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Protozoarios
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Laboratorio de
Microbiologa General IITcnicas de colecta y tincin de
parsitos
Blanco Blanco IvnGalicia Lpez Susana Vernica
Laguna Morales Juan CarlosMogollan Marn Luis Jonatan
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Aprender a colectar materialparasitario de animales de
experimentacin y domsticos.
Conocer utilizar las diferentestcnicas de tincin, utilizadas
enParasitologa.
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Es la manipulacin sobre un ser vivo, o biensobre parte de l, que
tiene por objetomantener toda su arquitectura tanto
estructural como qumica lo ms inalteradaposible.
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Los fijadores se dividen en 2:
Fsicos: Calor Fro Criodesecacin (liofilizacin)
Qumicos Lquido de Bouin Solucin Fijadora de PVA Solucin de
Schaudinn Gelatina-Glicerol Formalina AFA
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Se hace a la llama, con lo que se obtiene unacoagulacin rpida de
las protenas y portanto su estabilizacin.
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Fijador deProtozoarios yHelmintos.
cido pcrico,saturado con agua.
Formaldehdocido Actico
Glacial
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Cloruro demercurio, saturadocon agua
Alcohol etlico,95%
A esta solucin se le agregacido actico glacial enproporciones de
1 parte de c,actico glacial por 19 partes dela preparacin, antes
deusarla.
Fijador de quistes,trofozoitos,huevos, larvas.
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Fijador de trofozoitos yquistes (combinacin
Schaudinn ms resina).
PVAcido actico
glacialGlicerinaSolucin de
Schaudinn
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Sirve en preparaciones permanentes denematodos
Componentes:
Gelatina Agua destilada Glicerina Fenol (cristales)
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Sirve para preservar quistes, helmintos yprotozoarios
Componentes:
Formaldehido 0.5% Solucin salina (NaCl 0.85%)
Se recomienda calentar a 60-63 oC
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Se utiliza para preservar trematodos ycestodos
Componentes:
Etanol(96%) Formaldehido Agua destilada Acido actico
La mezcla de etanol, formaldehido y aguadestilada durar varios
meses. Cuando se agrega elacido actico dura un mes.
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Es un mtodo en el cual se utilizancolorantes especiales para
pintar o teir auna clula que ha sido procesada, esto con la
finalidad de poder observarla al microscopio.
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Para obtener buenos resultados en una
tincin esta se realiza lo ms rpido posibledespus de la
fijacin.
Las tinciones se clasifican en:
Simples: Utilizan solo un colorante.
Diferencial: Ocupa ms de un colorante.
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Y se pueden realizar de dos formas:
Progresivas: Son aquellas en las que el material
se coloca en colorante diluido durante el tiemponecesario para
colocar la tincin hasta laintensidad deseada.
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Regresiva: Son las tinciones en las que el material
o preparaciones se colocan en coloranteconcentrado hasta lograr
una sobre tincin yposteriormente decolorar hasta lograr
laintensidad deseada.
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Parsitos
Ectoparsitos Endoparsitos Hemoparsitos
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Coloracin de Giemsa Tincin Wright Tincin Indica
Eosina 5% Tincin de Gram Tinciones permanentes de
protozoarios
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Tie protozoarios,hemticos eintestinales.
Para protozoarios se
lava con buffer fosfatospH 6.8.
Flagelos, cilios yncleos (rojo),
citoplasma yesporozoitos (azul)
Reactivos:
Giemsa II-Eosina (Azul deMetileno-Eosina)
Giemsa II (Azul deMetileno)
Giemsa B (Azur B,formado por la oxidacindel Azul de
Metileno)-Eosina (colorantes)
Glicerina (humectante)
Metanol absoluto(fijador)
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Leishmania infantum
Toxoplasma gondii
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Tincin de tipoRomanowsky, debidoa que se produce unaseparacin
decolores:
Tie de prpura ncleosy grnulos neutrofilicos.
De rosa a los Eritrocitos.
De azul a protenascidos nucleicos ycitoplasma.
Reactivos:
Tincin de Wright Eosina Y Eosina B
Azul de Metileno
Glicerina
Alcohol metlicoabsoluto
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Melanoma maligno delperro
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til para evidenciar segmentos grvidosentre Taenia solium yTaenia
saginata.
Reactivos:
Tinta india (colorante)
Etanol al 50% o 70% (deshidratante) Xilol (aclarante) Se monta
en blsamo de Canad
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Observacin de parsitos en heces ya que,estos y sus quistes se
resisten a sucoloracin y la materia fecal se tie rosa.
(protozoarios es fondo blanco al igual quesus quiste)Reactivos:
Eosina 5%
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sta es una tincin diferencial usada parademostrar las
propiedades tintoriales debacterias de todos los tipos.
Las bacterias grampositivas retienen el
colorante de cristal violeta despus de ladecoloracin se ven azul
oscuro.
Las bacterias gramnegativas no son capacesde retener el
colorante violeta cristaldespus de la decoloracin y se contratiende
color rojo con el colorante de safranina.
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Las caractersticas tintoriales pueden ser
atpicas en cultivos muy jvenes, viejos,muertos o en degeneracin.
Tincin de formas qusticas de Pneumocystis
carinii
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Tinciones permanentes:
I. Tincin de Heidenhain con hematoxilina
frrica.II. Tincin de Wheatley, tricrmica.
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Utilizada para la deteccin e identificacin deprotozoos
fecales.
Preparacin de hematoxilinaI. HematoxilinaII. Alcohol etlico de
95III. Agua destilada
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La hematoxilina primero debe ser oxidadopara dar hematena.
Algunos agentes qumicos oxidantes que sepueden usar son: yodato
de sodio,permanganato de potasio, perxido dehidrgeno y oxido de
mercurio.
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La fase de la coloracin (solucin dealumbre de hierro y amonio al
2% ) es demucha importancia. El propsito es disolvergradualmente
algo del color negro de lapreparacin y se contina hasta que
laestructura nuclear de las amebas yflagelados sea perfectamente
visible.
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Es una alternativa a la hematoxilina frricapara la tincin de
protozoos.
Permite visualizar las caractersticas de losorganismos.
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I. 10mL de cido actico glacial a 6 g decromotropo 2 R, 3g de
verde brillante y 7gde cido fosfotngstico.
II. Mover y dejar la mezcla por 30 min.III. Agregar 1000mL de
agua destilada ymezclar.
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Los protozoos tienen citoplasmas de colorentre verde azulado y
violeta
Ncleos y cuerpos de inclusin de color entrerojo y rojo
purpreo
El fondo de la muestra es verde.
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Las tenias adulto estnformadas por una seriede segmentos
rectangulares planosdenominadosprogltidos
Cada progltide maduro
contiene ambos rganosreproductores
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Los progltidos se lavancon formol
Se escoge uno de losproglotidos terminalesdel gusano y se
colocaentre dos portaobjetos
Con un hilo en cadaextremo se presionan losportaobjetos, se deja
uno
de los hilos mas largos
Sujetando el hilo largo sesumerge en lactofenol, se
extrae hasta que seaclare
Se abren losportaobjetos, se toma el
progltido y se coloca enun portaobjetos limpiofijndose con
resina
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Las filarias son nematodos que se localizanen tejido subcutneo,
sangre, ojo ycavidades de animales y humanos; su formalarvaria es
conocida como Microfilaria, lacual es ingerida por mosquitos
hematfagos,en estos evolucionan hasta larva III(infectante) para
ser inoculados por picaduraa otros animales.
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1.Alumbre de amonioAgua destilada
2.Hematoxilina
Alcohol 95%Mezclar y agregar la solucin 1.3.Glicerina
Alcohol metlicoAgregar la solucin anterior
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Loa loa
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Reactivos:Azul de cresilo al 75% en solucin salinaAzul de
metileno al 1% es solucin salina
Se usa para teir microfilarias vivas, tie elncleo y provee un
contraste entre elportaobjetos y el m.o.
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Tipos de
muestra
Cuidados de la
muestra
Tcnicas Parsitos
Sangre HeparinaAzida de sodio
Recin extrada
Gota gruesaGota fina
Hemoparsitos,intra/extra
eritrocitariosEctoparsito Vivo Sacrificado
FraccionadoGarrapata
Materia Fecal Frasco bocaancha, limpio y
seco, ausencia deorina y rotulado
Varios procesos Parsitosintestinales
Slidas Cerradas( evitardesecacin) y
refrigeradas 2 C
CpsFlotacinConcentracin
Huevos y/oquistesnemtodos
Lquidas 37 C recinobtenidas Observacin enfresco Trofozoitos
yquistes
Tejidos frascos confijador
formalina
Varios procesos T. Solium
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Impregnacin que se produce al ejercerpresin con un porta objetos
sobre el tejidoque va a ser examinado.
Se fijan y se tien como un frotis sanguneo.
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Tcnica de GotaGruesa
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Frotis o extensin fina de sangre
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En la molleja o proventrculo suele atacar elTetrameres
americana.
En el intestino delgado laAscaridia galli y la
capillaria obstinta. Tambin pueden detectarse:o Davainea
proglotina
oAmoebotonea
o Hymenolepis carioca
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En el ciego (parte del intestino) suelealojarse el Heteraquis
gallinae, Capillariaanulata.
En la trquea se aloja el Syngamus laringeus
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Parsito Localizacin
Trypanosoma sp. Sangre
Trypanoplasma
sp.
sangre
Hexamita sp.
Tracto digestivo
Trichodina sp. Branquias
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NORMAS OFICIALES MEXICANAS
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NOM-062-ZOO-1999
NOM-033-ZOO-1995
NOM-051-ZOO-1995
NOM-059-ECOL-1994
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Microscopio Estereoscopio 1 Pliego de papel absorbente
Un estuche de diseccin Animales: sapo, gallina, pez carpa
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Localice y obtengalos ectoparsitos de
los animalesasignados
Haga observacionesde diferentesporciones del
artrpodo
Sacrifique losectoparsitos
Observe con ayudadel microscopio y
estereoscopio lasmuestras
Realice diversaspreparaciones ensolucin salinautilizando
lugol
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Coloque en elportaobjetos limpiouna gota de sangre
extendindola a 1.5 cm
Mueva rpido elportaobjetos de manera
suave para no lisar loseritrocitos y teir con elmtodo de
Wright
Deposite una gota desangre en uno de los
extremos y realizaruna extensin de lasangre
Observar en 10x,40x y 100x en el
microscopio
Se hace un lacado olisado de eritrocitosen agua destilada,seca y
teir con elmtodo de Giemsa
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El frotis de sangre secubre con unas gotas
de la tincin deWright; se deja
durante 1 minuto.
Este mtodo solo sirve
para frotis delgados
El exceso decolorante se quita con
agua amortiguada, seescurre con rapidez yse deja secar al
aire.
Se tie durante3-5 minutos ohasta por 15
minutos
Se agrega unas gotasde agua amortiguada(pH 6.8 a 7.2); sedebe
soplar sobre elportaobjetos paramezclar el agua con el
colorante.
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Fijar los preparados enmetanol absoluto duranteunos 30 segundos
porinmersin o por goteo delalcohol sobre el frotiscolocado en un
ngulo de
30 a 45.
Secar los frotis en posicin
vertical.
Lavarlos brevementeen agua amortiguada
neutra o bajocorriente.
Teirlos unos 20minutos en unadisolucin deGiemsa 1:20 o 45minutos
en unadisolucin 1:50.
Dejar que sequen.
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Sacrificar medianteincisin todo lolargo de la lneamedia
ventral
Buscar en la superficiede los rganos internos
y las membranas serosasla presencia de quistes
Abrir los rganos huecoscon una tijera y los
esponjosos sedesmenuzaran en buscade helmintos. Y en elintestino
en busca de
helmintos y protozoarios
Extraer rganopor rgano, losque se colocanen placas consolucin
salina
Realizar impronta conuna pequea y
delgada porcin dealgunos rganos del
animal
Se limpiara democo y resto de
tejido a loshelmintos
Conservar los helmintoslimpios en AFA y fijar
posteriormente
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Lawrence Ash. Atlas de ParasitologaHumana. Editorial
Panamericana. 5ta.Edicin. Mxico 2010. Pg. 455
Markell Edward K. Parasitologa, Diagnstico,Prevencin y
Tratamiento. Editorial el ManualModerno. 5ta. Ed. Mxico 1984. Pg.
411
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Tincin de giemsa
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1. Secar los frotis durante varias horas ohasta el da siguiente.
No fijarlos.
2. Teirlos durante 45 minutos con unadisolucin 1:50 del
colorante de Giemsa.
3. Lavarlos en agua amortiguada neutra o
bajo agua corriente por 3-5 minutos.
4. Secar los frotis en posicin vertical
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1. Fijar solo los frotis delgados en metanol
absolutoaproximadamente durante 30 segundos por inmersin o por
goteodel alcohol sobre el frotis colocado en un ngulo de 30 o
45.
2. Dejar que se sequen
3. Teir ambos frotis simltaneamente durante 45 minutos conuna
dilucin Giemsa 1:50.
4. Enjuagar brevemente los frotis delgados por inmersin en
aguaamortiguada neutra. Lavar el frotis grueso durante 3-5
minutosadicionales por inmersin en agua amortiguada sin dejar que
el
frotis delgado se ponga en contacto con el agua de lavado.
5. Secar los frotis en posicin vertical con el frotis delgado
haciaabajo.
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1. Fijar los frotis de sangre en alcohol metlicoabsoluto durante
1 minuto.
2. Dejar secar los portaobjetos.
3. Sumergir los portaobjetos en una solucin deGiemsa en
proporcin de una parte de sta con30-50 partes de agua amortiguada
(pH 6.8 a 7.2).Teir durante un lapso de 30 minutos a 1 hora.
4. Mojar brevemente los portaobjetos con aguaamortiguada, despus
se escurren con rpidez yse dejan secar al aire
