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Mémoire de Magister en Biologie
Option : Microbiologie
Présenté par :
CHEKROUN Chahinez
Jury
Président : M. BELKHODJA Moulay : Professeur Université d’Oran.
Examinateurs : Mme IGHILHARIZ Zohra : Maitre de conférences Université d’Oran.
Mme BENNECEUR Malika : Maitre de conférences Université d’Oran.
Encadreur : Melle BOUABDALLAH Louiza : Maitre de conférences Université d’Oran.
Année universitaire 2010-2011
Etude des effets des filtrats de culture d’Ascochyta rabiei (Pass.) Lab.,
agent de l’anthracnose sur des cals de Cicer arietinum
Remerciements
Mes remerciements sont d’abord au Dieu tout puissant de m’avoir donné la force et la
patience pour terminer ce travail.
Je tiens à remercier tout particulièrement Monsieur le Professeur BELKHODJA
Moulay qui me fait l’honneur d’accepter de présider le jury.
Je remercie Melle BOUABDALLAH Louiza qui ma fait l’honneur de diriger ce
travail. Ses connaissances et son expérience ont été une source constante de savoir.
Qu’elle trouve en ces quelques lignes ma profonde gratitude.
Je remercie vivement Mme IGHILHARIZ Zohra qui a bien voulu examiner ce travail
et de nous avoir aidé tout au long du Magister.
Je remercie Mme BENNECEUR Malika pour sa participation au jury en examinant
ce travail.
Je voudrais également remercier Messieurs ; BENSOLTANE A, BEKKI A et
MAROUF A pour le matériel qu’ils ont mis a notre disposition.
Mes sincères remerciements pour Monsieur KARKACHI N et Mme KARKACHI S
pour leur aide, encouragement et soutien.
Mes remerciements vont aussi vers mes parents pour leur soutien moral fournit tout au
long de la réalisation de ce travail.
Merci à tous
Résumé
Le pois chiche (Cicer arietinum L.) est une source de glucides et de protéines ravagée
par l’anthracnose due à Ascochyta rabiei. Elle attaque les parties aériennes de la plante. Les
moyens de lutte envisagés sont peu efficaces. La recherche d’une méthode de lutte plus
efficace nécessite l’étude des mécanismes déployés lors des interactions hôte pathogène. Le
but de notre mémoire se rapporte à la mise en évidence de phénols lors de la confrontation
des cals de C. arietinum et des filtrats d’A. rabiei. Les phytoalxines constitués de phénols
sont les composés produits en quantités importantes lors des mécanismes de défense chez
les variétés résistantes infectées par un pathogène.
Les cals de tiges et de folioles des génotypes INRAT 199, Twist et Flip 82-150C sont
initiés sur MS avec les combinaisons hormonales M1 (3mg/l 2,4-D, 3mg/l BAP), M2
(3mg/l 2,4-D, 0.1mg/l BAP), Ma (2mg/l 2,4-D, 4mg/l Kinetine) et M8 (2mg/l 2,4-D, 4mg/l
ANA et Kinétine 1mg/l). La callogenèse est obtenue au bout d’un mois. La confrontation
des cals de INRAT 199 résistant et Twist et Flip 82-150C tolérants s’est effectuée sur
milieu MS avec 50% de filtrat des isolats (H1 et E7). L’extraction des phénols totaux est
faite par macération et l’évaluation quantitative est réalisée par spectrophotométrie.
La callogenèse initiée chez C. arietinum est influencée par l’explant (organe et
génotype) et par la composition hormonale (nature et concentration). Une callogenèse
maximale de tiges est observée chez le génotype INRAT 199 sur les milieux M1 et M2 et
pour les génotypes Twist et Flip 82-150C sur les milieux Ma et M8 respectivement. Une
callogenèse importante de folioles du génotype INRAT 199 est signalée sur les milieux M2
et M8 et chez le génotype Twist sur les milieux M1, Ma et M8. Les folioles du génotype
Flip 82-150C ont donné une bonne initiation de cals sur un seul milieu M1.
Les résultats des interactions cals de C. arietinum-filtrat de culture d’A. rabiei
suggèrent l’existence de substance dans le filtrat de culture des isolats E7 et H1 d’A. rabiei
capables de provoquer la production de phénols par les cals de C. arietinum. Elle est
variable en fonction de l’origine des cals (génotype résistant ou tolérante) et de l’isolat.
Les quantités de phénols des cals confrontés au filtrat de culture d’A. rabiei (E7 et
H1) sont supérieures à celles du témoin en général. Les cals du génotype Twist tolérant
traités par les filtrats de culture d’A. rabiei synthétisent plus de phénols que les cals des
autres génotypes. Les cals du même génotype se comportent selon l’isolat. Le filtrat de
l’isolat E7 a entrainé une plus grande synthèse de phénols par les cals de folioles et de
tiges.
Mots clés : Cicer arietinum, Ascochyta rabiei, Callogenèse, hormones, phénols.
Abstract
Chickpea (Cicer arietinum L.) is a source of carbohydrates and protein devastated by
anthracnose caused by Ascochyta rabiei. It attacks the aerial parts of the plant. The control
methods are considered inefficient. The search for a more effective control method requires
the study of mechanisms deployed at the host pathogen interactions. The purpose of our
submission relates to the detection of phenols in the confrontation callus of C. arietinum and
filtrates of A.. rabiei. The phytoalxines consisting of phenols are compounds produced in
large quantities during defense mechanisms in resistant varieties infected by a pathogen.
Calli stems and leaflets of genotypes INRAT 199, Twist and Flip 82-150C were initiated
on MS with combination hormonal M1 (3mg / l 2,4-D, 3 mg / l BAP), M2 (3 mg / l 2, 4-D,
0.1mg / l BAP), Ma (2mg / l 2,4-D, 4 mg / l Kinetin) and M8 (2mg / l 2,4-D, 4 mg / l NAA
and Kinetin 1 mg / l). The callus was obtained after a month. The confrontation of resistant
calli INRAT 199 and Twist and Flip 82-150C tolerant took place on MS medium with 50% of
culture filtrate of the isolates (H1 and E7). The extraction of total phenols is made by
maceration and quantitative evaluation is performed by spectrophotometry.
Callus initiated in C. arietinum is influenced by the explant (genotype and body) and by
the hormonal composition (nature and concentration). A maximum stem callus was observed
in the genotype INRAT 199 on media M1 and M2 and for genotypes Twist and Flip 82-150C
on Ma and M8 respectively. A large callus of the genotype of leaflets INRAT 199 is reported
on the media M2 and M8 in the genotype Twist on media M1, Ma and M8. The leaflets of
genotype Flip 82-150C gave good callus initiation on a single medium M1.
The results of interactions callus of C. arietinum-culture filtrate of A. rabiei suggest the
existence of substance in the culture filtrate of isolates of A. rabiei (E7 and H1) able to induce
the production of phenols by the callus of C. arietinum. It varies depending on the origin of
callus (resistant or tolerant genotype) and the isolate.
The amounts of phenols callus face the culture filtrate of A. rabiei (E7 and H1) are higher
than those of the control in general. Calli tolerant genotype Twist treated culture filtrates of
A. rabiei synthesize more phenols than other genotypes calli. Calli of the same genotype
behave according to isolate. The filtrate of the isolate E7 resulted in a greater synthesis of
phenols by callus of leaflets and stems.
Keywords: Cicer arietinum, Ascochyta rabiei, Callogenesis, hormones, phenols.
Sommaire
Introduction………………………………………………..……………........ 1
Chapitre I : Etude bibliographique
1. Présentation de la plante hôte Cicer arietinum L. ………………………… 3
1.1. Description de la plante …………………………………………………. 3
1.2. Importance de la plante …………………………………………………. 6
1.3. Culture de tissu ………………………………………………………….. 10
1.3.1. Généralités ……………………………………………………………..
1.3.2. Callogenèse et variation somaclonale …………………………………
10
11
1.3.3. Culture de tissu du pois chiche………………………………………… 11
1.4. Les maladies du pois chiche ……………………………………………. 13
2. Anthracnose du pois chiche ……………………………………………….. 14
2.1. Présentation du pathogène Ascochyta rabiei ……………………………. 14
2.1.1. Description du pathogène ……………………………………………... 14
2.1.2. Processus infectieux…………………………………………………… 17
2.1.3. Cycle de la maladie …………………………………………………… 19
2.1.4. Symptômes ……………………………………………………………. 21
2.2. Mécanismes de résistance de la plante hôte C. arietinum……………….. 23
2.3. Moyens de lutte …………………………………………………………. 25
Chapitre II : Matériel et méthodes
1. Matériel biologique ……………………………………………………… 28
1.1. Matériel végétal …………………………………………………………. 28
1.2. Matériel fongique ………………………………………………………... 28
2. Méthodes ………………………………………………………………….. 28
2.1. Repiquage du champignon Ascochyta rabiei………………………………..
2.2. Préparation du filtrat de culture d’A. rabiei…………………………………..
28
29
2.3. Dosage du filtrat de culture d’A. rabiei…………………………………... 29
2.3.1. Dosage des protéines (Méthode de Bradford)……………………….. . 29
2.3.2. Dosage des sucres (Méthode de Dubois)……………………………... 30
2.4. Préparation du semis……………………………………………………... 31
2.5. Culture in vitro……………………………………………………….. …. 31
2.6. Interaction cals C. arietinum- filtrat d’A. rabiei ……… ………………… 32
2.7. Dosage des phénols………………………………………………………. 32
2.8. Analyse statistique………………………………………………………... 34
Chapitre III : Résultats et discussion
1. Partie culture in vitro du pois chiche………………………………………. 35
1. 1. Résultats……………………………………………………………….. . 35
1.1.1. Cas des explants d’entre nœuds……………………………………… . 35
1.1.2. Cas des explants de folioles…………………………………………… 41
1.2. Discussion………………………………………………………………. 52
2. Partie interaction cals C. arietinum- filtrat d’A. rabiei …………………… 54
2. 1. Résultats………………………………………………………………… 54
2.1.1. Etude du champignon A. rabiei ……………………. ………………… 54
2.1.2. Cas du dosage du filtrat de culture d’A. rabiei……………………………. 56
2.1.3. Effets du filtrat de culture d’A. rabiei sur les cals de C. arietinum…….. 57
2.1.4. Teneur des polyphénols totaux………………………………………… 57
2.2. Discussion……………………………………………………………….. 63
Conclusion et perspectives …………………………………………………... 67
Références bibliographiques…………………………………………………. 69
Annexe……………………………………………………………………….. 79
Liste des tableaux
Tableau 1: Principaux constituants biochimique du pois chiche (Cicer arietinum L.)……... 6
Tableau 2: Composition en acides aminés du pois chiche (Cicer arietinum L.)……………. 7
Tableau 3: Les éléments minéraux contenus dans le pois chiche (Cicer arietinum L.)…….. 8
Tableau 4: Gamme étalon pour le dosage des protéines……………………………………. 30
Tableau 5: Gamme étalon pour le dosage des sucres……………………………………….. 31
Tableau 6: Les différentes combinaisons hormonales additionnées au milieu MS………... 32
Tableau 7: Gamme étalon pour le dosage des polyphénols totaux…………………………. 34
Tableau 8 : Etude statistique (analyse de variance ANOVA) sur l’effet des trois facteurs
(explant-génotype-milieu) sur l’initiation de la callogenèse chez les entre nœuds de
Cicer arietinum L…………………………………………………………………………….
40
Tableau 9 : Etude statistique (analyse de variance ANOVA) sur l’effet des trois facteurs
(explant-génotype-milieu) sur l’initiation de la callogenèse chez les folioles de
Cicer arietinum L…………………………………………………………………………….
48
Tableau 10: Caractéristiques des cals issus des explants de folioles et d’entre nœuds de
trois génotypes (D1, D2 et D3) de Cicer arietinum L. sur les milieux (M1, M2, Ma et
M8)............................................................................................ ......................................
50
Tableau 11: Caractéristiques macroscopiques des deux isolats d’Ascochyta rabiei…………. 54
Tableau 12: Caractéristiques microscopiques des deux isolats d’Ascochyta rabiei…………. 54
Tableau 13: Teneur des polyphénols totaux des cals provenant des explants d’entre nœuds
et de folioles (mg EAG/ g de cal) confrontés au filtrat de culture des deux
isolats E7 et H1……………………………………………………………………………….
Tableau 14 : Pourcentage de cals des explants d’entre nœuds des trois génotypes de pois
chiche en présence de différentes combinaisons hormonales (2,4-D, ANA,
BAP et KIN)………………………………………………………………………………….
Tableau 15 : Pourcentage de cals des explants de folioles des trois génotypes de pois
chiche en présence de différentes combinaisons hormonales (2,4-D, ANA,
BAP et KIN)………………………………………………………………………………….
59
82
82
Liste des figures
Figure 1 : Description botanique du pois chiche (Cicer arietinum L.)…………………... 5
Figure 2 : Pourcentages de production du pois chiche dans différentes pays du monde… 9
Figure 3 : Production du pois chiche en Algérie (1999-2009)…………………………… 9
Figure 4 : Caractéristiques microscopiques et macroscopique d’Ascochyta rabiei………. 16
Figure 5 : Structure des Solanapyrones………………………………………………….. 18
Figure 6 : Cycle de l’anthracnose du pois chiche………………………………………... 20
Figure 7 : Symptômes de l’anthracnose du pois chiche (Cicer arietinum L.)…………… 22
Figure 8 : Structure des composés phénoliques sécrétés par Cicer arietinum L………… 23
Figure 9 : Structure des phytoalexines sécrétés par Cicer arietinum L………………….. 24
Figure 10 : Génotypes de pois chiche INRAT 199, Twist et Flip 82-150C…………….. 28
Figure 11 : Extracteur sous reflux et Evaporateur rotatif………………………………… 33
Figure 12 : Effet des différents milieux sur la formation des cals à partir des explants
d’entre nœuds du génotype D1 (INRAT 199)……………………………………………..
37
Figure 13 : Effet des différents milieux sur la formation des cals à partir des explants
d’entre nœuds du génotype D2 (Twist)……………………………………………………
37
Figure 14 : Effet des différents milieux sur la formation des cals à partir des explants
d’entre nœuds du génotype D3 (Flip 82-150C)…………………………………………...
37
Figure 15 : Initiation de la callogenèse des explants d’entre nœuds des trois génotypes
D1 (INRAT 199), D2 (Twist) et D3 (Flip 82-150C) sur les deux milieux M1 et M2…….
38
Figure 16 : Cals âgés d’un mois des explants d’entre nœuds des deux génotypes D1
(INRAT 199) et D2 (Twist) sur les deux milieux M1 et M2……………………………...
39
Figure 17 : Effet des différents milieux sur la formation des cals à partir des explants de
folioles du génotype D1 (INRAT 199)……………………………………………………
42
Figure 18 : Effet des différents milieux sur la formation des cals à partir des explants de
folioles du génotype D2 (Twist)…………………………………………………………..
42
Figure 19 : Effet des différents milieux sur la formation des cals à partir des explants de
folioles du génotype D3 (Flip 82-150C)…………………………………………………..
42
Figure 20 : Initiation de la callogenèse des explants de folioles du génotype D1
(INRAT 199) sur le milieu M8 et du génotype D3 (Flip 82-150C) sur le milieu M2…….
43
Figure 21 : Initiation de la callogenèse des explants de folioles du génotype D2 (Twist)
sur les deux milieux M1 et M2……………………………………………………………
44
Figure 22 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D1 (INRAT 199)
sur les milieux M1, M2 et M8……………………………………………………………..
45
Figure 23 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D2 (Twist)
cultivés sur les milieux M1, M2 et Ma……………………………………………………
46
Figure 24 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D2 (Twist)
cultivés sur le milieu M8 et du génotype D3 (Flip 82-150C) cultivés sur le milieu M2….
47
Figure 25 : Effet des différents milieux sur la formation des cals à partir des explants
d’entre nœuds des trois génotypes (D1, D2 et D3)………………………………………..
49
Figure 26 : Effet des différents milieux sur la formation des cals à partir des explants de
folioles des trois génotypes (D1, D2 et D3)……………………………………………….
49
Figure 27 : Callogenèse après mise en culture des explants d’entre nœuds et de folioles
des deux génotypes Twist et Flip 82-150C sur le milieu MS à base de charbon………….
51
Figure 28 : Aspect macroscopique et microscopique des deux isolats H1 et E7………… 55
Figure 29 : Courbe étalon du dosage des protéines par la méthode de Bradford………… 56
Figure 30 : Courbe étalon du dosage des sucres par la méthode de Dubois……………... 56
Figure 31 : Courbe étalon du dosage des phénols………………………………………... 58
Figure 32 : Teneur des polyphénols totaux (mg EAG/g de cal) d’explants d’entre nœuds
confrontés au filtrat de culture de l’isolat H1……………………………………………...
60
Figure 33 : Teneur des polyphénols totaux (mg EAG/g de cal) d’explants de folioles
confrontés au filtrat de culture de l’isolat H1……………………………………………...
60
Figure 34 : Teneur des polyphénols totaux (mg EAG/g de cal) d’explants d’entre nœuds
confrontés au filtrat de culture de l’isolat E7……………………………………………...
61
Figure 35 : Teneur des polyphénols totaux (mg EAG/g de cal) d’explants de folioles
confrontés au filtrat de culture de l’isolat E7……………………………………………...
61
Figure 36 : Effet du filtrat de culture brut d’Ascochyta rabiei sur les cals de
Cicer arietinum après 1 semaine de confrontation………………………………………...
62
Introduction
Introduction
1
Introduction
Le pois chiche (Cicer arietinum L.) est l’une des plus importantes légumineuses à
graines dans le monde. Il occupe une place importante dans l’alimentation humaine à cause
de sa valeur nutritive. Il fournit une source de glucides, de protéines, de lipides, de sels
minéraux et de vitamines. La consommation de cette plante est très demandée en Algérie
mais la production nationale de pois chiche ne recouvre pas les besoins. Cette culture est
limitée par l’action de plusieurs facteurs biotiques (insectes, champignons, bactéries et
virus) et abiotiques (la salinité, la sécheresse et le froid). Parmi les nombreux champignons
phytopathogènes attaquant le pois chiche, le principal est Ascochyta rabiei agent de
l’anthracnose. Il peut entrainer des pertes du rendement qui peut atteindre 100% pour les
variétés sensibles. De nombreux moyens de lutte ont été envisagés tels que :
Les techniques culturales
La lutte biologique
La lutte chimique
La lutte génétique par les méthodes traditionnelles
Les moyens de luttes citées n’ont pas permis de contrôler efficacement la maladie. Ils
présentent en plus certains inconvénients. L’utilisation des fongicides peut développer une
résistance chez le champignon et entrainer des risques de toxicité chimique pour l’homme
et l’environnement. Il n’existe pas jusqu’à présent d’agents biologiques permettant
d’éradiquer Ascochyta rabiei. Les variétés sélectionnées par les méthodes traditionnelles
sont obtenues après de nombreuses années de sélection et ne présentent pas une résistance
durable qui est liée à un degré élevé de variation génétique du champignon.
L’utilisation des outils de la biotechnologie permet l’obtention d’une variation
somaclonale qui fait intervenir les modifications génétiques. Les conditions de culture
(milieu, régulateurs de croissance, température,…) entrainent de nouveaux signaux qui
seront le résultat des changements génétiques. Les changements pouvant se manifester par
l’apparition d’une résistance nouvelle et différente à celle obtenue par les méthodes
classiques. Ce caractère nouveau de résistance sera difficile à contourner par le
champignon.
Introduction
2
Cette variation somaclonale peut être orientée par un agent de pression de sélection
qui peut être le champignon lui-même ; son mycelium et ses spores mais aussi les produits
de ses sécrétions telles que les toxines et les enzymes contenues dans son filtrat de culture.
Le criblage in vitro des cals par l’utilisation du filtrat de culture d’un champignon
phytopathogène est une méthode de sélection de nouveaux caractères engendrés par la
variation somaclonale.
La résistance aux micro-organismes phytopathogènes principalement aux
champignons y compris Ascochyta rabiei se manifeste par la production de composés
phénoliques qui sont les précurseurs des phytoalexines. La quantité produite de ces
composés est variable selon le degré de résistance de la plante ; chez une plante résistante,
ils sont produits en plus grande quantité.
Le but de notre travail est l’étude de la mise en évidence de la production des phénols
chez des cals de pois chiche confrontés au filtrat brut de culture d’Ascochyta rabiei. Ce
filtrat renfermant les produits (enzymes et toxines) de sécrétion du pathogène peut
constituer un agent de pression de sélection intéressant. Il peut entrainer une plus grande
production de phénols qui pourrait contribuer à l’amélioration de la résistance vis-à-vis
d’Ascochyta rabiei.
La réalisation de ce travail se déroule en deux étapes ;
La première est la recherche des conditions physiologiques et biologique telles que :
milieu de culture, type d’organe, température, photopériode pour l’initiation des cals de
Cicer arietinum.
La deuxième étape se rapporte à l’interaction du filtrat de culture brut d’Ascochyta
rabiei avec les cals de Cicer arietinum et la détection et l’évaluation quantitative de la
production des phénols chez les cals confrontés.
Chapitre I :
Etude bibliographique
Etude bibliographique
3
1. Présentation de la plante hôte Cicer arietinum L.
1.1. Description de la plante
1.1.1. Position systématique
Règne : Végétal
Sous règne : Phanérogames
Embranchement : Spermatophytes
Sous-embranchement : Angiospermes
Classe : Dicotylédones
Ordre : Fabales
Famille : Fabacées
Sous-famille : Papilionacées
Genre : Cicer
Espèce : arietinum L.
Nom commun : hommos (Arabe), pois chiche (Français), chickpea (Anglais),
garbanzo (Espagnol).
1.1.2. Description botanique
Cicer arietinum L. est une plante herbacée annuelle (Fig. 1a), diploïde (2n= 16)
autofécondée constituée de ;
a. La racine : la racine primaire est de type pivotant profond atteignant jusqu’à 1 à 2
m, ramifiée, les racines latérales pour la plupart sont étalées à 15-30 cm de profondeur dans
le sol. Les racines présentent des renflements ou nodosités suite à une association
symbiotique avec une bactérie Rhizobium.
b. La tige : est velue, anguleuse atteignant 20 à 40 cm de hauteur.
c. Les feuilles : sont alternes et composées imparipennées, sessiles de forme ovale à
elliptique, de 5 à 20 mm / 2 à15 mm, à contours fortement dentées dans les deux tiers
Etude bibliographique
4
supérieurs et sans vrilles. La présence de stipules ovales à triangulaires de 3 à 5 mm / 2 à 4
mm.
d. La fleur : est pentamère avec une formule florale de: 5S+ 5P+ (5+5) E+ 1C. La
corolle est de type papilionacé très zygomorphe, le pétale supérieur est très dominant et
constitue l’étendard qui recouvre les deux pétales latéraux recouvrant eux même ceux de la
carène. La corolle peut être de différentes couleurs blanches (Fig. 1b), bleues (Fig. 1c) ou
(Fig. 1d) roses. Le calice est composé de cinq dents égales. La fleur est bisexuée constituée
des organes reproducteurs males et femelles. L’androcée comporte dix étamines soudées.
Le gynécée est composé d’un style de forme variable, incurvé de 3 à 4 mm de long, et d’un
ovaire toujours libre et stipulé.
e. Le fruit : est une gousse définie par une double ouverture ventrale et dorsale
globuleuse ovoïde, renflée, jaunâtre de 15 à 30 mm à maturité, contenant une à deux
graines (Fig. 1e et 1f).
f. Les graines de pois chiche sont de surface lisse ou rugueuse présentent une
variation de forme et de longueur de 5 à 14 mm / 4 à 10 mm. La couleur et la forme varient
selon les variétés :
La variété Desi : à petites graines de couleurs sombres (Fig. 1g), lisses ou
ridées et recouvertes d’un tégument épais. Les fleurs sont de couleurs bleu violet. Ces
variétés sont cultivées surtout dans le subcontinent Indien, elles tolèrent la chaleur et
la salinité.
La variété Kabuli : à grosses graines de couleur crème (Fig. 1h) recouvertes
d’un tégument mince. Les fleurs sont blanches. Ces variétés sont cultivées dans les
régions méditerranéennes, elles tolèrent le froid.
Etude bibliographique
5
Figure 1 : Description botanique du pois chiche (Cicer arietinum L.).
a : Port herbacé de Cicer arietinum L. ; b : Fleur blanche de Cicer arietinum L. ; c : Fleur bleue de
Cicer arietinum L. ; d : Fleurs rose de Cicer arietinum L. ; e : Jeunes gousses vertes de Cicer
arietinum L. ; f : Gousses jeunes vertes et gousses mûres jaunes de Cicer arietinum L. ; g : Graines
de Cicer arietinum L. type Desi ; h : Graines de Cicer arietinum L. type Kabuli.
d
a
b c
e
f
g h
Etude bibliographique
6
1.2. Importance de la plante (Cicer aritinum L.)
1.2.1. Valeur alimentaire
Le pois chiche est une légumineuse extrêmement nutritive par ses teneurs en glucides
et en protéines qui constituent ensemble 80% du poids sec de la graine.
Le pois chiche est composé de 38 à 59% de glucides dont l’amidon est le principale
carbohydrate le contenu en amidon chez les variétés Desi est inférieur a celui présent chez
les variétés Kabuli (Williams et Singh, 1987).
La concentration des protéines est de 17 à 24% au niveau des cotylédons. Le pois
chiche est riche en Leucine et en Lysine (Tab. 2) qui sont des acides aminés essentiels.
L’acide glutamique et l’acide aspartique sont les majors acides aminés non essentiels
présents dans le pois chiche (Tab. 2).
Les lipides représentent 5,2%. Les triglycérides et les phospholipides sont les
composants prédominants des lipides.
Le pois chiche est riche en minéraux particulièrement en Potassium, phosphore et
calcium (Tab. 3). Le tégument est composé de 70% du calcium total de la graine (Williams
et Singh, 1987).
Tableau 1: Principaux constituants biochimique du pois chiche (Cicer arietinum L.).
Composants Valeurs (%)
Eau 7.3
Glucides 38 à 59
Protéines 24.0
Lipides 5.2
Etude bibliographique
7
Tableau 2: Composition en acides aminés du pois chiche (Cicer arietinum L.) (% de
protéines) (Iqbal et al, 2006).
Composants Valeurs (%)
Arginine 8.3 0.21
Histidine 3.0 0.03
Isoleucine 4.8 0.03
Leucine 8.7 0.03
Lysine 7.2 0.03
Méthionine 1.1 0.04
Phénylalanine 5.5 0.04
Thréonine 3.1 0.04
Tryptophane 0.9 0.02
Valine 4.6 0.03
Alanine 4.97 0.03
Acide aspartique 11.0 0.04
Cystéine 0.6 0.06
Acide glutamique 17.3 0.08
Glycine 3.7 0.03
Proline 3.8 0.05
Serine 3.7 0.02
Tyrosine 2.8 0.06
Etude bibliographique
8
Tableau 3: Les éléments minéraux contenus dans le pois chiche (Cicer arietinum L.) (Iqbal
et al, 2006).
Composants Valeurs (mg)
Sodium 101 3.51
Potassium 1155 5.00
Phosphore 251 6.11
Calcium 197 3.61
Fer 3.0 0.20
Cuivre 11.6 0.20
Zinc 6.8 0.26
Manganèse 1.9 0.10
Magnésium 4.6 0.04
1.2.2. Intérêt agronomique et écologique
Le pois chiche est une légumineuse qui présente des nodosités racinaires. Ces
dernières renferment des bactéries du sol telles que Rhizobium. Cette bactérie a la capacité
de fixer l’azote atmosphérique qui constitue un apport en azote pour le sol. Ceci va
augmenter sa fertilité et améliore ainsi le rendement de cette culture.
Cette symbiose qui contribue à un apport azoté va limiter l’utilisation des engrais
chimiques ce qui va entrainer une baisse des dépenses de production mais aussi une
protection de l’environnement présentant ainsi un intérêt écologique.
Etude bibliographique
9
1.2.3. Superficie et production
Selon les statistiques de la FAO (2009), la production mondiale du pois chiche
avoisine 9.7 millions de tonnes dans une surface de 11 millions d’hectares. L’Inde produit
66.9% de la production mondiale suivie par le second producteur le Pakistan avec une
quantité largement inférieur de 7,5% (Fig. 2). En Algérie la production est très faible de
0.18%. Au cours des dix dernières années (Fig. 3) cette production a subi des diminutions
et des augmentations. La production du pois chiche en Algérie reste toujours insuffisante et
ne recouvre pas les besoins de la population ce qui impose l’importation de cette
légumineuse.
Figure 2 : Pourcentages de production du pois chiche dans différentes pays du monde
(FAO 2009).
Figure 3 : Production du pois chiche en Algérie (1999-2009) (FAO 2009).
0
10
20
30
40
50
60
7066,9
7,5 5,7 4,5 3,1 2,1 0,58 0,51 0,18 0,11 0,05
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
Production (tonne)
Surface cultivée (hectare)
Etude bibliographique
10
1.3. Culture de tissu
1.3.1. Généralités
Le terme in vitro est toute exploitation ou expérimentation biologique qui se fait en
dehors de l’organisme. La culture in vitro des tissus végétaux est l’ensemble de techniques
qui se sont développées depuis les années 1950 permettant de régénérer des plantes
complètes à partir d’explants divers misent en culture en condition aseptiques dans un
environnement contrôlé (température, lumière, composition du milieu de culture,
phytohormones,…).
La culture in vitro est basée sur la propriété de totipotence des cellules végétales qui
signifie la capacité de ces cellules de se multiplier, s’organiser en tissus différents
permettant de donner naissance à des plantes entières
1.3.2. Avantages de la culture in vitro
La manipulation d’une grande quantité de plante dans un espace réduit.
La conservation des génotypes dans des conditions protectrices vis-à-vis des
microorganismes.
Le maintien des génotypes de l’explant (assainissement des plants virosés par
culture de méristème, multiplication de façon conforme par micropropagation).
Elle implique des modifications génétiques de la plante dans le cadre d’obtention
de nouvelles variétés améliorées (variation somaclonale).
1.3.3. Inconvénients de la culture in vitro
La culture de méristème permet l’obtention de plantes indemnes de virus mais qui
ne présentent pas une résistance totale.
Les techniques de culture in vitro peuvent présenter un danger d’instabilité
génétique impliquant des modifications chromosomiques et l’obtention de variants.
Ces techniques nécessitent trop de main-d’œuvre spécialisée ce qui rend le coût des
plantes élevé.
Etude bibliographique
11
1.3.4. Culture de tissu du pois chiche
L’embryogenèse somatique de cals est obtenue par induction des cals
embryogénique en utilisant des régulateurs de croissance de type auxine (Sagare et al,
1993 ; Kumar et al, 1994). Elle est influencée par la source d’auxine et sa concentration, la
source d’explant (génotype) et ses interactions (Barna et Wakhlu 1993, Kiran et al, 2005),
le picloran est la meilleure auxine pour l’induction de l’embryogénèse somatique (Kiran et
al, 2005). Mais ce type de régénération peut mener à une variation somaclonale, l’étude
réalisée par Kiran et al, 2005 sur l’embryogenèse somatique directe sans phase de cal à
partir des explants d’epicotyle de Cicer arietinum rapporte que 80% des plantes régénérés
survies au sol avec production des graines viables et qui ne présentent aucune variation
morphologique. Naz et al, 2008b signalent que la combinaison hormonale 2,4-D/ BAP
stimule l’induction d’embryon somatique indirecte et que 89,14% des plantes régénérés
survies après huit semaines de leur plantation au sol.
L’organogenèse de cal est obtenue par induction des pousses en utilisant les
régulateurs de croissance de type cytokinine (Rao et Chopra, 1987a ; Rao et Chopra, 1989 ;
Sangvan et al, 1989). Barna et Wakhlu, 1994 ont pu régénérer des plantes de pois chiche
par organogenèse indirecte par passage de stade cal et qui produisent des graines viables.
Huda et al, 2003 ont signalés que 35% de plantes régénérées à partir des cals dérivés des
cotylédons survies après quatre semaines de leur plantation dans le sol. Arora et Chawla,
2005 signalent que l’embryon immature est la meilleure source d’explant pour
l’organogénèse indirecte. Mirakabad et al, 2010 ont établies un protocole efficace de
régénération de 20 génotypes de pois chiche par l’utilisation de différentes combinaisons
hormonales pour l’induction des cals, des pousses et des racines.
Brandt et Hess, 1994 ont pu régénérer par organogenèse directe des plantes de pois
chiche avec une fréquence de survie au sol faible ; 28% (variété Desi : cv. Annigeri) et
23% (variété Kabuli : ICCV6). Sarker et al, 2005 ont développés un protocole de
régénération par organogenèse directe de trois variétés de pois chiche à partir des explants
de cotylédons et d’embryon. Naz et al, 2007 signalent que l’utilisation du BAP comme
régulateur de croissance permet la régénération par organogenèse sans phase cal à partir
des explants de nœuds et des pousses. Sujatha et al, 2007 ont établis un protocole rapide,
simple et efficace pour la régénération du pois chiche par l’utilisation de BA (Benzyl
Etude bibliographique
12
Adenine) et l’IBA (Indole Butyric Acid) comme régulateur de croissance, 76,3% des
plantes régénérées survivent au sol sans aucune variation phénotypique.
La régénération du pois chiche in vitro est hautement récalcitrante, Anwar et al, 2010
signalent que deux facteurs majores limitent cette régénération ; l’étape de l’enracinement
et la transplantation. L’utilisation d’un système d’enracinement efficace et de
transplantation des plantules cultivées in vitro permettent de régénérer des plantes de pois
chiche. La disposition d’un protocole efficace et reproductible de culture de tissu et la
régénération des plantes de pois chiche in vitro ouvrent la voie à de nombreuses
applications en génétique et en amélioration pour la production de plantes transgéniques.
1.3.5. Callogenèse et variation somaclonale
La mise en culture d’un explant végétal dans un milieu de culture contenant les
substances nutritives et les phytohormones conduit à la formation d’un tissu néoplasique
relativement homogène appelé « cal » qui correspond à une dédifférenciation accompagnée
d’une reprise des divisions cellulaires (mitoses) de l’explant initial (Margara, 1984).
La variation somaclonale est le résultat des changements génétiques préexistants
(révélés par la régénération) ou induits par la culture in vitro. Elle se manifeste dès le stade
cal par une différence au point de vue couleur, compacité et aspect superficiel et par des
différences morphologiques et physiologiques des plantes régénérées et leur descendance
(Bouharmont, 1991).
L’intérêt de la variation somaclonale est l’obtention de lignés résistants aux
maladies ou divers contraintes de l’environnement (la salinité, la chaleur,…).
L’incorporation d’un agent sélectif au milieu de culture permet la sélection in vitro de
nouveaux caractères engendrés par la variation somaclonale. Partant par ce principe, des
études ont été réalisés pour l’obtention de lignés de pois chiche résistant à Ascochyta rabiei
(Singh et al, 1999) ou tolérants à la salinité (Jaiswal et Singh, 2001).
Etude bibliographique
13
1.4. Les maladies du pois chiche
La production du pois chiche est limitée par l’action de plusieurs facteurs ; les
facteurs biotiques comme les nématodes et les micro-organismes (virus, bactéries et
champignons), les facteurs abiotiques (la salinité, la sécheresse et le froid) et les méthodes
de contrôles faibles.
Les nématodes comme Pratylenchus thornei, Meloidogyne incognita et
Macroposthonia ornata causent des lésions au niveau des racines. Les maladies virales sont
causées par différents virus comme le virus de la mosaïque du concombre, virus de la
mosaïque de Alfalfa et virus de la mosaïque de l’Haricot,…etc. (Nene et Reddy, 1987). Les
bactéries comme Pseudomonas andropogonis et Xanthomonas campestris pv cassiae
infectent le pois chiche et causent eux aussi des maladies (Nene et al, 1996).
Plusieurs champignons attaquent le pois chiche infectant soit les parties souterraines
et les tiges basses comme ; Fusarium oxysporum (agent du flétrissement), Pythium ultimum
(responsable de la fonte de semis et de la pourriture des racines et du collet) ou les parties
aériennes de la plante comme ; Botrytis cinerea (agent de la pourriture grise des racines et
du collet) et Ascochyta rabiei (agent de l’anthracnose)…etc. (Nene et Reddy, 1987).
La maladie la plus néfaste pour la production de pois chiche dans le monde est
l’anthracnose provoquée par Ascochyta rabiei (Nene et Reddy, 1987). C’est une maladie
fongique très importante qui sur le plan économique représente le facteur limitant de la
production du pois chiche. La baisse du rendement est le résultat du développement, sous
des conditions favorables, du champignon. Ce dernier attaque toutes les parties aériennes
de la plante aux différents stades de son développement (Navas-Cortes et al, 1998 ; Chongo
et Gossen, 2001) et persiste dans les résidus de culture, dans les graines et dans la plante
causant ainsi des pertes très considérables.
Etude bibliographique
14
2. Anthracnose du pois chiche
2.1. Présentation du pathogène
2.1.1. Description du pathogène
2.1.1.1. Position systématique
Division : Eumycètes
Subdivision : Deuteromycètes
Classe : Coelomycètes
Ordre : Sphaeropsidales
Genre : Ascochyta (Agrios, 1988)
La découverte du stade téléomorphe : Didymella rabiei (Mycosphaerella rabiei) a
permis de l’intégrer au sein de la taxonomie des Ascomycètes ce qui engendre une double
nomenclature pour cette espèce.
Division : Eumycètes
Subdivision : Ascomycètes
Classe : Loculoascomycètes
Ordre : Dothideales
Genre : Didymella (Agrios, 1988)
2.1.1.2. Les caractéristiques microscopiques
Ascochyta rabiei (Pass.) Labrousse (teleomorphe Didymella rabiei (Kovachevski) v.
Arx) est un champignon imparfait (Agrios, 1970) qui présente deux modalités de
reproductions ; la reproduction asexuée (stade anamorphe : Ascochyta rabiei) et la
reproduction sexuée (stade téléomorphe : Didymella rabiei).
La reproduction asexuée (stade anamorphe : Ascochyta rabiei) assure la dispersion
du champignon est caractérisée par la production de pycnides et des pycnidiospores.
Etude bibliographique
15
a. Les pycnides : sont globuleux sous épidermiques pourvus d’un ostiole (Viennot et
Bourgin, 1949 ; Hoger, 1954 ; Barnett et al, 1972). A l’intérieur des pycnides se
forment les spores asexuées : les pycnidiospores ou conidies (Fig. 4a).
b. Les pycnidiospores : sont hyalines droites ou légèrement incurvés, arrondis à
leurs extrémités, la plus part sont monocellulaires avec la présence de
pycnidiospores bicellulaires dont le pourcentage est bas mesurant 8.2 à 10.0 * 4.2
à 4.5µ (Nene et Reddy, 1987 ; Porta Puglia, 1990 ; Champion, 1997) (Fig. 4b).
c. Le mycelium : est cloisonné (Fig. 4c).
La reproduction sexuée (stade téléomorphe : Didymella rabiei) qui assure la
conservation du champignon est hétérothallique (Armstrang et al, 2001 ; Chang et al, 2008)
issue de l’association de deux cellules compatibles (MAT1-1 et MAT1-2) contribue à une
hétérozygotie des descendants et une diversité génétique et pathologique avec le
développement de nouvelles races du pathogène de haute virulence (Kaiser , 1997 ; Akem,
1999 ; Armstrong et al, 2001 ; Chongo et al, 2004 ; Taleei et al, 2009). Les organes de
reproduction sexuées sont ;
a. Le pseudothèce : mesure 76-152 * 120-250µm (Nene et Reddy, 1987), il
renferme des asques (Fig. 4d).
b. Les asques : mesurent 48-50 * 10-12µm (Nene et Reddy, 1987), chaque asque
contient huit ascospores (Fig. 4e).
c. Les ascospores : mesurent 13.5-17.25 * 6-6.75µm (Nene et Reddy, 1987).
2.1.1.3. Les caractéristiques macroscopiques
Les souches d’Ascochyta rabiei présentent une variabilité morphologique, les
colonies apparaissent en premier temps blanches et deviennent par la suite marrons foncés
à noires suite au développement des conidies après 3 à 4 jours d’incubation (Khan et al,
1999). La croissance du champignon est très lente et présente après repiquage des stries
concentriques très caractéristiques (Champion, 1997) dues au photopériodisme (Fig. 4f).
Etude bibliographique
16
Figure 4 : Caractéristiques microscopiques et macroscopique d’Ascochyta rabiei.
a : Pycnide ; b : Pycnidiospores monocellulaire et bicellulaire (flèche) ; c : Mycelium d’Ascochyta
rabiei ; d : Pseudothèce d’Ascochyta rabiei (Rhaïem et al, 2006) ; e : Asque d’Ascochyta rabiei
(Rhaïem et al, 2006) ; f : Aspect macroscopique d’Ascochyta rabiei
a
b c
f e d
Etude bibliographique
17
2.1.1.4. Pouvoir pathogène
Le degré élevé de la variabilité pathologique observé à l’intérieur de la population
d’Ascochyta rabiei à l’égard des variétés de pois chiche peut être du à plusieurs facteurs.
Cette variabilité est due à la reproduction sexuée et la combinaison de la diversité
génétique (Chongo et al, 2004; Chang et al, 2008). Les mutations qui peuvent se produire
au niveau du génome fongique et le phénomène de migration du champignon à l’échelle de
continents contribuent aussi à cette diversité (Lepoivre, 2003). Les isolats d’Ascochyta
rabiei dans le subcontinent indien ont été trouvés plus virulents que celle en Algérie et au
Liban (Singh et al, 1984). Atinsky et al, 2005 suggèrent que la variabilité du pathogène
observée d’un pays à un autre peut être due à un phénomène d’adaptation de ce dernier aux
conditions environnementaux. On parle de pathotypes.
2.1.2. Processus infectieux
Les spores portés par le vent se fixent sur l’hôte, cette fixation est facilitée par la
sécrétion d’une substance mucilagineuse (Jayakumar et al, 2005) qui permet la protection
du champignon contre la dessiccation (Höhl et al, 1990). La germination des spores et le
développement du tube germinatif sont observés après 12 à 48h de l’inoculation avec une
ramification des hyphes et développement de l’apressorium à leurs extrémités (Höhl et al,
1990). Les spores produisent des toxines qui jouent un rôle très important (Höhl et al,
1991 ; Chen et Strange, 1991) causant la destruction des tissus de l’hôte (Tivoli et Banniza,
2007), plusieurs toxines peuvent être secrétées ; solanapyrone A, B et C (Höhl et al, 1991),
cytochalasin D (Latif et al, 1993), proteinaceous phytoxin (Chen et Strange, 1994).
Le champignon peut pénétrer directement à travers la cuticule de la tige (Jayakumar
et al, 2005) et diffuse à travers le phloème, ou indirectement à travers l’espace
intercellulaire entre les cellules épidermiques et les cellules du parenchyme palisadique des
feuilles sans invasion des cellules vers le pétiole jusqu’à la tige (Höhl et al, 1990 ;
Jayakumar et al, 2005).
Le temps d’incubation et de latence est la période entre la pénétration du pathogène
et l’apparition des premiers symptômes dans l’hôte, la longueur de cette phase est
influencée par la température et l’humidité (Tivoli et Banniza, 2007), elle varie en fonction
de la souche et la variété. Les symptômes apparaissent et se manifestent par l’expression
des lésions caractéristiques.
Etude bibliographique
18
La sévérité de la maladie est influencée par la température et la durée de l’humidité
et leurs interactions (Trapero-Casas et Kaiser, 1992). L’humidité est le facteur le plus
important pour le développement des champignons phytopathogènes, la germination des
conidies et la pénétration du tube germinatif augmentent linéairement avec l’augmentation
de la durée d’humidité et la sévérité de la maladie atteint son maximale après 18h
d’humidité (Jhorar et al, 1998). La température optimale pour le développement de la
maladie est 20°C (Trapero-Casas et Kaiser, 1992), une température inférieure a 18°C ou
supérieur a 28°C inhibe de développement de la maladie (Höhl et al, 1990).
La concentration de l’inoculum influe aussi sur la sévérité de la maladie et son effet
dépend de la sensibilité de la plante, Trapero-Casas et Kaiser, 1992 ont remarqués que chez
les plantes sensibles la sévérité est plus de 50% pour toutes les concentrations testées alors
que chez les plantes résistantes présentent un maximum de 12.7% lorsque la concentration
de l’inoculum est maximale (107 conidies/ml).
Figure 5 : Structure des Solanapyrones (Bahti et Strange, 2004)
Solanapyrone A Solanapyrone B Solanapyrone C
Etude bibliographique
19
2.1.3. Cycle de la maladie
Le stade anamorphe : Ascochyta rabiei
Les graines infectées sont la source principale de l’infection primaire du pois chiche
et transmettent la maladie aux tiges et folioles de la plante (Fig. 6) sur laquelle apparaissent
des symptômes qui se manifestent par des tâches concentriques caractéristiques.
A la surface des tâches se développent les pycnides qui libèrent à maturité des
pycnidiospores constituant l’inoculum pour l’infection secondaire et qui vont être dispersés
par le vent et la pluie.
Le stade anamorphe est influencé par l’humidité relative (Navas-Cortes et al, 1998)
qui déterminera la croissance du champignon dans les tissus de la plante et les débris.
Le stade téléomorphe : Didymella rabiei
Le stade téléomorphe : Didymella rabiei (synonyme : Mycosphaerella rabiei) croit
saprophtytement dans les débris de pois chiche infectés (Fig. 6). Il commence en automne
par la formation des pseudothèce (Navas Cortes et al, 1995) qui libèrent, après maturation,
au début du printemps les ascospores. Ce stade comporte une étape de plasmogamie (fusion
de protoplaste) de deux cellules sexuées compatibles : l’anthéridie (gamétange mâle) et
l’ascogone (gamétange femelle) suivis d’une caryogamie (fusion des noyaux) et d’une
méiose qui aboutit à la formation d’asques dans lesquels se forment huit ascospores viables.
Apres maturation, les ascospore seront aéroportées et constituent une source d’inoculation
primaire permettant ainsi la propagation de la maladie et la survie de l’agent pathogène. A
ce stade, la sévérité de la maladie est corrélée avec la maturation du pseudothèce et la
production et la libération des ascospores (Trapero-Casas et al, 1996).
La capacité de ce champignon à survivre est limitée au genre Cicer et elle dépend de
son mode de propagation et de sa conservation.
Le développement des deux stades dépend des conditions environnementales et/ou
nutritionnelles, le pseudothèce se développe dans un environnement pauvre en nutriment
alors que la formation des pycnides nécessite la disponibilité des nutriments (Tivoli et
Banniza, 2007).
Etude bibliographique
20
Etude bibliographique
21
2.1.4. Symptômes
Sous des conditions favorables au développement du champignon, les symptômes
sont susceptibles de se manifester sur toutes les parties aériennes de la plante (Viennot et
Bourgin, 1949).
a. Sur les tiges : les lésions sont allongées mesurant 3 à 4 cm de longueur qui
peuvent entrainer la cassure de l’organe (Fig. 7a).
b. Les folioles : Des altérations nécrotiques se manifestent par l’apparition sur les
feuilles de tâches arrondies ou ovales qui peuvent atteindre jusqu'à 8 à 10 mm de
diamètre (Fig. 7b).
c. Sur les gousses et les graines : Sur les gousses apparaissent également des cercles
concentriques de 0,5 cm de diamètre (Fig. 7c et 7d) et le champignon peut ainsi
pénétrer dans la gousse et infecter la graine sur lesquelles une décoloration et des
nécroses irréguliers sont observés.
Le champignon peut être localisé à l’extérieur ou à l’intérieur de la graine ainsi
qu’il peut pénétrer dans les cotylédons et infecter rarement l’embryon. Lorsque le
champignon est proche des cotylédons il provoque la diminution de la
germination et les plantes issues présentent un taux élevé de symptômes
(Mitsueda et al, 2001).
Etude bibliographique
22
Figure 7 : Symptômes de l’anthracnose du pois chiche (Cicer arietinum L.).
a : Symptômes de l’anthracnose sur la tige ; b : Symptômes de l’anthracnose sur les folioles de pois
chiche ; c : Symptômes de l’anthracnose sur les gousses jeunes de pois chiche ; d : Symptômes de
l’anthracnose sur les gousses mûres de pois chiche
a b
c d
Etude bibliographique
23
2.2. Mécanisme de résistance de l’hôte
Lors des interactions hôte-pathogène, la plante réagit par développement d’un
mécanisme de résistance en synthétisant les phytoalexines, les composés phénoliques et les
enzymes de défense.
Les composés phénoliques sécrétés par Cicer arietinum L. sont des isoflavones ;
Biochanin A et Formononetin (Weigand et al, 1986), leur synthèse est constitutive
(Kebmann et Barz, 1987), présents à l’intérieur des cellules avant l’infection.
L’accumulation des Biochanin A et Formononetin (Fig. 8) est observée chez la variété
résistante (ILC3279) comme chez la variété sensible (ILC1929) avec une somme identique
entre les deux variétés (Weigand et al, 1986 ; Kebmann et Barz, 1987). La quantité de
Biochanin A est plus importante que la somme de Formononetin produit (Kebmann et
Barz, 1987).
Figure 8 : Structure des composés phénoliques sécrétés par Cicer arietinum L.
(Chérif et al, 2007)
Les phytoalexines Medicarpin et Maackiain (Fig. 9) sont des composés phénoliques
extracellulaires, leur synthèse est induite suite à une élicitation (Kebmann et Barz, 1987 ;
Daniel et al, 1990). Ces composés inhibent l’extension du mycelium lors de sa pénétration
dans les cellules de la plante (Jayakumar et al, 2005 ; Kavousi et al, 2009), Ils forment un
complexe avec les protéines solubles et extracellulaires et les parois des cellules
Biochanin A Formononetin
Etude bibliographique
24
microbiennes causant la perturbation de leurs membranes. La quantité des phytoalexines
sécrétée par la variété résistante (ILC3279) est plus importante que celle de la variété
sensible (ILC1929) (Weigand et al, 1986 ; Kebmann et Barz, 1987) et l’accumulation des
Maackiain est plus faible que les Medicarpin chez les deux variétés (Daniel et al, 1990).
Figure 9 : Structure des phytoalexines sécrétés par Cicer arietinum L. (Chérif et al, 2007)
Les enzymes de défense comportent la Chitinase, la Peroxidase et la B-1,3 glucanase.
Chez la variété sensible, une somme limitée d’enzymes (chitinase, B-1,3 glucanase) sont
sécrétées qui est insuffisante pour l’inhibition de la croissance du champignon. Chez la
variété résistante la quantité de ses enzymes est grande. L’accumulation des enzymes
extracellulaires à activité hydrolase va jouer un rôle très important dans le mécanisme de
défense et déterminera l’interaction incompatible (Vogelsang et Barz, 1990).
Chez les cultivars de pois chiche sensibles le stade de développement de la plante
n’affecte pas la progression de la maladie qui est néfaste aux différents stades (Chongo et
Gossen, 2001), alors que chez les cultivars résistants la résistance varie en fonction de
l’âge de la plante, elle diminue avec le développement de la plante. Cette réponse est
probablement liée à la diminution de l’expression des gènes de résistances (Basandrai et al,
2007).
Medicarpin Maackiain
Etude bibliographique
25
2.3. Moyens de lutte
2.3.1. La lutte chimique
La lutte chimique consiste à utiliser des fongicides qui peuvent être appliqués sur les
graines ou au stade de floraison. Les graines présentent la source principale de l’infection,
leurs traitements avec des fongicides comme Benomyl et Thiabendazole réduisent le
développement du champignon (Gan et al, 2006). L’application au stade de floraison ou de
formation des gousses augmente la quantité et la qualité des graines et réduit la sévérité de
l’anthracnose (Shahid et al, 2008).
Le traitement par les fongicides présente des risques de toxicités chimiques pour
l’homme et l’environnement, ainsi le champignon peut développer une résistance (Chérif et
al, 2007) qui est un processus d’adaptation empêchant le fongicide d’atteindre son site
d’action. Afin de maintenir une bonne efficacité d’une lutte chimique, des stratégies anti
parasitaires sont utilisés comme la limitation des nombres d’applications et l’association
des produits antiparasitaires à modes d’action différents (Gan et al, 2006).
2.3.2. La lutte culturale
L’utilisation de graines saines de qualités supérieures est toujours recommandée pour
s’assurer de l’absence totale d’Ascochyta. La destruction des plantes malades et la
désinfection du matériel utilisé sont des pratiques très importantes dans le contrôle de la
maladie. L’application des barrières horizontales par l’utilisation des plantes non hôtes
pour limiter la dispersion horizontale du champignon (Gan et al, 2006).
Ce champignon peut survivre de trois à quatre ans dans les débris de pois chiche
infectés. La rotation de culture chaque 3 ans (Kaiser, 1997) avec des plantes non hôtes
entre les cultures de pois chiche arrête le cycle de la maladie et réduit les changements des
structures des populations du pathogène (Chang et al, 2008). La lutte culturale vise à
accroitre la production agricole plutôt que de lutter contre les maladies. Ce type de lutte
n’est pas suffisant lorsque la pression de la maladie est élevée.
Etude bibliographique
26
2.3.3. La lutte biologique
La lutte biologique consiste à utiliser des organismes vivants antagonistes dont le but
de réduire la densité de l’inoculum de l’agent pathogène ou d’altérer son activité. La
résistance du pois chiche vis-à-vis des attaques pathogéniques par le contrôle biologique
fait appel a des bactéries (Genre : Bacillus, Pseudomonas et Rhizobium) et des
champignons (Genre : Fusarium non pathogène) antagonistes. Les agents de lutte
biologique vont permettre d’induire une résistance chez la plante à travers l’accumulation
des composés phénoliques et de phytoalexines et l’activation de ces mécanismes de défense
(Chérif et al, 2007).
2.3.4. Biotechnologie et amélioration des plantes
Les biotechnologies végétales reposent principalement sur les cultures in vitro qui
permettent la manipulation d’une grande quantité de plante dans un espace réduit ainsi la
conservation et le maintien des génotypes dans des conditions protectrices vis-à-vis des
microorganismes (Haïcour, 2002).
Le criblage in vitro est une méthode de sélection opérée à des explants végétaux
cultivés in vitro, en se basant sur des critères marqueurs. Trois critères de sélection des
individus résistants sont utilisés pour l’amélioration des plantes ; les critères phénotypiques
(observation des symptômes), les critères biochimiques (production des protéines et des
métabolites secondaires) et les critères moléculaires (information génétique de la plante).
Deux procédés de criblages sont appliqués dans la culture in vitro soit par co-culture
du pathogène et des tissus de l’hôte, soit par culture de l’hôte sur un milieu contenant des
toxines (Lepoivre, 2003), Ces méthodes permettent de rechercher une corrélation entre la
résistance in vitro des génotypes végétaux au stade cal et leurs résistances au champ, elles
nécessitent l’utilisation d’un agent sélective efficace et un système de régénération
permettant de régénérer des plantes résistantes (Vardi et al, 1986).
Les toxines purifiées ou le filtrat de culture contenant des métabolites toxiques
peuvent être utilisés comme agent de sélection. Behenke 1979 a pu régénérer des plantes de
pomme de terre résistants à partir des cals résistants au filtrat de culture de Phytophthora
infestans se qui indique la persistance de la résistance à travers la régénération.
Etude bibliographique
27
Cette méthode de sélection permet d’améliorer la résistance de la plante par
l’amélioration de l’expression des protéines reliées à la pathogénicité de la plante. Ahmed
et al, 1996 signalent la possibilité de sélectionner des cals de blé résistants au filtrat de
culture de Fusarium et de régénérer des plantes fertiles avec une résistance améliorée.
Ganesan et Jayabalan, 2006 ont pu régénérer pour la première fois des plantes de Coton
résistantes à partir de culture de cals confrontés au filtrat de culture de Fusarium
oxysporum. Les plantes régénérées produisent une quantité plus importante de chitinase qui
leurs permettent de résister à Fusarium oxysporum et à Alternaria macrospora.
Gayatri et al, 2005 ont pu régénérer des plantes tolérantes de Curcuma longa L. après
trois cycles de sélection des cals tolérants au filtrat de culture de Pythium graminicolum ce
qui indique une stabilité génétique. Rao et Ramgoapl, 2010 ont pu régénérer des plantes de
Tournesol (Helianthus annuus L.) à partir des cals tolérants au filtrat de culture
d’Alternaria helianthi.
Chapitre II :
Matériel et Méthodes
Matériel et méthodes
28
1. Matériel biologique
1.1. Matériel végétal
Trois génotypes de pois chiche ont été utilisés INRAT 199, Twist et Flip 82-150C.
Figure 10 : Génotypes de pois chiche INRAT 199 (a), Twist (b) et Flip 82-150C (c).
1.2. Matériel fongique
Les isolats des champignons utilisés pour cette étude ont été fournis par le laboratoire
de microbiologie de l’université d’ORAN (ES-SENIA). Ces isolats proviennent de cultures
monospores et ont été conservés dans le glycérol à 4°C (Mme Khouadjia).
1. Méthodes
2.1. Repiquage du champignon Ascochyta rabiei
Des cercles de 1cm du champignon débarrassés de l’huile avec du papier filtre stérile
sont déposés sur milieu pois chiche solide coulé en boite. Les boites sont mises en
conditions favorables de croissance du champignon (22°C, 12h d’éclairage). Afin de
maintenir les isolats en culture pure, deux à trois repiquages successifs sur le même milieu
ont été effectués.
Observation microscopique
Des fragments de mycelium d’Ascochyta rabiei sont déposés sur une lame. Elles sont
recouvertes par une goutte de bleu de coton. L’ensemble est recouvert d’une lamelle.
L’observation microscopique est réalisée à un grossissement (GX10 et GX40).
a b c
Matériel et méthodes
29
2.2. Préparation du filtrat de culture d’A. rabiei
Le milieu utilisé pour la préparation du filtrat de culture est le milieu Czapek liquide
modifié. Sa préparation est la suivante :
200 g de graines de pois chiche sont cuits dans l’eau distillée. Le bouillon de cuisson
est récupéré et auquel sont ajoutés les composés du milieu Czapek (voir annexe). Le milieu
est réparti à raison de 100 ml dans des erlenmeyer de 250 ml. Après autoclavage, chaque
erlenmeyer est ensemencé avec 2 disques de mycelium de 1cm de diamètre des isolats âgés
de 15 jours. L’ensemble des erlenmeyer est expos aux conditions citées précédemment.
Après la période d’incubation, le mycelium est séparé du milieu par filtration
grossière en utilisant un papier Whatman N°1.
2.3. Dosage du filtrat de culture d’A. rabiei
2.3.1. Dosage des protéines (Méthode de Bradford, 1976)
Principe
La méthode de Bradford est une méthode de dosage des protéines. Elle est basée sur
une réaction colorimétrique entre les protéines et un réactif (bleu de Coomassie).
Le résultat se manifeste par une coloration due à une réaction entre les acides aminés
aromatiques (tryptophane, tyrosine et phenylalanine) et leurs résidus hydrophobes
présentent dans les protéines. La forme anionique (liée) du colorant est bleu alors que la
forme cationique (libre) est rouge et verte. Le changement d'absorbance est proportionnel à
la quantité de colorant lié, indiquant donc la concentration en protéines dans l'échantillon.
Mode opératoire
Préparation du réactif de Bradford : 100 mg du Bleu de Coomassie G25 sont dissous
dans 50 ml éthanol 95°, 100 ml d’acide phosphorique (H3PO4) 85% sont ajoutés.
Le mélange est dilué dans 1l d’eau distillée puis filtré (papier Whatman N°1).
Préparation de la gamme étalon : une gamme de 10 tubes contenant de 10 à 100 ug de
protéines par tube est réalisée à partir de la solution mère BSA (Bovine Serum Albumin)
1 mg/ml.
Matériel et méthodes
30
Tableau 4: Gamme étalon pour le dosage des protéines.
Dilution Témoin 1/2 1/4 1/6 1/8 1/10 1/12 1/14 1/16 1/18 1/20 essai
Concentration
des protéines
(µg/ml)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
?
Solution BSA
(µl)
/ 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0
Eau distillée
(µl)
1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910 900 900
Réactif de
Bradford
(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Filtrat brute 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100
Le réactif est ajouté au même moment dans tous les tubes afin que la coloration se
développe dans les mêmes conditions pour la gamme étalon et l'échantillon à doser.
L'absorbance de tous les tubes est ensuite mesurée au spectrophotomètre à 595 nm.
2.3.2. Dosage des sucres (Méthode de Dubois et al, 1956)
Principe : La méthode de DUBOIS et al (1956) permet de doser les sucres en
utilisant le phénol et l'acide sulfurique concentré. En présence des deux réactifs, les oses
donnent une couleur jaune-orange dont l'intensité est proportionnelle à la concentration des
glucides. La densité optique est déterminée à 490nm.
Matériel et méthodes
31
Tableau 5: Gamme étalon pour le dosage des sucres.
Dilution Témoin 1/2 1/4 1/6 1/8 1/10 1/12 1/14 1/16 1/18 1/20 essai
Concentration
des sucres
(µg/ml)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
?
Solution de
glucose (µl)
/ 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0
Eau distillée
(µl)
1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910 900 900
Acide
sulfurique
concentré (ml)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Solution
phénolique à
5% (µl)
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
200
Filtrat brute 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100
2.4. Préparation du semis
Après une désinfection des graines par trempage dans l’hypochlorite de sodium 5%
pendant 1 min afin d’éliminer les saprophytes. Elles sont répartis dans des boites stériles
contenant du papier filtre imbibé par l’eau distillée stérile. Les boites sont incubées
à l’obscurité dans l’étuve à 22°C. Les graines germées sont repiquées en pot pour fournir
les plantules.
2.5. Culture in vitro
Après trois semaines de mise en culture, deux types d’explants sont prélevés à partir
des plantules (folioles et les entre nœuds de tiges) en évitant de prendre les zones
méristématiques. Ces derniers ont une taille de 0.5 cm de long.
Les explants de folioles et d’entre nœuds de tiges sont désinfectés avec de l’éthanol
70% pendant 30 secondes et ensuite avec une solution d’hypochlorite de sodium 5%
pendant 3 min.
Les explants sont transférés dans des boites de Petri contenant les différents milieux
de culture à raison de dix explants par boite. L’incubation est faite dans la chambre de
culture (photopériode 16h, température 22°C). Les milieux de culture M1, M2, Ma et M8
Matériel et méthodes
32
correspondent aux macroéléments et aux microéléments de Murashige
et Skoog additionnés de différentes recombinaisons hormonales de ;
2,4-D (Acide 2,4-Dichlorophenoxyacetique), ANA (Acide Naphthaleneacetique),
BAP (Benzylaminopurine) et KIN (Kinétine) (Tab. 6).
Tableau 6: Les différentes combinaisons hormonales additionnées au milieu MS.
Hormones
Milieux
Auxines (mg/l) Cytokinine (mg/l)
2,4-D ANA BAP KIN
M1 3 - 3 -
M2 3 - 0,1 -
Ma 2 - - 4
M8 2 4 - 1
2.6. Interaction cals C. arietinum- filtrat d’A. rabiei
Les cals de chaque génotype sont transférés sur le milieu MS contenant le filtrat de
culture de chaque isolat (H1 et E7) à la proportion de 50% (V/V). Le témoin est préparé en
remplaçant le filtrat de culture par l’eau distillée stérile. Les résultats sont mentionnés
après une semaine d’incubation dans les mêmes conditions et la sensibilité des cals est
estimée par évolution nécrotique.
2.7. Dosage des phénols
2.7.1. Extraction des polyphénols totaux (Naz, 1996 ; Naz et al, 2008a)
Après 96h de confrontation, Les cals sont bouillis dans le méthanol pendant
5 minutes (Fig. 11a), puis homogénéisés dans un mortier. Le mélange est filtré a travers un
papier filtre (Whatman N°1) et les débris sont lavés avec du Méthanol acidifié 80%
(HCl 0.1M). 2 ml d’eau distillée sont additionnés. L’extrait est concentré en volume
aqueux par évaporation par évaporateur rotatif sous pression à 40°C (Fig. 11b). L’extrait
aqueux est centrifugé à 6000 tours/min pour écarter la chlorophylle et les débris fins. Une
solution mère est préparée avec l’eau distillée pour obtenir une concentration final de
Matériel et méthodes
33
1g/ml (1g de cal/ 1ml d’eau distillée), cette solution est utilisée pour l’estimation
quantitative des composés phénoliques.
Figure 11 : Extracteur sous reflux (a) et Evaporateur rotatif (b).
2.7.2. Dosage des polyphénols totaux
Principe
Les composés phénoliques sont oxydés par les acides phosphotungstique et
phosphomolybdique et ceux-ci sont réduits en oxyde bleu de tungstate et de molybdène.
La coloration bleue développée présente un maximum d’absorbance à 760 nm.
Dosage
L’analyse quantitative des polyphénols totaux est réalisée par le dosage
spectrophotométrique selon la méthode de Folin Ciocalteu (Singleton et al, 1999 ;
Heilerova et al, 2003).
Dans des tubes à essai, on additionne à 100 µl d’extrait (dissous dans l’eau à une
concentration de 1g/ml) 500 µl de Folin Ciocalteu (Merck) (1/10 dissout dans l’eau
distillée). On agite et on laisse à l’obscurité pendant 5 min à température ambiante, ensuite
on ajoute 1.5 ml d’une solution de Na2CO3 saturée à l’ensemble (2%, dissout dans L’H2O).
On agite encore et on laisse à l’obscurité pendant 1 heure à température ambiante,
la couleur jaune du réactif vire au bleu. Les dosages subissent deux répétitions.
Les densités optiques sont lues au spectrophotomètre à 765 nm.
a b
Matériel et méthodes
34
La quantification des polyphénols a été évalué au moyen d’une courbe d’étalonnage
linéaire y= ax + b réalisée à l’aide de différentes concentrations d’acide gallique à partir
d’une solution mère d’acide gallique de 1mg/ml dissout dans l’eau distillée (Tab. 7).
Cette courbe est réalisée dans les mêmes conditions opératoires que les échantillons.
Les résultats sont exprimés en mg d’équivalent d’acide gallique par gramme
d’extrait, ils représentent la moyenne de 2 répétitions.
Le blanc est préparé en remplaçant la quantité de l’extrait par l’eau distillée dans les
mêmes conditions.
Tableau 7: Gamme étalon pour le dosage des polyphénols totaux.
Tubes 1 2 3 4 5 6 7 8
Concentration 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.04 0.05
Solution mère
d’acide gallique (µl)
5 10 15 20 25 30 40 50
Eau distillée (µl) 995 990 985 980 975 970 960 950
2.8. Analyse statistique
Les résultats de la culture in vitro sont exprimés en pourcentage, une étude statistique
par analyse de variance était réalisée.
Les résultats du dosage des polyphénols totaux sont exprimés sous forme de
moyenne calculée sur la moyenne de deux répétitions.
Les données expérimentales sont présentées sous forme d’histogramme et courbe
pour l’étalon.
Le coefficient de corrélation R2 entre les DO et les concentrations des étalons sont
calculés à l’aide du logiciel Microsoft Excel 2007.
Chapitre III :
Résultats et Discussion
Résultats et Discussion
35
1. Partie culture in vitro du pois chiche
1.1. Résultats
Les résultats obtenus montrent qu’une callogenèse a pu être obtenue chez
Cicer arietinum dans les conditions testées. Elle est influencée par le génotype, organe
(entre nœuds et folioles) et la balance hormonale (nature et concentration). Le traitement
statistique des résultats a confirmé les différences de pourcentages obtenus en fonction de
ces facteurs. La différence est significative entre les génotypes pour la production des cals
en présence de différentes combinaisons hormonales (Tab. 8 et 9).
Les concentrations des combinaisons hormonales auxine et cytokinine (2,4-D et
ANA/BAP et Kinétine) ont induit la formation des cals à partir des entre nœuds et de
folioles chez les trois génotypes de pois chiche (INRA 199, Twist et Flip 82-150C).
Le délai d’apparition des cals est variable selon l’organe. Ce sont les entre nœuds qui
ont subi leurs premières divisions cellulaires au bout de dix jours par contre les folioles
initient leurs mitoses quinze jours plus tard. C’est au bout d’un mois que des cals sont
obtenus chez les deux explants.
Cette callogenèse est influencée par un ensemble de facteurs. Elle est variable en
fonction du génotype, de l’organe (entre nœuds ou foliole) et des hormones (nature et
concentrations).
1.1.1. Cas des explants d’entre nœuds
Après un mois de mise en culture, les explants d’entre nœuds des trois génotypes ont
abouti à la formation des cals d’aspect dur de couleur verte (Fig. 16). L’importance et le
délai de cette callogenèse sont variables selon le génotype et les régulateurs de croissance.
D’une manière générale, les fragments d’entre nœuds ont réagi très favorablement aux
combinaisons hormonales employées (Tab. 14 annexe), Les taux varient de 80% à 100%
(Fig. 12, 13 et 14).
Une prolifération très importante et plus rapide est observée chez les explants du
génotype D2 cultivés sur le milieu M1 (Fig.16b et b1) contenant un rapport
Auxine/Cytokinine égal à 1 (3 mg/l 2,4-D, 3 mg/l BAP). Ce même milieu est très favorable
Résultats et Discussion
36
en induisant des taux de cals très élevés 98.3% de cals chez le génotype INRAT 199 (D1),
93.7% chez le génotype Twist (D2) et 90% chez le génotype Flip82-150C (D3).
Le milieu M2 comportant une grande quantité d’une auxine forte (3mg/l 2,4-D) et
une faible quantité de Cytokinine (0.1 mg/l BAP) s’est révélé aussi efficace. Les
pourcentages de cals sont respectivement de 98.3% chez le génotype D1 (INRAT 199),
93.7% chez le génotype D2 (Twist) et de 79.5% chez le génotype D3 (Flip82-150C).
Le milieu Ma constitué d’un rapport Auxine/Cytokinine égal à 1/2 (2mg/l 2,4-D et
4 mg/l Kinétine) s’est montré très intéressant en favorisant une callogenèse de 100% chez
le génotype D2. L’emploi de deux auxines fortes (2 mg/l 2,4-D et 4 mg/l ANA) combinées
à une Cytokinine (1 mg/l Kinétine) chez le milieu M8 a donné des résultats similaires aux
autres milieux.
Résultats et Discussion
37
Figure 12 : Effet des différents milieux sur la formation des cals à partir des explants
d’entre nœuds du génotype D1 (INRAT 199).
Figure 13 : Effet des différents milieux sur la formation des cals à partir des explants
d’entre nœuds du génotype D2 (Twist).
Figure 14 : Effet des différents milieux sur la formation des cals à partir des explants
d’entre nœuds du génotype D3 (Flip 82-150C).
Résultats et Discussion
38
Figure 15 : Initiation de la callogenèse des explants d’entre nœuds des trois génotypes D1
(INRAT 199), D2 (Twist) et D3 (Flip 82-150C) sur les deux milieux M1 et M2.
a : Initiation de la callogenèse chez les explants d’entre nœuds du génotype D1 (INRAT 199) sur
le milieu M1 ; b : Initiation de la callogenèse chez les explants d’entre nœuds du génotype D2 (Twist) sur
le milieu M1 ; c : Initiation de la callogenèse chez les explants d’entre nœuds du génotype D2 (Twist) sur
le milieu M2 ; d : Initiation de la callogenèse chez les explants d’entre nœuds du génotype D3
(Flip 82-150C) sur le milieu M2.
b
c
a
d
Résultats et Discussion
39
Figure 16 : Cals âgés d’un mois des explants d’entre nœuds des deux génotypes D1
(INRAT 199) et D2 (Twist) sur les deux milieux M1 et M2.
a, a1 et a2 : Cals âgés d’un mois des explants d’entre nœuds du génotype D1 (INRAT 199) sur
le milieu M1 ; b et b1: Cals âgés d’un mois des explants d’entre nœuds du génotype D2 (Twist) sur
le milieu M1 ; c : Cals âgés d’un mois des explants d’entre nœuds du génotype D2 (Twist) sur le
milieu M2.
a
b1
c
b
a1
a2
Résultats et Discussion
40
Tableau 8 : Etude statistique (analyse de variance ANOVA) sur l’effet des trois
facteurs (explant-génotype-milieu) sur l’initiation de la callogenèse chez les entre
nœuds de Cicer arietinum L.
Entre nœuds D1 D2 D3
M1 59 30 36 n = 4
M2 58 30 39
Ma 51 24 47 k = 3
M8 53 79 26
Somme T1= 221 T2= 163 T3= 148 G= 532
Moyenne 55.25 40.75 37 Total= 133
X 12255 8617 5702 Total= 26574
Erreur 44.75 1974.75 226 Total= 2245.5
Signification S
SCE inter-groupe = 743.17
Variance inter-groupes = 371.58
SCE intra-groupe = 2245.5
Variance intra-groupes = 249.5
F calculé = 1.48
Valeur de F ayant 5% de chances d’être dépassés est 4.256 (F théorique).
F calculé < F théorique
La différence est significative entre les génotypes pour la production des cals en
présence de différentes combinaisons hormonales.
Résultats et Discussion
41
1.1.2. Cas des explants de folioles
Après un mois de mise en culture, Les explants de folioles des trois génotypes
forment des cals friables de couleur blanche à marron (Fig. 22, 23 et 24). Le
déclenchement des mitoses se manifestent au niveau la nervure principale (Fig. 20 b1),
l’extrémité du limbe (Fig. 21 a1) et la zone d’excision (Fig. 21 a2). Ces cals ont donc
plusieurs origines.
Les résultats consignés au tableau 15 (annexe) montrent que les pourcentages de cals
sont variables en fonction du génotype et de la combinaison hormonale. Ils varient de
100% à 22% d’une façon générale. Les taux les plus élevés vont de 100% à 89%.
Les pourcentages 100% de cals sont obtenus de manière variable avec des
régulateurs de croissance diversifiés en nature et en concentration. Ils sont signalés chez le
génotype D2 (Twist) sur trois milieux M1, Ma et M8 (Fig. 18). Le milieu M1 contient un
rapport auxine/cytokinine égal à 1 (3mg/l 2,4D et 3mg/l BAP). Le milieu Ma renfermant la
même auxine (2mg/l 2,4D) que le milieu M1 mais une autre cytokinine (4 mg/l Kinétine).
Le milieu M8 comporte deux auxines (2mg/l de 2,4D et 4mg/l de NAA) et la même
cytokinine que le milieu Ma (1mg/l de Kinétine). Le même pourcentage de 100% est
signalé chez un autre génotype D3 (Flip 82-150C) sur le milieu M1 (Fig. 19).
Les plus bas pourcentages de cals formés sont obtenus chez les folioles du génotype
D3 sur les deux milieux M8 (22%) et Ma (32%). Ces faibles taux sont probables liés à la
majorité des explants qui se nécrosent ce qui réduit l’effectif des folioles aptes à la
callogenèse.
Résultats et Discussion
42
Figure 17 : Effet des différents milieux sur la formation des cals à partir des explants de
folioles du génotype D1 (INRAT 199).
Figure 18 : Effet des différents milieux sur la formation des cals à partir des explants de
folioles du génotype D2 (Twist).
Figure 19 : Effet des différents milieux sur la formation des cals à partir des explants de
folioles du génotype D3 (Flip 82-150C).
D3
Résultats et Discussion
43
Figure 20 : Initiation de la callogenèse des explants de folioles du génotype D1
(INRAT 199) sur le milieu M8 et du génotype D3 (Flip 82-150C) sur le milieu M2.
a, a1 : Initiation de la callogenèse des explants de folioles du génotype D1 (INRAT 199) sur le
milieu M8 ; b, b1 : Initiation de la callogenèse des explants de folioles du génotype D3
(Flip 82-150C) sur le milieu M2.
a a1
b1 b
Résultats et Discussion
44
Figure 21 : Initiation de la callogenèse des explants de folioles du génotype D2 (Twist) sur
les deux milieux M1 et M2.
a, a1 et a2 : Initiation de la callogenèse des explants de folioles du génotype D2 (Twist) sur le
milieu M1 ; b et c : Initiation de la callogenèse des explants de folioles du génotype D2 (Twist) sur
le milieu M2.
a a2
a1
c b
Résultats et Discussion
45
Figure 22 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D1 (INRAT 199) sur
les milieux M1, M2 et M8.
a et a1 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D1 (INRAT 199) cultivés sur le
milieu M1 ; b, b1 et b2 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D1 (INRAT 199)
cultivés sur le milieu M2 ; c et c1 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D1
(INRAT 199) cultivés sur le milieu M8.
c
b a
a1
c1
b1
b2
Résultats et Discussion
46
Figure 23 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D2 (Twist) cultivés
sur les milieux M1, M2 et Ma.
a : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D2 (Twist) cultivés sur le milieu M1 ;
b et c : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D2 (Twist) cultivés sur le milieu
M2 ; d, d1, d2, d3 et d4 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D2 (Twist)
cultivés sur le milieu Ma.
a
b c
d
d1
d3
d2
d4
Résultats et Discussion
47
Figure 24 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D2 (Twist) cultivés
sur le milieu M8 et du génotype D3 (Flip 82-150C) cultivés sur le milieu M2.
a, a1, a2, a3, a4 et a5 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D2 (Twist) sur le
milieu M8 ; b, b1, b2, b3 et b4 : Cals âgés d’un mois des explants de folioles du génotype D3
(Flip 82-150C) sur le milieu M2.
b
a
a1
a2
a3 a4 a5
b1 b2
b3 b4
Résultats et Discussion
48
Tableau 9 : Etude statistique (analyse de variance ANOVA) sur l’effet des trois
facteurs (explant-génotype-milieu) sur l’initiation de la callogenèse chez les folioles
de Cicer arietinum L.
Folioles D1 D2 D3
M1 53 55 40 n = 4
M2 57 42 48
Ma 26 52 16 k = 3
M8 51 93 11
Somme T1= 187 T2= 242 T3= 115 G= 544
Moyenne 46.75 60.5 28.75 Total= 136
X 9335 16142 4281 Total= 29758
Erreur 592.75 1501 974.75 Total= 3068.5
Signification S
SCE inter-groupe = 2028.17
Variance inter-groupes = 1014.08
SCE intra-groupe = 3068.5
Variance intra-groupes = 340.94
F calculé = 2.97
Valeur de F ayant 5% de chances d’être dépassés est 4.256 (F théorique).
F calculé F théorique
La différence est significative entre les génotypes pour la production des cals en
présence de différentes combinaisons hormonales.
Résultats et Discussion
49
Un même milieu peut se révéler très favorable à un génotype mais il peut donner des
résultats médiocres chez un autre génotype. Les deux milieux Ma et M8 ont donné 100%
de cals chez le génotype D2 mais des taux de cals faibles (30% et 22%) chez le génotype.
D3.
Figure 25 : Effet des différents milieux sur la formation des cals à partir des explants
d’entre nœuds des trois génotypes (D1, D2 et D3).
Figure 26 : Effet des différents milieux sur la formation des cals à partir des explants de
folioles des trois génotypes (D1, D2 et D3).
Résultats et Discussion
50
Une homogénéité de texture et de coloration des cals est observée entre les trois
génotypes (Tab. 10). Les caractéristiques des cals sont influencées par la nature de
l’explant et les hormones (nature et concentration)
Tableau 10: Caractéristiques des cals issus des explants de folioles et d’entre nœuds de
trois génotypes (D1, D2 et D3) de Cicer arietinum L. sur les milieux (M1, M2, Ma et M8).
Explants
Caractéristiques
D1 (INRAT 199)
D2 (Twist)
D3 (Flip 82-150C)
Entre nœuds
Folioles
Entre nœuds
Folioles
Entre nœuds
Folioles
Réactivité
Précoce
Tardif
Précoce
Tardif
Précoce
Tardif
Taux de prolifération
(1 mois)
++
+++
+++
+++
++
+++
Nature du cal
Dure
Friable
Dure
Friable
Dure
Friable
Aspect du cal
Compact
Noduleux
Compact
Noduleux
Compact
Noduleux
Couleur des cals
Vert
Vert claire
Vert
Blanchâtre
à vert claire
Vert
Blanchâtre
à vert claire
Résultats et Discussion
51
Après le deuxième repiquage, certains cals ont commencé à brunir. Ils ont été
repiqués sur le milieu MS dont les macroéléments ont été réduits de moitié et la teneur de
saccharose baissée à 1% (Fig. 27). Ce nouveau milieu MS est additionné de charbon actif
reconnu pour ses propriétés anti oxydantes et limitant la production de phénols
responsables du brunissement des cals.
Figure 27 : Callogenèse après mise en culture des explants d’entre nœuds et de
folioles des deux génotypes Twist et Flip 82-150C sur le milieu MS à base de
charbon.
Résultats et Discussion
52
1.2. Discussion
Les divisions cellulaires et la production des cals exigent la présence des auxines et
des cytokinines. Ces phytohormones sont des composés organiques qui à faible
concentration commande une réponse physiologique chez la plante. Le rôle des auxines
in vitro est de favoriser la croissance des cals, les divisions ainsi que l’allongement
cellulaires. Les cytokinines stimulent eux aussi les divisions cellulaires. Les effets des
cytokinines sont liés à ceux de l’auxine. La callogenèse est principalement sous un contrôle
hormonal. Il existe d’autres facteurs participent à son expression et à son importance, ces
derniers se rapportent au génotype (âge, organe, taille du fragment…). Les résultats de nos
travaux vont dans ce sens. Les hormones et les génotypes testés ont permis de produire des
cals mais de manière variable chez Cicer arietinum L.
Des deux organes testés, les explants d’entre nœuds des trois génotypes ont donné les
meilleurs taux de cals avec toutes les combinaisons hormonales. L’influence de l’organe
sur la callogenèse a été étudiée par Rao et Chopra, 1987b qui rapportent que les cotylédons,
les epicotyle, les hypocotyles, les folioles, le méristème et les racines donnent des résultats
variables avec l’ANA et le BAP. Sangvan et al, 1989 signalent des réactions différentes
selon la nature de l’explant (cotylédons, hypocotyle, racine et les nœuds) de
Cicer arietinum L.
La provenance des organes semble affecter la formation des cals. Les génotypes Desi
et Kabuli présentent une différence de réponse à l’aptitude callogène (Rao et Chopra,
1987b). Les mêmes résultats sont observés dans notre cas avec le génotype Desi (génotype
D1) et les deux génotypes Kabuli (génotypes D2 et D3) qui ont donné les plus importants
taux de cals.
Ce comportement variable des différents génotypes de Cicer arietinum L. est signalé
par Sangvan et al, 1989. Les génotypes de Cicer arietinum L. testés par ces auteurs (C 235,
H 75-35 et Gora Hisari) présentent un pouvoir callogène différents selon la combinaison
hormonale (ANA, BAP, 2,4-D, IAA et Kinétine). Les folioles du génotype D2 ont exprimé
une meilleure callogenèse sur les mêmes milieux que les folioles des autres génotypes D1
(INRAT 199) et D3 (Flip 82-150C). La différence génétique entre les génotypes décrit la
différence de réponse aux régulateurs de croissance (El Far et Taie, 2009).
Résultats et Discussion
53
Les résultats de nos travaux montrent l’importance majeure des hormones. Elles
déclenchent les divisions cellulaires au sein de l’explant et leurs poursuites pour produire
des cals et elles assurent la croissance de ces cals. D’après les résultats obtenus les facteurs
de croissance employés semblent influencer cette callogenèse par leur nature et leur
concentration.
Les résultats de l’étude réalisée par Huda et al, 2003 sur Cicer arietinum, ont révélé
que les maximum de cals de cotylédones sont observés dans le milieu MS additionné de 3
mg/l 2-4D et 3 mg/l BAP. Ce rapport auxine/cytokinine égal à 1 qui semble stimuler une
bonne callogenèse avec une vitesse de croissance importante des explants d’entre nœuds du
génotype D2 (Twist).
Naz et al, 2008b remarquent une meilleure formation de cals nodulaires chez les
cotylédons et les folioles de Cicer arietinum L. sur le milieu MS (3 mg/l 2,4-D et
0,1 mg/l BAP). Les mêmes résultats sont signalés par nos travaux en utilisant cette
combinaison hormonale avec des folioles mais aussi des entre nœuds. Javed et al, 1987
observent un meilleur développement de cals friables de nœuds du génotype var. 6163 en
présence d’une grande quantité d’une autre auxine (3mg/l ANA) et maintien de la
cytokinine (0.6 mg/l BAP).
Rao et Chopra, 1987a ont remarqué que le 2,4-D associé avec kinétine produisent des
cals abondants d’épicotyle du génotype GB 256 de Cicer arietinum L. L’association de
deux auxines (2,4-D et ANA) avec la kinétine en présence des entre nœuds de INRAT199,
Twist et Flip 82-150C et des folioles de INRAT 199 et Twist a produit des cals abondants.
Résultats et Discussion
54
2. Partie interaction cals C. arietinum- filtrat d’A. rabiei
2.1. Résultats
2.1.1. Etude du champignon A. rabiei
2.1.1.1. Caractères macroscopiques
L’observation macroscopique révèle des différences entre les deux isolats dans leurs
aspects, la couleur des colonies, l’abondance du mycelium, la couleur des pycnides et du
cirrhe et la vitesse de croissance (Tab. 11). Le mycelium des deux isolats ; H1 (Fig. 28a) et
E7 (Fig. 28b) se développe en ras et une zonation est observée qui résulte de l’alternance
de la lumière. La vitesse de croissance de l’isolat E7 est plus grande.
Tableau 11: Caractéristiques macroscopiques des deux isolats d’Ascochyta rabiei.
Caractère
Isolats
Couleur des
colonies
Aspect du
mycelium
Zonation Couleur de
cirrhe
Vitesse de croissance
Diamètre (cm)
H1
Vert foncé avec des
bords clairs
Ras
+
Marron
5.9
E7
Saumon
Ras
+
Saumon
6.5
2.1.1.2. Caractères microscopiques
L’observation microscopique révèle aussi des différences entre les deux isolats ;
H1 (Fig. 28c et e) et E7 (Fig. 28d et f) qui sont mentionnés dans le tableau 12.
Tableau 12: Caractéristiques microscopiques des deux isolats d’Ascochyta rabiei.
Caractère
Isolat
Couleur des
pycnides
Sporulation
H1 Foncé +++
E7 Clair ++
Résultats et Discussion
55
Figure 28 : Aspect macroscopique et microscopique des deux isolats H1 et E7.
a : Aspect macroscopique de l’isolat H1 ; b : Aspect macroscopique de l’isolat E7 ;
c : Pycnide de l’isolat H1 (GX 40) ; d : Pycnide de l’isolat E7 (GX 40) ; e : Spores de l’isolat
H1 (GX 100), spore bicellulaire (flèche) ; f : Spores de l’isolat E7 (GX 100), spore
bicellulaire (flèche).
a b
c d
f e
Résultats et Discussion
56
2.1.2. Cas du dosage du filtrat de culture d’A. rabiei
2.1.2.1. Dosage des protéines
La concentration des protéines dans le filtrat de culture des deux isolats H1 et E7
est de 42,5 µg/ml et 77,5 µg/ml respectivement. Le contenu protéique du filtrat de l’isolat
E7 est le double de celui du filtrat de l’isolat H1 (Fig. 29).
Figure 29 : Courbe étalon du dosage des protéines par la méthode de Bradford.
2.1.2.2. Dosage des sucres
La concentration des sucres dans le filtrat de culture des deux isolats H1 et E7 est
de 307,5 µg/ml et 337,5 µg/ml respectivement (Fig. 30).
Figure 30 : Courbe étalon du dosage des sucres par la méthode de Dubois.
Résultats et Discussion
57
2.1.3. Effets du filtrat de culture d’A. rabiei sur les cals de C. arietinum
Les résultats de cette confrontation se sont manifestés en général par :
Des nécroses apparaissant au bout de 24h sur la partie au contact avec le filtrat brut.
Elles se propagent progressivement vers les parties supérieures du cal. Le filtrat brut peut
renfermer des spores et des fragments de mycelium car il n’a pas subi aucun traitement
thermique.
La croissance mycélienne des deux isolats qui est apparue à la surface du milieu
après 24h de confrontation. Elle devient intense et envahit toute la surface du cal après
72h. La croissance de l’isolat E7 est plus rapide que celle de l’isolat H1.
Les nécroses des cals et la croissance mycelienne se sont manifestées de manière
variable en fonction de l’isolat et la provenance des cals.
Après une semaine, une variation de réaction des trois génotypes aux filtrats de
culture des deux isolats est observée (Fig. 36). Une croissance mycélienne peu importante
est observée au tour des cals de folioles et d’entre nœuds du génotype D1 confrontés au
filtrat de culture de E7 (Fig. 36a), alors que chez les deux génotypes D2 (Fig. 36c) et D3
(Fig. 36e) le mycelium de l’isolat E7 à envahi totalement les cals Aucune croissance
mycélienne n’est observée autour des cals confrontés au filtrat de culture de H1 chez les
trois génotypes INRAT 199 (Fig. 36b), Twist (Fig. 36d) et Flip 82-150 (Fig. 36f). Les cals
dérivés des explants d’entre nœuds et de folioles du même génotype répondent de la même
façon en présence du filtrat de culture des deux souches.
Après deux semaines de confrontation une inhibition totale de la croissance des cals
et des brunissements généralisés sont observés.
2.1.4. Teneur des polyphénols totaux
La teneur des polyphénols a été obtenue à partir d’une courbe d’étalonnage établie
avec des concentrations croissantes en acide gallique (Fig. 31). Elle est exprimée en
mg d’acide gallique par gramme de cal.
Résultats et Discussion
58
La courbe de tendance obtenue dans ce cas (Excel 2007) est Y= 30.32X + 0.060
(R2= 0.924).
Figure 31 : Courbe étalon du dosage des phénols.
Selon les résultats consignés au (Tab. 13) les quantités de polyphénols produites
chez les cals de folioles du génotype D1 (INRAT 199) en présence du filtrat de culture des
deux isolats E7 et H1 sont proche (0,819 mg EAG/g de cal et 0,738 mg EAG/g de cal).
Même résultat est obtenu chez les cals du génotype D3 (Flip 82-150C) mais avec des
concentrations supérieur (1,092 mg EAG/g de cal et 1,008 mg EAG/g de cal) se qui
démontre une influence du génotype. Alors que la quantité des polyphénols chez les cals
de folioles du génotype D2 (Twist) sont différentes (Tab. 13) en fonction de l’isolat ;
1.995 mg EAG/g de cal en présence du filtrat de culture de l’isolat E7 et presque de moitié
(1.320 mg EAG/g de cal) en présence du filtrat de H1.
Les réactions des cals d’entre nœuds du génotype D2 sont différentes en fonction
de l’isolat. Les cals confrontés au filtrat de culture de l’isolat E7 produisent deux fois la
quantité (0.861 mg EAG/g de cal) de phénols que ceux confrontés au filtrat de l’isolat H1
(0.567 mg EAG/g de cal). Les mêmes résultats sont obtenus avec les cals du génotype D3.
Une quantité de 0.840 mg EAG/g de cal est produite en présence du filtrat de l’isolat E7
alors que cette quantité est de moitié (0.483 mg EAG/g de cal) chez les cals confrontés au
filtrat de l’isolat H1. Cette différence de production à coïncidé avec la présence d’une
Résultats et Discussion
59
quantité plus importante de protéines et de sucres dans le filtrat de culture de l’isolat E7
que celui de l’isolat H1.
La quantité de polyphénols totaux chez les deux génotypes D2 et D3 est plus
importante dans les cals provenant des explants de folioles que celles qui proviennent des
entre nœuds (Tab. 13).
Tableau 13: Teneur des polyphénols totaux des cals provenant des explants d’entre nœuds
et de folioles (mg EAG/ g de cal) confrontés au filtrat de culture des deux isolats E7 et H1.
Cals
Génotypes
Teneur des polyphénols (mg EAG/ g de cal)
Entre nœuds
Folioles
Témoin
Confronté
au filtrat
(E7)
Confronté
au filtrat
(H1)
Témoin
Confronté
au filtrat
(E7)
Confronté
au filtrat
(H1)
Génotype D1
(INRAT 199)
-
-
-
0.621
(0.056)
0.819
(0.013)
0.738
(0.048)
Génotype D2
(Twist)
0.508
(0.053)
0.861
(0.038)
0.567
(0.027)
0.980
(0.076)
1.995
(0.042)
1.320
(0.089)
Génotype D3
(Flip 82-150C)
0.440
(0.091)
0.840
(0.02)
0.483
(0.018)
0.847
(0.015)
1.092
(0.026)
1.008
(0.065)
EAG : Equivalent d’acide gallique
Résultats et Discussion
60
Figure 32 : Teneur des polyphénols totaux (mg EAG/g de cal) d’explants d’entre
nœuds confrontés au filtrat de culture de l’isolat H1.
Figure 33 : Teneur des polyphénols totaux (mg EAG/g de cal) d’explants de folioles
confrontés au filtrat de culture de l’isolat H1.
Résultats et Discussion
61
Figure 34 : Teneur des polyphénols totaux (mg EAG/g de cal) d’explants d’entre
nœuds confrontés au filtrat de culture de l’isolat E7.
Figure 35 : Teneur des polyphénols totaux (mg EAG/g de cal) d’explants de folioles
confrontés au filtrat de culture de l’isolat E7.
Résultats et Discussion
62
Figure 36 : Effet du filtrat de culture brut d’Ascochyta rabiei sur les cals de
Cicer arietinum après 1 semaine de confrontation.
a : effet du filtrat de culture de l’isolat E7 sur les cals du génotype D1 (INRAT 199) ; b : effet
du filtrat de culture de l’isolat H1 sur les cals du génotype D1 (INRAT 199) ; c : effet du
filtrat de culture de l’isolat E7 sur les cals du génotype D2 (Twist) ; d : effet du filtrat de
culture de l’isolat H1 sur les cals du génotype D2 (Twist) ; e : effet du filtrat de culture de
l’isolat E7 sur les cals du génotype D3 (Flip 82-150C) ; f : effet du filtrat de culture de l’isolat
H1 sur les cals du génotype D3 (Flip 82-150C).
f e
d c
b a
Résultats et Discussion
63
2.2. Discussion interaction
Les filtrats bruts d’Ascochyta rabiei n’ayant pas subi aucun traitement affectant leur
contenu contiennent le mycelium, les spores et les produits de sécrétion tels que les
enzymes et les toxines, Le contact de ce filtrat avec les cals de Cicer arietinum a entrainé
leur brunissement qui correspond à une production de phénols.
Le filtrat de culture d’un champignon phytopathogène peut être utilisé comme agent
sélectif à condition qu’il reproduise les mêmes symptômes observés in vivo. Le filtrat de
culture d’Ascochyta rabiei peut contenir des toxines qui sont impliqués dans le
développement de l’anthracnose et qui sont actives au niveau cellulaire (Shahid et al,
2004). Les symptômes nécrotiques correspondant à des composés phénoliques sont
généralement liés à des activités des toxines.
Höhl et al, 1991ont détectés dans le filtrat de culture d’Ascochyta rabiei trois types de
toxines ; Solanapyrones A, B et C. Les travaux de Latif et al, 1993 ont signalé l’existence
de Cytochalasin D. Chen et Strange, 1994 distinguent un autre type de phytotoxine ; toxine
de nature protéique dans le filtrat de culture d’Ascochyta rabiei.
L’application des toxines d’Ascochyta rabiei sur des suspensions cellulaires de deux
variétés une sensible et l’autre résistante entrainent la perte de viabilité et plasmolyse des
cellules (Höhl et al, 1991).
Khouaidjia, 2001 a détectée la présence d’une activité enzymatique dans le filtrat de
culture d’Ascochyta rabiei, Trois groupes d’enzymes ont été mis en évidence ; les enzymes
pectiques (pectine méthyl estérase et polygalacturonases), les cellulases et les amylases.
Le filtrat de culture d’Ascochyta rabiei s’est montré toxique sur les embryons, les
semences et les plantules de la variété sensible ILC 1929, alors que chez la variété
résistante ILC 3279 aucune anomalie n’est observée (Khouaidjia, 2001), cette variabilité
de réponse peut être due à l’inactivation des composés toxiques par l’hôte résistant ou à la
quantité insuffisante de ces composés pour induire les symptômes chez se dernier.
Latif, 2002 confirme la toxicité du filtrat de culture d’Ascochyta rabiei et son effet
inhibiteur sur les cellules et les folioles de pois chiche ainsi sur l’induction des cals et la
croissance des racines. Zerroug et al, 2007 rapportent que le filtrat de culture
Résultats et Discussion
64
d’Ascochyta rabiei inhibe la germination des graines de pois chiche et l’élongation de
l’hypocotyle et la radicelle des plantules.
La toxicité du filtrat de culture d’Ascochyta rabiei dépend de la concentration des
Solanapyrones qui varie d’une souche à une autre (Chen et Strange, 1991 ; Latif et al,
1993 ; Latif, 2002). Une phytotoxicité maximale est observée avec le filtrat de culture de
deux semaines (Khouaidjia, 2001), se qui indique que le champignon est en phase de
croissance exponentielle avec une production maximale des Solanapyrones A dans les
cultures de 14 jours (Bahti et Strange, 2004 ; Zerroug et al, 2007).
La croissance des cals chez les trois génotypes est totalement inhibée se qui indique
que les deux isolats produisent des composés toxiques dans le filtrat de culture capables
d’inhiber les cals de Cicer arietinum. Toyoda et al, 1984 signale que le brunissement des
cals est un indicateur de l’effet létal du filtrat de culture, Une coloration avec le FDA
(Diacetate fluorescent 0.01%) révèle que toutes les cellules sont mortes lorsque les cals
sont totalement brunis.
Les cals dérivés d’entre nœuds et de folioles du même génotype réagissent de la
même façon en présence du filtrat de culture des deux isolats. Les mêmes résultats sont
rapportés par Ahmed et al, 1996 avec les cals de Blé de différentes origines du même
génotype qui répond de la même façon en présence de 30% du filtrat de culture de
Fusarium.
Plusieurs études rapportent que le filtrat de culture des champignons
phytopathogènes affecte la croissance des cals et la viabilité de leurs cellules. Chen et
Swart, 2002 ont montré que le filtrat de culture de Fusariun oxysporum contient des
métabolites toxiques capables d’inhiber la croissance des cals d’Amaranthus hybridus.
L’estimation de la viabilité des cellules des cals par une coloration avec le FDA réveille
une réduction de la viabilité des cellules au cours du temps.
L’effet létal du filtrat de culture de Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici sur les cals
de la tomate dépend de sa dose (Toyoda et al, 1984). Pijut et al, 1990 ont observé une
diminution de la viabilité des cellules avec l’augmentation de la concentration du filtrat de
culture de Ceratocystis ulmi et que 50% des cals sont inhibés en présence de 50% du filtrat
de culture.
Résultats et Discussion
65
Saxena et al, 2008 signalent que l’inhibition de la croissance des cals de Géranium
(Pelargonium graveolens) est proportionnelle à la concentration du filtrat de culture
d’Alternaria alternata. L’addition de 20% du filtrat de culture inhibe totalement les cals
Des plantes ont pu être régénérées à partir des cals confrontés à 12% du filtrat de culture
elles présentent une résistance vis-à-vis du pathogène.
Le filtrat de culture de 14 jours de Fusarium oxysporum f.sp ciceri à la concentration
de 1% s’est révélé le plus toxique pour les cals de Cicer arietinum qui sont totalement
inhibés (Parkash et Chowdhury 1992a et b).
Les résultats de l’étude réalisée par Fernandez et al, 2000 sur l’effet du filtrat de
culture de deux isolats de Colletotrichum lindemuthianum sur les cals d’Haricot montre
que l’utilisation de 25% du filtrat de culture de l’isolat 7 inhibe totalement les cals alors
que les mêmes résultats sont obtenus qu’en présence de 12,5% du filtrat de culture de
l’isolat 38, se qui indique que les protéines dans le filtrat de culture de l’isolat 38 sont plus
actives ou en quantité plus importante que celles de l’isolat 7.
Singh et al, 1999 ont pus régénérer des plantes de pois chiche résistantes par le
système de sélection in vitro des cals résistants au filtrat de culture d’Ascochyta rabiei avec
l’utilisation de concentrations plus faible (1, 3 et 5%).
Plusieurs travaux ont signalés l’accumulation des composés phénoliques et des
phytoalexines dans les suspensions cellulaires de différents cultivars de pois chiche
(Weigand et al, 1986 ; Kebmann et Barz, 1987 ; Daniel et al, 1990).
Le filtrat de culture d’Ascochyta rabiei à induit une augmentation quantitative des
composés phénoliques. Une quantité plus importante des composés phénolique est détectée
chez les cals confrontés au filtrat de culture d’Ascochyta rabiei comparés aux cals témoins.
Les mêmes résultats ont été obtenus par Hrubcova et al, 1992 avec les cals de Alfalfa
(Medicago sativa L.) en présence du filtrat de culture de Fusarium spp.
Singh et al, 2003 signale que la quantité de polyphénols, de peroxidase et de B1-3
glucanase produites par les cals de trois génotypes de pois chiche (WR315, C235 et JG62)
confrontés au filtrat de culture filtré de Fusarium oxysporum f. sp. ciceri augmente avec
l’augmentation de la concentration du filtrat de culture et la durée de confrontation, la
quantité est plus importante chez les cals de la variété résistante (WR315).
Résultats et Discussion
66
L’augmentation quantitative des composés phénoliques et de l’activité enzymatiques
(phenylalanine ammonia-lyase, peroxidase) chez les cals contribue au développement de
certain degré de résistance (Hrubcova et al, 1992).
Le système de sélection in vitro des cals permet de distinguer les cultivars sensibles
et tolérants (Koike et al, 1993). Botta et al, 1994 rapportent que la réponse des cals de
Pomme de terre au filtrat de culture de Fusarium eumarii est lié à la réponse du cultivar au
pathogène. De Melo et piccinin, 1999 ont trouvé une corrélation entre la résistance des
plantes de Concombre au filtrat de culture de Fusarium oxysporum et la résistance des
cellules des cals.
Te-chato et al, 1995 ont remarqué que les cals résistants de Caoutchouc confrontés
au filtrat de culture de Phytophthora spp produisent la peroxydase et l’acide phosphatase,
ces deux enzymes sont impliqués dans le mécanisme de résistance de la plante.
Les travaux de Hidalgo et al, 1998 rapportent que les cals de l’Ananas du génotype
résistante (Perolera) poursuit leur croissance en présence d’une forte concentration en
filtrat de culture de Fusarium subglutinans alors que les cals du génotype sensible (Smooth
Cayenne) sont inhibés se qui indique que la plante dispose une résistance cellulaire au
filtrat de culture.
Conclusion et
Perspectives
Conclusion et perspectives
67
Conclusion et perspectives
La callogenèse a pu être induite chez Cicer arietinum L. avec une variation de
réponse. Elle est influencée par l’explant (organe et génotype) et la composition hormonale
(nature et concentration).
Les réactions des tiges sont différentes selon le génotype et la composition
hormonale. Une callogenèse maximale d’entre nœuds de tiges est observée chez le
génotype INRAT 199 sur les deux milieux M1 (3 mg/l 2,4-D, 3 mg/l BAP) et M2
(3mg/l 2,4-D, 0.1 mg/l BAP) et pour le génotype Twist et Flip 82-150C sur les milieux Ma
(2 mg/l 2,4-D, 4 mg/l Kinétine) et M8 (2 mg/l 2,4-D et 4 mg/l ANA) respectivement.
Les folioles ont donné une callogenèse importante chez le génotype INRAT 199 sur
deux milieux M2 et M8 et chez le génotype Twist sur les milieux M1, Ma et M8. Les
folioles du génotype Flip 82-150 ont donné une bonne initiation de cals sur un seul milieu
M1.
Les entre nœuds de tiges forment des cals durs de couleur verte suite à des divisions
internes. Les explants de folioles forment des cals noduleux et friables dont l’origine est la
nervure principale, l’extrémité du limbe et la zone d’excision.
Lors de l’étude des interactions cals-filtrat de culture d’Ascochyta rabiei, les résultats
suggèrent l’existence de substance dans le filtrat de culture des deux isolats E1 et H7
d’Ascochyta rabiei capables de provoquer la production de phénols par les cals de
Cicer arietinum. Elle est variable en fonction de l’origine des cals (génotype résistant ou
sensible) et de l’isolat.
Les quantités de polyphénols produites par les cals confrontés au filtrat de culture
d’Ascochyta rabiei (E7 et H1) sont supérieures à celles du témoin en général. Les cals
provenant de génotype Twist tolérant traités par les filtrats de culture d’Ascochyta rabiei
synthétisent plus de phénols que les cals des autres génotypes. Les cals issus du même
génotype (résistant ou tolérant) confrontés se comportent différemment selon l’isolat. Le
filtrat de l’isolat E7 a entrainé une plus grande production de phénols chez les cals de
folioles et de tiges.
Conclusion et perspectives
68
Il serait intéressant de :
Voir l’effet du filtrat de culture d’Ascochyta rabiei au niveau cellulaire (suspension
cellulaire) et suivre le taux de mortalité des cellules des cals en fonction du temps.
Isoler et purifier les toxines produites par Ascochyta rabiei et voir leurs actions sur
les cals de Cicer arietinum L.
Identifier les composés phénoliques secrétés pas les cals de Cicer arietinum.
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Références
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Annexe
Annexes
79
Composition du milieu pois chiche solide:
Farine de pois chiche : 50 g
Glucose : 20 g
Eau distillée : 1000 ml
PH : 5,8
Agar : 12 g
Composition du milieu Murashige et Skoog :
Macroéléments :
NH4NO3 : 1650 mg/l
KNO3 : 1900 mg/l
CaCl2, 2H2O : 440 mg/l
MgSO4, 7H2O : 370 mg/l
KH2PO4 :170 mg/l
Microéléments :
H3BO3 : 6.2 mg/l
MnSO4, H2O : 22.3 mg/l
ZnSO4, 7H2O : 8.6 mg/l
KI : 0.83 mg/l
Na2MoO4 : 0.25 mg/l
Annexes
80
CuSO4, 5H2O : 0.025 mg/l
CoCl2, 6H2O : 0.025 mg/l
Vitamines :
Thiamine HCl (vitamine B1) : 0.1 mg/l
Acide nicotinique : 0.5 mg/l
Pyridoxine HCl (vitamine B6) : 0.5 mg/l
Glycine : 2 mg/l
Sucre :
Myo-inositol : 100 mg/l
Saccharose : 30 g/l
Solution ferrique : Fer EDTA
Na2EDTA : 37.3 mg/l
FeSO4, 7H2O : 27.8 mg/l
Les hormones :
Hormones
Milieux
Auxines (mg/l) Cytokinine (mg/l)
2,4-D ANA BAP KIN
M1 3 - 3 -
M2 3 - 0,1 -
Ma 2 - - 4
M8 2 4 - 1
PH : 5,8
Agar : 12 g
Annexes
81
Milieu Czapek :
NaNO3 : 3g
K2HPO4 : 1g
KCl : 0,5g
MgSO4, 7H2O : 0,5g
FeSO4, 7H2O : 0,01g
Saccharose : 30g
Eau distillée : 1000 ml
PH : 5,6
Les milieux préparés sont stérilisés par autoclavage (120°C pendant 20 min).
Annexes
82
Tableau 14 : Pourcentage de cals des explants d’entre nœuds des trois génotypes de pois
chiche en présence de différentes combinaisons hormonales (2,4-D, ANA, BAP et KIN).
Explants
Entre
nœuds
Composition hormonale (mg/l)
Pourcentages (%)
2,4-D ANA BAP KIN D1
(INRAT 199)
D2
(Twist)
D3
(Flip 82-150C)
M1 3 - 3 - 98.3 93.7 90
M2 3 - 0.1 - 98.3 93.7 79.5
Ma 2 - - 4 89.4 100 94
M8 2 4 - 1 94.6 96.3 100
Tableau 15 : Pourcentage de cals des explants de folioles des trois génotypes de pois
chiche en présence de différentes combinaisons hormonales (2,4-D, ANA, BAP et KIN).
Explants
Folioles
Composition hormonale (mg/l)
Pourcentages (%)
2,4-D ANA BAP KIN D1
(INRAT 199) D2
(Twist) D3
(Flip 82-150C)
M1 3 - 3 - 94.6 100 100
M2 3 - 0.1 - 98.2 97.6 96
Ma 2 - - 4 89.6 100 32
M8 2 4 - 1 98 100 22
Annexes
83
Analyse de variance (ANOVA)
T= Xi
G= Ti
La moyenne= Ti /n
Somme des carrés des écarts (SCE) expérimentales (inter-groupe) = n – G2/kn
Variance inter-groupes = SCE (inter-groupe)/ddl ; ddl = k-1
Somme des carrés des écarts (SCE) entre les traitements (intra-groupe) = Xi2 - Ti
2/n
Variance intra-groupe = SCE (intra-groupe)/ddl ; ddl = kn-k
F= Variance inter-groupes/ Variance intra-groupe
Expression des résultats des polyphénols totaux
On prend l’exemple de cal d’entre nœuds du génotype D2 (Twist) qui présente une DO de
0.897
D’après la courbe d’étalonnage, on a l’équation suivante :
Y= 30.32X + 0.060 avec Y=DO
X= (0.897- 0.06)/ 30.32
X= 0.027 mg/ml
On multiplie cette valeur par 21 qui correspond au facteur de dilution de notre échantillon
[µl (volume déposé de l’échantillon/ 2100 µl (volume réactionnel) = 1/21]
Donc : X’ = X. 21 = 0.027. 21
X’ = 0.567 mg/ml
La solution mère est de 1g/ml
On a X’ : 0.567 1000 mg/ml
X’’ 1000 mg
X’’ = 0.567 mg
Donc le cal d’entre nœuds du génotype D2 contient 0.567 mg de polyphénols totaux
(EAG) par gramme de cal.