Materiales y mtodos

Aislamiento de BacterifagosGiovanna Daz

Vctor SnchezOswin Uras

Jos Verdugo

IntroduccinLos Fagos, son virus que infectan especficamente bacterias.Fueron descritos por Frederick Twort (1915) Existen 13 familias de fagos que se clasifican de acuerdo a su naturaleza genmica y caractersticas morfolgicas

Mecanismos de Replicacin del FagoObjetivoLograr el aislamiento y la cuantificacin de bacterifagos utilizando tcnicas adecuadas.Materiales y mtodosMaterialesAguas negrasCepa de E. coli

Material de laboratorioTubos de ensaye de 16 X150 mm estrilesTubo de ensaye de 16 X 150 mm con 10 mL de caldo nutritivo ms extracto de levadura al 1%.Tubo de ensaye de 16 x150 mm con 10 ml de sol. Salina estrilTubos de ensaye de 13x100 mm estrilesTubos de ensaye de 13x100 mm con 3 ml de agar al 0.75% de agar (fundido)Cajas de Petri con agar nutritivo ms extracto de levadura al 1%.Pipetas de 1, 2 y 5 ml estrilesHisopos estriles

Pipetas Pasteur estrilesEmbudo de vidrio de 6 cm de dimetroPapel filtro WhatmanVaso de precipitadosFiltro com membrana de 0.45 mmJeringa de 5 mlCentrfuga y tubos de centrfuga de 10 mlBenzal 1:1000 o hipoclorito al 1%Mechero BunsenTripi

MetodologaAislamiento de fagosAgregar 3 ml de solucin salina estril en una caja con crecimiento masivo de la bacteria hospedera. (aislada y purificada previamente de la muestra)Cosechar el crecimiento con un hisopo estril y colocar la suspensin gruesa en un tubo de 15 x 150 mm con una pipeta Pasteur estril.Colocar en otro tubo de 16 x 150 mm estril 2 ml de la muestra previamente filtrada por papel Whatman y membrana de 0.45 mm. Aadir 2 ml de caldo nutritivo con extracto de levadura y 0.5 ml de la suspensin gruesa de bacterias.

Incubar el sistema durante 24 h a 37Cdespus de incubar, centrifugar el contenido del tubo a 10000 rpm durante 10 minutos. Separar el sobrenadante por decantacin.Agregar benzal al tubo que contiene el sedimento antes de desecharlo Filtrar el sobrenadante a travs de una membrana de 0.45 mm.

Preparar una suspensin gruesa a partir de cultivos de la bacteria de 18 horas, igual que en el punto 2.Sembrar esta suspensin gruesa en una caja, usando un hisopo estril. Dejar secar el inculo por 30 min.

Con una pipeta Pasteur colocar unas gotas del sobrenadante que se espera contenga fagos, en la caja sembrada con la bacteria.

Incubar a 37C durante 24 h.

Observar las cajas en bsqueda de placas lticas.

Titulacin de fagosHacer una serie de diluciones decimales de la suspensin del bacterifago, de 10^-1 hasta 10^-6 en caldo nutritivo ms extracto de levadura (0.1:0.9 ml)Tomar 0.1 ml de cada una de las tres ltimas diluciones y adicionarlo a tubos de ensaye con 3 ml de agar al 0.75 fundido (45C). a partir de este momento, trabajar rpidamente para evitar que solidifique el agar y no se homogenice bien.

Una vez aadido el fago, agregar a cada tubo 0.1 ml de la suspensin concentrada de una bacteria sensible al fago.Homogenizar el contenido del tubo por rotacin entre las manos y vaciar rpidamente en una caja de agar enriquecido con extracto de levadura.Distribuir el contenido del tubo en toda la superficie, por rotacin de la caja sobre la mesa.

Dejar solidificar e incubar a 37C por 24 horas.

Observar las cajas, e interpretar el resultado, si es positivo habr placas lticas que se observan como zonas claras que indican la destruccin de las bacterias.