des hydrocarbures. Ces molécules peuvent servir dans de nombreux
domaines (textile, pharmaceutique, cosmétique, alimentation, exploitation de
minerais), dont la dépollution des milieux contaminés par les hydrocarbures ou les
métaux. De nouvelles recherches sont toujours entreprises pour découvrir de nouvelles
molécules avec des propriétés inédites (Satpute et al., 2010).
Ces molécules d’origine biologique sont donc totalement biodégradables, bien moins
toxiques que leurs équivalents artificiels et favorisent clairement la biodégradation des
pétroles à la fois par des processus physiques (solubilisation des hydrocarbures) et
biologiques (source de nutriments) (Poremba et al., 1991).
13. Règlementation nationale
Le Code des Eaux, réaménagé en 1996, constitue une base suffisante pour une gestion
rationnelle et intégrée des ressources en eaux, mais il est encore peu appliqué.
L’Algérie a continué à chercher d’autres instruments législatifs afin de mieux protéger
son environnement, alors elle a adopté en 2002 une nouvelle loi relative à la protection
et la valorisation de l’environnement qui incite à préserver les espaces terrestres et
marins remarquables ou nécessaires au maintien des équilibres naturels et à
l’interdiction de toute implantation d’activité industrielles nouvelles sur le littoral.
C’est en 2003, que l’état a conçu la loi n°03-10 relative à la protection de
l’environnement dans le cadre du développement durable, où elle interdit toute
déversement, immersion et incinération dans les eaux maritimes sous juridiction
algérienne, de substances et matières susceptibles de nuire l’environnement.
Concernant les normes algériennes sur les hydrocarbures, il existe le décret exécutif n°
93-160 du juillet 1993 (J.O n°46 du 14 juillet 1993) qui fixe la valeur limite maximale
des hydrocarbures rejetés des installations de déversements industriels à 20 mg/l. Il y a
aussi le décret exécutif n° 06-141 du 19 avril 2006 qui définit les valeurs limites des
rejets d’effluents liquides industriels au niveau des anciennes installations pétrolières
Synthèse bibliographique
28
par 15mg/L des hydrocarbures totaux en attendant la mise à niveau des installations
dans un délai de sept (7) ans (conformément aux dispositions législatives en vigueur,
et notamment celles de la loi n°05-07 du 28 avril 2005). Après ce délai la valeur limite
des hydrocarbures totaux devient 10mg/L (Saker, 2007).
14. Règlementation internationale
Chaque catastrophe maritime a contribué au développement du Droit International.
Le naufrage du Titanic (1912) a posé le fondement du Droit à la sécurité maritime et
de la création d’une première organisation internationale qui allait devenir en 1948
l’Organisation maritime internationale (OMI).
L’OMI regroupe160 Etats-membres. Au total plus de quarante conventions ont été
adoptées et 800 recueils de règles, codes et recommandations ont été publiés. Les
travaux sont réalisés en comités et sous-comités et portent sur deux grands thèmes : la
sécurité maritime et la protection du milieu marin. La sécurité maritime est basée sur
la Convention pour la sauvegarde de la vie humaine en mer, appelée Convention
SOLAS « Safety of Life at Sea». La prévention de la pollution depuis les navires est
basée sur la Convention MARPOL 73/78 dont les dispositions réglementaires sont
présentées dans différentes annexes qui touchent à la nature de la cargaison transportée
et à la vie du navire (Marchand, 2003). Le professeur Jean-Marc Lavieille affirme que
« la convention de Marpol a pour objectif la préservation du milieu marin en assurant
l’élimination de la pollution intentionnelle par les hydrocarbures et autres substance
nuisibles et en minimisant le déversement accidentelle de ces substances». Il en
découle que cette convention s’intéresse aux cas des pollutions accidentelles et
intentionnelles (Ngamalieu Njiadeu, 2008).
Chapitre II
Ecologie des bactéries
Marines
hydrocarbonoclastes
Synthèse bibliographique
29
II. Ecologie des bactéries marines totales et hydrocarbonoclastes
L’Ecologie est une Science ayant pour objet les relations des organismes entre eux et
avec leur environnement. L’écologie microbienne marine a connu de nombreuses
révolutions depuis la découverte des micro-organismes au sein des écosystèmes
marins au début du 20e siècle (Waksman, 1934).
Il a fallu attendre les années 70 et la mise au point de techniques élaborées de
microscopie pour percevoir que l’abondance bactérienne était en réalité cent fois plus
élevée que les estimations faites à partir des méthodes cultivables (Hobbie et al.,1977).
Des lors, est née l’idée que malgré leur taille (0.2-2µm) et l’immensité des océans
(1370.106 Km3), les bactéries marines de part leur abondance (105 cellules par millilitre
d’eau de mer en moyenne) devaient jouer un rôle majeur dans l’évolution des cycles
biogéochimiques (Williams, 1981; Kirchman et al., 1982).
D’abord, compte tenu de la surface des océans (70% de la planète) la respiration
aérobie exercée par les bactéries hétérotrophes marines s’est révélée jouer un rôle clé
dans les budgets globaux de matière et d’énergie (Pomeroy, 1974).
Ensuite, ce changement a modifié le schéma classique du réseau trophique linéaire. Le
concept de « boucle microbienne », formalisé au début des années 1980 par un
collectif de chercheurs travaillant en milieu marin (Azam et al., 1983) a donné
naissance à l’écologie microbienne marine moderne dans laquelle les bactéries
tiennent une place centrale dans les flux de matière, puisque 10 à 50% de la matière
organique issue de la production primaire est reminéralisée sous l’action des micro-
organismes hétérotrophes. Ceux-là sont ingérés par les prédateurs (monoflagellés et
ciliés), eux-mêmes ingérés par le métazooplancton (Azam et al., 1983).
Depuis, le schéma originel de la boucle microbienne, le concept a évolué pour aboutir
davantage à un réseau trophique microbien dans lequel les interactions entre les micro-
organismes sont plus complexes (Sherr et al., 2009).
La photo-hétérotrophie bactérienne (capacité de combiner comme sources d’énergie la
lumière et des molécules organiques) serait également largement répandue (Kolber et
al., 2001). Enfin, les adaptations récentes du réseau trophique microbien prennent en
compte le compartiment viral, longtemps ignoré dans l’étude des transferts de matières
en milieu marin (Wilhelm et al., 1999).
Synthèse bibliographique
30
L’adhésion des bactéries à des surfaces (état sessile), où elles forment des biofilms est
un état très commun des bactéries dans les habitats naturels, prédominant par rapport
aux bactéries libres (état planctonique) (Davey et O’Toole, 2000).
Un biofilm est une communauté microbienne adhérant à une surface et fréquemment
incluse dans une matrice de polymères exocellulaires (Characklis, 1989 ; Marschall,
1992). C’est un système remarquable du fait des nombreuses interactions entre
les différents membres de la communauté microbienne qui le constituent
(Vandecasteele, 2005).
La compartimentation cellulaire et métabolique des biofilms résulte, elle aussi,
d’interactions cellulaires et, bien entendu, de phénomènes de transfert (nutriments,
oxygène, déchets du métabolisme, composés toxique). Dans un milieu parfaitement
aéré, les souches superficielles du biofilm auront un métabolisme aérobie, tandis que
les souches inférieures pourront être anaérobies suite à une limitation physico-
chimique du transfert d’oxygène, mais également par l’activité respiratoire des micro-
organismes situés vers l’extérieur (Prigent-Combaret et Lejeune, 1999).
La structure en biofilm confère aux bactéries des propriétés spécifiques par rapport aux
bactéries libres. Les biofilms présentent notamment une résistance accrue aux agents
toxiques, qui résulte de l’agrégation des bactéries entre elles, de modifications
physiologiques des micro-organismes fixés et de la neutralisation de ces agents par les
exopolymères. L’activité métabolique des biofilms peut également être accrue par le
piégeage des nutriments dans la matrice d’exopolymères, par un meilleur recyclage
des intermédiaires métaboliques entre les souches « géométriquement » proches, ainsi
que grâce à une grande diversité microbienne pouvant utiliser des substrats multiples.
Des bactéries fixées seraient ainsi capables de se multiplier alors que, dans les mêmes
conditions nutritives ; les bactéries sous forme libre entreraient en dormance
(Prigent-Combaret et Lejeune, 1999).
Tous les organismes participent aux cycles biogéochimique, mais les micro-
organismes jouent un rôle prépondérant de fait de leur ubiquité, de leurs capacités
métaboliques larges et de leur activité enzymatique intense. Ils ont plusieurs rôles
complémentaires : transformation d’éléments minéraux et surtout décomposition de la
matière organique (Vandecasteele, 2005).
Synthèse bibliographique
31
Cela prend tout son sens dans le cas d’une pollution pétrolière. En effet, parmi les
bactéries marines, cela fait tout juste un siècle que des bactéries capables d’utiliser les
hydrocarbures pétroliers comme seule source d’énergie et de carbone ont été isolées
pour la première fois. Ce sont les bactéries hydrocarbonoclastes (HCB pour
hydrocarbonoclastic bacteria) (Söhngen, 1913).
Il n’est pas étonnant qu’une telle fonction ait depuis été retrouvée dans tous les
écosystèmes du globe, y compris dans des zones dites extrêmes comme les régions
polaires (Whyte et al., 1995), les déserts (Al-Hadrami et al., 1995) ou les sources
chaudes (Zarilla et al., 1984), dans la mesure où le pétrole, de part son abondance et
son aspect hautement réduit, représente un apport très important en carbone et en
énergie utilisables par les micro-organismes.
En 1985, Carl Woese et ses collaborateurs dénombraient 11 groupes bactériens
phylogénétiquement différents, alors qu’en 2003, Rappé et Giovannoni en comptaient
53. Cette «nouvelle » diversité a fait naître un certain nombre de questionnements à la
fois en termes méthodologiques et écologiques.
La plupart des bactéries hydrocarbonoclastes appartiennent aux γ-protéobactéries. On
peut noter quelques genres majoritaires parmi les 79 récemment répertoriés (Prince,
2005) : Acinetobacter, Alcanivorax, Alcaligenes, Cycloclasticus, Flavobacterium,
Marinobacter, Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Thallassolituus, Oleispira et
Vibrio.
De nombreuses études ont montré qu’elles étaient ubiquistes et présentes en faible
quantité, même dans les environnements dépourvus de contamination (Colwell et al.,
1977; Leahy et al., 1990).
Naturellement, leurs effectifs sont accrus dans les zones chroniquement polluées par
les hydrocarbures et augmentent après un apport de pétrole (Atlas, 1981; Floodgate,
1995). Mais, chacun de ces genres bactériens n’est capable de dégrader qu’un nombre
restreint d’hydrocarbures, alors que le pétrole est composé de centaines voire de
milliers de molécules différentes (Sauret, 2011).
Synthèse bibliographique
32
La biodégradation totale d’un pétrole n’est donc possible que grâce à la mise en place
d’un consortium bactérien comprenant des groupes dont les équipements
enzymatiques complémentaires permettent la biodégradation quasi-totale de ces
différents types d’hydrocarbures (Head et al., 2006).
Si les bactéries dégradant les composés les plus simples (comme les alcanes linéaires à
courte chaine) sont abondantes dans l’environnement, celles qui possèdent les
machineries enzymatiques pour dégrader les composés les plus complexes (comme par
exemple les composés aromatiques de plus de quatre cycles) sont beaucoup moins
répandues (Rodriguez-Blanco et al., 2010).
Le niveau de dégradation des pétroles (mélange de composés facilement dégradables
et de composés récalcitrants) est donc totalement dépendant de la diversité
métabolique des bactéries hydrocarbonoclastes présentes dans l’environnement pollué
(Sauret, 2011).
La diversité des espèces bactériennes est un facteur décisif dans la réponse des
communautés bactériennes à ce type de variation environnementale. Son étude est
primordiale pour la compréhension du phénomène d’élimination naturelle des
polluants pétroliers (Sauret, 2011).
1. La biodégradation des hydrocarbures
L’utilisation de méthodes biologiques dans la dépollution des zones contaminées par
les hydrocarbures se basant sur le phénomène de la biodégradation par les micro-
organismes appelés hydrocarbonoclastes a été mise en évidence dès 1946 par ZoBell.
Depuis cette date, le nombre d’espèces bactériennes identifiées possédant cette
propriété n’a cessé d’augmenter (Soltani, 2004).
1.1. Définition
La biodégradation est l’ensemble des mécanismes de transformation d’un contaminant
en différents sous-produits par l’action des micro-organismes. Ce phénomène peut
s’effectuer à n’importe quel milieu (sol, eau), ainsi que dans différentes phases
du polluant (liquide, solide, gazeuse) (Lecomte, 1995).
Synthèse bibliographique
33
La biodégradation correspond à une action de décomposition d’un composé par des
agents biologiques. Lorsque la biodégradation conduit à des produits inorganiques tels
que CO2, H2O, H2, …, c’est une minéralisation. Au préalable, les macromolécules
et les polymères doivent être coupés en oligomères ou monomères afin de traverser
la barrière cellulaire. Cette phase s’appelle la fragmentation ou dépolymérisation
(Lecomte, 1995).
Certaines molécules nécessitent d’autres transformations (élimination de groupements
gênants, augmentation du caractère hydrophile, etc.) qui appartiennent à l’étape
de biotransformation. Toute molécule qui entre dans une cellule d’un décomposeur
pour y être transformée est considérée comme bioassimilable. La bioassimilation
est l’incorporation des molécules ou fragments de molécules dans les voies
métaboliques de la cellule. Le devenir des métabolites suit différentes voies
(Dommergues et Mangenot, 1972) :
- il intègre les voies cataboliques et est totalement transformé en produit final
minéral (CO2, H2O) excrété et en énergie pour la cellule,
- il subit des bioconversions en molécules organiques excrétées (alcool, acides,
aldéhydes, etc.),
- il participe à l’anabolisme cellulaire et sert à la synthèse d’une nouvelle
biomasse et de molécules de réserve,
- il participe au métabolisme secondaire.
La biodégradation est un processus naturel qui se manifeste au sein de la nature. Elle
est nécessaire pour la réalisation des cycles biogéochimiques. Un cycle
biogéochimique correspond à l’ensemble des échanges et transformations des
différents éléments (carbone, azote, oxygène, soufre, phosphore, eau) entre les
différents réservoirs d’une planète (hydrosphère, atmosphère, lithosphère et biosphère)
(Vandecasteele, 2005).
La matière organique constitue une source de nutriments (C, H, O, N, P, S,
oligoéléments) utilisés par les micro-organismes pour leur développement (croissance,
reproduction, métabolisme secondaire). Ainsi, toute matière carbonée semble
potentiellement décomposable par une flore microbienne adaptée. Toutefois, la nature
du substrat (hydrophobe/hydrophile), sa structure chimique (nature des liaisons,
Synthèse bibliographique
34
ramifications), et physique (masse moléculaire, cristallinité), les conditions
environnementales (humidité, pH, température, oxygène, oligoélements, facteurs de
croissance) peuvent avoir une influence sur le comportement de cette flore
(Vandecasteele., 2005).
1.2. Principe de biodégradation
La biodégradation est un phénomène naturel. Elle est le résultat de la dégradation
de molécules organiques par les micro-organismes (bactéries, champignons,…), dont
la croissance s’effectue par l’oxydation du carbone qui est utilisé comme source
d’énergie (Figure 7). Cette réaction met en jeu deux autres éléments, l’azote et le
phosphore, qui participent à la synthèse protéique. Lorsque l’oxydant est représenté
par l’oxygène, on parle de condition d’aérobiose. Dans le cas d’anaérobiose, l’oxygène
est remplacé par les nitrates, sulfates ou méthane (Jose, 1999).
Figure 7: Métabolismes impliqués dans l’utilisation des hydrocarbures
par les micro-organismes (D’après Widdel et Rabbus, 2001).
La littérature concernant l’oxydation des hydrocarbures par les microorganismes
indique que la croissance cellulaire dépend des processus de transport des
hydrocarbures à la surface cellulaire et de passage à travers l’enveloppe cellulaire
jusqu’au cytoplasme (Soltani, 2004).
Synthèse bibliographique
35
Dans les conditions naturelles, la biodégradation des hydrocarbures est un processus
lent et complexe, son mécanisme est décrit dans la figure 7.
Elle se déroule selon une réaction d’oxydation en chaine, les hydrocarbures sont
transformés par cassures successives en molécules de moins en moins complexe
jusqu’à l’obtention de sous-produits simples qui sont représentés par l’H2O et le CO2
avec renouvellement de la biomasse (Lecomte, 1995).
1.3. Mécanismes de biodégradation des hydrocarbures
Les hydrocarbures sont des molécules inertes du point de vue chimique et doivent être
activés par les bactéries tant en conditions oxique qu’anoxique. Une grande variété de
micro-organismes présente la capacité de dégrader les hydrocarbures. Ils sont qualifiés
d’« hydrocarbonoclastes » (Berthe-Corti et Höpner, 2005).
Les réactions initiales de transformation des hydrocarbures font intervenir une grande
diversité d’enzymes spécifiques des bactéries hydrocarbonoclastes. Ces enzymes sont
codées par différents gènes dont la localisation, l’organisation et la régulation
apparaîssent également diversifiées (Bertrand et al., 2011 ; Wang et al., 2010).
1.4 Le cométabolisme
Dans ce cas, le polluant ne sert pas de source principale de carbone ou d’énergie.
Le micro-organisme à besoin d’une source primaire de substrat, et le polluant
est considéré comme un substrat secondaire. Il s’agit alors d’une biodégradation
par cométabolisme, dans laquelle un substrat secondaire est biodégradé en même
temps qu’un substrat primaire. Ce mode de dégradation est essentiel pour la plupart
des polluants organochlorés (Baker et Herson, 1994). Un exemple d’alcane
cométabolisé est le cyclohexane dégradé par Mycobacterium austroafricanum
en présence d’isooctane (Marchal et al., 2003).
Synthèse bibliographique
36
2. Micro-organismes aptes à biodégrader les hydrocarbures
Les bactéries et les champignons sont des acteurs essentiels dans le recyclage des
composés organiques de toutes natures (Tableau 5), contribuant, ainsi, à la
biodégradation d’un grand nombre de substances utilisées comme source d’énergie ou
comme source de carbone directement assimilable par les cellules (Pelmont, 1995).
Selon Pelmont, (1995), Les caractéristiques des bactéries aptes à biodégrader
les hydrocarbures sont les suivantes :
Génétiquement stable ;
Apte à se reproduire rapidement suite à un entreposage de longue durée ;
Apte à biodégrader une vaste étendue de polluants pétroliers ;
Activité enzymatique et croissance des bactéries dans des conditions
environnementales optimum ;
Aucun effet secondaire néfaste et produits finaux non toxiques ;
63% pigmentés (orange, jaune et rouge) ;
La majorité des souches bâtonnées Gram négatives ;
Des bactéries motiles ou mobiles ;
20% des bactéries à Gram positives, filamenteux.
Synthèse bibliographique
37
Tableau 5 : Liste des bactéries capable de dégrader les hydrocarbures selon
Jagadevan et Mukherji (2004).
La capacité de se développer sur les hydrocarbures ne se limite pas uniquement aux
bactéries, certains sites contaminés contiennent également de nombreux champignons
et levures capables de les dégrader (Klug et Markovetz, 1971; Davies
et Westlake,1979; Blasig et al., 1984; Fedoraket al., 1984; Meulenberg et al., 1997;
Yamada-Onodera et al., 2002).
Ces micro-organismes sont largement répandus dans les environnements marins, à la
fois dans la colonne d’eau et dans les sédiments (Leahy et Colwell, 1990; Bachoon
et al., 2001; Van Hamme et al., 2003).
Composés Microorganismes
Alc
anes
Pseudomonas sp. Bacillus sp.
Acinetobacter calcoaceticus Micrococcus sp.
Candida antarctica Nocardia erythropolis
Ochrobactrum sp. Acinetobacter sp. Seiratia marcescens Candida tropicalis Alcaligene sodorans
Mon
o-ar
omat
iqu
e
Brevibacillus sp. Pseudomonas sp. Alcaligene sodorans
Pol
y-a
rom
atiq
ue
Sphingomonas paucimobilis Achromobacter sp. Mycobacterium sp. Pseudomonas sp.
Mycobacterium flavescens Rhodococcus sp.
Synthèse bibliographique
38
3. Mode d’accession aux hydrocarbures
Les hydrocarbures sont des composés hydrophobes dont la solubilité diminue d’autant
que la masse moléculaire des composés est importante. Pour les hydrocarbures dont la
solubilité est insignifiante, les micro-organismes ont dû développer des mécanismes
permettant un contact intime entre les cellules et le substrat. Quatre modes d’accession
ont été avancés pour expliquer l’assimilation des hydrocarbures par les micro-
organismes (Hommel, 1994 ; Bouchez-Naitali et al., 1999) :
3.1. La solubilisation
La solubilisation dans la phase aqueuse a surtout été rapportée pour les hydrocarbures
aromatiques suffisamment solubles et les alcanes légers. C’est sous forme solubilisée
que le substrat pénètre dans la cellule (Goswami et Singh, 1991 ; Bouchez
et al., 1995).
3.2. L’accession interfaciale
Les micro-organismes utilisant les alcanes peu solubles possèdent fréquemment une
membrane externe hydrophobe (Miura, 1978 ; Rosenberg, 1984). L’hydrophobicité
élevée de la membrane cellulaire externe permet l’adhésion du micro-organisme aux
gouttelettes de substrat présentes dans le milieu aqueux, souvent de taille très
supérieure à celle des bactéries. Le substrat pénètre directement dans la cellule par
diffusion ou transport actif sans se dissoudre dans la phase. L’hydrophobicité des
micro-organismes concernés entraîne souvent une forte tendance à l’agrégation
(Vandecasteele., 2005).
3.3. L’accession interfaciale facilitée (émulsification)
Dans ce mécanisme, le transfert entre les hydrocarbures et le micro-organisme
s’effectue par contact direct, mais l’intervention de biosurfactants produit par
le micro-organisme accélère le transfert en augmentant l’aire interfaciale entre les
phases hydrophobes et hydrophiles. On parle de transfert interfacial assisté
(Vandecasteele, 2005).
Synthèse bibliographique
39
3.4. Le transfert micellaire
Le mécanisme de transfert à travers l’enveloppe cellulaire n’est en réalité pas connu.
Hommel et Ratledge (1984) ont formulé une hypothèse sur l’existence des pores
hydrophobes au niveau de l’enveloppe bactérienne. Il faut noter que la surface externe
d’une micelle est majoritairement hydrophile et le transfert micellaire apparaît
privilégié chez les micro-organismes dont l’hydrophobicité de l’enveloppe cellulaire
est faible (Bouchez-Naitali et al., 1999).
4. La biodégradation aérobie
Selon Zhenpeng et al., (2002), la biodégradation aérobie d’une substance organique est
le degré de modification physique et chimique que subit cette matière organique par
les micro-organismes. La figure 8 illustre les processus de biodégradation d’une
substance organique en condition aérobie.
Figure 8: Mécanisme général de dégradation aérobie des hydrocarbures
par les micro-organismes (Das et al., 2011).
Synthèse bibliographique
40
4.1. Les oxygénases
Les oxygénases sont des enzymes qui catalysent l’incorporation de l’oxygène sous
forme d’O2 dans les composés organiques. Il existe deux classes d’oxygénases : les
di-oxygénases catalysent l’incorporation de deux atomes d’O2 dans une molécule, et
les mono-oxygénases qui catalysent le transfert d’un des deux atomes d’oxygène d’O2
dans un composé organique ; le deuxième atome d’O2 est réduit en H2O. Le donneur
d’électrons de la plupart des mono-oxygénases est le NADH ou le NADPH, bien
qu’O2 soit couplé directement à une flavine qui est ensuite réduite par NADH ou
NADPH (Figure 9) (Madigan et Martinko, 2007).
Figure 9 : Activité de la mono-oxygénase
(Madigan et Martinko, 2007)
Synthèse bibliographique
41
4.2. Les micro-organismes aérobies et les n-alcanes
Une grande variété de micro-organismes est capable d’oxyder les alcanes
(Singer et Finnerty, 1984 ; Witkinson et Morgan, 1990). Toutes les espèces d’un genre
donné ne sont pas capables d’utiliser les hydrocarbures aliphatiques comme seule
source de carbone et d’énergie. Mais, les souches d’une même espèce partagent
souvent la capacité de dégrader un hydrocarbure donné (Rehm et Reiff, 1981).
La dégradation des n-alcanes est beaucoup mieux connue que celle des autres classes
d’hydrocarbures saturés et fait apparaître une spécialisation des micro-organismes
selon les longueurs de chaînes (Vandecasteele., 2005).
Les alcanes courts (C2- C4) sont dégradés principalement par des bactéries
grampositives appartenant aux genres séparées Corynebacterium, Arthrobacter,
Nocardia, Mycobacterium, Rhodococcus, mais aussi quelques Pseudomonas. Ils sont
aussi utilisés par certains genres de champignons, notamment Graphium
(Hamamura et al., 1999).
Les alcanes à chaîne moyenne (C5- C10) ont été plus étudiés. Ils sont utilisés
notamment par des bactéries du genre Pseudomonas (Vandecasteele, 2005).
Les alcanes à longues chaînes (C10- C20) sont très bien utilisés par les micro-
organismes, plus rapidement que les alcanes moyens. Les bactéries appartiennent en
particulier au groupe Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia (CMN), et
notamment au genre Rhodococcus, mais aussi à des genres gram-négatifs
(Pseudomonas, Alcaligenes). Les alcanes à longues chaînes sont également
d’excellents substrats pour plusieurs genres de levures (Candida, Pichia, Yarrowia,
Torulopsis) (Vandecasteele, 2005).
Les alcanes à très longues chaînes (supérieures à C20) sont également dégradés par
les micro-organismes, mais l’utilisation de ces substrats, solides à température
ambiante, a été moins étudiée (Vandecasteele, 2005).
La pluparts des micro-organismes décrits sont des souches mésophiles présentes dans
les eaux et les sols des régions tempérées. Pour certaines, les alcanes constituaient les
seuls substrats carbonés utilisés. Il faut encore noter le développement de l’intérêt pour
le milieu marin qui conduit actuellement à l’isolement et à l’étude d’une série de
nouvelles souches. Ces souches mésophiles gram-négatives appartiennent à des genres
Synthèse bibliographique
42
nouveaux tels que Marinobacter (Gauthier et al., 1992) et Alcanivorax (Yakimov et
al., 1998) de la sous classe γ des protéobactéries.
Yakimovet al., (1999) ont également isolé deux souches psychrophiles marines
de l’Antarctique appartenant au genre Rhodococcus. Ces souches dégradent
l’hexadécane et le diphényle et produisent des tréhalose-lipides. Parmi les levures,
fréquentes dans les environnements aquatiques, Debaromyces hansenii est une espèce
halotolérante, commune en milieu marin notamment, qui utilise les alcanes et divers
xénobiotiques (Rhaff, 1986).
4.3. Les micro-organismes aérobies et les isoalcanes
De nombreuses espèces dégradant les n-alcanes dégradent, aussi, les isoalcanes
méthylés en position paire, la méthylation en position impaire nécessitant des bactéries
spécialisées beaucoup moins connues (Vandecasteele, 2005).
4.4. Les micro-organismes aérobies et les alcènes
Les micro-organismes les plus fréquemment isolés utilisant pour leur croissance divers
alcènes courts, l’isoprène et les monoterpènes, sont des bactéries appartenant aux
genres Mycobacterium, Nocardia, Xanthobacter et Rhodococcus. Cependant, les
hydrocarbures insaturés à courte chaîne ont une durée de vie limitée dans
l’atmosphère, l’éthène étant détruit par réaction avec les radicaux OH et l’ozone
(Hartmans et al., 1989).
L’isoprène est émis par les végétaux en quantités importantes. Cet hydrocarbure est
oxydé en grande partie dans l’atmosphère pour former l’ozone, des peroxydes
organiques et du monoxyde de carbone (Fall et Copley, 2000).
4.5. Les micro-organismes aérobies et les cycloalcanes
La dégradation des cycloalcanes dans l’environnement est un cas intéressant.
De rares souches (Nocardia, Pseudomonas) sont capables de les minéraliser.
Par contre, l’attaque initiale par Cométabolisme, relayé par des souches minéralisant
le cyclohexanol ou la cyclohexanone qui sont communes, est efficace
(Vandecasteele, 2005).
Synthèse bibliographique
43
4.6. Le métabolisme des hydrocarbures aliphatiques
Un certain nombre de bactéries et plusieurs espèces de moisissures et de levures
peuvent utiliser des hydrocarbures comme donneurs d’électrons pour croître en
conditions aérobies. Le réactif pour l’étape initiale de l’oxydation des hydrocarbures
aliphatiques saturés est l’oxygène moléculaire (O2) ; un des atomes de la molécule
d’oxygène est incorporé en oxydant l’hydrocarbure, généralement au niveau
de l’atome de carbone terminale (Leahy et Colwell, 1990).
Cette réaction est catalysée par une alcane hydroxylase (alcane mono-oxygénase) ou
un cytochrome P450 conduisant à la formation d’un alcool. Cet alcool est ensuite
oxydé via l’action d’un alcool déshydrogénase formant l’aldéhyde correspondant qui
est ensuite transformé en acide carboxylique par un aldéhyde déshydrogénase
(Leahy et Colwell, 1990).
L’acide carboxylique ainsi formé est, soit métabolisé par l’intermédiaire de la voie
de la β-oxydation, soit incorporé dans la voie de synthèse des lipides cellulaires
(van Beilen et al., 2003).
4.6.1. Les oxydations monoterminale et diterminale
Au cours de ces voies de dégradation qui sont prédominantes et qui correspondent au
même schéma général, les alcanes sont oxydés en acides carboxyliques. Ces derniers
sont métabolisés par l’intermédiaire de la voie de β-oxydation ou incorporés dans les
lipides cellulaires, ou encore ils subissent une nouvelle oxydation à l’autre extrémité
de la chaîne aliphatique (Ѡ-oxydation). Ils conduisent, dans ce dernier cas, à des
acides dicarboxyliques qui sont dégradés par β-oxydation (van Beilen et al., 2003).
4.6.2.L’oxydation subterminale
L’oxydation subterminale n’emprunte pas l’étape initiale de conversion
de l’hydrocarbure en acide gras, mais hydroxyle l’alcane sur un carbone secondaire
et l’alcool produit est déshydrogéné en cétones à partir d’alcanes (Figure 10).
Par exemple , P. aeruginosa, en croissance sur décane produit plusieurs alcools
comme les 1-, 2-, 3-, 4- et 5- décanols, ainsi que les cétones correspondantes
( Britton, 1984).
Synthèse bibliographique
44
Figure 10: Voies de dégradation des n-alcanes les plus fréquents
(Oxydation terminale et subterminale) (Rojo, 2010).
4.7. Le métabolisme des hydrocarbures aromatiques
4.7.1. Les bactéries impliquées
Un certain nombre de micro-organismes aérobies mésophiles isolés des sols et des
bactéries d’autres habitats ont été isolées, par exemple des souches de Sphingomonas
de sédiments profonds de plaines côtières (Fredrickson et al., 1995).
Une oligobactérie marine, Cycloclastus oligotrophus RB1, une souche cultivable
oligotrophe capable de croître sur de faibles concentrations de toluène, ou xylène, a été
isolée, et certains gènes de la voie catabolique ont été caractérisés (Wang et al., 1996).
Des souches bactériennes thermotolérantes (croissance à 42°C) (Lee et Lee, 2001) et
psychrotolérantes d’habitats divers ont également été décrites (Busse et al., 2003). La
dégradation des hydrocarbures dans des habitats très acides (Stapleton et al., 1998) et
dans des milieux très salins (Nicholson et Fathepure, 2004) a été rapportée.
Synthèse bibliographique
45
4.7.2. Les levures et les champignons
La dégradation des hydrocarbures monoaromatiques par les levures et les
champignons est partielle, mais peut favoriser la dégradation par cométabolisme. Les
lignines peroxydases des champignons ligninolytiques oxydent divers hydrocarbures
polyaromatiques, mais n’apparaissent pas intervenir dans la dégradation des
BETX (benzène, toluène, éthylbenzène et le xylène). Cependant, plusieurs souches de
champignons sont capables de croitre sur certains hydrocarbures aromatiques. C’est le
cas, par exemple, de souches d’Exophiala jeanselmei qui poussent sur styrène et sur
toluène (Cox et al., 1996), de Cladosporium sphaerocarpum et de Scedosporium
apiospermum qui poussent sur toluène (Garcia-Pena et al., 2001),
et de Cladophialophora sp. qui poussent sur toluène et éthylbenzène (Prenapheta-
Boldù et al., 2002).
4.7.3. Les voies cataboliques
En conditions aérobies, beaucoup de donneurs d’électrons sont des hydrocarbures
aromatiques ; parmi les micro-organismes concernés, les bactéries du genre
Pseudomonas ont été le mieux étudiées. Le métabolisme de ces composés, dont
certains sont de très grosses molécules, a généralement comme étape initiale la
formation de catéchol ou d’un composé structuralement proche (Figures 11)
(Madigan et Martinko, 2007).
Ces composés à un seul noyau sont désignés sous le nom de substrat de départ parce
que le catabolisme oxydatif débute seulement après que les grandes molécules
aromatiques ont été converties en ces formes plus simples (Madigan
et Martinko, 2007).
Le protocatéchuate et le catéchol peuvent ensuite être dégradés en composés pouvant
entrer dans le cycle de l’acide citrique : succinate, acétyl-CoA et pyruvate (Figure 11).
Plusieurs étapes du catabolisme des hydrocarbures aromatiques nécessitent
habituellement des oxygénases. Les figures (a, b et c) montrent des réactions
catalysées par des oxygénases différentes, l’une d’elles utilisant une mono-oxygénase
et les deux autres, une dioxygénase (Madigan et Martinko, 2007).
Synthèse bibliographique
46
Figure 11 : Rôle des oxygénases dans le catabolisme
des composés aromatiques (Madigan et Martinko, 2007).
a : Mono-oxygénase , b: Dioxygénase , c : Dioxygénase
En ce qui concerne la dégradation des hydrocarbures aromatiques polycycliques
(HAPs), plus le nombre de cycles augmente dans la molécule, plus celle-ci est
difficilement dégradable. Ainsi, de nombreuses bactéries ont été répertoriées pour la
dégradation de molécules comme le benzène ou le naphtalène, alors qu’à ce jour,
seules quelques espèces sont connues pour dégrader les HAP de plus de 4 cycles tel
que le benzo[a]pyrène (Rodriguez-Blanco et al., 2010).
L’étape initiale d’attaque des HAPs par les bactéries consiste en l’incorporation de un
ou deux atomes d’oxygène dans l’hydrocarbure par l’intervention d’une mono- ou
di-oxygénase entraînant, ainsi, l’oxydation du cycle aromatique (Pérez-Pantoja
et al., 2010).
Synthèse bibliographique
47
A l’issue de plusieurs réactions biochimiques, l’attaque par l’oxygénase conduit à un
cis dihydrodiol caractéristique de la dégradation bactérienne. Les produits sont ensuite
minéralisés ou incorporés dans la biomasse cellulaire (Habe et Omori, 2003; Bamforth
et Singleton, 2005).
5. La biodégradation anaérobie des hydrocarbures
Les hydrocarbures peuvent être dégradés en anaérobiose avec le nitrate, le fer (III),
ou le sulfate comme accepteurs d’électrons, dans des conditions de méthanogénèse,
ou par photosynthèse anoxygéniques. Dans les environnements anoxiques, l’absence
d’oxygène implique une stratégie d’activation enzymatique spécifique. Ainsi, les
bactéries anaérobies possèdent différentes voies biochimiques pour convertir les
hydrocarbures, substrats apolaires en composés contenant un groupement polaire
(Heider et al., 1999).
Des voies de dégradation ont été décrites en conditions de dénitrification,
sulfato-réduction et méthanogénèse (Habe et Omori, 2003 ; Wentzel et al., 2007;
Foght, 2008). Ces réactions conduisent à la formation de composés comprenant une
fonction acide qui seront alors transformés en acétyls-CoA par la voie de la
β-oxydation. Ces acétyls-coA seront alors ensuite pris en charge par le cycle de Krebs
(Mbadinga et al., 2011).
5.1. Les hydrocarbures aliphatiques
En anaérobiose, les mécanismes d’activation des hydrocarbures ne peuvent utiliser
des molécules d’oxygène comme cela le cas en aérobiose. Les mécanismes principaux
d’attaque des alcanes sont l’activation par l’ajout de fumarate (Figure 12 A)
(Aeckersberg et al., 1991 ; So and Young, 1999a , 1999b ; Cravo-Laureau et al., 2005;
Callaghan et al., 2006) et la carboxylation (Figure 12 B) (Aeckersberget al., 1998;
Fuchs, 2008; Callaghan et al., 2009 ; Mbadinga et al., 2011).
Le mécanisme d’ajout de fumarate semble être le mécanisme le plus répandu, il a été
mis en évidence chez la plupart des souches sulfato-réductrices, des souches
dénitrifiantes et récemment, dans une culture d’enrichissement avec octacosane (C28)
en condition de méthanogénèse (Callaghan et al., 2010).
Synthèse bibliographique
48
D’autres mécanismes alternatifs, plutôt atypiques, ont également été proposés
(Figure 12 C). Par exemple, la souche Pseudomonas chloritidismutans AW-1T
est capable de produire de l’oxygène moléculaire, via la respiration de chlorate
(dismutation), qui sera alors utilisé pour oxyder l’alcane à l’aide d’une oxygénase
(Figure 12 C-1) (Mehboob et al., 2009). Cette réaction est qualifiée
« d’oxygénation inhabituelle » de l’alcane, car elle se déroule sous une atmosphère
totalement anoxique.
Une stratégie similaire via « la production d’oxygène intra-cellulaire » est également
possible avec des accepteurs d’électrons comme les nitrates ou les nitrites (Ettwig
et al., 2010). Cependant, il a été récemment présumé que l’oxyde nitrique ou les
nitrites générés lors de la réduction des nitrates peuvent être directement impliqués en
tant que co-réactif dans l’activation des alcanes chez la souche HdN1 (Figure 12 C-2)
(Zedelius et al., 2011).
Enfin, une étude récente réalisée en condition de méthanogénèse suggère que les
alcanes pourraient être activés via une hydroxylation (Figure 12 C-3)
(Head et al., 2010).
Synthèse bibliographique
49
Figure 12: Voies de dégradation anaérobie des alcanes (Mbadinga et al., 2011)
12 A : Addition de fumarate ; C1: Oxydation de l’alcane à l’aide d’une oxygénase ;
12 B : Carboxylation ; C2 : Implication des nitrites de en tant que co-réactif dans
l’activation des alcanes ;
12 C : Mécanismes Alternatifs ; C3 : Hydroxylation des alcanes.
5.2. Voies de biodégradation anaérobie des hydrocarbures aromatiques
Les molécules d’hydrocarbures, ainsi, activées sont ensuite dégradées en acétyl-CoA
par des étapes de déshydrogénation et d’hydratation, avant d’entrer dans le cycle de
Krebs. Elles servent alors de donneurs d’électrons qui sont capturés par un accepteur
d’électrons externe, tels que le nitrate, le sulfate ou le fer (Widdel et Musat, 2010).
D’autres mécanismes d’activation des hydrocarbures ont aussi été identifiés
en anaérobiose et passent par la carboxylation ou encore l’hydroxylation
des molécules (Qiao et Marsh, 2005).
Synthèse bibliographique
50
Plusieurs études ont montré la biodégradation des hydrocarbures aromatiques
en anaérobiose. Cependant, la majorité des souches isolées dégradent essentiellement
les BTEX (mono-aromatiques) et le naphtalène. Ces souches appartiennent
aux Alpha-, aux Béta-, aux Gamma-, aux Delta-protéobactéries ou aux Firmicutes.
La dégradation des hydrocarbures aromatiques a été démontrée en condition
de dénitrification, sulfato-, ferri-réduction et photosynthèse anoxygénique (Widdel
et Musat, 2010).
Actuellement, quatre voies de dégradations sont reconnues (Figure 13) (Foght, 2008 ;
Fuchs, 2008): l’addition de fumarate catalysée par une enzyme à radical glycyl
(Widdel et Rabus, 2001); la méthylation des aromatiques non substitués (Safinowski et
Meckenstock, 2006) ; l’hydroxylation catalysée par une déshydrogénase (Rabus et
Widdel, 1995), et la carboxylation (Zhang et Young, 1997).
Addition de fumarate (a,b,c), déshydrogénation (d) et carboxylation(e).
Figure 13 : Exemples de réactions initiales de dégradation anaérobie
des hydrocarbures aromatiques. (D’après Widdel et Rabbus, 2001).
Synthèse bibliographique
51
Ces réactions conduisent à la formation de cycles saturés, l’oxydation et/ou au clivage
du cycle produisant des métabolites comme le benzoyl-CoA qui peut être incorporé
pour la biomasse ou être complètement oxydé (Harwood et al., 1998).
Les HAPs constituent une classe à part du fait de l’énergie de résonance due aux
cycles aromatiques qui leur confère une stabilité chimique et leur dégradation par des
souches pures n’a été rapporté que peu de fois (Meckenstock et Mouttaki, 2011). Ils
sont activés par des mécanismes d’hydroxylation, de carboxylation ou de méthylation
qui peut être suivie d’une addition de fumarate.
Jusqu’à présent, la dégradation anaérobie des composés mono-aromatiques comme
le benzène, toluène, éthylbenzène et le xylène (BTEX) ont été très documentés
en comparaison à la dégradation anaérobie des HAPs ou des alcanes. En effet
à ce jour, la dégradation anaérobie a été démontrée pour un nombre limité de HAPs
en présence de nitrate, de fer, de manganèse, de dioxyde de carbone et de sulfate
(Meckenstock et al., 2004).
6. Facteurs physiques et chimiques affectant la biodégradation des hydrocarbures
La biodégradation des hydrocarbures est l’un des premiers mécanismes conduisant à la
transformation de ces polluants en produits moins toxiques. Les travaux de recherche
sur l’oxydation des hydrocarbures par les micro-organismes ont montré que ce
processus dépend de la structure chimique des hydrocarbures et des conditions
environnementales (Figure 14). Les facteurs physico-chimiques influant sur la vitesse
de biodégradation microbienne sont: la température, l’oxygène disponible, le pH, la
salinité, les éléments nutritifs, l’osmose et la pression hydrostatique (Atlas, 1981;
Leahy et Colwell, 1990).
Synthèse bibliographique
52
Figure 14: Facteurs affectant l’efficacité de biodégradation (Stauffert, 2011).
Certains paramètres environnementaux comme la température et le pH vont affecter
les propriétés du pétrole (viscosité du pétrole, volatilité et solubilité des molécules)
et l’activité des communautés microbiennes (Chung et al., 2000 ; Boszczyk-Maleszak
et al., 2006).
Partie II
Matériel et méthodes
Matériel et méthodes
53
1. Zone d’échantillonnage
Le port d’Arzew situé sur la partie Nord-Ouest de la baie d’Oran, de coordonnées
géographiques (latitude Nord : 35°51'10.60"N, longitude Ouest 0°17'45.99"O)
(Figure 12). C’est un site caractérisé par un trafic maritime intense, des rejets urbains
de la ville d’Arzew ainsi que les villages adjacents. C’est un port mixte : commercial,
pêche, ainsi qu’un grand port pétrochimique.
Pour notre étude, nous avons réalisé des échantillonnages sur une zone portuaire
appartenant à la société des hydrocarbures, et nous nous sommes intéressés à la jetée
réservée au chargement du pétrole et de ses dérivés.
Cette jetée est longue de 1400 m et abrite trois postes de chargement qui sont
respectivement le P1 ayant un tirant d’eau de 9 m, le P2 ayant un tirant d’eau de 13 m
et le P3 avec un tirant d’eau de 22 m.
Figure 15 : Site d’échantillonnage (port d’Arzew Oran)
Matériel et méthodes
54
2. Echantillonnage
Pour la collecte des échantillons d’eau de mer contaminé ; nous avons utilisé
la méthode la plus simple qui consiste à tenir une bouteille stérile prés de sa base, de
l’introduire à l’interface eau-huile et de retirer son bouchon afin de pouvoir la remplir
d’eau. Trois prélèvements ont été effectués durant l’année 2011. La bouteille
est poussée doucement dans l’eau pendant le remplissage pour éviter toute
contamination de la main. Une fois la bouteille pleine, elle est fermée immédiatement,
conservée à l’abri de la lumière et de la chaleur et transporter dans une glacière
au laboratoire.
Les bactéries se fixent par adsorption aux particules et aux parois internes de la
bouteille d’échantillon. Un espace suffisant doit donc être laissé dans la bouteille
d’échantillon lors du prélèvement afin de permettre le mélange avant l’analyse.
Les échantillons sont analysés dans les deux heures qui suivent leur réception
au laboratoire afin d’assurer la qualité et la validité des résultats.
3. Dénombrement de la microflore totale
Cette étape permet de mettre en évidence la microflore existante dans les échantillons
de l’eau de mer contaminés par les hydrocarbures pour cela, nous avons procédé à une
mise en culture sur gélose marine (ensemencement). Pour se faire, une série
de dilution variant de 10-1 à 10-7 a été préparée selon les étapes suivantes:
3.1. Préparation des dilutions : A partir d’un échantillon d’eau de mer du port de la
zone industrielle Arzew destiné à l’analyse microbiologique, 1 ml est prélevé, puis
mélangé à 9 ml d’eau physiologique préalablement autoclavée. Le tube est ensuite
agité énergiquement pendant 2 minutes. Le contenu du tube représente la dilution 10-1.
On continue ainsi jusqu’à l’obtention de la dilution 10-7.
3.2. Ensemencement par étalement sur gélose marine: Le milieu gélosé
préalablement fondu est réparti dans des boîtes de Pétri à une hauteur d’environ 3 à 4
mm qu’on laisse ensuite refroidir. 0.1 ml de chaque dilution est prélevé à l’aide d’une
pipette Pasteur, puis déposé sur la gélose, ensuite étalé par un râteau sur toute la
surface du milieu.
Matériel et méthodes
55
Après 24h à 48h d’'incubation à 25°C, les colonies développées sont dénombrées à
l’aide d’un compteur de colonies (Marchal et Bourdon, 1982).
Le nombre de germes par ml d’eau de mer est déterminé en calculant la moyenne
arithmétique des résultats obtenus et en tenant compte des facteurs de dilution, selon la
formule:
N = n / d. v
Où :
N : nombre des microorganismes en UFC/ ml.
n: nombre des colonies dénombrées.
v: Volume prélevé.
d: Dilution.
4. Isolement des souches susceptibles de dégrader les hydrocarbures
A partir des échantillons d’eau de mer du port de la zone industrielle d’Arzew (wilaya
d’Oran), 1 ml est prélevé puis mélangé à 9 ml de milieu minéral (Bushnell-Hass
medium : BH) (Annexe 1).Ce dernier est additionné du pétrole brut à raison de 2% qui
est considéré ici comme seul source de carbone.
Le mélange est ensuite incubé à 30°C sous agitation à raison de 150 tours/min. Après
l’étape de pré-enrichissement, nous procédons à l’ensemencement sur gélose marine.
L’incubation se fait à 30°C pour une durée de 24 heures (Johnsen, 2005).
4.1. Purification
Après 24 h d’incubation, l’étape de purification des cultures permet d’obtenir des
cultures pures à partir des différentes souches obtenues.
La sélection est basée sur l’aspect macroscopique des colonies à savoir la couleur, la
forme, le diamètre, l’opacité,…etc. Un échantillon de chaque type de colonie est
prélevé et ensuite purifié par repiquage successif selon la méthode de stries
(Martinneau, 1996).
Matériel et méthodes
56
5. Conservation des souches isolées
Diverses techniques peuvent être utilisées pour la conservation des souches pures.
5.1. Conservation de courte durée
Chaque souche est ensemencée sur gélose inclinée en tube. Après incubation à 30°C,
et dès l’apparition d’une bonne croissance bactérienne, les tubes sont placés à 4°C. Un
repiquage périodique est nécessaire (Saidi etal., 2002).
5.2. Conservation de longue durée
Les bactéries sont ensemencées dans du bouillon nutritif stérile dès la croissance à
30°C, les bactéries sont placées à -20°C et peuvent être ainsi conservées pendant
plusieurs mois à quelques années (Herrero et al., 1996).
La conservation peut se faire aussi de la même manière à -20°C, mais dans du bouillon
nutritif additionné de glycérol 40% (V/V) pour une durée prolongée (Herrero et al.,
1996).
6. Identification des souches purifiées
Concernant la sélection et la classification des souches ; elles sont fondées
principalement sur une série de caractères phénotypiques résumés ci-dessous (Rossello
et Amann, 2001)
- Morphologies cellulaires (forme, mobilité, coloration de Gram,…) et
coloniales ;
- Physiologiques, notamment la température et le pH de croissance, les
accepteurs d’électrons (conditions aérobies ou anaérobies) ;
- Biochimiques, notamment des activités enzymatiques et l’utilisation de
différents composés (dégradation, croissance). Dans ce cas sélectif des
systèmes commerciaux de batteries de tests (API 20 NE) sont utilisés.
6.1. Etude morphologique
a. Aspect macroscopique
L’observation de l’aspect macroscopique des colonies (forme, taille, couleur,
l’élévation…) permet d’effectuer une première caractérisation, avec une orientation
possible des résultats au cours de l’identification (Singleton, 1999).
Matériel et méthodes
57
b. Aspect microscopique
L’observation microscopique consiste à observer les cellules bactériennes à l’état frais
et après une coloration de Gram :
Etat frais : permet de déterminer la forme, l’arrangement et la mobilité des
bactéries. Il consiste en l’observation d’une goutte de suspension bactérienne,
préparée avec de l’eau physiologique et placée entre lame et lamelle.
L’observation se fait au microscope photonique à grossissement X 100
(Singleton, 1999).
Coloration de Gram : est une double coloration qui permet de connaître la
forme, l’arrangement, la pureté, ainsi que la nature biochimique de la paroi des
cellules purifiées.
Cette coloration permet de classer les bactéries selon leur capacité à fixer le
cristal violet. Celles qui possèdent une couche de peptidoglycane mince sont
décolorées lors du lavage à l’éthanol (Gram-), alors que celles qui possèdent
une couche de peptidoglycane épaisse vont retenir le colorant (Gram+). La
consistance et la valeur de la coloration de Gram correspond à des différences
biochimiques entre la paroi des bactéries Gram positif et les bactéries Gram
négatif (Marchal et Bourdon, 1982).
Recherche de spore: Coloration de Moeller fuschine de Ziehl à chaud + bleu
de méthylène. Les spores apparaissent rouges sur fond bleu (Delarras, 2007).
6.2. Etude biochimique
L’étude biochimique nous oriente sur le métabolisme suivi par les micro-organismes
étudiés et les enzymes qu’ils possèdent. Ces tests ont été réalisés en utilisant la galerie
biochimique pour les souches microbiennes.
Les épreuves biochimiques permettent, en général, de distinguer les espèces, même
étroitement apparentées entre elles (Tortora et al., 2003).
Matériel et méthodes
58
6.2.1. Métabolisme énergétique
6.2.1.1 Étude du type respiratoire
Selon Marchal et Bourdon (1982), Le type respiratoire est mis en évidence par
l’ensemencement d’un milieu gélosé (viande-foie) dans des tubes fins et profonds dans
lesquels l’oxygène n’est présent qu’en surface et sur une zone étroite de 1cm.
Après incubation des milieux à 30°C pendant 24 heures, 4 types respiratoires peuvent
être distingués :
- Croissance en surface: bactéries aérobies strictes ;
- Croissance en profondeur: bactéries anaérobies strictes ;
- Croissance le long du tube: bactéries aéro-anaérobies facultatives ;
- Croissance dans la partie supérieure proche de la surface: bactéries
microaérophiles.
a. Recherche de la catalase
La catalase est une enzyme ayant la propriété de décomposer le peroxyde d’hydrogène
(H2O2) avec dégagement d’oxygène selon la réaction suivante:
Catalase
H2O2 H2O + 1 / 2 O2
Sur une lame et à l’aide d’une pipette Pasteur, on dépose une colonie bactérienne
à laquelle on ajoute de l’eau oxygénée (à 10 volumes). La présence d’une catalase
est révélée par l’apparition immédiate de bulles de gaz qui correspondent à l’oxygène
dégagé (Tortora et al., 2003).
b. Recherche de l’oxydase
Ce test permet la détection de la phénylène-diamine-oxydase ou le cytochrome
oxydase, enzyme entrant dans divers couples d’oxydoréduction. Agissant sur un
substrat incolore, cet enzyme entraîne la formation d’une semi-quinone rouge. Cette
dernière, très instable, s’oxyde rapidement pour donner un composé noirâtre.
Pour réaliser ce test, un disque d’oxydase contenant de l’oxalate N-
dimethylparanitrophénylène-diamine, qui est préalablement imbibé d’une goutte
d’eau distillée stérile, déposé sur une lame et mis en contact avec une colonie
Matériel et méthodes
59
bactérienne fraîchement cultivée. L’apparition d’une coloration violette
immédiatement indique que le test est positif (Singleton, 1999).
c. Recherche de la nitrate réductase
L’étude de la réduction des nitrates se fait par la mise en évidence des nitrites formés.
Ces derniers en milieu acétique ou sulfurique, donnent une coloration rose.
L’enzyme nitrate réductase B catalyse la réduction des nitrates en nitrites (réduction
assimilatrice). Les nitrates peuvent aller également jusqu’au stade azote (N2).
A une culture de 24 à 48h d’incubation à 30°C en bouillon nitraté, cinq gouttes
de réactif de Griess sont ajoutés. Après agitation, la lecture est immédiate. Plusieurs
cas de figures peuvent se présenter :
- Lorsque la coloration est rose ou rouge ; les nitrates sont réduits en nitrites, on parle
de nitrate réductase positive (NR+) ;
- Lorsque le milieu reste incolore, de la poudre de zinc est ajouté (réducteurs des
nitrates), après cinq minutes les tubes sont de nouveau observés :
· Si le milieu devient rose ou rouge, il reste des nitrates, donc ces derniers n’ont pas été
réduits par la bactérie: nitrate réductase négative (NR-).
· Si le milieu reste incolore, il ne reste plus de nitrates, les bactéries les ont réduit au-
delà du stade nitrites: nitrate réductase positive (NR+) (Tortora et al., 2003).
6.2.2. Métabolisme glucidique
6.2.2.1.Étude de la voie d’attaque des glucides
L’étude de la voie d’attaque des glucides permet de distinguer les bactéries à
métabolisme oxydatif ou fermentatif ou les deux à la fois (Tortora et al., 2003).
6.2.2.2.Étude des différentes voies fermentatives intermédiaires
L’étude des différentes voies fermentatives intermédiaires permet d’effectuer une
différenciation entre la fermentation des acides mixtes (réaction rouge de méthyle :
RM) et butylène glycolique (réaction Voges Proskauer, VP) (Singleton, 1999).
Matériel et méthodes
60
6.2.2.3. Recherche de la β-galactosidase
L’orthonitrophényl- β-D- galactopyranoside (ONPG) est un analogue structural
du lactose. Ce substrat synthétique incolore peut être scindé en galactose et en
orthtophénol (composé soluble jaune) en présence d’une des enzymes appelées ONPG
hydrolases.
En effet, ces enzymes correspondent :
- Soit à la β galactosidase, ONPG-hydrolase qui catalyse la réaction de
l’hydrolyse de l’ONPG.
- Soit à d’autres enzymes bactériennes ONPG hydrolases, mais pas le lactose,
elles sont différentes de la β galactosidase (Delarras, 2007).
Ce processus se fait selon la réaction suivante :
β-galactosidase
6.2.2.4. Utilisation des sucres
La voie d’utilisation des sucres permet de mettre en évidence d’une part,
la fermentation du glucose (avec ou sans dégagement de gaz), du lactose,
du saccharose et d’autre part, la production d’hydrogène de sulfate (H2S) (Marchal
et Bourdon, 1982).
Matériel et méthodes
61
6.2.2.5. Utilisation du citrate comme source de carbone
Le milieu utilisé ne contient que le citrate(C6H5O7) comme seule source de carbone.
Seules les bactéries possédant une citrate perméase seront donc capables de se
développer sur ce milieu en provoquant la libération des OH qui alcalinisent le milieu,
entraînent un virage au bleu (Singleton, 1999).
Citrate perméase
Citrate + 3H2O acide citrique + 3OH
6.2.2.6. Réaction de Voges- Proskauer (VP)
Certaines bactéries sont capables de produire de l’acétyl-méthyl carbinol, soit à partir
de deux molécules d’acide pyruvique, soit, le plus souvent au cours de la fermentation
de 2-3 butyléneglycolique. En présence d’une base forte, l’acétoine donne une
coloration rouge au milieu oxygéné (oxydation en diacétyle). Le diacétyle formé réagit
avec le groupement guanidine de α- naphtol pour donner un composé rouge
(Joffin et Leyral, 2006).
6.2.2.7. Test Mannitol mobilité
Le Mannitol est un produit de réduction de D-Mannose. Sa dégradation conduit à la
formation du fructose dont l’attaque aboutit à la formation des acides à chaînes très
courtes (acide acétique, Acide formique). Le milieu Mannitol mobilité permet la
recherche simultanément de la fermentation du Mannitol et la mobilité des bactéries
(Marchal et Bourdon, 1982).
· La fermentation du Mannitol entraîne le virage du milieu au jaune.
· Les souches mobiles diffusent à partir de la ligne d’ensemencement.
Matériel et méthodes
62
6 .2.3. Métabolisme protéique
6 .2.3.1. Recherche des décarboxylases
Les décarboxylases, scindent les acides aminés entraînant la formation de l’amine
correspondante avec la libération de CO2, suivant la réaction :
Décarboxylase
R-CH-COOH RCH2-NH2 + CO2
NH2 amine
Acide aminé
Il s’agit d’enzymes induites, dont la synthèse est favorisée par un pH acide (pH =3,5-
5,5) et des conditions d’anaérobiose (Joffin et Leyral ,2006).
La lysine décarboxylase ou LDC : Lysine Cadavérine + CO2
L’ornithine décarboxylase ou ODC : Ornithine Putricine + CO2
L’arginine dihydrolase ou ADH : Arginine Agmatine + CO2.
6.2.4. Recherche de l’uréase
Selon Singleton (1999), toutes les bactéries hydrolysent l’urée grâce à la réaction
suivante:
NH2 Uréase
C=O + H2O H –COO- NH2 + NH3
NH2
Seule, une uréase très active aboutit finalement à la réaction :
NH2 Uréase
C =O + H2O CO2 + NH3
NH2
Matériel et méthodes
63
Le CO2 et le NH3 en présence d’eau se combinent en donnant le carbonate
d’ammonium selon la réaction:
CO2 + 2NH3 +H2O CO3 (NH4)2 Carbonate ammonium
Le carbonate d’ammonium alcalinise le milieu (Marchal et Bourdon, 1982).
6.2.5. Production de H2S
La production d’H2S est révélé par les ions Fe3+ qui forme avec le sulfure d’hydrogène
un précipité noir de sulfure de fer. Le précipité peut être redissous en milieu acide
(Joffin et Lyeral, 2006).
6.2.6. Production d’indole
Ce test s’effectue en utilisant un milieu riche en tryptophane exempt d’indole
(ou milieu urée-indole). L’indole produit par la bactérie est mis en évidence par
le réactif de Kovacs (Marchal et Bourdon, 1982).
6.2.7. Recherche de la tryptophane-désaminase (TDA)
La désaminase agit sur le L- tryptophane en donnant l’acide indol-pyruvique.
Ce dernier donne avec le perchlorure de fer une coloration brune (Marchal et Bourdon,
1982) selon la réaction :
TDA
Tryptophane + H2O acide indol-pyruvique + NH3 +2H+ + 2é
6.2.8. Recherche de gélatinase (Collagénase)
La gélatine peut être incorporée dans un milieu de culture afin de mettre en évidence
sa dégradation par certaines bactéries possédant une gélatinase. Cette enzyme
hydrolyse le collagène en acides aminés ou en peptides (Joffin et Lyeral, 2006).
6.3. Sélection des bactéries par utilisation de milieux de culture spécifiques
6.3.1. Croissance sur Cétrimide agar
Le milieu de gélose au Cétrimide (Annexe1) est un milieu sélectif pour P. aeruginosa.
Lorsqu’il est incubé à 30°C, les colonies apparaissent muqueuses et vertes
(Joffin et Lyeral, 2006).
Matériel et méthodes
64
6.3.2. Croissance sur milieu King (King A et King B)
Les milieux King A et King B (Annexe 1) permettent la différenciation entre
les espèces de Pseudomonas par la mise en évidence de leurs pigments spécifiques.
La production de pigments est favorisée par la composition du milieu
(Marchal et Bourdon, 1982).
Le milieu King A favorise la production de pyocyanine, pigment permettant
l’identification de Pseudomonas aeruginosa. Les cultures typiques sont colorées
en bleu-vert.
Le milieu King B favorise la synthèse de la pyoverdine, pigment vert fluorescent
produit par Pseudomonas aeruginosa et d’autres Pseudomonas (P.fluorescens,
P.putida).
6.3.3. Utilisation des galeries API
L’utilisation de galeries miniaturisées prêtes à l’emploi ont permis l’identification des
bacilles à gram négatif non fermentaires (API 20 NE), qui occupent une place de choix
pendant notre étude, ainsi que les galeries Staph pour l’identification des cocci à gram
positif, catalase positive.
7. Le suivi de la cinétique de croissance des bactéries isolées
Nous avons réalisé un suivi de la croissance des bactéries isolées sur milieu minéral
contenant le pétrole comme seule source ce carbone et d’énergie en mesurant
la concentration microbienne par spectrophotomètre à 600 nm toutes les 12 heures
et durant toute la période de fermentation.
La sélection d’isolat dégradant le pétrole portera sur la meilleure croissance de ces
souches et selon les paramètres de croissance à savoir : le temps de génération (G)
et le taux de croissance (µ).
Le temps de génération correspond au temps nécessaire à une souche pour passer
du nombre initiale n0= x0 à t = 0 au nombre = 2 x à tn (Prevot, 1961).
Matériel et méthodes
65
Le taux de croissance est le nombre de divisions N par unité de temps (heures).
µ = N/t
G = t/N
N = (log Nt – log N0) / log2
7.1. Méthode analytique
7.1.1. Préculture
Prélever une colonie à partir d’un milieu gélosé et la mettre dans des erlenmeyers
de 100 ml contenant 20 ml de milieu BH autoclavé + 2 % de pétrole.
Incuber à 30°C pendant 24 heures sous agitation rotative (150 tours/min).
7.1.2. Culture
Transférer 5ml de chaque préculture dans des erlenmeyers de 250 ml contenant chacun
50 ml de milieu BH autoclavé + 2% de pétrole. L’agitation de 150 tours/min facilite
l’aération des souches et leurs accès au substrat.
7.1.3. Mesure de la concentration microbienne
La concentration microbienne est suivie par mesure des densités optiques avec
spectrophotomètre à 600 nm.
Des dilutions décimales sont préparées, puis 0,1 ml de chaque dilution est ensemencée
sur gélose nutritive et incubée à 30°C pendant 24 à 48 heures, pour déterminer
la viabilité des bactéries. Les colonies sont exprimées en UFC/ml.
Avant de mesurer la capacité de nos isolats à dégrader des polluants comme le pétrole
brut, il été important d’optimiser cette biodégradation à travers certains paramètres qui
peuvent l’influencer comme la température, le pH et la tolérance des isolats
à différentes doses de pétrole brutes additionnées au milieu de culture (BH).
8. Etude de l’optimum de température
Les souches isolées (âgés de 24 heures) sont inoculées dans des erlenmeyers de 250 ml
remplit de 50 ml de milieu BH stérile + 2% de pétrole brut. Le pH est ajusté à 7.
L’incubation est faite sous agitation rotative en raison de 150 tours/min et ceci
à différentes températures (10°C, 15°C, 20°C, 25°C et 30°C) pendant 24 heures
(Rodrigo; 2005).
Matériel et méthodes
66
Afin d’estimer l’optimum de température la viabilité des cultures après 24 heures
d’incubation est mesurée. Des dilutions sont préparées où 1 ml de culture est diluée
de 1/10, puis 0,1 ml de chaque dilution est ensemencée sur gélose nutritive à 30°C
pendant 24 à 48 heures. Les colonies sont exprimées en UFC/ml.
9. Etude de l’optimum de pH
Cette étude est réalisée avec l’utilisation de 50 ml du milieu BH dans des erlenmeyers
de 250 ml additionné de pétrole brut comme seule source de carbone à raison de 2%.
Les différentes valeurs de pH (5, 6, 7, 8, 9 et 10) sont ajustées par l’ajout de HCl 1M
ou de NaOH 1M. On inocule en utilisant des cultures de 24 heures que l’on incube
ensuite à 30°C sous agitation de 150 tours/min.
10. Tolérance des souches au pétrole
Selon la méthode de Fukumaki et al., (1994), on a inoculé 100 ml de milieu BH stérile
dans des erlenmeyers de 500 ml avec 2 ml d’inoculum. Ensuite, 0% (témoin), 2%,
5%, 10%, 15%, 20% de pétrole (v/v) recouvraient les milieux. L’incubation se fait à
30°C sous agitation rotative (150 tours/min) pendant 2 jours. A la fin de l’incubation,
les méthodes conventionnelles de dilution et d’ensemencements sur gélose nutritive
ont été utilisées pour le dénombrement des souches viables, avec également mesure
de la turbidité à 600 nm.
11. Profils de la résistance aux antibiotiques
Afin d’évaluer l’effet de quelques inhibiteurs de croissance sur les bactéries
hydrocarbonoclastes, on a procédé à faire des tests pour les différentes classes
d’antibiotiques en effectuant des antibiogrammes pour chacune des souches étudiées.
Les antibiogrammes ont été effectués en boîtes de gélose Müeller - Hinton (MH) par la
méthode de diffusion à partir de disques pré-imprégnés et incubés en aérobiose à 30°C
pendant 18 à 24 heures.
Les antibiotiques utilisés sont de différentes classes thérapeutiques :
SXT : Triméthoprime / Sulfaméthoxazole, GN : Gentamicine, K : Kanamycine,
Matériel et méthodes
67
TOB : Tobramycine, P : pénicilline, FOX : Céfoxitine, CAZ : Ceftazidime,
IPM : Imipénème, AML : Amoxicilline, CT : Céfotétan, TI: Ticarcilline ,
ATM: Aztréonam, CIP : Ciprofloxacine, Lev: Levofloxacin, E : Erythromycine,
C: Chloramphénicol (Tableau 6). Les résultats obtenus ont été interprétés selon les
critères du Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie
(Société française de Microbiologie, 1998).
Tableau 6 : Classements et concentrations des antibiotiques utilisés.
UI : unités internationales (1 UI correspond à 0,0006 g) ; S : Sensible ; R : résistante
Familles Antibiotiques Abréviations Charge du
disque
Diamètres
Critiques
(mm)
Sulfamides/
Diaminopyrimidines
Triméthoprime/
sulfaméthoxazole SXT 1,25/23,75 μg
S R
≥16 <10
Aminosides
Gentamicine CN 10 UI ≥18 <16
Kanamycine K 15 μg ≥18 <15
Tobramycine TOB
≥15 <12
Bêta-lactamines
Pénicilline P 30 μg ≥21 <16
Amoxicilline AML 25 μg ≥23 <16
Ceftazidime CAZ 30 μg ≥21 <19
Céfoxitine FOX 30 μg ≥22 <15
Ticarcilline
Imipénème
Aztréonam
Céfotétan
TIC
IPM
ATM
CT
75 μg
10 μg
30 μg
30 μg
≥24
≥19
≥22
≥23
<22
<15
<15
<17
Phénicoles Chloramphénicol C 30 μg ≥23 <19
Quinolones Ciprofloxacine CIP 5 μg ≥21 <15
Levofloxacin LEV 5μg ≥20 <17
Macrolides Erythromycine E 15UI ≥22 <17
Matériel et méthodes
68
12. Profils de la résistance aux métaux lourds
Les différents métaux lourds considérés sont le Mercure, le Fer, le Nickel,
le Cadmium, le Zinc, le Cuivre, le Plomb, l’Etain et l’Aluminium.
Pour évaluer qualitativement leurs effets, nous avons eu recours à une méthode
de diffusion en gélose Müeller - Hinton (MH) à partir de puits (de 1 cm de diamètre
et 3 mm de profondeur) remplis de la solution aqueuse métallique [NiCl2, CdI2, Cl2Fe,
Zn, Cu, PbO2, Hg, Fe, AlCl2] à une concentration finale de 200 mM. Les boîtes ont été
incubées en aérobiose à 30 °C pendant 48 à 72 heures (Hassen et al., 1998).
13. Le suivi de la biodégradation
Pour évaluer la biodégradation du pétrole brut, on a appliqué la méthode de Jacques
RJS et al. (2008) modifiée. On s’est basé sur le test de tolérance au pétrole brut pour
sélectionner les meilleures souches de notre collection.
Les isolats sélectionnés sont incubés dans 100 ml de milieu BH contenant 20%
de pétrole brut comme seule source de carbone à une agitation de 150 tours/minute
et pour une durée de 21 jours.
Les prélèvements sont effectués tous les trois jours, pour le suivi régulier
des paramètres suivants :
La concentration microbienne par des prises des densités optiques à 600 nm
et le dénombrement sur milieu solide ;
Test d’index d’émulsion E24 ;
La tension superficielle ;
Le taux de biodégradation qui est déterminé par spectroscopie infrarouge
(IRTF).
13.1. Détermination de l’index d’émulsion E24
L’index d’émulsion permet de vérifier la capacité des souches à émulsionner une
phase hydrophobe (pétrole brut) dans une phase hydrophile (milieu de culture).
Il a été mis au point par Broderick et Cooney, pour être ensuite modifié par Bodour
et al., (2004). Ce test permet de vérifier la capacité des souches à émulsionner
une phase hydrophobe (pétrole brut) dans une phase hydrophile (milieu de culture).
Matériel et méthodes
69
Le test consiste à mélanger 3 ml du milieu de culture avec 3 ml de pétrole brut
dans des tubes. Les tubes sont agités au vortex pendant 3 min et après
homogénéisation des deux phases. On procède au calcul de l’index d’émulsion, et on
les compare au témoin, qui est constitué du milieu de culture aseptique et de pétrole
brut, soumis aux mêmes conditions.
Après 24 heures de repos à température ambiante, on calcule une deuxième fois le E24
pour vérifier la stabilité de l’émulsion. Le calcul de l’index de l’émulsion E24 c’est le
rapport de la hauteur de l’émulsion formée sur la hauteur totale de mélange multiplié
par 100.
E24 = (he / ht) x 100
Où :
he : hauteur de l’émulsion.
ht : hauteur totale du mélange.
13.2. Détermination de tension superficielle
La tension superficielle est définie comme étant un état résultant des interactions
s’exerçant entre les molécules à la surface d’un liquide au repos. Cette tension provient
des forces intermoléculaires qui exercent une traction vers le bas sur les différentes
molécules en surface. La méthode utilisée consiste à prélever un échantillon de culture
touts les 3 jours et ce pour une durée de 21 jours pour le suivi de la tension
superficielle. Ce procédé a été réalisé pour chaque souche bactérienne étudiée
(Abu-Ruwaida et al., 1991).
La mesure est effectuée par la méthode de capillarité, où un tube de verre de faible
diamètre est plongé dans le milieu de fermentation. Dans le tube, le niveau du liquide
est supérieur au niveau de la surface libre du récipient. L’ascension capillaire est due
aux forces superficielles appliquées en tout point du contour du ménisque. La
résultante F de ces forces équilibre le poids P du liquide soulevé. L’élévation du
liquide dans le tube compense la différence de pression entre les deux côtés de la paroi
(Bonnel, 2006).
Matériel et méthodes
70
Le calcul de la tension superficielle s’effectue en appliquant la loi de Jurin :
h =
Où :
r : rayon intérieur du tube,
ρ: masse volumique du liquide,
g : accélération de la pesanteur,
γ : tension superficielle du liquide,
α: angle de raccordement liquide/tube.
On déduit une valeur de γde la mesure de la dénivellation h et de la connaissance
des autres paramètres.
13.3. Evaluation de la biodégradation par spectroscopie moyen infrarouge
13.3.1. Principe de la méthode
L’infrarouge analytique regroupe plusieurs méthodes d’identification et de dosages
non destructifs basés sur l’absorption, ou la réflexion, par l’échantillon, des radiations
électromagnétiques comprises entre 1 et 50 μm. Cette bande spectrale est divisée en
proche infrarouge (de 1 à 2,5 μm) et en moyen infrarouge (2,5-50 μm). Bien que le
domaine du proche infrarouge soit pauvre en absorptions spécifiques, il a pris une
grande importance dans les laboratoires de contrôle comme moyen d’analyse
quantitative. Le moyen infrarouge est, par contre, plus riche en informations sur les
structures des composés examinés. De ce fait, il est utilisé pour l’identification
des molécules organiques dont il permet de garder une sorte d’empreinte digitale
(Laxalde, 2012).
13.3.2. La spectroscopie moyen infrarouge
La spectroscopie MIR correspond à la région du spectre électromagnétique qui s’étend
de 4000 à 400 cm-1 (2500 - 25000 nm). Les bandes d’absorption observées dans cette
région sont principalement dues aux vibrations fondamentales des molécules.
Généralement, les bandes observées sont bien résolues et relativement spécifiques
(Poilblanc et Crasnier, 2006). Ainsi, il est possible d’attribuer la plupart des bandes à
2γ COS α
rρ g
Matériel et méthodes
71
un groupement chimique spécifique. Cette plage spectrale est donc particulièrement
bien adaptée à l’identification des composés organiques et à l’étude de la conformation
des molécules (Laxalde, 2012).
13.3.3. Acquisition des spectres
Le suivi de biodégradation par l’acquisition des spectres de pétroles brut et les
échantillons de pétrole comme seule source de carbone et d’énergie pour les bactéries
sélectionnées et leur consortium après 21 jours de culture. L’appareil utilisé pour cet
effet est un spectromètre infra-rouge à transformée de Fourier Alpha Bruker, équipé
d’une ATR diamant (Attenuated Total Reflectance).
Le protocole expérimental consiste à homogénéiser l’échantillon à température
ambiante et à déposer un petit volume sur le cristal, faire descendre la tige métallique
de telle façon qu’elle soit en contact avec l’échantillon à analyser, les spectres sont
prises à partir d’un écran d’ordinateur couplé à l’appareil.
Enfin, le cristal est nettoyé à l’acétone entre chaque acquisition.
Figure 16 : Spectromètre infra-rouge à transformer de Fourier Alpha Bruker
Cristal
Tige métallique
Acétone
Matériel et méthodes
72
13.4. Evaluation de la biodégradation par spectroscopie ultraviolette (UV)
Il est nécessaire de pouvoir disposer d’un outil de mesure rapide, simple et peu
coûteux afin d’effectuer un diagnostic initial ou de suivre une dépollution. Dans cette
optique, la spectrophotométrie UV pourrait être une bonne méthode de caractérisation
puisque, d’une part, les HAP ayant un caractère aromatique, absorbent dans
le domaine UV -visible et, d’autre part, cette méthode a fait ses preuves dans
de nombreux domaines (El Khorassani, 1998 ; Roig, 1999 ; Vaillant, 2000).
La spectrophotométrie UV est une technique d’analyse simple et rapide
en comparaison aux méthodes conventionnelles. Elle bénéficie d’un temps
d’acquisition du spectre très court. Les méthodes d’exploitation des spectres sont
multiples et performantes (Beer-Lambert, dérivées, déconvolution).
13.4.1. Principe
La spectrophotométrie ultraviolette (200-350 nm) est basée sur l’absorption
du rayonnement lumineux par la matière. Cette absorption est occasionnée par
un transfert d’énergie du rayonnement vers la structure électronique de la molécule.
7.4.2. Mode opératoire
Les échantillons de pétrole brut et les pétroles bruts après 21 jours de culture avec les
bactéries sélectionnées, ainsi que leur consortium sont mis dans l’acétonitrile à une
concentration de 5mg.l-1(Magalie, 2013).
Ensuite, les échantillons sont mis dans des cuves en quartz afin de les faire passer
un par un dans le spectrophotomètre UV de type OPTIZEN 2120 UV pour les prises
des spectres à partir d’un écran d’ordinateur couplé à l’appareil.
Matériel et méthodes
73
13.4.3. Choix du solvant : l’acétonitrile
Des études comparatives ont montré que l’acétonitrile est un solvant capable d’extraire
les HAP (Chen et al., 1996; Noël et al., 1996). De plus, ce solvant est compatible et
adapté avec la spectrophotométrie UV, puisqu’il n’absorbe pas dans le domaine
200- 500 nm (transparent à partir de 190 nm) (Rosset et al., 1982). L’utilisation de ce
solvant évite les étapes de purification nécessaires avant la chromatographie
(Noël et al., 1996).
F
Figure 17 : le spectrophotomètre UV de type OPTIZEN 2120UV
Cuves en
quartz
Case
principale
Ecran LCD
Partie III
Résultats & Discussion
Résultats et discussion
75
1. Dénombrement de la microflore totale
Le dénombrement de la microflore totale, dans nos échantillons d’eau de mer polluée
d’une façon chronique par les hydrocarbures, fait ressortir un taux de 48 x 104 UFC/ml
d’eau de mer.
On peut dire que nos résultats de dénombrement des isolats sur gélose marine est
en accord avec ceux de Williams (1981) et Kirchman et al.,(1982) qui ont rapporté
que l’abondance des bactéries marines est de 105 cellules par millilitre d’eau de mer
en moyenne.
Le compartiment microbien joue un rôle clé dans la régulation des contraintes que
subit l’écosystème marin face à l’action directe ou indirecte des activités humaines ou
des phénomènes climatiques naturels. Il constitue aujourd’hui un compartiment
biologique incontournable dans la compréhension du milieu marin et de sa réaction
aux perturbations anthropiques. Amann et al., (1995) avancent que l’isolement de
souches microbiennes permet d’identifier les capacités fonctionnelles de communautés
microbiennes. Cependant, le pourcentage de bactéries potentiellement cultivables
est estimé entre 0,1 et 3% selon l’environnement considéré.
La prise de conscience actuelle sur les enjeux posés par la défense de l’environnement
place les micro-organismes sur le devant de la scène. Les bactéries ont un fort
particularisme physiologique et nous étonnent par l’étendue et le perfectionnement des
mécanismes de régulation dont elles sont le siège. Chaque cellule se présente comme
une petite usine chimique pilotée par un ordinateur. Son fonctionnement n’est abordé
qu’à grand renfort de biochimie et de génétique moléculaire (Pelmont, 1994).
2. Isolement et purification des espèces bactérienne
Nous avons pu isoler et purifier des bactéries capables d’utiliser le pétrole brut comme
unique source de carbone et d’énergie.
L’identification préliminaire des espèces isolées de l’eau de mer contaminée d’une
façon chronique par les hydrocarbures, est essentiellement basée sur les
caractéristiques morphologiques, la coloration de Gram, la mobilité, la recherche de la
catalase et de l’oxydase, arginine dihydrolase, voie d’utilisation du glucose, ainsi que
Résultats et discussion
76
l’étude des caractéristiques physiologiques et biochimiques selon Holt et al., (1994) et
Bossis et al., (2000)
3. Identification des souches isolées et purifiées
3.1. L’examen macroscopique
L’étude macroscopique a permis d’isoler 09 colonies distinctes par les caractéristiques
regroupées dans le tableau 7.
Tableau 7 : Observations macroscopiques des colonies.
Diamètre Couleur Forme Elévation Contour Opacité Surface Consistance
S1 2-3 mm Blanche Ronde Convexe Régulier Translucide Lisse Crémeuse
S2 2 mm Verte Ronde plate Régulier Translucide Lisse
brillante Muqueuse
S3 0,5 -1 mm Jaune or Ronde Bombé Régulier Opaque Lisse
brillante Crémeuse
S4 0.5-1 mm Blanche Ronde Convexe Régulier Translucide Lisse
brillante Muqueuse
S5 1 mm Verte Ronde Convexe Régulier Opaque Lisse Crémeuse
S6 2-3 mm Orange Ronde Convexe Régulier Opaque Lisse Muqueuse
S7 2 mm Beige Ronde Convexe Régulière Opaque Lisse
Brillante Crémeuse
S8 1-2 mm blanche Ronde Bombé Régulière opaque Lisse Muqueuse
S9 1-2 mm Blanche Ronde Bombée Régulière Translucide Lisse
Brillante Muqueuse
3.2. Examen microscopique
Les observations microscopiques ont été réalisés suivant trois étapes : la première une
observation à l’état frais de la forme et la mobilité des bactéries ; la deuxièmes
observation après l’addition du bleu de méthylène afin de mettre en évidence les
spores si elles existent et la dernière après la double coloration de Gram, les résultats
sont rassemblés dans le tableau 8, ci-après.
Résultats et discussion
77
Tableau 8 : Résultats de l’étude microscopique des souches isolées
Souches Présence de spores
Mobilité Arrangements Forme de cellules
Gram
S1 - - Isolées et en
amas cocci +
S2 - + Isolées en paire et en
amas Bacille -
S3 - -
En amas et sous forme de
grappe de raisin
cocci +
S4 - - Isolées en paire et en chainettes
colibacilles -
S5 - + Isolées en paire et en
amas Bacille -
S6 - - Isolées en paire et en chainettes
Bacille -
S7 - + Isolées et en
amas Bacille -
S8 - + Isolées en paire et en chainettes
Bacille -
S9 - + Isolées en paire et en
amas Bacille -
3.3. Les résultats des tests biochimiques
En ce qui concerne les résultats des tests biochimiques effectués sur les isolats
par le biais du système api (api 20 NE, api 20 E et api staph) et les tests
complémentaires, sont regroupés dans le tableau 9.
Résultats et discussion
78
Tableau 9 : Résultats des tests biochimiques des souches isolées
AS : aérobie strict ; AAF : aéro-anaérobie facultatif ;
OF : oxydatif et fermentatif ; O : oxydatif.
Souches
Caractères biochimiques S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9
Métabolisme énergétique
Type respiratoire (VF) AS AS AAF AS AAF AS AS AS AS
Oxydase + + - + - + - + +
Catalase + + + + + + + + + Nitrate réductase + - + + + - + + -
Métabolisme glucidique
Milieu Mevag O O OF O OF OF O O O
Milieu TSI
Glu + + + + + + + + +
Lac/Sac. - - - - - - - - -
H2S - - - - - - - - -
Gaz - - - - - - - - - β-galactosidase
(ONPG) - - - - - - + - -
Citrate perméase - + + + + + + - -
Milieu Mannitol/ mobilité
Mannitol + - - - + + - + +
Mobilité - + - - + - + + +
Milieu Clarck et Lubs
VP - - + - - - - + -
RM + + + + + + + + +
Métabolisme protéique
Milieu Moeller
ADH - + + - - - + - +
LDC - - - - - - - + -
ODC - - - - - - - - +
Milieu Urée/ Indole
Urée + - + + + + - + +
Indole - - - - + + - - -
TDA + - - + + - - - -
Milieu King
King A - + - - - - + - -
King B - + - - - - + + +
Résultats et discussion
79
3.4. Caractérisation des souches isolées
La souche S1 a été affilée au genre Micrococcus en raison de ses colonies qui ne
présentent aucun pigment (Figure 18) et ses cellules en forme de cocci Gram positive
(Figure 19) qui se présentent soient en amas ou isolées et catalase positif
(Guy Leyral et al., 1998,).
Cette souche est aérobie stricte, oxydase positive et a mobilité négative. D’après les
résultats des tests biochimiques (Tableau 9) et en comparaison avec ceux établis par
(Bergey, 1984 et Camille Delarras, 2007). Il est probable que cette souche correspond
à Micrococcus lylae.
La souche S2 a été rattachée au genre Pseudomonas pour sa morphologie
macroscopique et microscopique : colonies très grandes, blanc jaunâtre, plates
(Figure 20), bactérie Gram négative en forme de bacilles (Figure 21), aérobie stricte à
oxydase, ADH, catalase, citrate perméase positives et ONPG, LDC négatives
(Tableau 9 et Figure 22) (Delarras, 2007) .
Cette souche peut correspondre à l’espèce Pseudomonas aeruginosa vu qu’elle est
caractérisée par la production des pigments de pyocyanine et pyoverdine. Ces
pigments diffusent dans les cultures sur gélose et les colonies colorent le milieu en
bleu verdâtre ou jaune verdâtre (Singleton, 1999). Ces caractères sont spécifiques de
l’espèce Pseudomonas aeruginosa (Lotfabad et al., 2000).
Figure 19 : Aspect microscopique de la souche S1 après
coloration de Gram (Gr x 1000)
Figure 18: Aspect
macroscopique de la souche
S1sur milieu Chapman
Résultats et discussion
80
Pseudomonas aeruginosa est un microbe pathogène opportuniste important, fortement
résistant à un grand nombre de désinfectants et d’antibiotiques. Cette bactérie vit
à l’état saprophytique dans l’eau, le sol et sur les végétaux (Sotirova et al., 2009).
Cette distribution mondiale semble être due à une adaptabilité physiologique
et génétique élevée (Spiers et al., 2000).
Figure 22 : Identification biochimique de la souche S2 par galerie Api 20 NE
NO3 : réduction des nitrates en nitrites; TRP : L-tryptophane; D glu : fermentation;
ADH: arginine dihydrolase ; Urée: UREase ; ESC : ESCulinase; GEL : GELatinase;
PNPG: 4-nitrophnyl- Dgalactopyranoside; tests d’assimilation; GLU: GLUcose,
ARA: ARAbinose, MNE : D-mannose, MAN: D-mannitol, NAG: N-acetyl-glucosamine,
MAL: D-maltose ; GNT: potassium gluconate, CAP : acide caprique, ADI : acide
adipique, MLT : acide malique, CIT : trisodium citrate, PAC : acide phénylacétique.
Figure 21: Aspect microscopique de la souche S2 après coloration de Gram
(Gr x 1000)
Figure 20 : Aspect macroscopique de La souche S2 sur milieu Hektoen
Résultats et discussion
81
La souche S3 a été rattachée au genre Staphylocoques pour sa morphologie
macroscopique et microscopique : d’après la figure 23 les colonies sont rondes,
opaques, bombées, crémeuses, lisses et brillantes pigmentées en jaune or et se
présentent sous forme de cocci Gram positif se disposent en amas irréguliers
« grappe de raisin », ce qui caractérise l’espèce Staphylococcus aureus (Figure 24).
S. aureus à un métabolisme aérobie prédominant et anaérobie facultatif, produisent
une coagulase, une nucléase thermostable et une catalase, mais pas d’oxydase
(Ananthanarayan et Paniker, 2006). Les S. aureus sont: indole -, uréase +, VP +, MR+,
réduisant le téllurite de potassium et les nitrates en nitrites (Figure 25), et produisant
de l’ammoniaque à partir de l’arginine (Fasquelle, 1974 ; Le Minor et Verron, 1990 ;
Freney et al., 1999).
Figure 25: Identification biochimique de la souche S3 par galerie Api 20 NE
Figure 23 : Aspect macroscopique de La souche S3 sur milieu Chapman
Figure 24: Aspect microscopique de la souche S3 après coloration de Gram
(Gr x 1000)
Résultats et discussion
82
La souche S4 a été affilée au genre Acinetobacter en raison de l’aspect de ses colonies
(Figure 26) et de la forme de ces cellules qui sont des coccobacilles groupés par deux
ou parfois en chaînes de longueur variable (Figure 27), catalase positive
(Delarras, 2007).
La morphologie particulière des Acinetobacter permet et presque à coup sûr d’orienter
correctement leur identification. L’examen au microscope optique de culture en
milieux liquides peptonés simples, montre des diplobacilles à extrémités arrondies
toujours immobiles, isolés ou en courtes chaînettes accompagnés de formes cocci plus
ou moins nombreux, plus rarement de formes allongées et massues dites " formes
souffrantes" dont la formation serait favorisée par l’agitation des cultures.
(Lothorlary, 1995).
Cette souche est aérobie strict, oxydase positive, non sporulée, capsulée, immobile.
Une réponse négative est obtenue pour les tests LDC, ODC, ADH, production
d’hydrogène sulfuré, indole, bêta-galactosidase (Tableau9), donc il est probable que la
souche 4 fait partie de l’espèce Acinetobacter. sp (Delarras, 2007).
Figure 27: Aspect microscopique de la souche S4 après coloration
de Gram (Gr x 1000)
Figure 26 : Aspect macroscopique de La souche S4 sur Gélose nutritive
Résultats et discussion
83
La souche S5 est apparentée à la famille des Entérobactériaceae et présente
les caractéristiques suivantes : une forme bacillaire, Gram négatif (Figure 29),
aéro-anaérobie facultatives, catalase positive et à métabolisme fermentatif
(Madigan et Martinko, 2007).
En se basant sur les résultats des tests biochimiques (Tableau 9) : oxydase, ONPG,
Lactose, H2S négatifs et TDA, Citrate permease et uréase positifs (Figure 30), nous
avons supposé que la souche appartiendrait à l’espèce Providencia rettgeri
(Bergey,1994 et Delarras, 2007).
Figure 30 : Identification biochimique de la souche S5par galerie Api 20 E
Figure 29: Aspect microscopique de la souche S5 après coloration de Gram
(Gr x 1000)
Figure 28: Aspect macroscopique de La souche S5 sur gélose au sang
Résultats et discussion
84
La souche S6 a été rattachée au genre Flavobactérium en raison de ces colonies
pigmentées en jaunes orangé sur milieu hecktoen (Figure 31) et ses cellules en forme
de bacilles courts à Gram négatif, aérobies strictes et immobiles (Figure 32)
(Bergey, 1994 et Delarras, 2007).
D’après les caractères biochimiques de cette souche qui sont rapportés dans le
tableau 9, elle est oxydase, catalase, indole, uréase et citrate perméase positives et a
des réactions négatives avec l’ONPG, nitrate réductase, H2S, LDC, ODC et ADH,
donc il est probable que la souche S6 fait partie de l’espèce Flavobactérium breve
(Delarras, 2007).
La souche S7, d’après sa morphologie macroscopique et microscopique, a été
rattachée au genre Pseudomonas. Celle-ci forme de petites colonies circulaires de
couleur beige, lisses et brillantes (Figure 33). La souche a une forme bacillaire, à Gram
négatif (Figure 34), oxydase négative, catalase, ADH et citrate perméase positives et
présente un caractère aérobie strict (Tableau 9) (Figure 32).
L’incapacité de cette souche à dégrader le mannitol et l’oxydase négative nous permet
de supposer qu’il s’agit de Pseudomonas luteola (Singleton, 1999). D’après la
littérature, l’espèce Chryseomonas luteola aurait également comme synonyme le nom
d’espèce Pseudomonas luteola (Laurent et al., 2000). L’habitat naturel du
Figure 31: Aspect macroscopique de La souche S6 sur milieu
Hektoen
Figure 32: Aspect microscopique de la souche S6 après coloration de Gram (Gr x 1000)
Résultats et discussion
85
Pseudomonas luteola n’est pas bien connu, mais elle est trouvée fréquemment dans le
sol, l’eau et les environnements légèrement humides (De et al., 2010).
Figure 35: Identification biochimique de la souche S7 par galerie Api 20 NE
La souche S8 ce sont des bacilles droits, Gram négatif (Figure 37), mobiles, aérobies,
catalase +, oxydase +, capables de croître en utilisant comme source unique de carbone
le glucose, le glycérol, l’inositol, le galactose, le sorbilol, le mannose et le mannitol
(Figure 38), ce qui nous a permis de supposer qu’il s’agit bien de l’espèce
Burkholderia cepacia (Savoia et Zucca, 2007).
En 1992, Yabuuchi et ses collègues ont défini le genre Burkholderia où sept espèces
du genre Pseudomonas du groupe II ont été reclassées dans ce genre dont
Burkholderia cepacia, autrefois nommé Pseudomonas cepacia (Woods
et Sokol, 2006).
Figure 34: Aspect microscopique de la souche S7
après coloration de Gram (Gr x 1000)
Figure 33: Aspect macroscopique de la
souche S7 sur milieu Hektoen
Résultats et discussion
86
La taxonomie a déterminé un groupe hétérogène, connu sous le nom de complexe
Burkholderia cepacia (Bcc) qui contient neuf espèces proches génétiquement
(auparavant appelé Génomovars). Elles peuvent être isolées des eaux douces ou
marines, du sol, des profondeurs océaniques, de l’air, sur la peau, du système digestif
des animaux et sont même capables de coloniser des milieux particulièrement
extrêmes tels que les déchets radioactifs (Fredrickson et al., 2004 ;Savoia
et Zucca, 2007).
Figure 38 : Identification biochimique de la souche S8 par galerie Api 20 NE
La souche 9 a été rattachée à l’espèce Burkholderia gladioli en se basant sur les
caractères macroscopiques et microscopiques (Figures 39 et 40), et en raison des
caractéristiques suivantes: aérobies, catalase et uréase positifs (Figure 41).
Burkholderia gladioli peut être distinguée des autres Burkholderia parce qu’elle est
indole, nitrate, et la lysine décarboxylase négative (Graves, Margot et al., 1997;
Coenye et al., 1997).
Figure 36: Aspect macroscopique de La souche S8 sur Gélose
nutritive
Figure 37: Aspect microscopique de la souche S8 après coloration de
Gram (Gr x 1000)
Résultats et discussion
87
Figure 41 : Identification biochimique de la souche S9 par galerie Api 20 NE
La présence des différentes souches à savoir Staphylococcus, Micrococcus,
Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobactérium, isolées de l’eau de mer contaminée par
les rejets de la raffinerie d’Arzew était prévisible vu qu’elles font parties des genres
bactériens hydrocarbonoclastes prédominants cités dans les travaux de Leahy et
Colwell (1990) et Floodgate (1995). Ces organismes dégradant les hydrocarbures et
sont ubiquistes (Atlas, 1995 a, b; Olivera et al., 1997). Nous avons identifié
Providencia rettgeri qui peut être isolé du milieu marin selon les études de Hassen et
al. (1998), ainsi que deux espèces du genre Burkhoderia qui peuvent être isolées des
eaux marines (Fredrickson et al., 2004 ; Maravic et al., 2012).
Figure 40: Aspect microscopique de la souche S9
après coloration de Gram (Gr x 1000)
Figure 39: Aspect macroscopique de La
souche S9 sur Gélose nutritive
Résultats et discussion
88
4. Le suivi de la cinétique de croissance des bactéries isolées
La cinétique de croissance des souches isolées sur milieu BH additionné de 2% de
pétrole brut comme seule source de carbone a été suivie en mesurant la concentration
microbienne en fonction du temps, ainsi le dénombrement sur milieu solide ; ce qui a
permis de tracer les courbes représentées par la figure 42.
Figure 42 : Cinétique de croissance des souches bactériennes isolées,
cultivées sur milieu BH additionné de 2% de pétrole brut.
Les courbes Log UFC/ ml = ƒ (t) obtenues ont l’allure d’une courbe de croissance
bactérienne classique dans un milieu non renouvelé.
Pour les neufs souches bactériennes étudiées, les phases de latence observées sont très
courtes ce qui concorde avec les résultats trouvés par Akmouci-Toumi (2009).
Ce résultat démontre une adaptation plus ou moins rapide de ces souches qui
possèdent un équipement enzymatique convenable pour attaquer les différents types
d’hydrocarbures de pétrole utilisé comme seule source de carbone et d’énergie.
Nous pouvons observer que la concentration microbienne augmente dès la 1ère heure de
fermentation jusqu’à atteindre des valeurs maximales après 48 heures pour les
souches S4, S5 et S6, après 60 heures pour la souche S1, et au-delà de 72 heures pour
la souche S8, après 84 heures pour les souches S2, S3 et S9 et après 96 heures pour la
0
2
4
6
8
10
12
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
Log UFC/ml
Time (heures)
Résultats et discussion
89
souche S7. Cette augmentation correspondrait à la phase exponentielle durant laquelle
la dissolution du substrat (pétrole) satisfait les besoins métaboliques des cellules. Cette
dissolution est en fonction de l’équipement enzymatique des bactéries et qui est
spécifique pour chaque type d’hydrocarbures de pétrole ; ce qui explique les différents
pics de charges microbiennes marqués dans des temps différents pour les neufs
souches étudiées (Akmousi-Toumi, 2009).
Après les phases exponentielles qui sont spécifiques pour les différentes souches, la
croissance devient stable. Ce constat s’explique par le niveau des exigences
nutritionnelles qui surpasse la vitesse de dissolution du substrat, la biodisponibilité
devient alors limitante. Durant cette phase stationnaire, les fractions les plus
complexes du pétrole sont dégradées (Rocha et al., 2007).
Au- delà de 108 heures, on remarque une chute de la charge microbienne, qui est due à
l’épuisement du milieu ou à la sécrétion des métabolites secondaires ou bien à
l’inaptitude des bactéries à dégrader les fractions les plus complexes du pétrole.
Tableau 10: Paramètres des cinétiques des croissances des souches isolées
En comparant les résultats des différentes souches, les isolats S2, S8 et S9
sont les seuls à atteindre un nombre de cellules vivantes de 108 à 109 UFC/ml avec un
taux de croissance très élevé qui présente des valeurs respectivement pour les trois
souches : µ= 0,97, 0,90et 0,98 h-1 correspondant à un temps de génération
G= 1,02; 1,10 et 1,01h.
Selon Rodrigo (2005), les isolats de Pseudomonas cultivés sur un milieu minéral
contenant une seule source de carbone ont atteint un taux de croissance allant de 0,31 à
0,34 h-¹. Ce qui ne correspond pas aux résultats obtenus avec nos isolats de
Pseudomona aeruginosa (S2) et les deux espèces de Burkhoderia (S8 et S9) inoculés
Souches S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9
N 3.52 11.66 7.64 3.25 5.18 0.76 8.30 10.89 7.64
µ (h-1) 0.29 0.97 0.63 0.27 0.43 0.06 0.69 0.90 0.98
G (h) 3.40 1.02 1.57 3.68 2.31 15.7 1.44 1.10 1.01
Résultats et discussion
90
dans un milieu minéral contenant le pétrole brut comme unique source de carbone.
Les taux de croissance beaucoup plus élevés peuvent être expliqués par l’origine des
souches qui sont isolées d’un milieu contaminé d’une façon chronique par les rejets de
la raffinerie d’Arzew, donc elles ont une adaptation naturelle vis-à-vis du pétrole brut.
La présence d’hydrocarbures dans le milieu marin va de paire avec un enrichissement
sélectif en bactéries capables de les dégrader, notamment en bactéries marines
hydrocarbonoclastes (HCB). Elles sont ubiquitaires et capables de cataboliser des
hydrocarbures à chaîne aliphatique courte ou longue, ainsi que les composés
aromatiques, incluant les poly-aromatiques, car elles possèdent les voies de
dégradation adéquates (Yakimov et al., 2007; Martins et Peixoto, 2012).
D’après Bordenave et al.,(2007), Cappello et al., (2007) et Coulon et al., (2007), en
cas de pollution pétrolière, les bactéries avantageusement sélectionnées par l’apport
d’hydrocarbures sont généralement très actives.
En se basant sur les paramètres de croissance, on a remarqué une particularité pour les
trois souches S1, S4 et S6 concernant leurs taux de croissance bas et très éloignés de
ceux des autres souches qui présentent respectivement des valeurs µ=0,29; 0,27 et
0,06 h-1 correspondant à un temps de génération G= 3,40; 3,68 et 15,7 h ; ce qui nous
a permis de sélectionner les meilleures souches (S2, S3, S5, S7, S8 et S9) et les
garder pour continuer nos expériences afin de savoir comment exploiter ces micro-
organismes autochtones dans la décontamination de leurs environnement naturel marin
des hydrocarbures.
5. Etude de l’optimum de température
Afin d’évaluer l’influence de la température sur la croissance des souches isolées,
différentes valeurs de températures ont été testées allant de 10°C au 30°C. Les
résultats obtenus sont représentés par les courbes de la figure 43.
Résultats et discussion
91
Figure 43 : Effet de la température sur la croissance des isolats sur milieu BH
additionné de 2% de pétrole, à différentes valeurs de température après 24 heures
d’incubation
D’après les courbes de la figure 43, nous remarquons que nos isolats croîssent dans
une large gamme de températures allant de 10°C à 30°C. Ces résultats concordent avec
ceux retrouvés par Rodríguez-Blanco et al., (2010) qui ont rapporté que la dégradation
du diesel ou du pétrole brut pouvait aussi bien se faire à 25, 10 ou 4°C en conditions
contrôlées avec de l’eau de la Méditerranée. Cette tolérance aux différentes
températures peut être expliquée par l’origine marine de ces bactéries et les
changements de température dans cet intervalle entre les saisons. Nous constatons
aussi que les taux de croissance les plus élevés sont relevés à 25°C pour toutes les
souches étudiées; ce qui permet de déduire que cette valeur de température peut être
considérée comme température optimale de croissance. Les travaux de Sauret (2011)
démontrent que la biodégradation optimale des hydrocarbures a été observée en
culture pure autour de 25 à 37°C; ce qui correspond à l’optimum de température d’un
grand nombre d’enzymes bactériennes. De ce fait, même si la biodégradation est un
processus pouvant se faire durant toute l’année, certains auteurs proposent qu’elle soit
plus efficace en été qu’en hiver (Atlas et al., 1973).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 15 20 25 30
S2
S3
S5
S7
S8
S9
Log UFC/ml
Température (°C)
Résultats et discussion
92
Atlas (1981); Leahy et Colwell (1990) ont rapporté que la température est un
paramètre pouvant influencer la biodégradation du pétrole en modifiant son état
physique, sa composition chimique, l’activité physiologique des micro-organismes et
par conséquence la vitesse de dégradation des hydrocarbures, ainsi que la nature et la
concentration des espèces microbiennes présentes.
6. Etude de l’optimum de pH
Afin de tester l’effet de pH sur la croissance des isolats, différentes valeurs ont été
testés allant d’un pH acide 4 jusqu’au basique 10. Les résultats obtenus sont
représentées par les courbes de la figure 44.
Figure 44 : Effet des différentes valeurs de pH sur la croissance des isolats sur milieu
BH additionné de 2% de pétrole, après 24 heures d’incubation.
En observant les courbes dans la figure 44, on peut constater que les isolats ont une
croissance normale au pH proche de la neutralité. D’après Vandecasteele (2005), les
pH extrêmes inhibent la biodégradation de l’huile. Cependant, en règle générale, en
environnement marin comme en eau douce, on se situe dans une gamme de pH très
favorable (entre 7 et 8). Toutefois, on a remarqué une augmentation notable de
croissance des souches: S3, S5, S8 et S9 au pH 10. Ce résultat peut être expliqué par
l’acide produit par le métabolisme aérobie des hydrocarbures qui va acidifier le milieu
de culture qui est alcalin dès le départ dans notre cas expérimental.
0
2
4
6
8
10
12
4 5 6 7 8 9 10
S2
S3
S5
S7
S8
S9
Log UFC/ml
pH
Résultats et discussion
93
Nos résultats concordent avec ceux de Dibble et Bartha (1979) et Hambrick et al.
(1980) qui ont trouvé que la dégradation des hydrocarbures est plus élevée dans des
conditions légèrement basiques.
Chung et al, (2000) ; Boszczyk-Maleszak et al, (2006) rapportent que certains
paramètres environnementaux comme la température et le pH vont affecter les
propriétés du pétrole (viscosité du pétrole, volatilité et solubilité des molécules) et
l’activité des communautés microbiennes.
7. Tolérance des souches au pétrole
Pour l’étude de la tolérance de nos souches, différentes concentrations de pétrole ont
été testées pour les souches isolées et les résultats sont représentés par les
histogrammes de la figure 45.
Figure 45: Effet des différentes concentrations de pétrole sur la croissance
des isolats sur milieu BH aprés 48h d’incubation.
Nous remarquons que tous les isolats supportent jusqu’à 20% de pétrole, avec un
optimum de croissance des quatre souches de la famille des Pseudomonacae S2, S7,
S8 et S9 à 5% de pétrole brut, suivi d’une régression de leurs charges dans les milieux
0
2
4
6
8
10
12
0% 2% 5% 10% 15% 20%
S2
S3
S5
S7
S8
S9
Log UFC/ml
Pétrole( %)
Résultats et discussion
94
avec 10% de pétrole brut, contrairement aux autres souches qui gardent à peu près les
mêmes concentrations. Alors, on relève que les deux souches S2 et S7 s’adaptent
mieux à 15% de pétrole brut, tandis que la souche S9 est la seule bactérie qui assimile
20% de pétrole dans son milieu de culture. Ces différences d’adaptation peuvent être
expliquées par l’équipement enzymatique spécifique pour chaque souche, ainsi que
leurs modes de fonctionnement sur les différents types d’hydrocarbures qui composent
le pétrole brut. Ces résultats sont conformes à ceux rapportés par Suzuki et al., (2001),
Priefert et al., (2004) et Taketani et al., (2010) qui avancent que les bactéries isolées
d’une région contaminée d’une façon chronique par le pétrole (port d’Arzew dans cette
étude) supportent des concentrations considérables de pétrole, parce que dans les zones
polluées par ce dernier, des mécanismes d’induction des enzymes d’intérêt dans sa
biodégradation ont été retrouvés. C’est une adaptation qui se traduit par une grande
stabilité qui confère aux bactéries la capacité de répondre plus rapidement aux
nouvelles sources d’hydrocarbures que les bactéries trouvés dans des régions
dépourvues de contamination (Head et al., 2006; Maila et al., 2006;
Bordenave et al., 2007).
Vandercasteele (2005) et Taketani et al., (2010) rapportent que le site d’origine va
déterminer le temps de réponse des micro-organismes autochtones. En effet, la pré-
exposition aux hydrocarbures de la communauté bactérienne entraîne une sélection de
populations capables de répondre rapidement à l’addition ultérieure de pétrole. Ainsi,
les hydrocarbures peuvent entraîner une augmentation des populations
hydrocarbonoclastes (Syutsubo et al., 2001), une chute de la diversité (Yakimov et al.,
2005), ou même aucune modification (Evans et al., 2004 ; Röling et al., 2004b). Aussi,
les communautés bactériennes exposées à des contaminations chroniques et
accidentelles ou soumises à des antécédents de contamination ne présentent pas les
mêmes réponses adaptatives (Carman et al., 1996; Hayes et al., 1999; Evans et al.,
2004; Greenwood et al., 2009).
Harayama et al., (2004) et Kostka et al., (2011) ont rapporté que si le pétrole peut être
toxique pour bon nombre d’espèces marines, les bactéries hydrocarbonoclastes sont,
au contraire, favorisées par un apport d’hydrocarbures, parce qu’elles utilisent
préférentiellement le pétrole plutôt que des sucres comme source de carbone.
Résultats et discussion
95
D’après Ron et Rosenberg (2002) ; Berthe-Corti et Höpner (2005), l’accessibilité au
substrat dépend de plusieurs mécanismes permettant aux cellules bactériennes de
détecter, solubiliser, importer et dégrader l’hydrocarbure ; ce qui peut expliquer qu’en
milieu pollué, les communautés bactériennes sont dominées par quelques groupes
majoritaires, avantagés sélectivement par l’apport de pétrole (Jürgens et al., 2000;
Jiang et al., 2006).
8. Profils de résistance aux antibiotiques
Tableau 11 : Profils des résistances aux antibiotiques des six souches
Souches Antibiotiques
S2 S3 S5 S7 S8 S9
Sulfamides R R S R R S
SXT
Aminosides S S S S S S
GN
K R S S R R S
TOB S S S S S S
Β-Lactamines R
S
R
R
R
R P
FOX R S S R R R
CAZ R R S S R S
IPM S S S S S S
AML R S S R R S
CT S R S S R R
TI R S S S R S
ATM S S S S S S
Quinolones S
S
S
S
S
S CIP
LEV S S S S S S
Macrolides R
R
S
R
R
R E
Phénicoles R
S
S
S
R
R C
R : Résistante P : pénicilline TI :Ticarcilline
S : Sensible FOX : Céfoxitine ATM : Aztréonam
SXT:Triméthoprime/Sulfaméthoxazole CAZ : Ceftazidime CIP : Ciprofloxacine
GN : Gentamicine IPM : Imipénème Lev : Levofloxacin
K : Kanamycine AML : Amoxicilline E :Erythromycine
TOB :Tobramycine CT : Céfotétan C: Chloramphénicol
Résultats et discussion
96
Figure 46 : Antibiogramme de Pseudomonas aeruginosa sur milieu Mueller-Hinton
Figure 47 : Antibiogramme de Burkholderia cepacia sur milieu Mueller-Hinton
C SXT
GN AML
CAZ
P
FOX
E
LEV TI
SXT
GN
C
IPM
CTX
AML
CAZ
FOX CIP
K
Résultats et discussion
97
Figure 48 : Antibiogramme de Staphylococcus aureus sur milieu Mueller-Hinton
Figure 49 : Antibiogramme de Pseudomonas luteola sur milieu Mueller-Hinton
DA VA
P
SP
TE
E
C SXT
AML GN
E CAZ
FOX P
C
AML
SXT
GN
E CAZ
FOX P
CIP
CT TI
LEV
CAZ
SXT TOB
ATM GN
IPM K
TIC
NA C
N
S
AMX
ATM
Résultats et discussion
98
D’après les résultats obtenus, on peut constater que Burkholderia cepacia
et Pseudomona aeruginosa résistent à la majorité des β-Lactamines testés sauf
imipénème et aztréonam concernant la première, tandis que la deuxième, en plus des
deux antibiotiques cités, elle est sensible au céfotetan. En revanche, les autres souches
présentent plus de sensibilité que de résistance aux β-lactamines ; Pseudomona luteola
et Burkholderia gladioli résistent à la pénicilline et la céfoxitine (Figures 46, 49).
On rajoute pour la première souche, l’amoxicilline, tandis que pour la seconde souche,
le céfotétan. S.aureus ne résiste qu’à ce dernier et à la céfozidine (Figure 48). Quant à
Providencia rettgeri elle ne résiste qu’à la penicilline.
Les bactéries testées sont résistantes au sulfamide utilisé sauf Providencia rettgeri et
Burkholderia gladioli.
En ce qui concerne les aminosides, toutes les souches sont sensibles à la gentamicine
et la tobramycine. Quant à la kanamycine, cet antibiotique a subi une résistance par
S. aureus, P. aeruginosa et Burkholderia cepacia (Figures 46, 47 et 48).
Toutes les bactéries présentent une sensibilité vis-à-vis des deux quinolones testés. La
même remarque est relevée pour Providencia rettgeri avec le macrolide
(Erythromycine). Cependant, les quatre souches qui font partie de la famille des
Pseudomonaceae résistent au Chloramphénicol.
Cette résistance est principalement due à la faible perméabilité de leur membrane
(Segonds et al., 2001) qui va permettre de réduire l’entrée des molécules. Les bactéries
peuvent également acquérir la résistance à un antibiotique suit à une modification
génétique par mutation ou d’une acquisition de matériel génétique étranger, cette
dernière n’est présente que dans certaines souches de l’espèce (Faure, 2009). A titre
d’exemple les gènes qui codent pour la production d’enzymes inactivant certains
antibiotiques comme les aminosides ou les β-lactamines (Kettner et al., 1995, Faure,
2009). Ces mécanismes sont essentiellement codés par des déterminants
chromosomiques. Toutefois, ces bactéries possèdent également une grande capacité
à acquérir de nouveaux mécanismes de résistance par transferts horizontaux ou
mutations, la modification de la cible ou de l’antibiotique (Levy et Marshall, 2004).
Les ß-lactamases sont des enzymes d’inactivation de type sérine (classes A, C et D) ou
métalloenzymes (classe B) dont les substrats sont des ß-lactamines.
Résultats et discussion
99
L’inactivation enzymatique (perte de l’activité antibiotique) survient lors de
l’ouverture du cycle β-lactame (Philippon, 2005).
Nordmann et al., (2009), Parveen et al., (2010) avancent que la résistance
des antibiotiques de la classe des β-lactamines peut remettre en cause la présence
d’une β-lactamase chromosomique de type Amp C qui a été décrite chez une large
variété de bacilles a Gram négatifs tel que P. aeruginosa et le complexe B. cepacia.
D’après Cattoir (2004), Burkholderia cepacia présente un haut niveau de résistance
intrinsèque à de nombreux antibiotiques (β-lactamines, aminosides) ; ce qui confirme
nos résultats (Figure 47).
P. aeruginosa possède une membrane externe faiblement perméable, ce qui lui confère
une résistance naturelle à de nombreux antibiotiques, dont la plupart
des bêta-lactamines hydrophiles (Liazid, 2012).
La sensibilité de nos isolats aux aminosides peut être expliquée par le fait que nos
souches ont été isolées du milieu naturel, sont encore sauvages et n’ont pas encore
développées des mécanismes de résistances vis-à-vis des aminosides qui agissent au
niveau du ribosome bactérien et perturbent la synthèse protéique (Eric, 2008). Cela se
traduit par une action bactéricide rapide et puissante (Marty, 2000), ainsi que les
quinolones qui sont spécifiques à l’ADN bactérien et exercent une activité bactéricide
pendant la phase de multiplication et de repos des bactéries (Larouche, 2001 ;
Mérens et al., 2010).
L’hypersensibilité de notre souche S. aureus à la majorité des antibiotiques
en comparaison aux souches du milieu hospitalier, est probablement due à l’origine
marine de notre bactérie qui en s’adaptant à son environnement, a perdu quelques
caractéristiques ou à un dysfonctionnement de l’un de ces mécanismes de résistance
cités par Schwarz et Chaslus-Dancla (2001):
- Stratégie dite « offensive » par inactivation enzymatique de l’antibiotique ;
- Stratégie dite «d’évitement» par modification de la molécule cible de l’antibiotique;
- Stratégie dite « de contournement » par shunt des voies métaboliques classiques ;
- Stratégie dite « d’expulsion » par diminution de la perméabilité de l’antibiotique
et par accélération du mécanisme d’efflux.
Résultats et discussion
100
En raison de la richesse des voies métaboliques des bactéries hydrocarbonoclastes,
elles sont souvent capables de résister à de nombreux antiseptiques ou antibiotiques ;
ce qui explique leur émergence dans les régions polluées, non seulement par les
hydrocarbures, mais aussi sont exposées à plusieurs formes de pollution.
Les espèces du genre Pseudomonas produisent une couche d’exopoly-saccharide
entourant leurs cellules, ce procédé physiologique les protège de la phagocytose par
les macrophages chez les mammifères. Cette couche d’exo-polysaccharide (E.P.S) leur
permet de former des biofilms, grâce auxquels elles peuvent rester collées aux
surfaces, de telle manière qu’il est difficile de les déloger (Visca et al., 2007). Ce
genre produit beaucoup de poly-hydroxyalcanoates et d’alginates, ainsi que d’autres
substances métaboliques. Ce qui les rend d’un grand intérêt biotechnologique
(Holloway, 1992).
Le groupe en question inclut des espèces importantes pour la biodégradation de divers
composés (Johnsen et al., 1996; Heinaru et al., 2000), et la production de métabolites
utiles (Palleroni, 1992).
Résultats et discussion
101
9. Profil de résistance aux métaux lourds
Tableau 12 : La résistance des six bactéries sélectionnées aux métaux lourds
+ : croissance, - : inhibition de la croissance
Les résultats obtenus donnent une évaluation qualitative de l’effet de certains métaux
lourds sur la croissance des souches. Nous avons constaté que le mercure, le nickel, le
cadmium et l’aluminium sont les métaux les plus toxiques pour toutes les bactéries
testées. Des zones d’inhibition ont été observées autour des puits contenant ces
métaux. Tandis que le dichlorure de fer (Cl2Fe) et le plomb ont un effet létal sur la
majorité des isolats à l’exception de S3 : Staphylococcus aureus (Figure 51).
Alors la S2 (Pseudomonas aeruginosa) et S7 (Pseudomonas luteola) sont les seules
bactéries de notre collection qui présentent une sensibilité vis-à-vis du cuivre
(Figures 52 et 53). Quant à l’étain il n’a aucun effet sur la croissance de toutes nos
bactéries (Figures 50 et 53).
Souches
Métaux lourds S2 S3 S4 S7 S8 S9
Mercure - - - - - -
Fer Fe + + + + + +
Cl2Fe - + - - - -
Nickel - - - - - -
Cadmium - - - - - -
Etain + + + + + +
Zinc + + + + + +
Aluminium - - - - - -
Cuivre - + + - + +
Plomb - + - - - -
Résultats et discussion
102
Figure 50: Effet des métaux lourds sur Burkholderia gladioli
sur milieu Mueller-Hinton
Figure 51: Effet des métaux lourds sur Staphylococcus aureus
sur milieu Mueller-Hinton
Figure 52 : Effet des métaux lourds sur Pseudomonas aeruginosa
sur milieu Mueller-Hinton
Cl2Fe Zn
Cl2Fe
Cl2Fe
Zn
Zn
Cu
Hg
PB
Cd Fe
Ni
Al
ET
PB Cd
Hg Cu
ET
Fe
Ni
Al
PB
Cu Hg Al
Ni
Fe
Cd
ET
Résultats et discussion
103
Figure 53 : effet des métaux lourds sur Pseudomonas luteola
sur milieu Mueller-Hinton
Figure 54 : Effet des métaux lourds sur Burkholderia cepacia
sur milieu Mueller-Hinton
Nous avons remarqué que la capacité de nos souches à dégrader le pétrole brut
est associée à une résistance multiple aux métaux lourds et /ou antibiotiques, à cela
rien de bien singulier puisque les polluants organiques, les métaux lourds
et les antibiotiques sont fréquemment présents dans les secteurs proches des zones
urbanisées (Bouchez et al., 2000).
Divers auteurs tels Halling-Sorensen et al., (1998) et Sarmah et al., (2006) ont constaté
dans certains environnements, des concentrations en antibiotiques suffisamment
élevées pour inhiber beaucoup d’espèces bactériennes. Plusieurs bactéries ont
développé des mécanismes de résistance aux antibiotiques, souvent liés
Cl2Fe
Cl2Fe
Zn
Zn Pb
Cu
Hg
Fe Cd
Ni
Al
ET
Al
Cd Fe
Ni ET
PB
Cu
Hg
Résultats et discussion
104
à une résistance aux métaux lourds (De Vicenteetal., 1990 ; Baker-Austin et al., 2006).
La résistance aux antibiotiques et aux métaux pouvant être co-sélectionnées
simultanément (Baker-Austinetal., 2006) à la fois dans les environnements
contaminés et hospitaliers.
La présence de gros plasmides extra-chromosomiques transmissibles transportant les
différents gènes de résistances permet d’acquérir ces résistances multiples (Springael
et al., 1993 ; Nakajima et al., 1995 ; Alonso et al., 2000). Selon Lawrence (2000),
le groupement de plusieurs gènes sur un plasmide est bénéfique pour les souches
bactériennes qui auront plus de chance pour survivre lorsque les gènes sont transférés
ensemble lors de la conjugaison.
Les capacités d’adaptation des bactéries à un milieu, conduisant à une variation
phénotypique, vont ainsi déterminer leur présence in fine dans le milieu considéré. En
effet, malgré un apport exogène régulier, une espèce bactérienne peut être incapable de
se maintenir dans un environnement donné. L’étude de la distribution d’une espèce ou
d’un genre bactérien dans différents milieux permet d’étudier leur potentiel adaptatif et
leur capacité à évoluer dans diverses conditions, ce qui s’avère fondamental pour les
micro-organismes hydrocarbonoclastes. Dans ce contexte, les connaissances de l’effet
des facteurs environnementaux sur ces micro-organismes est l’un des éléments clé de
compréhension de phénomène de biodégradation de matière organique plus
précisément le pétrole et surtout pour aboutir à des observations qui visent ainsi
à développer des moyens de contrôle et de surveillance du milieu marin contre le fléau
de la pollution par les hydrocarbures.
Résultats et discussion
105
10. Le suivi de la biodégradation
Afin de mieux comprendre les phénomènes qui accompagnent la biodégradation du
pétrole brut et le comportement des micro-organismes concernés. Nous avons suivi
l’évolution de certains paramètres comme la concentration bactérienne, le pH, la
tension superficielle, l’index d’Emulsion (E24) et enfin le taux de biodégradation.
10.1. Evolution de la concentration bactérienne
Les résultats de la variation de la cinétique de croissance en fonction du temps pour
toutes les souches sont donnés en annexes et sont représentés sur la figure 55.
Figure 55 : Suivi de la concentration bactérienne
au cours de la biodégradation de pétrole brut
D’après les courbes représentées dans la figure 55, nous remarquons une augmentation
de la concentration microbienne pendant les trois premiers jours et à partir de là,
chaque souche a un comportement spécifique en métabolisant la seule source de
carbone (pétrole brut) avec ces multitudes classes d’hydrocarbures.
En ce qui concerne la souche S2 on observe une régression de la charge bactérienne
de 109 à 108 qui reste jusqu’au 15ème jour, dans lequel on signale une deuxième
augmentation à 109 qui reste constante jusqu’à la fin de l’expérimentation.
0
2
4
6
8
10
12
3 6 9 12 15 18 21
S2
S3
S4
S7
S8
S9
C
Log UFC/ml
Jours
Résultats et discussion
106
Pour la souche S3 l’augmentation de la concentration microbienne continue jusqu’au
12ème jour où on signale un maximum de 1010, et à partir du 15ème jour, on note une
diminution en continu du nombre de cellules, alors que pour la S4, la concentration
augmente en continu jusqu’au 15ème jour avec un nombre égal à 107, suivie d’une
réduction du nombre à 105. Pour la S7, on note un pic après 6 jours avec un nombre
égal à 109, ensuite une chute pour arriver à 108 cellules, suivie par un nouveau pic
après 12 jours de 109 cellules mais qui reste constant jusqu’au 21ème jour où on
remarque une nouvelle diminution de la charge bactérienne dans le milieu de culture.
Pour la S8 après une charge bactérienne importante de 109au 9ème jour, on observe une
régression après 12 jours avec 105 cellules, suivie d’une reprise de la charge
bactérienne avec 106 et 107 respectivement pendant les 18 et 21ème jours. Pour la S9, on
discerne une diminution de nombre de cellules de 108 à 107 après 6 jours d’incubation,
suivi d’une nouvelle augmentation après 9 jours avec 108 en continu jusqu’au 15eme
jour avec une charge bactérienne de 1010, se continuant par une nouvelle régression
après 18 jours, avec un nombre de 107,ensuite un autre pic signalé après 21 jours dont
la concentration microbienne est de 1010.
Concernant le consortium la concentration bactérienne augmente jusqu’à 109 après 9
jours, ensuite on note une diminution de la charge microbienne jusqu’aux 18ème jours
aves 109, suivi d’une nouvelle augmentation signalée après 21 jours avec une
concentration de 108.
Toutes ces différences de comportement des souches en culture peuvent être expliquer
par le manque d’accessibilité du pétrole aux micro-organismes en raison de son
hydrophobicité. Pour pallier à cette contrainte, un grand nombre de bactéries se sont
adaptées au fil du temps pour excréter des agents tensio-actifs, amphiphiles, appelés
aussi biosurfactants ou bioémulsifiants (Satpute et al., 2010), elles permettent de
réduire l’énergie nécessaire au transfert de matières entre la surface du pétrole et
l’intérieur des cellules bactériennes (Ron et al., 2002). Elle confère un avantage
sélectif aux bactéries qui les produisent et augmentent la dégradation du pétrole
(Nerurkar et al., 2009; Satpute et al., 2010).
Résultats et discussion
107
Une fois le substrat carboné (pétrole brut) est à l’intérieur des cellules, la machinerie
enzymatique dédiée à la dégradation des hydrocarbures de pétrole peut s’enclencher.
Il existe ainsi une grande diversité des voies métaboliques aérobies de chaque classe
d’hydrocarbures. Cependant, l’attaque initiale précise la voie métabolique mise en jeu.
D’après Sauret (2011), chacun des genres bactériens n’est capable de dégrader qu’un
nombre restreint d’hydrocarbures, alors que le pétrole est composé de centaines, voire
de milliers de molécules différentes. La biodégradation totale d’un pétrole n’est donc
possible que grâce à la mise en place d’un consortium bactérien comprenant des
groupes dont les équipements enzymatiques complémentaires permettent la
biodégradation quasi-totale de ces différents types d’hydrocarbures (Head et al.,
2006), alors que notre consortium est loin de remplir ces conditions, mais on peut
remarquer une amélioration vers le 21ème jour de la culture et qui peut être justifier par
l’inconvénient de la biodégradation qui est un processus lent.
Toutefois, les mécanismes qui interviennent sont très diversifiés, en grande partie à
cause de la multitude de molécules de type hydrocarbures. Toutefois, Das et al.,
(2011) ont proposé un schéma général de la dégradation des hydrocarbures par les
micro-organismes en condition aérobie, condition prépondérante en milieu pélagique.
L’attaque initiale intracellulaire est un processus oxydatif et l’activation, ainsi que
l’incorporation d’oxygène est la clé de la réaction enzymatique catalysée par les
oxygénases et les peroxydases (Das et al.,2011).
Les voies périphériques de dégradation convertissent les hydrocarbures, étape par
étape en intermédiaires du catabolisme, à l’aide par exemple du cycle des acides
tricarboxyliques (TCA ou cycle de Krebs). La biosynthèse de molécules pour la
biomasse de la cellule se fait par la glycogénèse (Sauret, 2011) ; ce qui peut expliquer
les écarts entre les pics de charges bactériennes.
Rodriguez-Blanco et al.,(2010) rapportent que les bactéries dégradant les composés les
plus simples (comme les alcanes linéaires à courte chaîne) qui sont abondantes dans
l’environnement, celles qui possèdent les machineries enzymatiques pour dégrader les
composés les plus complexes (comme par exemple les composés aromatiques de plus
de quatre cycles) sont beaucoup moins répandues. Le niveau de dégradation des
pétroles (mélange de composés facilement dégradables et de composés récalcitrants)
Résultats et discussion
108
est donc totalement dépendant de la diversité métabolique des bactéries
hydrocarbonoclastes présentes dans l’environnement pollué (Sauret, 2011).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0123456789
10
0 3 6 9 12 15 18 21S2
pH
Log UFC/ml pH
Jours
5,8
6
6,2
6,4
6,6
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0
2
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0 3 6 9 12 15 18 21S3
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0 3 6 9 12 15 18 21 S4
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Log UFC/ml pH
Jours0
1
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0123456789
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0 3 6 9 12 15 18 21 S7
pH
LogUFC/ml pH
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0 3 6 9 12 15 18 21 S8
pH
LogUFC/ml pH
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0 3 6 9 12 15 18 21 S9
pH
LogUFC/ml pH
Jours
Résultats et discussion
109
Figure 56 : Suivi de changement de pH au cours de la biodégradation de pétrole brut
10.2. Evolution du pH
L’évolution du pH en fonction du temps est représentée par les courbes dans
la figure 56. Au temps initial de la croissance, le pH était ajusté à 7. Durant les 6
premiers jours de l’expérience, le pH diminue légèrement pour toutes les souches ; ce
qui correspond à la croissance microbienne. Cet état est suivi d’une augmentation
proche de la neutralité du pH de la souche S2 vers le 9ème jour, pour diminuer à 5,45
puis se stabilise à un pH proche de la neutralité jusqu’à la fin de l’expérience.
Concernant la souche S3, le pH de son milieu se stabilise proche de la neutralité du
9ème au 15ème jour, suivi d’une légère diminution à 6,41 en fin d’expérience. Pour la
souche S4, le pH de son milieu atteint une valeur de 5,7 vers le 9ème pour se stabiliser
dans un pH entre 7,2 et 6,1. Le pH du milieu de la S7 atteint 5,3 pendant le 9ème jour,
pour se stabiliser dans un pH proche de la neutralité jusqu’à la fin de l’expérience.
Concernant la souche S8 le pH de son milieu ne dépasse pas l’intervalle de la
neutralité avec une légère acidification (pH=5,6) signalée dans le 15ème jour, Pour la S9
après un pic de pH=7,27 marqué vers le 15ème jour, on remarque une légère
acidification de milieu avec un pH minimale de 5,81, alors que pour le consortium des
six bactéries sélectionnées, on observe que le pH du milieu migre vers l’acidité jusqu’à
une valeur minimale de 5,15 atteinte après 18 jours, pour retourner en fin d’expérience
vers la neutralité (pH= 6,18).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0123456789
10
0 3 6 9 12 15 18 21 C
pH
pH
Jours
pHpHLog UFC/ml
Résultats et discussion
110
A lumière des résultats exposés, et selon Ballerini et al., (1999), le pH du milieu peut
affecter l’activité microbienne. En effet la plupart des bactéries sont capables de se
développer dans un intervalle de pH allant de 5 à 9, avec un optimum se situant aux
alentours d’un pH neutre.
En résumé les valeurs de pH que nous avons relevés restent bien incluses dans cet
intervalle donné.
En effet, on peut remarquer un changement de pH pour l’ensemble des isolats vers
l’acidité ; la raison étant certainement due aux différentes réactions biochimiques qui
entraînent l’assimilation des composés du pétrole brut comme seule source de carbone
et d’énergie d’un côté, avec synthèse des acides gras porteurs de groupement (COOH),
et d’un autre côté, causant ainsi l’acidification du milieu de culture. Ces groupements
représentent des métabolites intermédiaires de biodégradation des hydrocarbures avant
leur minéralisation complète par les micro-organismes hydrocarbonoclasles.
L’oxydation des n-alcanes en acides gras a été signalée par Leahy et Colwell (1990)
White et al., (1998), Abed et al., (2002) et Van Beilen et al., (2003). En effet, il a été
observé que durant la dégradation, par exemple de xylène (Labrecque, 2003), et de
l’anthracène (Wong et al., 2002), il y a eu une production d’acides intermédiaires qui
acidifient le milieu.
10.3. Index d’émulsification (E24)
Il existe plusieurs microorganismes capables de produire des biosurfactants, les
espèces les plus importantes sont celles appartenant au genre Pseudomonas produisant
des rhamnolipides.
Ce test a pour but l’estimation de la production des biosurfactants par les souches.
Les variations de l’index d’émulsion (E24) en fonction de temps ont été décelées
et reportées dans la figure 57.
Résultats et discussion
111
Figure 57 : Evolution temporelle de l’index d’émulsion
Les souches bactériennes isolées ont la capacité d’émulsionner le pétrole brut
(Figure57). Les courbes obtenues E 24 (%) = f (t) des souches étudiées ont la même
allure que les courbes de croissance (Figure 42).
L’augmentation de l’index d’émulsion est proportionnelle à la concentration
microbienne. Il atteint des valeurs qui fluctuent entre 57 %, 56%, 55%, et 50 % pour
les quatre souches S8, S7, S2, S9 et le consortium, suivi des deux valeurs moindres
38% et 43% concernant les souches : S3 et S5 respectivement (Figure 57).
Des résultats similaires ont été trouvés chez Pseudomonas aeruginosa qui peut
atteindre un index d’émulsion de 50% (Benincasa et Accorsini, 2009)
et de 58% (Lovaglio et al., 2011).
Il en ressort que ces souches produisent des biosurfactants à différentes concentrations.
Rappelons que les biosurfactants sont des molécules tensioactives produites par
certains micro-organismes. Leur nature, tout comme leur pouvoir tensioactif, sont
fortement dépendants du type de micro-organisme concerné (Rossignol, 2007).
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
0 3 6 9 12 15 18 21
S2
S3
S5
S7
S8
S9
C
E24%
Jours
Résultats et discussion
112
10.4. La tension superficielle
La tension superficielle est la force nécessaire pour rompre la surface entre deux
liquides immiscibles (Neindre, 1993). Les courbes obtenues de la variation de la
tension superficielle au cours du temps (mN/m) = f (t) sont inversement
proportionnelle aux courbes de croissance (Figure 58).
Figure 58 : Evolution temporelle de la tension superficielle
On peut remarquer que la tension superficielle pour toutes les souches sélectionnées
aux premiers jours de culture est relativement élevée (valeurs > 60mN/m). Au bout du
9ème jour, nous observons que pour les souches S7, S8, S9 et S2 les valeurs décroisent
jusqu’à atteindre 38, 39,40 et 36 mN/m. Ce résultat permet de suggérer qu’il existe une
production de biomolécules spécifiques ayant des propriétés tensio-actives :
Les biosurfactants connus pour provoquer l’abaissement de la tension superficielle
(Tabatabaee et al., 2005). La propriété tensioactive du biosurfactant dépend
principalement de sa capacité de réduire la tension superficielle et la formation des
émulsions stables avec des différents substrats immiscibles dans l’eau
(Raza et al., 2007).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 3 6 9 12 15 18 21
S2
S3
S5
S7
S8
S9
C
Ten
sion
su
per
fici
elle
mN
/M
Jours
Résultats et discussion
113
Les mêmes résultats ont été obtenus par Banat et al. (1991) qui ont pu isoler plusieurs
bactéries ayant la capacité de réduire la tension superficielle du milieu de culture à des
valeurs inférieures à 40 mN/m. Nous citerons, les rhamnolipides produites par
Pseudomonas aeruginosa qui ont la capacité de réduire la tension superficielle de l’eau
de 72 mN/m à 30 mN/m. Une autre souche de Pseudomonas aeruginosa isolée à partir
d’un sol contaminé par les hydrocarbures peut réduire la tension superficielle du
milieu de culture jusqu’à 36 mN/m (Somayeh et al., 2008).
Il convient de noter que les rhamnolipides sont activement synthétisés au cours de la
phase stationnaire de Pseudomonas aeruginosa. Par conséquent, elles sont également
produites pendant la première étape du processus de la bioremédiation et contribuent à
la mobilisation et solubilisation des contaminants pendant les étapes de minéralisation
(Chayabutra et Ju, 2000).
Plusieurs travaux ont indiqués que les souches de Pseudomonas aeruginosa ont la
capacité de réduire la tension superficielle à des valeurs minimales et peuvent
émulsionner et stabilisent les émulsions de différents types d’hydrocarbures et des
huiles comme le pétrole brut, le kérosène, les n-alkanes, les composés aromatiques,
l’huile d’olive, les huiles minérales et le diesel (Patel et Desai, 1997 ; Benincasa et al.,
2004 ; Wei et al., 2005).
Il est à noter qu’il existe une relation entre l’augmentation de la biomasse, l’index
d’émulsion (E24), la diminution de la tension superficielle et la production de
biosurfactants par les souches, ce constat peut être expliqué par la phase prolongée de
la croissance microbienne (Das et al., 2009). Ce qui confirme que la production de
biosurfactants s’effectue pendant la phase exponentielle de croissance, et qui suggère
qu’il est produit comme métabolite primaire (Amiriyan et al., 2004). La croissance
bactérienne associée à la production de biosurfactants pourrait faciliter l’adhérence des
cellules bactériennes aux molécules de substrats hydrophobes et les métaboliser
(Barathi et Vasudevan, 2001).
D’un autre côté, des valeurs plus élevées de la tension superficielle sont atteintes (56 et
59 mN/m) par les deux autres souches S5 et S3 respectivement ce résultat peut être
expliqué par une absence de production de biosurfactants ou bien une quantité
insuffisante à réduire la tension superficielle, si on les compare aux autres souches S7,
Résultats et discussion
114
S8, S9 et S2. En effet, un nombre limité de bactéries impliquées dans la
biodégradation des hydrocarbures est capable de produire des biosurfactants connus.
Les micro-organismes qui dégradent les hydrocarbures produisent des substances
tensioactives, et certains d’entre eux permettent la stabilité de l’huile ou les phases
hydrophobes dans l’émulsion.
Ces micro-organismes peuvent être divisés en deux catégories :
- Une qui produit les biosurfactants à faible poids moléculaire mais
habituellement ne font pas des émulsions stables,
- L’autre qui produit des biosurfactants qui agissent principalement en tant que
stabilisateurs d’émulsions sans affecter la tension superficielle (Silva
et al., 2010).
La croissance sur des substrats pétroliers a été très souvent associée à la capacité des
micro-organismes à produire des molécules tensioactives appelées encore
biosurfactants (Gerson et Zajic, 1979;Cooper et Zajic, 1980; Boulton et Ratledge,
1984). Cependant, la croissance d’un micro-organisme sur substrat hydrophobe et la
production de biosurfactants ne sont pas nécessairement liées, car les rôles
physiologiques des biosurfactants sont divers (Vandecasteele, 2005).
Résultats et discussion
115
10.5. Le suivi de biodégradation par spectroscopie infrarouge
Tableau 13: Fréquences d’absorption caractéristiques de quelques groupements
organiques (Jacob, 2010)
Résultats et discussion
116
Figure 59 : Spectre infrarouge de pétrole brut
Comme l’illustre le spectre IRTF dans la figure 59, et en comparant avec le tableau 13
récapitulatif des fréquences d’absorption caractéristiques de quelques groupements
organiques et les données de Dragan et Fitch (1998), on constate que notre échantillon
de pétrole brut est composé principalement des alcanes en se basant sur les fortes
absorptions de C-H, qui correspondent aux trois pics situés dans l’intervalle :
2962-2853 cm-1, suivi par les groupements CH2 et CH3 correspond à des bandes
d’absorption : 2921,61, 2853,35, 1458,50 et 1377,01 cm-1 respectivement.
La déformation du cycle présente des bandes d’absorptions à 430-580 cm-1 d’après
Dragan et Fitch (1998); ce qui indique que notre échantillon de pétrole brut contient
des alcanes cycliques correspondent aux bandes : 439,21, 464,99 et 523,50cm-1.
Toutefois, le pétrole brut contient une partie importante de composés aromatiques
comme l’illustre le pic d’absorption aux alentours de 1600cm-1. Ainsi, les pics :
873,46, 807,11, 866,18 et 674,43 cm-1. Finalement on remarque un pic vers 419,84
correspondant au groupement C-OH (Figure 57).
C:\Program Files\OPUS_65\MEAS\Petrole Brut.0 Petrole Brut Instrument type and / or accessory 26/10/2014
2954
.51
2921
.61
2853
.35
1606
.84
1458
.16
1377
.01
1034
.12
873.
4680
7.11
766.
1872
3.42
674.
4359
6.53
523.
5046
4.99
439.
2141
9.84
394.
8638
4.27
500100015002000250030003500
Wavenumber cm-1
6065
7075
8085
9095
100
Tra
nsm
ittan
ce [
%]
Seite 1 von 1
Résultats et discussion
117
Figure 60 : Spectre infrarouge de la souche S2 et sa superposition avec celui du
pétrole brut
H:\youcef\Petrole Brut.0 Petrole Brut Instrument type and / or accessory
H:\youcef\S2.1 S2 Instrument type and / or accessory
26/10/2014
12/01/2015
33
50.4
1
32
00.7
5
29
54.4
12
921.7
32
853.3
0
16
57.7
6
15
91.2
8
15
16.4
21
459.1
3
13
76.7
11
310.8
01
273.9
11
243.7
51
214.8
81
145.1
61
097.1
81
030.5
79
86.1
39
47.7
39
16.5
18
13.1
67
25.9
66
73.8
66
34.5
46
00.2
15
21.8
84
75.5
24
38.1
63
98.0
4
500100015002000250030003500
60
80
100
29
54.5
129
21.6
128
53.3
5
14
58.1
6
13
77.0
1
10
34.1
2
80
7.1
176
6.1
872
3.4
267
4.4
3
52
3.5
046
4.9
943
9.2
141
9.8
4
500100015002000250030003500
60
80
100
Wavenumber cm-1
Tra
nsm
itta
nce
[%
]
Seite 1 von 1
H:\youcef\Petrole Brut.0 Petrole Brut Instrument type and / or accessory
H:\youcef\S2.1 S2 Instrument type and / or accessory
26/10/2014
12/01/2015
500100015002000250030003500
Wavenumber cm-1
6065
7075
8085
9095
100
Tra
nsm
ittan
ce [
%]
Seite 1 von 1
Résultats et discussion
118
L’examen direct des spectres de pétrole brut et celui de la souche S2 montre une nette
différence d’allure notamment concernant les pics : 2951,51 et 2954,51 ; 1034,12 et
1030,57 ; 807,11 et 813,16 ; 766,18 et 725,96 ; 464,99 et 475,52 cm-1. Tandis qu’on
remarque l’émergence de nouveaux pics d’absorption cités dans le tableau 14 qui
témoignent l’activité métabolique de la souche. Ces changements sont inclus dans la
région d’empreinte digitale de produit, donc on peut déduire que Pseudomonas
aeruginosa a utilisé les alcanes, les alcanes cycliques et les aromatiques pour son
métabolisme.
Tableau 14 : Nouveaux pics et leurs groupements appropriés.
Pics (Cm-1) Fréquence de groupe Wavenumber (Cm-1)
Groupements Références
3350.41 3200.75 1677.76 1591.28 1273.91 1243.75 1214.88 1145.16 1097.18 986.13 916.51 813.01 634.54 600.21
3570-3200 3400-3200 1680-1630 1610-1580 1340-1250 1270-1230
1200 1150
1190-1080 995-985 995-885 810-820 720-590 720-590
OH OH
Amide Acide carboxylique Amine tertiaire ; CN
Aromatique éther ɸ-O-H C-O C-O
-OCN et C-OCN C-H C-H
Alcanes Alcool, OH Alcool, OH
Bataille et ENCPB (2002) Bataille et ENCPB (2002) Bataille et ENCPB (2002) Bataille et ENCPB (2002) Bataille et ENCPB (2002) Bataille et ENCPB (2002) Bataille et ENCPB (2002) Bataille et ENCPB (2002) Jacob (2010) Bataille et ENCPB (2002) Bataille et ENCPB (2002) Bataille et ENCPB (2002) Bataille et ENCPB (2002) Bataille et ENCPB (2002)
La spécificité des substrats à l’attaque microbienne a été largement étudiée. Atlas
(1981) et Leahy et Colwell (1990) ont classé les composés du pétrole en quatre familles:
les hydrocarbures saturés, les aromatiques, les asphaltènes (phénols, acides gras,
kétones, esters et porphyrines) et les résines (pyridines, quinolines, carbazoles,
sulfoxides, et amides). Ces composés diffèrent par leur susceptibilité à l’attaque
microbienne. Ainsi, la vitesse de biodégradation est plus élevée pour les saturés,
viennent ensuite les aromatiques légers, les aromatiques à haut poids moléculaire, les
composés polaires ayant la vitesse de dégradation la plus faible.
Résultats et discussion
119
Figure 61 : Spectre infrarouge de la souche S3 et sa superposition avec celui du
pétrole brut
H:\youcef\Petrole Brut.0 Petrole Brut Instrument type and / or accessory
H:\youcef\S3.0 S3 Instrument type and / or accessory
26/10/2014
12/01/2015
33
50
.56
32
89
.35
29
54
.50
29
21
.67
28
53
.25
16
59
.11
16
06
.12
14
58
.18
13
76
.99
12
73
.38
12
15
.25
11
45
.85
10
98
.55
10
30
.90
98
5.9
8
81
3.0
1
72
3.2
467
4.2
7
59
9.8
252
2.4
847
5.8
643
4.9
439
8.3
5
500100015002000250030003500
60
80
100
29
54.5
12
921.6
12
853.3
5
14
58.1
6
13
77.0
1
10
34.1
2
80
7.1
17
66.1
87
23.4
26
74.4
3
52
3.5
04
64.9
94
39.2
14
19.8
4
500100015002000250030003500
60
80
100
Wavenumber cm-1
Tra
nsm
itta
nce [
%]
Seite 1 von 1
H:\youcef\Petrole Brut.0 Petrole Brut Instrument type and / or accessory
H:\youcef\S3.0 S3 Instrument type and / or accessory
26/10/2014
12/01/2015
500100015002000250030003500
Wavenumber cm-1
6065
7075
8085
9095
100
Tran
smitt
ance
[%]
Seite 1 von 1
Résultats et discussion
120
Tableau 15 : Nouveaux pics et leurs groupements appropriés.
Pics (Cm-1) Fréquence de groupe
Wavenumber (Cm-1) Groupements Références
3350.56
3289.35
1659.11
1606.12
1273.38
1215.25
1145.85
1098.55
985.98
813.01
3570-3200
3400-3200
1680-1630
1650-1550
1350-1260
1200
1150
1190-1080
995-985
810-820
OH
OH
Amide
Acide carboxylique
OH
C-O
C-O
-OCN et C-OCN
C-H
Alcanes
Bataille et ENCPB (2002)
Bataille et ENCPB (2002)
Dragan et Fitch (1998)
Bataille et ENCPB (2002)
Bataille et ENCPB (2002)
Bataille et ENCPB (2002)
Bataille et ENCPB (2002)
Bataille et ENCPB (2002)
Bataille et ENCPB (2002)
Jacob (2010)
C’est grâce à la spectroscopie IRTF-ATR, qu’il est possible de faire une distinction
entre les fonctions organiques, et en comparant les deux spectres dans la figure 61, on
peut noter une modification de quelques bandes d’absorption (1034,12 par 1030,90 ;
807,11 par 813,01 ; 523,50 par 599,82 ; 464,99 par 475,25 ; 439,99 par 434,94 cm-1),
et la disparition d’autres telles (766.18 et 419.84cm-1). Cet indice observé témoigne
l’activité métabolique de Staphylococcus aureus qui avait utilisé comme substrat en
plus des hydrocarbures aliphatiques qui sont les plus faciles à dégrader des
cycloalcanes, ainsi que l’apparition de nouveaux pics d’absorption cités
dans le tableau 15 confirmant ainsi l’incorporation d’atomes d’oxygène
donc un métabolisme oxydatif.
Résultats et discussion
121
Figure 62 : Spectre infrarouge de la souche S5 et sa superposition avec celui du
pétrole brut
L’allure des deux spectres dans la figure 62 indique une différence caractérisée par
l’apparition d’une nouvelle bande d’absorption vers 3324,98 cm-1 et une deuxième 876,18
cm-1correspondant aux groupements: OH, C-O-O- respectivement. On note également une
modification au niveau des différents pics qui font ressortir les groupements dans
l’échantillon de pétrole brut notamment : 464,99 par 474,26 ; 439,21 par 421,27 ; 419,84
par 409,69 cm-1, ainsi que la disparition de la bande d’absorption 523,50 cm-1, donc
Providencia redjirri a ciblé surtout les alcanes cycliques.
H:\youcef\Petrole Brut.0 Petrole Brut Instrument type and / or accessory
H:\youcef\S8.0 S8 Instrument type and / or accessory
26/10/2014
12/01/2015
3324
.98
2954
.38
2921
.65
2853
.22
1606
.00
1458
.27
1377
.19
1032
.32
876.
76
806.
0376
6.88
722.
6867
5.05
474.
2644
9.96
421.
2740
9.69
500100015002000250030003500
6080
100
2954
.51
2921
.61
2853
.35
1458
.16
1377
.01
1034
.12
807.
1176
6.18
723.
4267
4.43
523.
5046
4.99
439.
2141
9.84
500100015002000250030003500
6080
100
Wavenumber cm-1
Tran
smitt
ance
[%]
Seite 1 von 1
H:\youcef\Petrole Brut.0 Petrole Brut Instrument type and / or accessory
H:\youcef\S8.0 S8 Instrument type and / or accessory
26/10/2014
12/01/2015
500100015002000250030003500
Wavenumber cm-1
6065
7075
8085
9095
100
Tran
smitta
nce [
%]
Seite 1 von 1
Résultats et discussion
122
Figure 63 : Spectre infrarouge de la souche S7 et sa superposition avec celui du
pétrole brut
H:\youcef\Petrole Brut.0 Petrole Brut Instrument type and / or accessory
H:\youcef\S7.0 S7 Instrument type and / or accessory
26/10/2014
12/01/2015
29
54.2
12
921
.60
28
53.1
6
16
06.7
3
14
58.1
4
13
77.0
3
11
48.7
5
10
32.8
4
87
3.7
58
09.
18
76
7.4
07
22.
95
67
4.8
5
57
8.2
75
64.
94
47
1.6
24
26.
39
500100015002000250030003500
60
8010
0
29
54.5
12
921
.61
28
53.3
5
14
58.1
6
13
77.0
1
10
34.1
2
80
7.1
17
66.
18
72
3.4
26
74.
43
52
3.5
04
64.
99
43
9.2
14
19.
84
500100015002000250030003500
6080
100
Wavenumber cm-1
Tra
nsm
ittanc
e [%
]
Seite 1 von 1
H:\youcef\Petrole Brut.0 Petrole Brut Instrument type and / or accessory
H:\youcef\S7.0 S7 Instrument type and / or accessory
26/10/2014
12/01/2015
500100015002000250030003500
Wavenumber cm-1
6065
707
580
8590
9510
0
Tra
nsm
ittan
ce [
%]
Seite 1 von 1
Résultats et discussion
123
Concernant Pseudomonas luteola, en comparant les deux spectres dans la figure 63,
on remarque un changement au niveau des bandes d’absorption : 1034,2 par 1032,82 ;
523,50 par 578,27 ; 439,21 et 471,62 ; 419,84 et 426,39 cm-1avec apparition d’un
nouveau pic : 873,75 cm-1 ; correspond à un groupement C-O-O-. Donc, on peut dire
que la souche S7 a une activité métabolique des hydrocarbures aliphatiques, mais
moins importante que les souches S2, S3et d’une façon remarquable.
D’après Berthe-Corti et Höpner (2005), les micro-organismes hydrocarbonoclastes,
en général, ont une capacité de dégradation spécifique d’un groupe d’hydrocarbures
(alcanes, aromatiques). Selon ces mêmes auteurs la capacité de certaines espèces
à dégrader les aromatiques n’implique pas automatiquement que ces espèces puissent
dégrader les alcanes, et inversement.
Résultats et discussion
124
Figure 64 : Spectre infrarouge de la souche S8 et sa superposition avec celui du
pétrole brut
H:\youcef\Petrole Brut.0 Petrole Brut Instrument type and / or accessory
H:\youcef\S5.0 S5 Instrument type and / or accessory
26/10/2014
12/01/2015
3351.0
0
2954.5
92921.8
52852.9
7
1632.8
2
1458.0
6
1377.0
2
1260.7
3
871.9
6804.7
6766.7
9740.6
4722.0
1632.8
5610.5
6593.2
9561.8
1513.7
6472.7
1452.5
7442.6
2434.5
2398.0
2
500100015002000250030003500
60
80
100
2954.5
12921.6
12853.3
5
2001.4
9
1458.1
6
1377.0
1
1034.1
2
873.4
6
807.1
1766.1
8723.4
2674.4
3
523.5
0464.9
9439.2
1419.8
4
500100015002000250030003500
60
80
100
Wavenumber cm-1
Tra
nsm
itta
nce [
%]
Seite 1 von 1
Résultats et discussion
125
En comparant les deux spectres indiqués sur la figure 64, on observe une différence
remarquable des bandes d’absorption entre le pétrole brut et ce dernier après addition
de la souche S8, notamment les pics : 2951,51 et 2954,59 ; 873,48 et 871,96 ; 525,50
et 593,29 ; 464,99 et 472,71 ; 419,84 et 442,62, ainsi que la disparition du pic :
1034,12 qui représente les groupements ciblés par Burkholderia cepacia : alcanes,
aromatiques, alcanes cycliques et cyclohexanes. Les nouvelles bandes d’absorption
sont apparues et celles-ci sont mentionnées dans le tableau 15, et représentent les
produits de dégradation avec présence d’oxygène (O2).
Les hydrocarbures cycliques constituent une fraction importante des hydrocarbures
dans la plupart des bruts pétroliers. Ils sont plus difficilement dégradables à cause de
leur toxicité suite à l’interaction avec la membrane cellulaire des micro-organismes
(Sikkema et al., 1994, 1995).
Les expériences montrent de façon non équivoque que la biodégradation des
cycloalkanes est très limitée (Atlas, 1981). La non accumulation des hydrocarbures
cycliques dans l’environnement, implique des phénomènes non conventionnels de
dégradation telle que l’intervention des phénomènes de co-oxydations impliquant
plusieurs souches microbiennes dont l’équipement enzymatique est complémentaire
(Bertrand et al., 1983; Perry, 1979; Rontani et al., 1985; Leahy et Colwell, 1990).
Tableau 16 : Nouveaux pics et leurs groupements appropriés.
Pics (cm-1) Fréquence de groupe Wavenumber (Cm-1)
Groupements Références
3351.00 1632.82 1260.73 610.56 561.81 513.76
3400-3200 1550-1650 1270-1230 720-590 720-590 465-550
O-H Acide carboxylique
Aromatique éther ɸ-O-H Alcool Alcool C-C=O
Bataille et ENCPB (2002) Dragan et Fitch (1998) Bataille et ENCPB (2002) Bataille et ENCPB (2002) Bataille et ENCPB (2002) Dragan et Fitch (1998)
Résultats et discussion
126
Figure 65 : Spectre infrarouge de la souche S9 et sa superposition avec celui du
pétrole brut
H:\youcef\Petrole Brut.0 Petrole Brut Instrument type and / or accessory
H:\youcef\S9.0 S9 Instrument type and / or accessory
26/10/2014
12/01/2015
295
4.09
292
1.35
285
2.79
160
6.69
145
8.09
137
6.89
101
9.84
875
.50
805
.39
767
.20
741
.17
722
.57
698
.13
466
.01
428
.34
409
.11
380
.65
500100015002000250030003500
60
80100
2954.5
129
21.6
128
53.3
5
1606.8
4
1458.1
6
1377.0
1
1034.1
2
807.1
176
6.1
872
3.4
2
674.4
3
523.5
0
464.9
943
9.2
141
9.8
4
500100015002000250030003500
6080
100
Wavenumber cm-1
Tra
nsm
ittanc
e [%
]
Seite 1 von 1
H:\youcef\Petrole Brut.0 Petrole Brut Instrument type and / or accessory
H:\youcef\S9.0 S9 Instrument type and / or accessory
26/10/2014
12/01/2015
500100015002000250030003500
Wavenumber cm-1
6065
7075
8085
9095
100
Tra
nsm
ittan
ce [
%]
Seite 1 von 1
Résultats et discussion
127
Les deux spectres consignés dans la figure 65 ont la même allure, mais en comparant
les pics d’absorption au niveau de la région d’empreinte digitale de ces deux spectres,
il ressort un changement des bandes d’absorption : 1034,12 et 1019,84 ; 523,5
et 466,01 ; 464,99 et 428,34 ; 439,21 et 409,21 cm-1. Avec la disparition du dernier
pic : 419,84 cm-1.Cette image spectrale peut être expliquée par l’utilisation
préférentielle des alcanes cycliques par Burkholderia gladioli pour son métabolisme
oxydatif confirmé par l’apparition des nouveaux pics : 875.50 et 741.17 cm-1
qui représentent les groupements C-O-O- et OH respectivement.
Résultats et discussion
128
Figure 66 : Spectre infrarouge de consortium et sa superposition avec celui du
pétrole brut
H:\youcef\Petrole Brut.0 Petrole Brut Instrument type and / or accessory
H:\youcef\C.1 C Instrument type and / or accessory
26/10/2014
12/01/2015
2954.1
42921.3
22852.9
4
1607.8
5
1458.0
0
1376.9
3
1261.3
4
964.5
4
872.6
8805.4
9767.2
8722.3
7674.9
3567.8
4478.0
1465.7
4450.4
4418.7
8
500100015002000250030003500
60
80
100
2954.5
12921.6
12853.3
5
2001.4
9
1458.1
6
1377.0
1
1034.1
2
807.1
1766.1
8723.4
2674.4
3
523.5
0464.9
9439.2
1419.8
4
500100015002000250030003500
60
80
100
Wavenumber cm-1
Tra
nsm
itta
nce [
%]
Seite 1 von 1
H:\youcef\Petrole Brut.0 Petrole Brut Instrument type and / or accessory
H:\youcef\C.1 C Instrument type and / or accessory
26/10/2014
12/01/2015
500100015002000250030003500
Wavenumber cm-1
6065
7075
8085
9095
100
Tra
nsm
ittan
ce [
%]
Seite 1 von 1
Résultats et discussion
129
Pour comprendre la réaction de consortium des six bactéries sélectionnées vis-à-vis
des différentes classes d’hydrocarbures qui composent le pétrole brut, en comparant
les deux spectres (cf. fig. 66), on observe bien l’apparition des nouveaux pics :
2001,34 ; 1261,34 et 872,68 cm-1 correspondant aux fonctions : l’ion cyanure, l’ion
thiocyanate ou d’ions liés, tandis que le troisième revient au groupement HO.
Ce résultat peut être expliqué par la sécrétion des substances résultantes de l’activité
métabolique exercée par les bactéries de consortium, ainsi l’incorporation d’atomes
d’oxygènes révélée par l’émergence de groupement HO qui témoigne de leur
métabolisme oxydatif. On note également des changements aux niveaux des bandes
d’absorption situées dans l’intervalle de l’empreinte digitale.
On peut donc dire que le consortium des six bactéries a des réactions remarquables sur
les classes d’hydrocarbures notamment les alcanes, les cycloalcanes et les aromatiques
avec sécrétion des métabolites qui sont le résultat de l’attaque bactérienne
de substrat (hydrocarbure).
Head et al., (2006) relèvent qu’a un premier consortium bactérien capable
de métaboliser les molécules les plus simples succède plusieurs autres consortiums
capables de dégrader des molécules de plus en plus complexes (par exemple les
hydrocarbures aromatiques polycycliques HAP), où on peut classer notre consortium
bactérien. Ce résultat observé se traduit par une alternance de différents groupes
bactériens qui se poursuit jusqu’à l’élimination quasi-complète des hydrocarbures.
Ce travail souligne, ainsi, l’efficacité de la caractérisation et l’étude des espèces
bactériennes impliquées dans la régulation de l’activité de dégradation
des hydrocarbures pétroliers en milieu pélagique.
Les hydrocarbures aromatiques constituent généralement 10 à 30 % des hydrocarbures
totaux d’un brut pétrolier (Bertrand et Miller, 1989). Des études sur la transformation
de ces hydrocarbures par les micro-organismes ont montré leur toxicité cellulaire
(Sikkema et al., 1995). La structure moléculaire de ces substrats détermine la vitesse
de leur dégradation: un grand nombre de substituants « méthyle » empêche l’oxydation
initiale (Cooney et Summers, 1976; Atlas et al., 1981).
Résultats et discussion
130
Les asphaltènes et les résines constituent une faible partie du pétrole brut, 1 à 5 % du
pétrole léger, alors qu’un pétrole lourd peut contenir plus de 25 % d’asphaltènes
et 20 % de résines, cette dernière classe de composés pétroliers n’est pas
biodégradable ou très lentement dégradable. La biodégradabilité des pétroles bruts est
très fortement dépendante de leur composition (Atlas, 1975). Selon ce dernier auteur, à
une température déterminée, un pétrole léger est plus susceptible d’être biodégradé
qu’un pétrole lourd.
10.6. Le suivi de biodégradation par spectroscopie UV
Nous avons ciblé dans cette partie les HAP parmi les hydrocarbures de notre
échantillon de pétroles brut pour deux raison :
La première c’est une confirmation des résultats de la spectroscopie
infrarouge consternant les isolats qui ont pu attaquer les hydrocarbures aromatiques ;
La deuxième parce-que les HAP sont des composés récalcitrants, toxiques pour
l’homme et l’environnement.
Dans cette optique, la spectrophotométrie UV pourrait être une bonne méthode de
caractérisation, puisque d’une part, les HAP qui ont un caractère aromatique absorbent
dans le domaine UV -visible et, d’autre part, cette méthode a fait ses preuves dans de
nombreux domaines (El Khorassani, 1998; Vaillant, 2000).
200 250 300 350 400 450 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
20
0
22
5
26
0
Abso
rban
ce
Longueur d'Onde nm
Echantillon Brute
200 250 300 350 400 450 500
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
20
5 22
5
26
0
Abso
rban
ce
Longueur d'Onde nm
Echantillon C
Figure 67 : Spectres UV de pétrole brut et celui de consortium bactérien
Résultats et discussion
131
200 250 300 350 400 450 500
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
200
230
260A
bso
rba
nce
Longueur d'onde nm
Echantillon S2
200 250 300 350 400 450 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
20
0
22
5
26
0
Abso
rbance
Longueur d'Onde nm
Echantillon S3
200 250 300 350 400 450 500
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
20
0
22
5
26
0
Abso
rban
ce
Longueur d'Onde nm
Echantillon S5
200 250 300 350 400 450 500
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
20
0
22
5
26
0Abso
rban
ce
Longueur d'Onde nm
Echantillon S7
200 250 300 350 400 450 500
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
195
205
225
260
Absorb
an
ce
Longueur d'Onde nm
Echantillon S8
200 250 300 350 400 450 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
200
225
260
Ab
sorb
an
ce
Longueur d'Onde nm
Echantillon S9
Figure 68 : Spectres UV des isolats sélectionnés (S2, S3, S5, S7, S8 et S9)
Résultats et discussion
132
D’après le spectre UV de pétrole brut dans la figure 67, on peut remarquer trois pics
distincts, chaque bande d’absorption correspond à un hydrocarbure aromatique. Donc
notre échantillon de pétrole selon Magalie (2013) contient le Benzène (200 nm) un
seul cycle aromatique, l’Acénaphtène (225 nm) 3 cycles aromatiques et le Chrysène
(260 nm) 4 cycles aromatiques.
En comparant les pics d’absorption dans les différents spectres des isolats, on confirme
les résultats des spectres infrarouge indiquent que les hydrocarbures aromatiques ont
été attaqués par Pseudomonas aéruginosa et Burkhoderia cepacia.
Pour Pseudomonas aéruginosa, on relève une modification du deuxième pic : 225 par
230 nm ; donc S2 a utilisé l’Acénaphtène pour son métabolisme, alors que
Burkhoderia cepacia a pu métaboliser le Benzène, parce qu’un changement
s’est opéré de la bande d’absorption passant de 200 à 190 nm. Ainsi, faisant apparaître
un nouveau pic 205 nm.
La modification du pic 200 par 205 nm confirme l’attaque des bactéries du consortium
du Benzène.
Conclusion
&
Perspectives
Conclusion et perspectives
133
Conclusion et perspectives
En terme quantitatif, le pétrole brut est un des polluants organiques les plus répandus
dans les environnements côtiers du fait de la concentration importante des activités
humaines dans ces zones (stockage, transport, activités industrielles)
(Head et Swannel, 1999).
Des études d’impact sur l’environnement ont révélé les effets perturbateurs de cette
pollution sur les milieux récepteurs. Des informations sur leurs propriétés et surtout la
biodégradation de ces hydrocarbures sont nécessaires pour le choix et l’application
d’un traitement efficace ou pour le contrôle de l’atténuation naturelle (Gallego et al.,
2001 ; Salanitro, 2001). Si le rôle des bactéries est essentiel dans les cycles
biogéochimiques en milieu marin, elles jouent un rôle également très important dans la
réaction des écosystèmes aux impacts anthropiques (Head et Swannel, 1999).
L’objectif de notre étude est de contribuer à la biodégradation du pétrole brut à l’aide
des micro-organismes isolés de l’eau de mer. Pour se faire, des bactéries marines
ont été isolées, purifiées et identifiées.
Afin de mener à bien nos travaux, nous avons réalisé une étude préliminaire
concernant, d’une part, la sélection des meilleures bactéries qui se cultivent en
présence de pétrole brut comme seule source de carbone, pour une bonne
compréhension des conditions optimales du processus de biodégradation des
hydrocarbures dans le milieu marin. Pour cela, nous avons procédé à l’étude de l’effet
de quelques paramètres abiotiques comme la température, le pH, différentes
concentrations de pétrole, les antibiotiques et, les métaux lourds et d’autre part
l’évaluation de la biodégradation de pétrole par les bactéries sélectionnées.
L’ensemble des résultats que nous avons obtenus se résume ainsi :
Les résultats d’isolement bactérien à partir des prélèvements de l’eau de mer
contaminé, a permis d’isoler neuf espèces bactériennes.
Le calcul des paramètres de cinétique révèle que les bactéries : S2, S3, S5, S7, S8
et S9 présentent des taux de croissance élevés qui sont respectivement : µ= 0.97, 0.63,
0.43, 0.69, 0.90 et 0.98.
Conclusion et perspectives
134
En se basant sur leurs caractères microscopiques, macroscopiques, biochimiques
et physiologiques, nous avons pu rapprocher les souches comme suit :
S2: Pseudomonas aeruginosa, S3: Staphylococcus aureus, S5: Providentia rettgiri,
S7: Pseudomonas luteola, S8: Burkholderia cepacia, S9: Burkholderia gladioli.
L’étude de l’effet du pH et de la température a montré une influence sur la croissance,
avec des optimums de pH ente (6 et 8) à T°=25°C. Sur la base des résultats obtenus on
a pu constater que les bactéries marines hydrocarbonoclastes isolées peuvent tolérer
jusqu’à 20% de pétrole.
Concernant le profil de résistance, les résultats indiquent que la capacité de nos
souches à dégrader le pétrole brut est associée à une résistance multiple aux métaux
lourds et /ou antibiotiques, à cela rien de bien singulier puisque les polluants
organiques, les métaux lourds et les antibiotiques sont fréquemment présents dans les
secteurs proches des zones urbanisées (Bouchez et al., 2000).
Le suivi de l’évolution de la tension superficielle des souches montre qu’elles ont la
capacité de réduire la tension superficielle du milieu de culture jusqu’à atteindre
les 36 mN/m. Ce résultat permet de suggérer qu’il y a eu production de biomolécules
ayant des propriétés tensio-actives confirmés par des index d’émulsion qui peuvent
atteindre 51%.
La biodégradation du pétrole brut était optimale avec les souches S3 et S7,
et spécialement les souches S2 et S8 qui ont pu métaboliser les alcanes, les
cycloalcanes et les hydrocarbures aromatiques d’une façon remarquable, d’après les
bandes d’absorption des spectres infrarouges, suivi par les souches S5 et S9 avec une
biodégradation non négligeable.
On a confirmé l’efficacité de l’utilisation d’un consortium concernant l’attaque des
différentes classes d’hydrocarbures, mais le rendement était toujours plus important
avec Pseudomonas aeruginosa et Burkholderia cepacia.
On peut donc conclure que les différents constituants de pétrole sont intrinsèquement
biodégradables, mais à des degrés variables et appropriés aux différentes espèces
des bactéries hydrocarbonoclastes utilisées.
Conclusion et perspectives
135
En perspective, il serait souhaitable de compléter cette étude par une approche
plus approfondie, à savoir :
Approfondir nos recherches actuelles selon deux axes principaux, à savoir
l’analyse phylogénétique et physiologique des souches les plus résistantes
aux hydrocarbures, aux métaux et aux antibiotiques ;
Caractérisation des mécanismes impliqués dans la dégradation du pétrole brut,
la transformation des métaux lourds et la résistance aux antibiotiques ;
La valorisation des métabolites sécrétés par les bactéries hydrocarbonoclastes
(biosurfactants), et leurs exploitation pour améliorer la biodégradation ;
L’étude des propriétés physicochimiques des biosurfactants produits par les
bactéries hydrocarbonoclastes, pour mieux connaître leur nature, leur structure
et leur mode d’action ;
Effectuer un essai de bioremédiation d’un site pollué.
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Annexes
Annexe I: Milieux de culture et réactifs
A. composition de milieux de culture
1. Milieux Bushnell-Haas medium :
Ingrédients Quantité
K2HPO4 1,00g
MgSO4 0.20 g
NH4NO3 1,00 g
CaCl2 0,02 g
FeCL3 0.05 g
KH2Po4 1,00 g
Eau distillée 1000 ml
pH 7,00
3. Gélose nutritive :
Ingrédients Quantité
Extrait de viande 1,0g
Extrait de levure 2,0g
Peptone 5,0g
Chlorure de sodium 5,0g
Agar 15,0g
Eau distillée 1000 ml
pH 7,4
2. Gélose marine
Ingrédients Quantité
Peptone 5,00g
Extrait de levure 1,00 g
Citrate ferrique 0,10 g
Sodium chlorure 19,45 g
Magnésium chlorure 8,80 g
Sulfate de sodium 3,24 g
Calcium chlorure 1,80 g
Potassium chlorure 0,55 g
Sodium bicarbonate 0.16 g
Potassium bromure 0,08 g
Strontium chlorure 0,034
Acide borique 0,022
Silicate de sodium 0,004 g
Sodium fluorure 0,0024 g
Nitrate d'ammonium 0, 0016 g
Disodium phosphate 0,008 g
Agar 15,0 g
Eau distillée 1000 ml
pH 7,00
5. Bouillon nutritive :
Ingrédients Quantité
Peptone 5,00 g
Extrait de viande de bœuf 3,00 g
Eau distillée 1000 ml
pH 7.20
4. Cétrimide Agar :
Ingrédients Quantité
Peptone de gélatine 20.0 g
Chloride de magnésium 1.4 g
Sulfate de potassium 10.0 g
Glycérol 10.0 ml/l
Cetrimide 0.3 g
Agar 13.0 g
Eau distillée 1000 ml
pH 7.2
Gélose Hektoen
Composition Quantité
Protéose peptone 12g
Extrait de levure 3g
Chlorure de sodium 5g
Thiosulfate de sodium 5g
Sels biliaires 9g
Citrate de fer III et d'ammonium 1,5g
Salicine 2g
Lactose 12g
Saccharose 12g
Fuschine acide 0,1g
Bleu de bromothymol 0,065g
Agar 14g
Eau distillée (qsp) 1000 ml
pH 7.4
Gélose hypersalée au mannitol (Chapman)
Composition Quantité
Peptone 11.0 g
Extrait de viande 1.0 g
Chlorure de sodium 75.0 g
Mannitol 10.0 g
Agar 15.0 g
Rouge de phénol
(solution sodique à 0.25%)
20 ml
Eau distillée 1000 ml
pH 7.6
6. Milieu king A :
7. Milieu king B :
Composition Quantité
Peptone dite "B" 20.0 g
Glycérol 10.0 g
Hydrogénophosphate de potassium 1.5 g
Sulfate de magnésium heptahydraté 1.5g
Agar 12.0 g
Eau distillée 1000 ml
pH 7.2
Composition Quantité
Peptone dite "A" 20.0 g
Glycérol 10.0 g
Sulfate de potassium 10.0 g
Chlorure de magnésium 1.4 g
Agar 12.0 g
Eau distillée 1000 ml
pH 7.2
Milieu semi-solide Muller-Hinton (MH)
8. Milieu gélose viande foie :
Ingrédients Quantité
Peptone 5,00 g
Extrait de viande de bœuf 3,00 g
Peptone pepsique de viande et de foie 30g
Glucose 2 g
Agar 6 g
Eau distillée 1000 ml
pH 7.40
B. Réactifs et solutions
- Alcool,
- Disques d’oxydases,
- Eau distillée,
- Eau oxygénée 10 V,
- Fuchsine,
- Pétrole brut
- Huile de vaseline,
- Huile à immersion,
- Poudre de Zinc,
- Réactifs de Kovacs,
- Solution de lugol,
Composition Quantité
Infusion de viande de bœuf 300 ml
Peptone de caséine 17,5 g
Amidon de maïs : 1,5 g
Eau distillée 1000 ml
Agar 17,0 g
pH 7,4
- Violet de gentiane,
- HCl,
- NaOH,
- Réactif de TDA,
- Réactif VP 1 et VP 2.
Annexe II : Techniques d’identification et résultats
a. Coloration de Gram
D’après SINGLETON(1999), la coloration de Gram s’effectue selon les étapessuivantes :
- Préparer et fixer un frottis bactérien à la chaleur du bec Bunsen.
- Recouvrir au violet de Gentiane pendant 1 minute. Eliminer l'excès par l'eau courante;
- Ajouter du Lugol : deux bains de 45 secondes, jeter l'excès par l'eau courante;
- Traiter a l'alcool 95° pendant 30 secondes, puis rinçage à l'eau;
- Recolorer à la Fuschine pendant 1à 2 minutes, rinçage à l'eau puis séchage;
- L’observation se fait en ajoutant de l'huile à immersion ; les bactéries Gram positif
secolorent en violet alors que les Gram négatif se colorent en rose.
b. Présentation des galeries API 20NE (d’après la documentation bio-Mérieux).
1 Galerie API 20 NE
API 20 NE est un système standardisé pour l’identification des bacilles à Gram négatif
non entérobactéries et non fastidieux (ex. Pseudomonas, Acinetobacter,
Flavobacterium, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, etc.) combinant 8 tests
conventionnels, 12 tests d’assimilation, et une base de données.
a. Préparation de l’inoculum
• Ouvrir une ampoule d’API NaCI 0.85 % Médium (2 ml)
• A l’aide d’une pipette, prélever 1 à 4 colonies de morphologie identique, par
aspirations ou par touches successives. Utiliser préférentiellement des cultures jeunes
(18-24 heures).
• Réaliser une suspension d’opacité égale à 0.5 de Mc Farland. Cette suspension doit
être utilisée extemporanément.
b. Inoculation de la galerie
• Remplir les tubes (et non les cupules) des tests NO3 à PNPG avec la suspension
précédente en utilisant la pipette ayant servi au prélèvement. Pour éviter la formation
de bulles au fond des tubes, poser la pointe de la pipette sur le côté de la cupule, en
inclinant légèrement la boîte d’incubation vers l’avant.
• Remplir tubes et cupules des tests | GLU| à | PAC| en veillant à créer un niveau
horizontal ou légèrement convexe, mais jamais concave. Des cupules incomplètement
remplies ou trop remplies peuvent entraîner des résultats incorrects.
• Remplir d’huile de paraffine les cupules des trois tests soulignés (GLU, ADH, URE)
pour former un ménisque convexe.
• Refermer la boîte d’incubation et incuber à 29°C ± 2°C pendant 24 heures (± 2
heures).
c. Lecture de la galerie
Après incubation, la lecture de la galerie doit se faire en se référant au Tableau de
Lecture (annexe).
Noter sur la fiche de résultats toutes les réactions spontanées (GLU. ADH. URE, ESC.
GEL, PNPG).
La révélation des deux tests NO3 et TRP doit se faire en mettant les tests d’assimilation
à l’abri d’une contamination par l’air ; pour cela, placer le couvercle de la boite
d’incubation au-dessus de ces tests, pendant la période de révélation des tests NO3 et
TRP.
Test NO3 :
- Ajouter une goutte de réactifs NIT l et NIT 2 dans la cupule NO3.
- Après 5 mn une couleur rouge indique une réaction positive, à noter sur la fiche de
résultats.
- Une réaction négative peut être due à la production d’azote (éventuellement signalée
par la présence de microbulles) ; ajouter 2-3 mg de réactif Zn dans la cupule NO3.
- Après 5 mn, une cupule restée incolore indique une réaction positive à noter sur la
fiche de résultats.
- Si la cupule devient rose-rouge, la réaction est négative car les nitrates encore
présents dans le tube ont alors été réduits en nitrites par le zinc.
- La réaction utilisée pour l’identification de la bactérie est la réduction des nitrates ;
elle est positive si l’une ou l’autre des deux réactions précédentes (production de NO2
ou de N2) est positive.
Test TRP :
Ajouter une goutte de réactif Kovacs. Une couleur rose diffusant dans toute la cupule
indique une réaction positive.
Tests d’assimilation :
Observer la pousse bactérienne. Une cupule trouble indique une réaction positive.
d. Interprétation
L’identification est obtenue à partir du profil numérique.
• Détermination du profil numérique :
Sur la fiche de résultats, les tests sont séparés par groupes de trois et une valeur 1, 2 ou
4 est indiquée pour chacun. En additionnant à l’intérieur de chaque groupe les valeurs
correspondant à des réactions positives, on obtient 7 chiffres ; la réaction de l’oxydase
qui constitue le 21ème test est affectée de la valeur 4 lorsqu’elle est positive.
• Identification :
Elle est réalisée à partir de la base de données (V 6.0)
* à l’aide du Catalogue Analytique :
- Rechercher le profil numérique dans la liste des profils.
* à l’aide du logiciel d’identification :
- Entrer manuellement au clavier le profil numérique à 7 chiffres.(bio-Mérieux ; 2003)
I.2.3.2 La galerie API Staph
API Staph est un système standardisé pour l’identification des genres Staphylococcus,
Micrococcus et Kocuria comprenant des tests biochimiques miniaturisés ainsi qu’une
base de données.
a. Préparation de l’inoculum
Réaliser une préculture sur gélose Columbia au sang 18-24 H à 36°C ± 2°C.
Vérifier l’appartenance de la souche à la famille des Micrococcaceae (morphologie,
Gram, catalase...), ainsi que sa pureté.
Ouvrir une ampoule d’API Staph Medium. Préparer une suspension bactérienne
homogène, d’opacité égale à 0,5 de Mc Farland. Utiliser préférentiellement des
cultures jeunes (18-24 heures). Cette suspension doit être utilisée extemporanément.
b. Inoculation de la galerie
A l’aide d’une pipette, remplir les tubes de la galerie avec API Staph Medium
ensemencé.
Ne remplir que les tubes et non les cupules, sans dépasser le niveau du tube. Pour
éviter la formation de bulles au fond des tubes, poser la pointe de la pipette sur le côté
de la cupule, en inclinant légèrement la boîte d’incubation vers l’avant.
Créer une anaérobiose dans les tests ADH et URE en remplissant leur cupule d’huile
de paraffine pour former un ménisque convexe.
Renfermer la boîte d’incubation.
Incuber à 36°C ± 2°C pendant 18-24 heures.
c. Lecture de la galerie
Après incubation, lire les réactions conformément au Tableau de Lecture en ajoutant
une goutte de chacun des réactifs suivants :
- Test VP : VP 1 et VP 2
Attendre 10 minutes. Une couleur rose franche ou violette indique une réaction
positive. Une couleur rose pâle ou rose claire obtenue après 10 minutes doit être
considérée négative.
- Test NIT : NIT 1 et NIT 2
Attendre 10 minutes. Une coloration rouge indique une réaction positive.
d. Interprétation
L’identification est obtenue à partir du profil numérique.
e. Détermination du profil numérique :
Sur la fiche de résultats, les tests sont séparés par groupes de trois et une valeur 1, 2 ou
4 est indiquée pour chacun. En additionnant à l’intérieur de chaque groupe les valeurs
correspondant à des réactions positives, on obtient 7 chiffres qui constituent le profil
numérique.
f. Identification :
Elle est réalisée à partir de la base de données (V 4.1)
* à l’aide du Catalogue Analytique :
- Rechercher le profil numérique dans la liste des profils.
* à l’aide du logiciel d’identification apiweb TM :
- Entrer manuellement au clavier le profil numérique à 7 chiffres (bio-Mérieux ; 2009).
B. Les résultats
Tableau 1:Les résultats de croissance des souches bactériennes isolées, cultivées sur
milieu BH additionné de 2% de pétrole brut.
Temps heures
Log UFC/ml
de S1
Log UFC/ml
de S2
Log UFC/ml
de S3
Log UFC/ml
de S4
Log UFC/ml
de S5
Log UFC/ml
de S6
Log UFC/ml
de S7
Log UFC/ml
de S8
Log UFC/ml
de S9 0 4,5 3,02 3,02 4,26 3,98 3,98 3,31 3,26 3,01
12 5,56 6,53 5,32 5,24 5,54 4,48 6,48 6,54 6,69 24 6,6 7,83 6,6 6,51 7,83 6,78 7,99 7,99 8,04 36 6,77 7,9 7,72 6,53 7,91 6,85 8,49 8,91 8,87 48 7,2 7,94 7,77 6,55 8,93 6,91 8,94 8,99 8,99 60 7,45 8,01 7,78 5,43 7,77 6,88 9,01 7,77 9,77 72 7,2 8,08 7,9 5,32 7,69 6,85 9,85 9,84 10,04 84 7,05 9,09 8,03 5,27 7,62 6,82 9,99 8,62 10,73 96 6,9 8,11 7,62 5,21 7,6 6,81 10,11 7,84 9,62
108 6,61 8,02 7,61 5,18 7,56 5,77 9,84 7,53 7,7 120 5,74 7,89 7,57 4,16 7,5 4,68 7,99 6,71 7,44
Tableau 2 : Suivi de la concentration bactérienne au cours de la biodégradation de pétrole brut
Jours Log UFC 2 Log UFC 3 Log UFC 5 Log UFC 7 Log UFC 8 Log UFC 9 Log UFC
C
0 3 3,4 2,7 3 3 2,6 3,51 3 8,96 5,43 5,47 8,81 7,95 8,25 7,85 6 7,89 6,46 5,9 8,97 9,18 7,49 7,97 9 7,99 7,73 5,95 7,99 9,17 8,84 8,83
12 7,81 9,98 6,84 8,78 6,85 8,94 6,9 15 9,49 6,49 6,87 8,83 5,6 10,7 6,39 18 9,17 6,4 5,87 8,96 6,1 7,87 5,15 21 8,99 6,29 5,94 7,68 6,82 10,11 7,9
Tableau 3 : Evolution temporelle de l’index d’émulsion
Tableau 4 : Suivi de changement de pH au cours de la biodégradation de pétrole brut
Jours pH de S2 pH de S3 pH de S5 pH de S7 pH de S8 pH de S9 pH de C 3 6,1 6,25 6,48 6 6,2 6,3 6,4 6 6,5 6,4 6,35 6,35 6,4 6,48 6,52 9 6,97 6,99 5,7 5,3 7,3 5,85 4,5
12 5,45 7,01 7,02 6,98 6,85 7,27 6,9 15 6,2 6,9 6,1 6,2 5,6 4,97 6,39 18 5,8 6,52 6,55 6,18 6,1 5,99 5,15 21 6,71 6,41 6,48 6,79 6,82 6,81 6,81
Tableau 5 : Evolution temporelle de la tension superficielle
Jours S2 S3 S5 S7 S8 S9 0 79 79 79 79 79 79 3 70 72 72 69 68 70 6 62 70 71 63 64 65 9 59 69 68 58 59 59
12 58 66 65 57 58 58 15 46 63 61 53 49 57 18 39 61 60 45 43 47 21 36 59 56 38 39 40
Jours S 2 S 3 S 5 S 7 S8 S 9 C
0 10% 10% 10% 10% 10% 10% 10% 3 48% 35% 43% 35% 36% 32% 45% 6 49% 36% 42% 36% 47% 37% 50% 9 49% 36% 43% 49% 49% 38% 51%
12 50% 37% 42% 51% 50% 38% 54% 15 51% 37% 43% 52% 52% 50% 51% 18 52% 37% 43% 55% 55% 50% 51% 21 55% 38% 43% 56% 57% 50% 50%
Tableau 6: Résultats de la Spectroscopie Ultra- violet
Brute S5 S3 C S7 S2 S9 S8
L.O (nm) Peak ABS Peak ABS Peak ABS Peak ABS Peak ABS Peak ABS Peak ABS Peak ABS
190.0 0.346 1.638 1.329 1.673 1.687 1.671 0.297 1.492
195.0 1.526 2.238 0.752 2.283 2.282 2.218 1.494 P 1.897
200.0 P 1.639 P 2.417 P 0.893 2.479 P 2.479 P 2.452 P 1.587 0.870
205.0 1.548 2.218 0.784 P 2.546 2.433 2.296 1.542 P 0.894
210.0 0.519 1.222 0.691 2.434 2.205 1.207 0.524 0.837
215.0 0.737 1.302 0.725 2.486 1.374 1.292 0.742 0.861
220.0 0.931 1.385 0.784 2.592 1.455 1.376 0.936 0.916
225.0 P 1.055 P 1.439 P 0.813 P 2.647 P 2.417 1.436 P 1.059 P 0.944
230.0 1.034 1.408 0.722 1.547 1.518 P 1.437 1.041 0.869
235.0 0.804 1.146 0.452 1.418 1.324 1.253 0.823 0.648
240.0 0.547 0.730 0.304 1.051 0.868 0.904 0.567 0.426
245.0 0.424 0.596 0.229 0.825 0.720 0.691 0.434 0.316
250.0 0.412 0.569 0.225 0.793 0.699 0.652 0.414 0.299
255.0 0.442 0.601 0.244 0.837 0.744 0.685 0.439 0.317
260.0 P 0.454 P 0.605 P 0.245 P 0.842 P 0.746 P 0.691 P 0.449 P 0.322
265.0 0.431 0.565 0.226 0.788 0.693 0.649 0.425 0.304
270.0 0.395 0.516 0.205 0.721 0.628 0.593 0.389 0.278
275.0 0.360 0.471 0.186 0.659 0.571 0.540 0.353 0.253
280.0 0.320 0.423 0.165 0.593 0.512 0.484 0.313 0.227
285.0 0.279 0.376 0.145 0.529 0.455 0.429 0.274 0.201
290.0 0.243 0.337 0.128 0.475 0.407 0.384 0.242 0.179
295.0 0.208 0.300 0.112 0.423 0.363 0.342 0.211 0.160
300.0 0.171 0.258 0.094 0.364 0.312 0.295 0.179 0.138
Publication
Corresponding Author: Khelil F, Environmental Monitoring Network, Department of Biology, Faculty of
Science of the Nature and Live, University of Oran, Algeria. E-mail: [email protected]
JOURNAL OF CURRENT RESEARCH IN SCIENCE (ISSN 2322-5009) CODEN (USA): JCRSDJ 2014, Vol. 2, No. 5, pp: 557-563 Available at www.jcrs010.com
ORIGINAL ARTICLE
CHARACTERIZATION OF HYDROCARBONOCLASTES BACTERIA ISOLATED FROM MARINE WATERS WEST ALGERIA: EVOLUTION ANALYSIS IN PRESENCE OF CRUDE OIL
Khelil F, Matallah-Boutiba A, Chemlal-Kherraz D, Boutiba Z
Environmental Monitoring Network, Department of Biology, Faculty of Science of the Nature and Live, University of Oran, Algeria
ABSTRACT: This work aims at providing methodological approaches to characterize microbial communities in marine pollution by oil and to evaluate the influence of some abiotic factors on the biodegradation activity of oils by bacteria. We have isolated 09 bacteria strains from seawater contaminated by releases of the Arzew refinery (Littoral western Algeria). A phenotypic identification of these strains allowed bringing to Staphylococcus aureus, Micrococcus lylae, Acinetobacter sp, Flavobactérium breve, Pseudomonas aerugenosa, Pseudomonas luteola, Burkholderia cepacia, Burkholderia gladioli and Providensia rettgeri. Six of these strains were selected to measure their ability to grow in the presence of crude oil. To check the mechanism biodegradation of oil, an evolution study of certain parameters such as microbial concentration, pH, temperature and the follow-up of the targeted strains tolerance was approached. The results show that Pseudomonas has a broad spectrum of growth to a pH close to neutrality (6 to 8), while the optimum growth in the majority of species is observed at alkaline pH (10) and optimum temperature growth is observed at 25 °C. Our experiments revealed that the isolated marine hydrocarbonoclastes bacteria could tolerate up to 20% oil. KEYWORDS: bacteria, hydrocarbonoclastes, characterization, biodegradation, contamination, crude oil, seawater, Littoral western Algeria.
INTRODUCTION The contamination of the marine environment, in particular by oil, has a considerable ecological impact and a significant environmental repercussion not only because of the disruption it causes to the marine environment and organisms, but also for the definition criteria of quantitative and qualitative evaluation of substances involved. Oil is a source of pollution of marine environments that can affect the ecological balance and, by extension, economic activities in the polluted areas. Crude oil is a complex mixture contains a large number of distinctively different chemicals and is composed of four mains fractions: saturated hydrocarbons and aromatic hydrocarbons, resins and asphaltenes (Hasanuzzaman et al., 2007). Hydrocarbon are relatively unereative due to lack of functional groups of low water solubility (Hassanshahian et al., 2012). Many damages have been incurred in accidents, releases or deliberate spills, which can cause irreversible ecological disasters. The consequences of this environmental pollution may have a direct or indirect impact on the ecosystems and human health (Gabet, 2004). Knowledge of the effect of pollutants in the environment is essential to develop effective and realistic actions to complex problems. There are
necessary to assess the acceptability of the products towards the environment, and to appreciate perspectives and possibilities of restoration of polluted sites. Biodegradation by natural populations of microorganisms is the basic and the most reliable mechanism by which thousands of xenobiotic pollutants, including crude oil, are eliminated from the environment (Cappello et al., 2007). The effects of environmental conditions on the microbial degradation of hydrocarbons and the effects of hydrocarbon contamination on microbial communities are areas of great interest (Rahman et al., 2004; Cappello et al., 2012). Bioremediation is the strategy to utilize biological activities as much as possible for quick elimination of environmental pollutants. Growth stimulation of indigenous microorganisms, biostimulation, along with inoculation of foreign oil-degrading bacteria is a promising means of accelerating detoxifying and degrading activities at a polluted site with minimum impact on the ecological systems (Cappello et al., 2006). Microorganisms play a crucial role in the evolution of pollutants, particularly in the degradation of petroleum hydrocarbons (Leahy and Colwell, 1990). Numerous studies show that hydrocarbonoclastes microorganisms were
558 Khelil et al., 2014
selected following the contamination (Head and Jones, 2006; Yakimov et al., 2007). The elimination of oil from the marine environment requires the involvement of various biotic and abiotic factors (Soltani, 2004). The effect of oil on microbial communities involves metabolic capacity complex mechanisms; it is depended and influenced by environmental parameters and duration of exposure to pollutants (Yakimov et al., 2004; Bordenave et al., 2007).
MATERIALS AND METHODS This study was conducted at the laboratory of Environmental Monitoring Network (LRSE) at the University of Oran (Algeria) and whose primary purpose is: isolation, purification and identification of the microbial populations from seawater contaminated by fluids released from oil refinery and assess their capacity to degrade them. 2.1. Isolation and identification of strains This step helps to highlight the existing microflora in seawater of industrial area contaminated by fluids releases. The samples originate from the sea water of industrial port of Arzew (Oran west Algeria). 1ml was taken and mixed with 9 ml of mineral medium (Bushnell-Haas medium: BH). This mixture was added of crude oil at a rate of 2% which is considered here as the sole carbon source. The mixture is then incubated at 30°C with stirring at 150 revolutions/min. After the pre-enrichment, we do the seeding marine agar. The incubation was at 30°C during 24 hours. Bacteriological identification of our isolates is mainly based on morphological, physiological and biochemical characterization (using API 20 NE) (Rossello-Mora and Amann, 2001). 2.2. Monitoring the kinetics growth of bacteria isolated We have been tracking the growth isolated bacteria on mineral medium (BH) containing crude oil as the sole source of carbon and energy within the microbial concentration. We measure optical density with a spectrophotometer (OD
600) and a bacterial count on agar medium at regular intervals every 12 hours throughout the fermentation period (120 hours) (Akmousi-Toumi, 2009). The colonies are expressed as UFC/ml. We also calculated the following parameters: - µ = N / t - G = t / N - N = (log UFC0 - log UFC1) / log2 With μ: growth rate t: the doubling time of the number of bacteria N: number of division G: generation time
2.3. Study of the optimum temperature The isolated strains (24 hours old) were inoculated into Erlenmeyer flasks of 250 ml filled with 50 ml of sterile BH medium + 2 % of crude oil. The pH is adjusted to 7. The incubation of 24h is made with rotary stirring rate of 150 revolutions/min at different temperatures (10°C, 15 °C, 20°C, 25°C and 30°C) (Rodrigo et al., 2005). To estimate the optimum temperature, the viability of the cultures was determined by counting on nutrient agar at a temperature of 30°C after 24 to 48 hours of incubation. The colonies are expressed as UFC/ml. 2.4. Study of optimum pH This study was performed with use of 50ml of BH medium in Erlenmeyer flasks of 250 ml supplemented by crude oil as the sole carbon source at a rate of 2 %. The different values of pH (5, 6, 7, 8, 9 and 10) are adjusted by adding NaOH 1M or KCl 1M. The cultures were incubated at 30 ° C with stirring 150tours/min. Growth was checked by counting on nutrient agar (Akmousi-Toumi, 2009). 2.5. Tolerance stem oil According to the method of Fukumaki et al., (1994) were inoculated 2 ml of inoculums in 100 ml sterile BH medium in Erlenmeyer flasks of 500 ml. Then 0 % (control), 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, and 20 % of oil (v / v) the media was covered. Incubation is at 30 ° C under agitation (150 rpm/ min) for 2 days. The counting was done by measuring the optical density (OD600) and by counting on solid GN.
RESULTS 3.1. Isolation and identification of bacterial species Macroscopic study has differentiated 9 strains, distinct by the following characteristics: color, size, shape, contour elevation. To identify the different isolates, the biochemical test was used and the results are summarized in Table (1). S1 strain was straight to the genus Micrococcus because of its cells shaped cocci Gram and catalase positive (Holt et al., 1994; Atlas, 1995; Leyral et al., 1998; Madigan and Martinko, 2007). This strain is strictly aerobic, oxydase positive and to negative mobility based on the results of biochemical tests (Table 1) and colonies that have no pigment and in comparison with those established by Bergey, (1984) and Delarra, (2007) this strain correspond to Micrococcus lylae. S2 strain shaped bacilli, Gram-negative strictly aerobic oxidase, ADH, catalase, citrate permease
Characterization Of Hydrocarbonoclastes Bacteria Isolated From… 559
and ONPG positive, negative LDC (Table 1), may be linked to the species Pseudomonas aeruginosa since it is characterized by the production
pigments pyocyanin and pyoverdine (Lotfabad et al., 2000; Delarra 2007).
Table 1: Results of biochemical testing of isolates strains
AS: strictly aerobic. O: oxidative. AF: Aerobic optional. OF: oxidative and fermentative.
S3 strain as Gram-positive cocci in clusters presents irregular "bunch of grapes", which characterizes the species Staphylococcus aureus with a predominant aerobic metabolism and facultatively anaerobic, producing coagulase, thermostable nuclease and catalase, but no oxidase (Ananthanarayan, 2006). S4 strain was straight to the genus Acinetobacter sp. due to the shape of these cells which are coccobacilli, Gram negative or sometimes grouped by two variable length strings, catalase positive. This strain has a negative response to the test LDC, ODC, ADH, producing hydrogen sulfide, indole, and beta - galactosidase (Bergey, 1984). S5 strain is related to the family Enterobacteriaceae and has the following characteristics: a bacillary form, Gram-negative, aero- anaerobic facultative, catalase positive and fermentative metabolism (Madigan and Martinko, 2007). Based on the results of biochemical tests: oxidase, ONPG, Lactose, H2S negative and TDA, citrate permease and urease positive, we assumed that the strain belonged to the species Providencia rettgeri (Bergey, 1984; Delarra, 2007). S6 strain was connected to the genus Flavobacterium because of these pigmented yolk on hecktoen middle colonies, as well as Gram-
negative bacilli short , strict aerobic and immobile (Bergey, 1984; Delarra, 2007). S7 strain was straight to the genus Pseudomonas due to the shape of these cells which are bacilli, Gram negative, catalase positive, oxidase negative. This strain has a positive response to the test catalase, ADH, citrate permease and beta –galactosidase, assumed that the strain belonged to the species Pseudomonas luteola (Singleton, 1999). S8 strain free bacilli, Gram-negative, generally accumulating granules of poly-beta-hydroxybutyrate, moving through one or more polar flagella, strict aerobic catalase positive, oxidase positive, capable of growth using as a sole carbon source, glucose, glycerol, inositol, galactose, sorbitol, mannose, and mannitol, this strain correspond to Burkholderia cepacia. S9 strain is related to the species Burkholderia gladioli because it has the following characteristics: aerobic, catalase positive, urease positive, non spore formers. Burkholderia gladioli can be distinguished from the other Burkholderia because it has a negative response to the test oxidase, indole, nitrate and lysine decorboxylation (Coenye and Vandamme, 2007). 3.2. Monitoring the kinetics of growth of bacteria isolated The growth kinetics of the isolated strains on medium BH supplemented with 2% of crude oil
Souches Biochemical characters
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9
Metabolism energy
Type respiratory (VF) AS AS AAF AS AAF AS AS AS AAF Oxydase + + - - - + + + - Catalase + + + + + + + + + Nitrate réductase + _ + + + + - + -
Metabolism carbohydrate
Milieu Mevag O O OF O OF O O O OF
Milieu TSI
Glu + + + + + + + + + Lac./Sac. - - - - - - - - - H2S - - - - - - - - - Gas - - - - - - - - -
β-galactosidase (ONPG) - - - - - + - - - Citrate perméase - + + + + + - - +
Milieu Mannitol/mobilité
Mannitol + - - - - + + + + Mobilité + + - - + + + + -
Milieu Clarck et Lubs
VP - - + - - + - - - RM + + + + + + + + +
Metabolism protein
Milieu Moeller
ADH - + + - + - + - - LDC - - - - - - + - - ODC - - - - - - + - -
Milieu Urée/ Indole
Urée + - + + - + + + + Indole - - - - - - - + - TDA + - - + - - - - -
Milieu King King A - + - - - + - - - King B - + - - - + + + -
560 Khelil et al., 2014
as the sole carbon source was followed by measuring the microbial concentration versus time which allowed us to draw the curves shown in Figure 1. The Log UFC / ml = ƒ(t) curves have the appearance of a classical bacterial growth curve in a medium not renewed. In comparing the results of the growth parameters of the different strains (Table 2), isolates S1, S4 and S6 are the only ones to reach a lesser number of live cells to 106UFC/ml with a very small growth rate of 0.29, 0.27 and 0.06 h-1, respectively for the three strains and corresponding to a generation time of 3.40, 3.68 and 15.7 h respectively.
Figure 1: Growth kinetics of isolated bacterial strains cultivated on BH medium supplemented with 2% of crude oil.
Table 2: Parameters of the kinetics of growth of isolates
Strains S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 N 3.52 11.66 7.64 3.25 5.18 0.76 8.30 10.89 12.22 µ (h-1) 0.29 0.97 0.63 0.27 0.43 0.06 0.69 0.90 1.01 G (h) 3.40 1.02 1.57 3.68 2.31 15.7 1.44 1.10 0.98
3.3. Study of the optimum temperature To evaluate the influence of temperature on the growth of strains isolated, different values of temperatures ranging from 10°C to 30°C have been tested. The results obtained are shown in Figure 2.
Figure 2: Effect of different temperatures on the growth of the isolates on medium supplemented with 2% BH oil, during 24 hours of incubation. 3.4. Study of optimum pH From the curves in Figure 3, it can be seen that the majority of isolates support changes in pH, with a maximum of reported growth at pH between 9 and 10, except for the S2 that gives a maximum strain of growth a pH between 6 and 8.
Figure 3: Effect of different pH on the growth of the isolates on BH medium supplemented with 2% of oil during 24 hours of incubation.
3.5. Tolerance stem oil The results of the tolerance of the strains to different concentrations of the oil are summarized in Figure 4.
Figure 4: Effect of different concentrations of oil on the growth of isolates on BH medium for 48 h incubation.
DISCUSSION The presence of different strains namely Staphylococcus, Micrococcus, Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium isolated from seawater contaminated by discharges of the Arzew refinery was predictable since they are among the predominant hydrocarbonoclastes bacterial genus cited in studies of Leahy and Colwell, (1990) and Floodgate, (1995). These organisms degrading hydrocarbons are ubiquitous (Atlas, 1995; Olivera Nelda et al., 2009). We identified Providencia rettgeri which can be isolated from the marine environment according to studies of Hassen et al., (1998) and Foti et al., (2009), and two species of the genus Burkholderia which can be isolated from marine waters. For all bacterial strains tested, the observed lag phases are very short. This result demonstrates a more or less rapid adaptation of these strains which possess an appropriate enzymatic
Characterization Of Hydrocarbonoclastes Bacteria Isolated From… 561
equipment to attack different types of petroleum hydrocarbons used as the sole source of carbon and energy (Akmousi-Toumi, 2009). From the curves (Figure 1), we can observe that the microbial concentration increases from the first fermentation time until reaching maximum values after 36 hours for the S4 strain, beyond 48 hours for S5 strain, after 60 hours for S1 and S6 strains, after 72 hours for the S8 strain, after 84 hours for the S2, S3 and S9 strains and after 96 hours for the S7 strain. This increase corresponds to the exponential phase during which the dissolution of the substrate (oil) satisfied the metabolic cells needs. This solution is based on the enzymatic equipment of bacteria and is specific for each type of petroleum hydrocarbons, which explains the different peaks of microbial loads marked in different time for the six strains studied (Akmousi-Toumi, 2009). After the exponential phases that are specific for the various strains, growth became stable. This can be explained by the level of nutritional requirements that surpasses the rate of dissolution of the substrate, then the bioavailability becomes limiting. During this stationary phase, the most complex petroleum fractions are degraded (Rocha et al., 2007). Beyond 108 hours, there is a drop in the microbial load, which is due to the depletion of the medium or secretion of secondary metabolites or the inability of bacteria to degrade the most complex oil fractions. From the curves of Figure 2, we note that our isolates grow in a wide range of temperatures from 10°C to 30°C. these results are consistent with those found by Rodríguez-Blanco and Antoine, (2010) who reported that the degradation of crude oil or diesel might as well be done at 25, 10 or 4°C in Mediterranean water with controlled conditions. This tolerance to different temperatures can be explained by marine origin of these bacteria and the temperature changes in the interval between seasons. We also find that the highest growth rates were recorded at 25°C for all strains studied, which allows us to deduce that this temperature value can be considered optimal growth temperature. The Research Work of Sauret, (2011) show that the optimal hydrocarbon biodegradation was observed in pure culture around 25-37°C, which corresponds to the temperature optimum of a large number of bacterial enzymes. Therefore, even if biodegradation is a process that can be done all year, some authors suggest that it is more efficient in summer than winter (Atlas and Bartha, 1973).
According to Vandecasteele (2005), extreme pH inhibits the biodegradation of the oil. However, in the marine environment as fresh water, it is within a very favorable pH range (between 7 and 8). However, we noted a significant increase in growth of the strains: S1, S3, S4, S5 and S6 to pH 10, this result can be explained by the acid produced by the aerobic metabolism of hydrocarbons which will acidify the medium culture that is alkaline from the outset in our experimental cases. Some environmental parameters such as temperature and pH will affect the properties of the oil (oil viscosity, volatility and solubility of the molecules) and activity of microbial communities (Chang et al., 2006; Boszczyk-Maleszak et al., 2006). To study the tolerance of our strains to different concentrations of oil, we note that all isolates support up to 20 % oil, these results are consistent with those reported by Suzuki et al., (2001); Priefert and O‘Brien, (2004) and Taketani et al., (2010) who argument that the bacteria isolated from a chronic contaminated area by oil (port of Arzew in this study) tolerate significant concentrations of oil because the polluted areas, mechanisms of induction of enzymes of interest were found in the presence of oil. This adaptation results in high stability which gives bacteria the ability to respond more quickly to new source of hydrocarbons that bacteria without spoilage (Head and Jones, 2006; Maila and Randima, 2006; Bordenave et al., 2007).
CONCLUSION Our study aims to use indigenous strains to solve the problem of marine pollution by hydrocarbons. To achieve this goal we must deepen our current research in two main areas, namely the phylogenetic and physiological analysis of the most tolerant strains. The results described in this paper show that efficient crude oil degrading bacteria present in the Arzew gulf at Algeria. Also a direct relationship found between biosurfactant production and crude oil biodegradation in C. variabile strain PG-Z.
ACKNOWLEDGEMENTS Authors gratefully acknowledge the financial support of Laboratory: Environmental Monitoring Network, Department of Biology, Faculty of Science University of Oran – Ministry of Higher Education and Scientific Research, Government of Algeria.
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