1. Tinción de Wright

Esta coloración es conocida como policromática debido a que produce varios colores. Es

una solución de alcohol metílico de un colorante ácido (eosina) y otro básico (azul de

metileno). El alcohol sirve como un fijador del frotis sanguíneo al portaobjetos. El

amortiguador, que consiste en una solución tamponada, mantiene el pH del colorante y

favorece la mejor absorción por los diferentes componentes celulares. Materiales:

Colorante de Wright: para 100 mL se requiere de colorante de Wright (0.3g),

metanol (97.0 mL) y glicerol (3.0 mL). Disolver en un mortero el colorante con el

glicerol. Una vez disuelto se adiciona el metanol trasvasándolo a un frasco oscuro.

Agitar. Filtrar antes de usar.

Solución amortiguadora tamponada: en un litro de agua destilada se agregan 3.76 g

de hidrofosfato disódico (Na2HPO4* 2H20) y 2.10g de fosfato de potasio

dihidrogenado (KH2PO4). Mezclar todos los reactivos y guardar en frasco de vidrio

en lugar fresco. Ajustar el pH a 7.2.

Rejilla horizontal o soporte de tinción. Técnica:

Colocar el frotis secado al aire sobre una rejilla o cubeta de tinción con la sangre

hacia arriba (ver figura 4).

Cubrir completamente el portaobjetos o cubreobjetos con el colorante de Wright

gota a gota. Dejarlo que permanezca en el frotis aproximadamente de 5-8 minutos,

para fijar los glóbulos sanguíneos. El colorante deberá cubrir completamente el

portaobjetos, pero no debe derramarse por los bordes. Deberá agregarse una

cantidad adicional si éste se comienza a evaporar.

Agregar directamente al colorante un volumen igual de amortiguador de Wright,

para evitar la coloración débil. Esperar la formación de brillo metálico. Puede usarse

de igual manera agua desionizada. Dejar actuar de 10-15 minutos.

Lavar con agua en el chorro cuidadosamente hasta que la extensión presente un

aspecto rosado al examinarlo a simple vista.

Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodón humedecido en alcohol

para eliminar cualquier resto de colorante.

Secar al aire y observar con el microscopio con el objetivo de inmersión.

Resultados:

Los eritrocitos se observarán de color naranja o rosado. El citoplasma de los monocitos presentarán una tonalidad azul grisácea con gránulo

rojizos bastante finos y sus vacuolas características. El citoplasma de los linfocitos

presentará varias tonalidades azules.

Los núcleos de los linfocitos y neutrófilos aparecerán de color púrpura oscuro. Los

núcleos de los monocitos de color púrpura algo más claros (lila).

Los gránulos de los eosinófilos son de color rojo-anaranjado intenso. Los gránulos

de los basófilos púrpura azulado muy oscuro. Los gránulos de los neutrófilos se

aprecian de color lila, bastante finos.

Las plaquetas toman coloración violeta o púrpura.

Observaciones:

Los tiempos varían de acuerdo a cada lote o tiempo de maduración del colorante.

De ahí que si los frotis recién teñidos resultan demasiado pálidos se corrige

aumentando el tiempo de tinción o disminuyendo el tiempo de lavado.

Si en la preparación se observa precipitados de colorante puede ser debido a varias

causas: lavado insuficiente al final del proceso, utilización de porta o cubreobjetos

sucios, mala filtración del colorante, mala distribución del colorante a lo largo de la

extensión por no mantenerse en posición horizontal.

Durante la tinción el tampón fosfato controla el pH del colorante. Si el colorante es

demasiado ácido la extensión resultará demasiado rojiza y si por el contrario es

demasiado alcalina la precipitación presentará un aspecto azulado.

AcidófilosLos microorganismos que tienen un crecimiento óptimo en niveles de pH inferiores a 5 se llaman acidófilos. Estos microbios se encuentran en varios entornos, incluyendo los géiseres y las piscinas sulfúricas, así como en el estómago humano. Algunos ejemplos de acidófilos son la microscópica alga Cyanidium caldarium y Dunaliella acidophila. Los hongos microscópicos Acontium cylatium, Cephalosporium y Trichosporon cerebriae pueden crecer en un pH cercano a 0. Un microorganismo primitivo llamado Picrophilaceae tiene valores óptimos de pH próximos a cero y también puede crecer en valores de pH negativos.

AlcalófilasLos microorganismos alcalófilos tienen un crecimiento óptimo en valores de pH entre 9 y 12. Estos microorganismos crecen en lagos, suelos alcalinos y otros entornos de pH alto. En los vertederos del lago Calumet, al sureste Chicago, el agua puede alcanzar un pH de 12,8, que es similar a la soda cáustica. Algunas bacterias relacionadas con el Clostridium y el Bacillus viven en ese ambiente extremadamente alcalino. El Lago Mono en California y el Octopus Spring en el parque Yellowstone son ejemplos deentornos donde se encuentran microorganismos alcalófilos.

NeutrófilosLos valores de pH neutro, entre 6 y 8, son más comunes en la naturaleza. A lo largo de su evolución, la mayoría de los microorganismos se han adaptado para tener crecimientos óptimos en entornos de acidez neutra. Estos microorganismos se denominan neutrófilos e incluyen a la mayoría de especies de microalgas y otros organismos que forman el fitoplancton, así como algunas bacterias y levaduras que viven en el suelo.

Los patógenos y el PHLa mayoría de los microorganismos asociados con las enfermedades de humanos, animales y plantas son los neutrófilos, tales como la Escherichia coli, que causa infecciones intestinales; la Erwinia caratovora, un parásito de las plantas; la Pseudomonas aeruginosa, que causa una serie de infecciones en humanos y animales; y el Streptococcus pneumoniae, que causa neumonía. Sin embargo, los agentes patógenos se encuentran también entre acidófilos y alcalófilos. Las bacterias Lactobacillus acidophilus tienen un crecimiento óptimo en niveles bajos de pH, causando infecciones vaginales. La bacteria alcalófila Vibrio cholerae causa el cólera en los seres humanos.

Ciclo celular y control de la replicación

El DNA tiene que duplicarse a lo largo del ciclo celular para que las células hijas tengan la misma cantidad de DNA que la célula de que proceden. Por tanto ha de haber un acoplamiento perfecto entre replicación y división celular. El tiempo que tarda una célula en dividirse se llama tiempo de generación (T) que, en el caso de E. coli en condiciones óptimas de crecimiento (medio rico, 37 ºC, buena aireación) es 20 min; si crecemos E. coli en condiciones limitantes este tiempo puede alargarse hasta 60 min. El tiempo de generación es variable y depende de las condiciones ambientales de crecimiento. El tiempo que tarda el DNA de E. coli en replicarse se llama tiempo de replicación (C) y es de 40 min en condiciones normales. Desde que termina una ronda de replicación hasta que la célula se divide, pasa un tiempo de 20 min. que se llama D.

¿Como es que siendo C y D constantes T es variable ?. La velocidad de elongación en la replicación es constante, es decir, las horquillas avanzan a la misma velocidad, pero la frecuencia con que se inicia una ronda de replicación no es constante. Esto significa que el control de la replicación se efectúa a nivel de iniciación, cuando la célula crece mas deprisa y por tanto T es mas pequeño, el DNA no se replica más rápidamente, sino que las rondas de replicación se inician con más frecuencia, de hecho, en condiciones óptimas las rondas de replicación se solapan, es decir empieza una ronda antes de haber acabado la anterior.

El siguiente esquema muestra cómo estaría el DNA de una célula con un tiempo de generación de 60 min., el DNA se representa lineal para simplificar el esquema:

En el primer caso T = C + D. En el segundo T = C, por lo que C y D están solapados, cada 40 min se inicia una ronda de replicación y nada mas terminar una comienza otra. No se sabe bien qué es lo que controla la iniciación de la replicación, pero si  se sabe por qué no hay reiniciaciones.

Una vez que se inicia una ronda, no debe iniciarse otra hasta pasado un tiempo T. ¿Qué es lo que bloquea la reiniciación? En los 245 pb de oriC hay 12 secuencias GATC conservadas. Estas secuencias son sustrato de la enzimaDam metilasa, que introduce un grupo metilo en una A (dam = deoxyadenosin metilasa) de la secuencia GATC de un DNA hemimetilado (una banda metilada y la otra no).:

La metilasa Dam no actúa inmediatamente, sino que tarda unos 2 min. en metilar la hebra complementaria. Las GATC de oriC tardan mucho más, ver más adelante. Durante estos dos minutos dicho DNA hemimetilado constituye una señal que impide la reiniciación (esto supone una ventana a lo largo de la cual estas secuencias actúan como señales de reparación).  Estas señales interaccionan específicamente con la membrana que secuestra secuencias GATC hemimetiladas (si ambas están metiladas o ninguna está metilada no existe esta interacción). El oriC secuestrado en la membrana no es activo, esto es lo que explica que no haya una nueva iniciación:

Existe una proteína unida a la membrana llamada secA que impide que entre la DnaA. Las secuencias unidas en la membrana tardan 10 min en metilarse del todo, después se liberan de dicha membrana, interaccionan con Dna A y se inicia otra ronda de replicación.

Ese origen ha de activarse de forma sincronizada con la división celular. Lo más lógico es pensar que lo que controla la frecuencia de iniciación son los niveles de proteína DnaA, sin embargo sé vio que los niveles de DnaA no fluctúan a lo largo del ciclo, sino que permanecen constantes. Lo que varía en realidad es la cantidad de DnaA activa. Para que la proteína, DnaA esté activa y reconozca las cajas DnaA, ha de estar desagregada y acomplejada con ATP. Esta es la representación de la hipótesis:

Replicación del DNA eucariótico

De manera similar a los procariontes la replicación eucariótica es semiconservativa, bidireccional, semidiscontinua y tiene el mismo mecanismo general. La diferencias fundamentales de la replicación en eucariontes con respecto a la replicación de procarióticos radican en que:

1) La velocidad de elongación es mucho menor: E. coli: 1000 nt/seg, levaduras: 60 nt/seg, Drosophila: 40 nt/seg, ratón: 30 nt/seg y sin embargo los DNAs son mucho más grandes: E. coli 4.6·103 kb y en el humano ~1.5·105 Kb, los DNAs eucarióticos tardarían mucho en replicarse, lo que ocurre es que:

2) Existen múltiples orígenes de replicación (en E. coli sólo había uno).

3) No existen rondas de replicación solapadas. En E. coli había rondas de replicación solapadas que generaban tiempos de generación cortos. Esto es algo inadmisible en eucariotas: la división celular se da una vez se ha replicado el DNA, dicha replicación solo ocurre en una fase concreta del ciclo celular: la fase S.

4) Los fragmentos de Okazaki son más cortos.

5) El control es más complejo.

Sistemas modelo in vitro

Reconstrucción in vitro de un sistema que replique DNA. Se han purificado proteínas viéndose así cuales son necesarias para replicar el DNA. Uno de los sistemas más utilizados ha sido el del virus SV40 (virus con DNA circular de doble banda). La ventaja del SV40 es que para replicar solo se requiere una proteína del virus, las demás son celulares. La proteína requerida del virus es el antígeno T que reconoce específicamente el origen de replicación. A partir de aquí todo es extrapolable a lo que ocurre en otros organismos eucarioticos.  En la tabla se listan los componentes del sistema celular HeLa que puede replicar el DNA del virus del simio SV40.

Las dos polimerasas α y δ existen como un complejo que consiste de una subunidad catalítica de 180 kD asociada con otras subunidades, incluyendo dos pequeñas proteínas que le aporta actividad primasa. DNA pol δ esta menos bien caracterizada. El sistema que replica el DNA eucariótico in vitro se ha purificado, con la excepción de las topoisomerasas todos los componentes listados forman parte de la horquilla de replicación.

Factores de replicación eucarióticos:

Proteína Función

DNA polimerasa α /primasa Síntesis del cebador

DNA polimerasa δ Síntesis de DNA

PCNA Le confiere procesatividad

Factor de replicación C Elongación (Actividad ATP asa)

Factor de replicación A Se unen a DNA de simple cadena

Topoisomerasas I y II Liberan superarrollamientos en el DNA parental

MF-1 (5’ → 3’ exonucleasa) Elimina el RNA

DNA ligasa I Sella mella

En la figura siguiente se muestra un modelo para el mecanismo de la replicación en eucariontes:

1.      La iniciación en el origen de SV40 requiere el producto del virus, antígeno T que se une al origen e inicia el proceso de separación de las cadenas. (no se sabe en las células eucarióticas quien lleva a cabo esta función del anti T)

2.      El factor de replicación A (RFA) es una proteína tipo SSB que se une al DNA y permite desenrollar las cadenas más extensivamente. La polimerasa α existe como un complejo que contiene la actividad cebadora.

3.      La unión de pol α  inicia la síntesis de ambas cadenas del DNA. La reacción  cebadora es inusual, comienza con RNA, como otras, pero el cebador es extendido por la actividad polimerizante una secuencia de DNA (200 bases), llamada iDNA.  El factor de replicación C (RFC) se une al extremo 3’del iDNA y carga la DNA pol δ  y PCNA (llamada así por razones históricas Proliferating Cell Nuclear Antigen) que actúa como un factor que confiere procesatividad a la pol δ.

La tuberculosis es una de las enfermedades más antiguas en la historia de la humanidad. Se calcula que habrá cerca de 80 millones de casos de tuberculosis en la primera década del siglo XXI, una proporción de los cuales es muy probable que sea resistente a medicamentos. Aproximadamente un tercio de la población mundial es portadora de M. tuberculosis, y la OMS predice que, en el año 2005, en los países en desarrollo, causará 8 millones de nuevos casos y de 3 a 4 millones de muertes por año, más que cualquier otro agente infeccioso único. Esto está atribuido primariamente a una respuesta inmune inadecuada del huésped, lo cual sugiere que se produce una inhibición del crecimiento de la micobacteria más que su destrucción, con la ulterior multiplicación catastrófica 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8.

El agente causal de la tuberculosis fue descubierto en 1882 por Roberto Koch, es de aspecto bacilar recto y alargado, mide 0.4 x 3 micras, pertenece al orden Actinomicetae, a la familia Mycobacteriaceae y al género Mycobacterium 9, 10, 11.

      El género Mycobaterium incluye más de 100 especies que pueden clasificarse en seis grupos desde el punto de vista bacteriológico; con fines didácticos se dividen en tres apartados 13.

Complejo tuberculosis: Incluye las especies M. tuberculosis, Mycobacterium bovis (incluida la cepa BCG) y Mycobacterium africanum, productoras todas ellas de tuberculosis, siendo el primero el que se aísla con mayor frecuencia. Se incluye también Mycobacterium microti, productor de tuberculosis en rata.

Complejo lepra: En el que se incluyen las especies M. leprae, productor de la lepra humana.

Otras Micobacterias: Algunas llegan a ser patógenas, otras pueden ser patógenas oportunistas y finalmente otras suelen ser saprofitas. Producen las denominadas micobacteriosis.

Se caracteriza por ser un microorganismo intracelular obligado, aerobio, inmóvil, que se replica dentro de los fagosomas de los macrófagos6, 13, 14. Su tiempo de duplicación es de 12 horas o más por lo que su crecimiento en medios de cultivo es muy lento.15 Es sensible al calor, rayos ultravioleta y al sol directo, presenta resistencia a ácidos, alcoholes, álcalis, desinfectantes y a la desecación; además es naturalmente resistente a muchos antibióticos debido principalmente a la envoltura celular altamente hidrofóbica que actúa como una barrera permeable lo que hace difícil su tratamiento.13, 16 

Su pared celular es compleja, posee un alto contenido de lípidos (40%), proteínas y polisacáridos; es rica en ácido micólico, el cual se encuentra unido covalentemente con glicolípidos tales como α,α- tetrahalosa dimicolato (TDM, cord factor) y α,αtrihalosa monomycolato (TMM). Ésta barrera permeable protege al organismo del medio ambiente,  contribuye a la persistencia de la enfermedad y a la resistencia a muchos antibióticos a la vez que contribuye a la longevidad de la micobacteria. Inicia las reacciones inflamatorias del huésped y actúa en la patogénesis de la enfermedad15, 17, 18.

Estructura celular de M. tuberculosis12

Consta de un gruesa pared, separada de la membrana celular por el espacio periplásmico, con cuatro capas. La mas interna es el glicopéptido o peptidoglicano con moléculas de N-acetilglucosamina y ácido-N-glucolilmurámico, con cortas cadenas de alanina. Esta capa es el esqueleto de la bacteria que le da forma y rigidez. Externamente, hay otras 3 capas compuestas: una por polímeros de arabinosa y galactosa, otra formada por ácidos micólicos (que son ácidos grasos derivados y otra superficial formada por lípidos como los

sulfolípidos, el cord factor, llamado así por su aparente asociación con la forma acordonada con que se agrupan las micobacterias virulentas, y los micósidos.

    Los principales antígenos de las micobacterias pueden dividirse en dos grandes grupos: los solubles o citoplasmáticos y los insolubles ligados a la pared celular

En relación a la naturaleza de los antígenos solubles, se sabe que hay:

a) De naturaleza polisacárida: comunes a todas las micobacterias y constituidos por arabinomananos, arabinogalactanos, glucanos.

b) Proteínas: algunas están bastante estudiadas. Entre ellas la denominada tuberculina vieja (OT) o el Derivado Proteíco Purificado (PPD). También el antígeno 5 o el de 65 Kda.

c) Lipídica: los monósidos de fosfatidil inositol (PIM) constituyen una familia de lípidos polares que se encuentran presentes en la membrana plasmática de las micobacterias. Entre ellos podemos citar los glicolípidos fenólicos, específicos para M. tuberculosis (PGL-Tbl).

d) El denominado antígeno 60 (Ag 60): es un complejo proteíco-lipopolisacárido procedente del citoplasma y de la membrana celular de M. bovis BCG y es común a M. tuberculosis. M. bovis y otras micobacterias.

Las proteínas del Mycobacterium son las que le confieren la propiedad antigénica; ciento cincuenta de sus 1000 proteínas han sido caracterizadas15. Las más predominantes han sido aisladas, caracterizadas y copiadas por síntesis química o sus genes han sido insertados en huéspedes comoEscherichia coli, para la reproducción en gran escala de proteínas recombinantes19. Para su estudio se han agrupado en cuatro grupos de acuerdo a su función, secuencia y características físico químicas:

El primer grupo formado por proteínas de stress térmico (hsp, del inglés heat shock protein), son un grupo de polipéptidos esencialmente citoplasmáticos, que incrementan su síntesis frente a estímulos estresantes como los cambios en la temperatura, el incremento de daño oxidativo y la disminución de nutrientes; esta respuesta probablemente proteja a la micobacteria durante situaciones adversas, manteniendo la conformación funcional de proteínas esenciales y asistiendo en la reducción de proteínas desnaturalizadas. Se agrupan en familias dependiendo del peso molecular: hsp65 kDa o GroEL, hsp 10 kDa o GroES, hsp 70 kDa o DnaK, hsp 90 kDa, hsp 16 kDa entre otras. Estas proteínas están presentes tanto en células procarióticas como eucarióticas; se conoce que están altamente conservadas dentro y a través de las especies, lo que ha llevado a plantear la hipótesis de que la respuesta de las células T a determinantes compartidos de las hsp propias y las del Mycobacterium tuberculosis tienen un papel importante en el desarrollo de las enfermedades autoinmunes4, 15, 20, 21, ,22, 23, 24, 25, 26, 27.

El segundo grupo son las lipoproteínas, incluye a las de 19 kDa, 26 kDa, 27 kDa y 38 kDa, fundamentalmente constitutivas de la pared celular pero pueden ser encontradas en el citoplasma, las de 19 y 38 kDa son las más importantes. Se considera que estas lipoproteínas están involucradas en la inducción de respuestas humoral y celular, en especial de la respuesta de las células T de memoria  invitro, y tienen un papel funcional en el transporte de nutrientes a través de la pared celular28,29. Un tercer grupo son las proteínas secretorias, están constituidas principalmente por proteínas de 15, 18, 23, 26, 27, 30, 31, 31.5 y 41 kDa, algunas de éstas forman el complejo 85 que es el mayor constituyente del sobrenadante de los cultivos delMycobacterium tuberculosis30, 31, 32.

El último grupo está constituido por las enzimas, la L-alanina deshidrogenasa de 40 kDa y la superóxidodismutasa de 23 kDa, que están involucradas en los mecanismos de defensa del bacilo dentro de los macrófagos.

Se está tratando de definir que antígeno o epítopo estimula las diferentes respuestas de las células T; la gran mayoría de los antígenos micobacterianos son llamados timodependientes, ya que necesitan de la participación de los linfocitos T cooperadores para generar suficientes respuestas humorales33. 

El Mycobacterium presenta 30 diferentes sustancias antigénicas que son capaces de despertar reacciones de hipersensibilidad con destrucción celular34.

El antígeno 38 kDa antes conocido como antígeno 78, antígeno 5 o antígeno proteico b(pab), es una proteína de 38,000 daltones, que se ha identificado como una de las de más alta especificidad para la detección de la enfermedad. Es el mayor constituyente de líquido de cultivo de Mycobacterium tuberculosis. De las especies de Micobacterias se encuentra sólo presente en Mycobacterium bovis y Mycobacterium tuberculosis, su concentración en este último es 10 veces superior. La secuencia de aminoácidos de la proteína 38 kDa posee un 30% de homología con una proteína (PhoS) relacionada con la fijación y el transporte de fósforo en Eschericia coli, la cual se incrementa durante la disminución de fosfato en el citoplasma.

El antígeno 38 kDa de la micobacteria posee diferentes epítopes localizados en la porción central de la molécula y en el carboxilo terminal, los cuales son capaces de inducir la proliferación de clones de células T específicos para M. tuberculosis, aunque algunos pueden tener reactividad cruzada. Una respuesta humoral excesiva al 38 kDa parece tener significado patogénico   11, 33, 35. La glicoproteína 38 kDa es una molécula blanco para los CD8. La inmunodominancia del 38 kDa en las reacciones mediadas por anticuerpos y células T se basa en su localización extracelular.

Lo anticuerpos dirigidos contra la proteína 38 kDa se presentan en un alto porcentaje de pacientes con Tuberculosis y tiene una alta especificidad para la enfermedad activa35, 36. La mayoría de pacientes produce anticuerpos contra la proteína 38 kDa, mientras que en los controles sanos no se encuentra.

Recientemente se demostró que la vacuna DNA de 38kDa está induciendo una inmunidad protectora en ratones vacunados que se exponen a bacilos tuberculosos virulentos, lo que resulta en una disminución de la carga bacteriana. Este anticuerpo se une sólo al antígeno hallado en M. tuberculosis y en BCG de M. bovis, no produce una reacción visible con otros sueros, por lo que el antígeno de 38 kDa parece ser serológicamente específico. Debido a su alta especificidad, se considera que la proteína 38 kDa puede llegar a sustituir al derivado proteico purificado (PPD) en el diagnóstico de la Tuberculosis4, 11, 33, 38, 39, 40, 41.

El antígeno 16 kDa es una proteína de superficie, el más potente inmunógeno, una herramienta de gran valor en el estudio del Mycobacterium, puesto que es altamente específico. La localización celular es desconocida, aunque se considera que está en la parte externa de la pared celular; en otras palabras, esta proteína es probablemente periférica asociada con la membrana4, 42  . Forma un complejo de 9 subunidades específicas con una masa total calculada de 144.9 kDa, pudiendo funcionar como chaperón molecular in vitro en una forma independiente del ATP.

Cuando hay infección por M. tuberculosis, la respuesta al óxido nitroso (NO) produce el incremento en la síntesis del homólogo alfa cristalino sHsp 16, que es una proteína mayor de M tuberculosis producida por la exposición a intermediarios de nitrógeno reactivos37, 43, 44. El antígeno de 16 kDa es un antígeno inmunodominante con valor serodiagnóstico, lleva los epítopes restringidos al bacilo tuberculoso. La presencia de la proteína 16 kDa se eleva en casos de enfermedad activa o cuando se ha desarrollado una recaída o el bacilo se ha vuelto resistente a los fármacos, disminuye en caso de que exista una respuesta adecuada al tratamiento. Los anticuerpos contra 16 kDa podrían elevarse en respuesta a la infección aún sin que la tuberculosis sea clínicamente aparente, por lo que se considera como un marcador temprano de enfermedad, además de que puede utilizarse también en el diagnóstico de la enfermedad en los niños.

MECANISMOS DE INTERCAMBIO DE INFORMACIÓN GENÉTICALa transferencia de ADN entre microorganismos puede ocurrir básicamente por cuatro procesos : a) transformación, b) conjugación, c) transducción y d) sexducción. Mediante estos mecanismos los microorganismos pueden incorporar material genético o donar material genético dando lugar a formas recombinantes.TransformaciónPodemos definir el proceso de transformación bacteriana como la capacidad que presenta una bacteria para incorporar un fragmento de ADN que se encuentra en el medio externo. Este mecanismo fue descubierto en el año 1928 por F, Griffith en Streptococcus pneumoniae (transformación de cepas rugosas no patógenas a cepas lisas patógenas). Posteriormente Avery, Mac Leod y Mc Carty (1944) demuestran que el principio transformante era el ADN (experiencia que muestra por primera vez que la información genética estaba codificada en las moléculas de ADN).

En el proceso de transformación natural el ADN a ser captado debe encontrarse en estado de doble cadena y el número de moléculas de ADN que puede captar una bacteria es limitado existiendo una cinética de saturación.El fenómeno de transformación ocurre en varias etapas, y la bacteria que va a recibir el ADN exógeno debe encontrarse en estado "competente" (estado en el cual la bacteria es capaz de incorporar ADN del medio e integrarlo al cromosoma bacteriano).El estado de competencia depende de varios factores y es diferente para cada especie bacteriana. Los factores que influyen son varios como la densidad celular del cultivo, temperatura, pH, nutrientes (fuente de carbono o de nitrógeno). Las bacterias pueden llegar al estado de "competencia" cuando se acercan al final de la fase de crecimiento exponencial y entran en la fase estacionaria. En el estado de "competencia" en general se encuentran entre un 10% a 20% de la población bacteriana aunque esto puede variar según la especie bacteriana. Por ejemplo el Streptococcus pneumoniae el estado competente afecta al 100% de las célulasdurante la etapa exponencial mientras que el Bacillus subtilis solo entre el 1 y el20% se encuentran en estado competente y este se manifiesta en la etapa estacionaria. El primer paso de la transformación consiste en la unión de la molécula de ADN a la superficie de la célula bacteriana. Por ejemplo el Streptococcus pneumoniae presenta entre 20 y 50 puntos de unión. Una vez que el ADN se une, sufre una serie de cortes en las dos cadenas mediante la acción de endonucleasas. Cuando los fragmentos de ADN entran a la célula, pierden una de las dos cadenas. En el interior de la célula, el ADN forma un complejo con proteínas quedando protegido de la ADNasa I.Existe en este momento un estado denominado fase de eclipse cuando el ADN que entró por transformación (exogenote) si sale de la célula no va a poder ejercer el efecto transformante.Este ADN posteriormente se integra al cromosoma bacteriano en zonas de homología de secuencias.ConjugaciónLederberg y Tatum en 1946 descubren un proceso por el cual las células de E. colipueden intercambiar material genético mediante un contacto físico entre ellas (fig1). Hoy día este fenómeno tiene gran importancia evolutiva y ecológica puesto que la transferencia de ADN puede establecerse no solo entre células de la misma cepa bacteriana sino entre especies distintas y alejadas evolutivamente. El plásmido F conocido originalmente como factor de fertilidad fue el primero que se descubrió que podía pasar de una bacteria donante a una receptora mediante el mecanismo de conjugación (fig 2).El plásmido F es de tipo conjugativo y tiene la capacidad de interaccionar con el cromosoma bacteriano e integrarse en él (forma denominada "episoma")El contacto físico se establece mediante la formación de un "pelo" o "pili" sexual constituido por proteínas. Para la formación del "pili" intervienen no menos de 16 productos génicos. Dentro de las bacterias donantes se pueden diferenciar tres+tipos 1) las F, que presentan al plásmido F y pueden transferirlo, 2) las Hfr(células de alta frecuencia de recombinación) que contienen al factor F integrado en su propio cromosoma bacteriano, y lo pueden transferir junto con genes bacterianos, y 3) las F' (F-prima) que son células Hfr que portan el genoma del factor F pero este tiene la capacidad de excindirse y recircularizarse (forma de plásmido) llevando consigo genes bacterianos. El primer factor F-prima (F') fue aislado por Jacob & Adelberg y llevaba genes del operón Lac . A este fenómeno de transferencia de F' de una bacteria donante a una receptora se le conoce con

-el nombre de sexducción. A las bacterias receptoras se le denomina F, ellas nocontienen al plásmido F y lo reciben de las bacterias donantes . Previo al proceso de conjugación, el Plásmido F se replica y transfiere su información a la célula F- convirtiéndola en F+ sin perder ella misma dicha capacidad.

Fig 1: Observación al microscópio electrónico del mecanismo deConjugación.

Fig 2 : Mapa físico y funcional del plásmido F (100 Kb).TransducciónEste mecanismo se puede definir como la transferencia de material genético no vírico de una bacteria a otra por intermedio de un bacteriófago. Estos fagos llevan la información genética de la bacteria en el interior de su cápsida (partículas transductoras) (fig 3).Originalmente este fenómeno se describió en Salmonella aunque hoy se conoce en distintas especies bacterianas. Varios fagos presentan capacidad transductora como el P1, T4, Mu y el fago ?. Existen dos tipos de transducción:, a) la transducción generalizada en la cual el fago puede portar un fragmento cualquiera del genoma bacteriano, b) la transducción especializada en la cual el fago lleva información de regiones específicas del cromosoma bacteriano (ej el operón gal de E.coli en el fago ? ) pudiendo transducir e infectar.

Fig 3: Esquema general del proceso de transducción.

TRANSPOSONESSe conocen también con el nombre de elementos genéticos móviles, genes saltarines, casetes, etc. Los primeros genes saltarines los descubrió Barbara McClintock en la década del 40 cuando estudiaba la genética del maíz y en 1967 se descubren en organismos procariotas (E.coli). Son secuencias de ADN que tienen la capacidad de saltar de un lugar a otro del genoma. Los transposonesmás simples se denominan elementos IS (secuencias de inserción) y presentan una región central de 700 a 1500 bp rodeados de una secuencia invertida de 10 a30 bp. En la región central se encuentran los genes encargados de realizar el salto o transposición. También se encuentran los llamados transposones compuestos que presenta una región central rodeada por dos elementos IS, estos transposones llevan información genética adicional. En el mecanismo del salto o transposición intervienen enzimas tales como la transposasa (produce cortes) y la resolvasa (actúa en el proceso de recombinación).En algunos casos el elemento móvil puede replicarse antes de saltar dejando una copia en el lugar original mientras que otras veces puede saltar sin dejar copia e insertarse en otra región del genoma. Estos elementos genéticos móviles los podemos encontrar tanto en el cromosoma bacteriano como en plásmidos y pueden ser transferidos entre bacterias por los mecanismos de conjugación, transducción y transformación.

MUTACIÓN EN MICROORGANISMOSEl material genético de un microorganismo puede alterarse por factores endógenos (origen espontáneo) o exógenos (origen inducido). Existen distintos niveles mutacionales, por ejemplo cuando la mutación tiene un efecto puntual en un gen se denomina mutación génica mientras que si esta afecta a diversas partes del genoma, la denominamos mutación genómica. Si la mutación afecta la estructura del cromosoma (en bacterias) o de los cromosomas (microorganismos eucariotas; levaduras) las denominamos mutaciones cromosómicas. Al hablar de mutaciones en microorganismos debemos tener en cuenta la variabilidad microbiana existente así como el tamaño de sus genomas (Tabla 1).

Microorganismo sTamaño del genoma(Mb)

Proporción del genoma codificante de proteínas

Número de proteínas por genoma

E. coli 4.64 88 4288

H. influenzae 1.83 85 1703

H. pylori 1.70 91 1590

Mycoplasma pneumoniae 0.82 89 677

Saccharomyces cerevisie 12.1 72 5885

Tabla 1: Comparación de genomas de distintos microorganismosLas mutaciones que afectan al fenotipo del microorganismo nos permiten diferenciarlo en algún carácter en particular respecto del microorganismo con fenotipo "normal" que sirve de referencia (fenotipo silvestre).En última instancia los fenómenos mutacionales tienen su efecto a nivel de la molécula de ADN y pueden verse alteradas secuencias o elementos necesarios para la expresión de un gene o de varios genes (promotores, secuencias reguladoras, terminadores, etc.). Por otro lado las mutaciones pueden afectar secuencias moduladoras tales como operadores.Las células bacterianas crecen y se dividen dé tal forma que en uno o dos días una célula origina millones de ellas, todas genéticamente idénticas (clones). Las células que derivan de una de ellas se mantienen juntas formando la colonia bacteriana (visible al ojo humano, aproximadamente 10 millones de bacterias). Por lo tanto la colonia constituye la unidad más importante para la identificación de células mutantes. Uno de los desafíos del genetista microbiano consiste en diseñar estrategias experimentales para el reconocimiento de colonias mutantes; a tales efectos se emplean los procesos de réplica, selección y contraselección (Fig 4).Actualmente existe tecnología adecuada y costosa para poder identificar células mutantes en forma separada o sea que mediante estos métodos, la célula pasaría a ser la unidad de identificación de fenotipos mutantes.Una de las técnicas de análisis reciente de células es la citometría de flujo; que consiste en tratar a una población celular con un agente mutagénico y luego se hace pasar por un tubo capilar iluminado por un rayo de luz que analiza varios parámetros celulares (tamaño, transparencia celular, emisión de fluorescencia). Posteriormente mediante un sistemaseparador es posible obtener células aisladas con diferentes características. La posibilidad de marcar a las células con compuestos fluorescentes aumenta las posibilidades de separación de las mismas en un citómetro de flujo.

Fig 4: Procedimientos para la búsqueda de colonias mutantes. Mediante la réplica se comparan copias idénticas de colonias en dos o más cajas de Petri con distintos medios de cultivo (por ejemplo: medio completo y medio mínimo para identificar mutantes auxótrofos) o también con igual medio de cultivo pero distintascondiciones de temperatura (por ejemplo: cultivos a 30º C y cultivos a 40º C, para identificar microorganismos termosensibles). El sistema de selección utiliza el agregado de sustancias que matan a unas células mientras que otras no se ven afectadas. El sistema de contraselección se utiliza para la identificación y análisis de las colonias mutantes ya que se eliminan primero las que crecen y posteriormente se dejan crecer en condiciones óptimas a las colonias supervivientes.

Protótrofo: Cepa de microorganismo capaz de crecer en un medio mínimo definido a partir del cual puede sintetizar la totalidad de las moléculas biológicas complejas que requiere.Auxótrofo: Cepa de microorganismo incapaz de sintetizar una molécula orgánica determinada necesaria para su crecimiento. Se produce su crecimiento cuando sesuministra en el medio de cultivo el compuesto requerido.¿Son frecuentes las mutaciones?En general las mutaciones espontáneas son poco frecuentes. Para cuantificar las mutaciones se suelen usar dos parámetros a) tasa de mutación, y b) frecuencia de mutación.La tasa de mutación nos mide la tendencia que tiene un gen de sufrir mutaciones, y se expresa como el número de mutaciones que ocurren por cada unidad que mida la oportunidad de mutar. Dicha unidad puede ser el tiempo de generación celular o de división celular (tiempo biológico).Por frecuencia de mutación se entiende como la frecuencia de aparición de un mutante en la población final de bacterias.

Ejemplo: Tasa de mutación será el cociente entre un evento mutacional (M) en 7 divisiones celulares reales. Mientras que la frecuencia mutacional se calculará como el cociente entre la frecuencia de células mutadas en el total final de la población (2/8= 0.25).

Test de AMESDicho test fue desarrollado por el microbiólogo Bruce Ames con la finalidad de poder determinar el poder mutagénico de determinadas sustancias químicas. Este nos permite en forma rápida evaluar aquellas sustancias químicas que pueden tener poder carcinogénico.En este tipo de análisis se parte de la premisa de que si una sustancia química ocasiona daño en el ADN con un efecto mutagénico, también pueden llegar a tener un efecto carcinogénico. A pesar de esto existen sustancias que causan cáncer en animales de laboratorio y son negativas al mismo.En el test de Ames se emplean diferentes cepas de la bacteria Salmonella typhimurium de las cuales se le conocen los tipos de mutaciones que presentan. Estos mutantes han perdido la capacidad de sintetizar el aminoácido histidina (His) por lo tanto se dice que son histidina auxotróficos (His-) pues solo crecen en medios de cultivo a los que se les adiciona dicho aminoácido. Las cepas salvajes de Salmonella typhimurium contienen todas las enzimas necesarias para fabricar el aminoácido His (cepas prototróficas, His +).Por lo tanto se evaluara la capacidad o habilidad que presentan determinados compuestos químicos para producir mutaciones revertientes (back mutation) o sea que las cepas mutantes histidina auxotróficas reviertan a cepas salvajes de Salmonella typhimurium (prototróficas) (Fig 5).

Los principales tipos de mutaciones observadas son a) de cambio del marco de lectura de genes, que traen como consecuencia una traducción errónea de los mismos y b) mutaciones puntuales con sustitución de una base produciendo un cambio en la secuencia aminoacídica de la proteína codificada por dicho gen.Las cepas de Salmonella typhimurium que se utilizan en el test han sido seleccionadas basándose en la sensibilidad a sufrir mutaciones. Estas cepas presentan una serie de características: a) un aumento de la permeabilidad de la pared celular para permitir el ingreso rápido de la sustancia a testar (mutantes rfa), b) mutaciones en el sistema de reparación de daños en el ADN (mutantes uvrB),c) plásmidos R y plásmidos multicopias que agregan errores durante la acción del sistema reparador de daños del ADN. Estas cepas se conocen con el nombre de TA97A, TA98, TA100, TA102 y TA1535.Con el correr de los años se observó que existían sustancias que si bien no eran mutagénicas pero que al ser metabolizadas en organismos superiores producían metabolitos intermediarios que si tenían capacidad mutagénica y podían ser potenciales carcínogenos. Para solucionar parcialmente este problema; al medio de cultivo empleado en el test de AMES se le adicionó una mezcla de enzimas de hígado de rata para simular el metabolismo que sufre la sustancia en un organismo superior. Este sistema que simula al hígado de un mamífero se conocecon el nombre de S-9 y nos permite detectar metabolitos intermediarios posiblemente carcinogénicos.Las ventajas del empleo de dicho test son muchas: es rápido (las bacterias crecen y se dividen rápidamente), es muy simple (El tiempo aproximado para obtener un resultado final en este test es de 30 días), tiene bajo costo económico, es posible testar varias sustancias al mismo tiempo, utilizando las mismas condiciones es repetible el resultado obtenido.

Figura 5: Se observa una versión cualitativa del test de Ames. En la placa de Petri se sembraron cepas de Salmonella typhimurium que requieren His para su crecimiento (auxotróficas, His- ). El disco de papel blanco esta impregnado con una sustancia carcinogénica (2-aminofluorine). Dicha sustancia produce un efecto mutagénico en dicha cepa y se observa crecimiento de diversas colonias alrededor del disco (los mutantes His- mutan a cepas prototróficas que crecen en un medio carente de His).

Resistencia Microbiana a sustancias antibióticasEn los últimos años el avance de la industria farmacéutica permitió generar nuevos antibióticos artificiales para el tratamiento de enfermedades infecciosas.Por otra parte esto genero una adaptabilidad de los microorganismos producto del desarrollo de resistencia. Durante los años de 1940 al 1950 el uso de las sulfamidas y penicilinas produjo el surgimiento de cepas bacterianas resistentes a esas drogas constituyendo un serio problema.En Inglaterra el uso de penicilina G produjo en los staphylococcus aureus un aumento de la frecuencia de cepas resistentes del 10% al 60%. Existe una fuerte base genética que permite explicar la resistencia bacteriana a determinadas drogas. Dentro de los mecanismos genéticos-moleculares podemos citar: 1) la capacidad de que se generen nuevas mutaciones en genes localizados en el cromosomas bacteriano, 2) introducción de plásmidos R. Estos pueden pasar de una cepa bacteriana a otra mediante conjugación.

Los plásmidos R presentan una serie de ventajas adaptativas: a) han evolucionado como respuesta a la presión selectiva del ambiente como ser, los distintos antibióticos utilizados por humanos, b) presentan genes de resistencia a múltiples sustancias antibióticas, c) pueden trasladarse entre bacterias de la misma especie o de especies diferentes, d) presentan elementos genéticos móviles o transposones, e) al no existir presión selectiva (utilización de antibióticos) las células bacterianas los van perdiendo como una forma de "economía" f) no interfieren con otros genes bacterianos por lo cual las bacterias se desarrollan normalmente mostrando todo su potencial fenotípico.En el tema de la resistencia, los seres vivos más abundantes del planeta (las bacterias) nos permiten comprobar la teoría "Darwiniana" de la supervivencia de los más aptos. Como mecanismos bioquímicos implicados en el fenómeno de la resistencia podemos citar : disminución en la permeabilidad a absorber el antibiótico, inactivación enzimática de la sustancia antibiótica, modificación del "blanco" o "diana" sobre la que actúa el antibiótico, síntesis de una enzima de resistencia.La disminución de la permeabilidad puede estar dada por: modificaciones a nivel de la membrana externa (barrera natural), por la existencia de mecanismos de bomba de expulsión que envía al exterior al antibiótico luego de su entrada, alteraciones en el mecanismos, por alteraciones en el mecanismo de transporte del antibiótico.En el caso de las tetraciclinas por ejemplo hay bacterias que presentan transposones tipo el Tn10 o el Tn1721 que codifican proteínas con la función de expulsar al antibiótico desde el interior al exterior de la célula. En el caso de los antibióticos beta-lactámicos (penicilina, cefalosporina) los plásmidos R presentan genes que codifican para enzimas beta lactasas (penicilasas, cefalosporinasa) que abren el anillo lactámico y hacen que el antibiótico pierda su acción. En el caso de la resistencia generada al cloranfenicol , esta viene dada por una enzima inactivante del mismo, denominada cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT). Uno de los genes que codifica para la CAT forma parte del transposón Tn9 . La presión selectiva contínua va generando nuevos mecanismos de resistencia como la creación de nuevas enzimas resistentes.

RESISTENCIA BACTERIANA Y SU RELACIÓN CON LA BIOTECNOLOGÍALa construcción biotecnológica a gran escala de plantas modificadas genéticamente (plantas transgénicas) plantea una serie de problemáticas. Una de ellas es la posibilidad de generar resistencia a los antibióticos por parte de las bacterias que habitan el mismo ecosistema. Este fenómeno podría producirse mediante la migración de genes de resistencia antibiótica desde la planta transgénica a las bacterias.Este efecto boomerang (retorno de los genes hacia las bacterias) podría generar bacterias con alta resistencia a los antibióticos, patógenas para el hombre y los animales (Fig 6).El proceso de transgénesis supone la introducción de un gen extraño, llamado transgén en el genoma de un organismo vivo. Este transgén aportará una ventajaecológica, nutricional, farmacéutica, o permitirá avanzar en las investigaciones sobre regulación génica en eucariotas. Para la realización de este proceso en los laboratorios de biología molecular es necesario manipular los genes para obtener la clonación de los mismos. Esta técnica exige el uso de vectores de clonaciónportadores de genes de resistencia a sustancias antibióticas (tabla 2).

Nombre del gen Confiere resistencia a:Planta transgénica portadora

del gen

Bla TEM-1 Penicilina G, ampicilina, amoxycilina Maíz

aph 3'-2 (NPTII) Kanamicina, neomicina Tomate

Aph 3'-3 Amikacina Tomate

Aad 9 Estreptomicina, espectinomicina Algodón

Tabla 2: genes de resistencia a sustancias antibióticas más frecuentemente utilizados en los procedimientos de transgénesis en vegetales.Actualmente se ha demostrado que las transferencias de ADN pueden establecerse entre reinos muy alejados como el procariota (bacterias) y el reino vegetal. En este caso estaríamos hablando de transferencia entre un organismo eucariota (planta transgénica) y un organismo procariota (bacteria). Dicho proceso se muestra

favorecido por el cultivo intensivo de una planta que porta un gen de resistencia a un antibiótico provocándose un aumento del número de copias de este gen en el ecosistema. En teoría este proceso es totalmente viable de ahí la preocupación de las empresas biotecnológicas destinadas a la producción de plantas mejoradas por estas técnicas.La transferencia horizontal de información genética se efectúa en tres etapas: a) transferencia del ADN, b) estabilización del mismo en un nuevo ser vivo (huésped receptor), c) expresión del gen en dicho huésped.

Fig 6: Bacterias patógenas (Staphylococcus aureus) que desarrollan una resistencia cada vez mayor a los antibióticos de uso frecuente. Problema preocupante en hospitales de saludhumana y salud animal.¿Cómo puede transferirse un gen de resistencia antibiótica desde una planta transgénica a una bacteria?El efecto boomerang del cual hablamos puede producirse por dos mecanismos. El primero de ellos podría ocurrir en el tubo digestivo de animales o seres humanos que ingieren una planta transgénica o un derivado de la misma. Pensemos que en el tubo digestivo encontramos una gran variedad de cepas bacterianas comensales que se encuentran en distintos estados fisiológicos. Algunas bacterias podrían encontrarse en estados de competencia donde por permeabilidad pueden recibir un gen codificador de resistencia antibiótica liberado por la planta durante la digestión (ej. gen bla TEM-1 de 858 bp). A su vez el contacto íntimo entre las bacterias podría favorecer el intercambio de este material genético dentro del tubo digestivo (transferencia horizontal entre distintas especies bacterianas) generándose cepas resistentes. El segundo mecanismo mediante el cual puede generarse el efecto boomerang sería el pasaje de genes desde la planta transgénica en descomposición (raíces) hacia bacterias del suelo. Este mecanismo se ve favorecido por la resistencia y estabilidad de la molécula de ADN en los suelos y por la eficacia de las bacterias del suelo para incorporar material hereditario.¿Cómo puede estabilizarse el o los genes de resistencia incorporados?La estabilización de dichas secuencias de ADN puede realizarse por la llamada recombinación homóloga entre secuencias que están a ambos lados del gen de resistencia y el ADN de la célula bacteriana receptora. Holliday en 1964 propone un modelo de recombinación mediante el proceso de rotura-reunión donde se constituye un ADN híbrido e intervienen una serie de proteínas (RecA, RecBCD, ligasas) (fig 7). En este proceso de estabilización, el gen se incorporará al cromosoma bacteriano y se transmitirá a la descendencia de manera estable.Otro de los procesos de estabilización de material genético extraño puede darse a través de elementos genéticos móviles (transposones) o plásmidos nointegrativos. En estos casos la transmisión puede ser vertical (a la descendencia)u horizontal (entre bacterias).¿Qué alternativas existen para evitar estos problemas?Si bien los genes de resistencia a sustancias antibióticas son los más utilizados como marcadores de selección en las técnicas de ingeniería genética, una de las alternativas viables sería sustituir a dichos marcadores por otros menos problemáticos. Actualmente se empezó a utilizar un gen de resistencia a un herbicida que sería de mayor utilidad en los procesos de selección de plantas transgénicas.

Otra solución sería realizar construcciones separadas o sea el gen marcador y el gen de interés (transgén) e integrarlos en sitios diferentes del genoma para posteriormente realizar cruzamientos entre estas plantas transgénicas y seleccionar aquellas que solo heredan el transgén y no el gen marcador.La tercer alternativa consistiría en colocar a ambos lados del gen marcador secuencias especiales que posteriormente con la utilización de enzimas de restricción se podrían cortar y eliminarlas junto con el gen marcador.

Fig 7: Modelo de Holliday para explicar los fenómenos de recombinación genética.

DIRECCIONES DE INTERNET DE IMPORTANCIA EN GENÉTICA MICROBIANA

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