AISLAMIENTO BACTERIANO EN MEDIO SLIDO Y POR DILUCIONES Fecha:
28/10/2014
RESUMENEn el presente prctico se sembraron y aislaron bacterias,
lo cual consiste en obtener colonias, es decir, conjunto de clulas
bacterianas que se han originado desde una sola clula. Las celulas
con las que se trabajaron fueron E.coli, S.aureus, K.pneumoniae.
Los medios a utilizar fueron medio agar nutritivo y medio McConkey.
Para aislar bacterias se usaron 2 tcnicas, una de ellas fue el
plaqueo en medio slido; E.coli y S.aureus fueron plaqueadas en
medio agar nutritivo mediante 3 tcnicas (por agotamiento, siembra
masiva y tcnica libre), ademas estas dos bacterias fueron sembradas
por agotamiento en medio McConkey. La segunda tcnica usada fue por
dilucin, en la cual se hicieron 8 diluciones 10-1, 10-2,
10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,y 10-8, las cuales se generaron a partir
de 100 l de mezcla de las 3 bacterias anteriormente mencionadas en
900 l de agua destilada. De estas diluciones 10-4,10-5,10-6 fueron
sembradas en medio McConkey con rastrillo de vidrio. Por otro lado,
las 8 diluciones fueron sembradas por el mtodo de la microgota.
Dado que los medios proporcionan los nutrientes necesarios para el
crecimiento bacteriano, las bacterias que crecen en cada uno de
ellos depende de su metabolismo. En agar nutritivo crecieron todas
las bacterias sembradas, mientras que en McConkey crecen slo
bacterias negativas y las que son capaces de fermentar lactosa. La
siembra por dilucin proporciona una gran ayuda a la hora de
contabilizar bacterias. Por el mtodo de la microgota podemos
obtener las unidades formadoras de colonias, en este prctico se
detemin que el nmero corresponda a ______
OBJETIVOS
1. Determinar cul de las tcnicas utilizadas para separar
colonias sin diluir fue ms efectiva.2. Determinar cules fueron las
bacterias que crecieron en cada uno de los cultivos.3. Determinar
las unidades formadoras de colonias a partir del mtodo de la
microgota y por plaqueo de diluciones 10-4, 10-5, 10-6.
INTRODUCCINEs de gran utilidad obtener colonias aisladas de
bacterias para el estudio de estas. Existen varios mtodos que
permiten esto, los cuales van desde la variedad en plaqueo, como
por ejemplo_____Otra forma de tener colonias mas separadas son por
el mtodo de diluciones, el cual consiste en_____El mtodo de la
microgota consiste en_________Existe una gran variedad de medios de
cultivos en donde poder sembrar bacterias. Existen medios de
cultivos generales y especficos_____Bacterias de fcil manipulacin
pueden ser____
MATERIALES Y METODOLOGA
Separacin de coloniasSe tom una muestra de Escherichia coli +
Staphylococcus aureus con el asa circular y se realiz sembrado por
3 tcnicas distintas en medio agar nutritivo y una tcnica en medio
McConkey. Las tcnicas a utilizar en medio agar fueron: siembra por
agotamiento, siembra masiva, y tcnica libre, mientras que para
medio McConkey slo se realiz siembra por agotamiento.Para la
siembra por agotamiento, se tom una muestra con el asa de argolla y
se esteriliz llevndola al rojo, luego se puso en un rea perifrica
de la placa Petri y se hicieron movimientos circulares para
homogeneizar el inculo, se procedi a realizar estras horizontales
hasta la tercera parte de la placa, luego se procedi a girar la
placa Petri en 90o. el asa se volvi a esterilizar y se repiti el
procedimiento anterior. Para la siembra masiva se esteriliz el asa
de argolla y se tom una muestra de la mezcla de bacterias
mencionadas. El asa se ubic en el extremo superior de la placa y se
realizaron movimientos circulares hasta la mitad de la placa
(abarcando toda esta, pero sin que las estras se toparan), luego se
gir en 180o la placa, se esteriliz el asa y se rellen la mitad
sobrante con la misma tcnica.Para la tcnica libre se realizaron
estras hasta la mitad de la placa, luego se gir en 100o y se realiz
otra estra. El asa se esteriliz tanto al principio como entre las
dos estras.Las placas se sellaron con parafilm y se incubaron por
24 hrs a 35oC.
Dilucin de cultivos En 8 tubos Eppendorf se agregaron 900 l de
agua destilada, luego se tomaron 100 l de la muestra a analizar, la
cual contena E.coli + S.aureus + K.pnuemoniae y se agregaron al
tubo 1. Del tubo 1 se tomaron 100 l de la muestra diluida y se
agregaron al tubo 2, luego del tubo 2 se tomaron 100 l de la
muestra y se depositaron en el tubo 3, el procedimiento se realiz
sucesivamente hasta el tubo 8. Siembra con rastrilloCon una
micropipeta se tomaron 100 l de la mezcla del tubo 4, es decir, con
una dilucin 10-4, y se agreg en el medio de una placa con medio de
cultivo McConkey y se esparci por toda la placa con un rastrillo de
vidrio esterilizado anteriormente. Para esterilizar el rastrillo se
puso en etanol y luego se llev a la llama directa del mechero, se
esper a que se enfriara y se utiliz.Siembra por microgotaSe tomaron
dos placas con medio agar y se dividieron en 8 segmentos iguales.
En el segmento 1 se pusieron 2 gotas de 5 l de muestra de la
dilucin 10-1, en el segmento 2 se pusieron 2 gotas de 5 l de
muestra de la dilucin 10-2, este procedimiento se repiti hasta
poner en el segmento 8, 2 gotas de 5 l de muestra de la dilucin
10-8. En la segunda placa se realiz una rplica de lo antes
mencionado. Las placas se sellaron con parafilm y se incubaron por
24 hrs a 36oC.Todos los procedimientos anteriormente mencionados se
realizaron bajo el mechero de Bunsen para asegurar esterilidad.
RESULTADOS
Luego de realizar la separacin por colonias y poner las colonias
en incubacin, los resultados fueron los siguientes
Figura 1: Siembra de E.coli+ S.aureus por agotamiento
En la figura 1 se observa la aparicin de 19 colonias
aproximadamente de color amarillo oscuro, las cuales presentan
forma circular, las cuales se encuentran bastante alejadas entre
ellas.Por otro lado, se pueden observar lneas de color caf claro,
las cuales corresponden a colonias que no se pudieron separar lo
bastante como para verse unidades.
Figura 2: Siembra de E.coli+ S.aureus por siembra masiva
En la figura 2 se aprecia la aparicin de mayor cantidad de
colonias que en la figura 1. Las colonias se encuentran bastante
separadas a lo largo de la placa Petri. Las colonias nuevamente son
de color amarillo circulares. Se observan colonias un poco ms
grandes que otras, pero en general se parecen mucho. Nuevamente se
observan colonias de color caf claro como unidades no
separadas.
Figura 3: Siembra de E.coli+ S.aureus por tcnica libre
En la placa se observan colonias no tan dispersas como en las
figuras 1 y 2. La forma que tienen estas colonias son circulares de
colores amarillos. Nuevamente observamos colonias de color caf
claro muy juntas unas con otras.
Figura 3: Siembra de E.coli+ S.aureus por agotamiento en medio
McConkey.
En la figura 4 observamos colonias de color rosado, con un tamao
mayor que las que se pueden apreciar en las que contienen agar. Las
colonias presentadas se encuentran muy cercanas en el lado derecho
y luego terminan mas dispersas en el extremo superior derecho.Luego
de realizar las diluciones, podemos observar los siguientes
resultados
Figura 5: siembra con rastrillo de 100 l de la dilucin 10-4 de
bacterias E.coli+ S.aureus + K.pneumoniae.
En la figura 5 observamos la aparicin de 423 colonias rosadas
con forma circular. Las colonias se encuentran bastante alejadas
entre ellas. Estas colonias en general son ms grandes que las que
se pueden apreciar en agar.
Figura 6: Siembra de dilucin 10-5 de bacterias E.coli+ S.aureus+
K.pnuemoniaeEn la figura 6 se aprecian 360 colonias las cuales son
de color rosado y circulares. En general estas se encuentran
bastante alejadas unas de otras.
Figura 7: Siembra de dilucin 10-6 de bacterias E.coli+ S.aureus+
K.pnuemoniae
En la figura 6 se aprecian 26 colonias en total, las cuales
presentan formas circulares y rosadas. Estas colonias se encuentran
muy alejadas unas de otras.De la tcnica de microgota podemos
observar los siguientes resultados:
Se aprecia que en la seccin 1 aparecieron 3 colonias, en la
seccin 2 hay 4, en la 3 se observan 3 colonias, en la seccin 4 y 5
se aprecian 2 colonias, mientras que en la seccin 6 se aprecian 6
colonias, en la 7 3 colonias y finalmente en la 8 solo apreciamos 1
colonia.Las colonias que se aprecian aqu son de color caf clara,
con tamaos variables, las formas que tienen son
irregulares.DISCUSINDado que el agar nutritivo favorece el
crecimiento de todas las bacterias, es un medio no selectivo,
podemos inferir que las bacterias que estn creciendo en las placas
para separar colonias son tanto la E.coli como la S.aureus, pues,
aunque la e.coli sea Gram negativa y la S.aureus sea positiva,
ambas tienen los nutrientes necesarios para crecer. Por otro lado
vemos que hay colonias que son de color amarillo oscuro, las cuales
son de S.aureus, y las de caf claro son entonces E.coli. Del mtodo
de plaqueo tambin tenemos un medio selectivo, el cual es el agar
McConkey. Este agar es selectivo, dado que en l slo crecen
bacterias Gram negativas y bacterias que fermentan lactosa. Debido
a lo anteriormente mencionado, podemos inferir que slo la E.coli es
la que est produciendo colonias en este agar, dado que es una
bacteria Gram negativa, capaz de fermentar lactosa.Del mtodo de
dilucin, las mezclas de bacterias (E.coli+ S.aureus + K.pneumoniae)
fueron puestas en medio agar McConkey. Dado que este medio es
selectivo, podemos inferir que las bacterias que crecieron en este
medio fueron E.coli+ K.pneumoniae ya que ambas son Gram negativas y
capaces de fermentar la alctosa, mientras que la S.aureus es una
bacteria Gram positiva incapaz de vivir en este medio selectivo.En
el mtodo de la microgota tenemos una mezcla de 3 bacterias
nuevamente, ya que las diluciones usadas en el mtodo de la dilucin
tambin fueron usadas aqu, por ende las bacterias que tenemos son
las 3 de la mezcla anterior, es decir, E.coli+ S.aureus y
K.pneumoniae.En cuanto a las tcnicas de separacin, podemos apreciar
que todos los mtodos fueron eficiente ya que en todos observamos
separacin de colonias, se aprecia sin embrago que en la tcnica por
siembra masiva se observa una mayor cantidad de colonias nacientes
en contraste con la tcnica por agotamiento. De la siembra por
tcnica libre se aprecia que hay una gran cantidad de bacterias,
pero no muy separadas unas de otras.De la tcnica por dilucin, se
aprecia que a mayor dilucin, menor es la cantidad de colonias, es
decir, son inversamente proporcionales. Esto se debe a que mayor
dilucin debemos tener menor unidades formadoras de colonias, ya que
tenemos menor cantidad de bacterias cuando estamos en un medio muy
diluido. Asi, de las diluciones 10-4, 10-5 ,10-6 tenemos 423, 360 y
26 colonias aproximadamente.Este es un mtodo muy eficiente, ya que
se aprecian colonias muy separadas, lo cual favorece en la
determinacin numrica de colonias, caso que no se da para las
tcnicas anteriormente mencionadas.De la tcnica por microgota
rescatamos los siguientes datos:SeccinColoniasFDVolumen agregado
(l)UFC
130,110300
240,01104000
330,0011030000
420,000110200000
520,00001102000000
660,0000011060000000
730,000000110300000000
810,00000001101000000000
Los datos encontrados no concuerdan con lo que debera
observarse, ya que a menor dilucin deberamos tener mayor cantidad
de colonias, es decir, a medida que aumentamos el factor de dilucin
deberan disminuir las colonias en la placa.Esto puede radicar en
que las colonias que se observan en un principio son colonias muy
grandes, lo cual lleva a pensar que son muchas colonias que no se
alcanzaron a separar, de ser asi, tomaremos las ultimas 3 secciones
para sacar un promedio de las UFC, dndonos como resultado
453.333.333 UFC, lo cual es bastante racional dada la turbidez de
la muestra inicial.
CONCLUSIN
En este experimento, se observ que luego de sembrar las
bacterias las bacterias se distribuyen de manera uniforme por la
superficie de la placa.De las muestras obtenidas se puede apreciar
que obtenemos colonias tanto de forma filamentosa, irregular y
circular, los bordes que le presentan son curvos, lisos, ondulados
y lobulados con elevacin plana, convexa y en forma de gota con
superficies planas y rugosas.Especficamente en la muestra de papa
tenemos que macroscpicamente las colonias son irregulares, con
bordes ondulados, elevacin convexa y su superficie es arrugada. Al
ver una colonia bajo microscopio luego de realizar la tincin Gram
se aprecia que tenemos tanto bacterias teidas de color violeta y de
color rojo. Las gran positivas resultaron ser cocobacilos, mientras
que las Gran negativo resultaron ser bacilos. Resulta de gran ayuda
la tincin Gram, ya que nos facilita el reconocimiento de las
bacterias presente en nuestra muestra. Al adquirir color podemos
observar su forma y determinar el tipo de bacteria con la que
estamos tratando de acuerdo a su pared bacteriana.
Bibliografa:(1)
http://www.monografias.com/trabajos/bacterias/bacterias.shtml#ixzz3GMRbAYNE(2)
http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practicoIII.pdf
(3)
http://microdonto.files.wordpress.com/2009/03/morfologia-de-las-colonias-bacterianas.pdf(4)
http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/MorfologiayEstructuraBacteriana.pdf(5)
http://biologiamedica.blogspot.com/2010/09/bacterias-gram-positivas-y-gram.html(6)
http://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-ii/pb-ii-2-fisicos.htm
