Upload
duonghuong
View
218
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
EXPRESIÓNEN
TRIPANOSOMÁTIDOS
Verónica Fernández Mancebo
2015
Trypanosoma brucei Trypanosoma cruci
Leishmania major Leishmania mexicana
Trypanosoma brucei
Organización del genoma nuclearOrganización del genoma nuclear
L. major: 32.8Mb en 36 cr peq. (0.28-2.8Mb)
T. brucei: 26Mb en 11cr grandes
T. cruci: 60.3Mb en 41 cr peq
Organizado en grandes grupos de genes policistrónicos (PGCs)(10 a cientos de genes codifican proteínas en la misma hebra)
RepetidosRepetidos RepetidosRepetidos
3232 5353
¿Promotor? ¿Otras seq?Codif. para ARNt ó ARNr Organización policistrónica
GGGTTA
ARN polimerasas nucleares
SUBUNIDADESARNpolARNpol II 12, ARNpol I 14, ARNpol III 17
5 subun son compartidas entre las 32 subun son compartidas entre I y III con homólogas en la II
5 subun homólogas entre las 35 subun son específicas de III2 subun son específicas de I
Diferencias con eucariotas superiores:Existen varias copias para algunas de las subunidades
El CTD de la pol II no contiene los repetidos 7-pept característicos de eucariotas superiores
• 3 ARN polimerasas nucleares (I, II y III)
• Transcripción policistrónica (genes no relacionados func.)
Transcripción Inicio de la transcripción
Se han identificado muy pocosAlgunos muestran clara identidad de seq con los ortólogos en
levaduras y vertebradosOtros presentan muy baja identidad
Para ARNPara ARN--polpol II: TRF4 (ortólogo II: TRF4 (ortólogo divdiv de TFIIB); de TFIIB); SNAPcSNAPc(SNAP50+SNAP2+SNAP3); TFIIA; TFIIH (9 sub); complejo PBP2(SNAP50+SNAP2+SNAP3); TFIIA; TFIIH (9 sub); complejo PBP2
Para ARN-pol III: TFIIIB (2 subunidades); TRF4; SNAP50
Para ARN-pol I: CITFA (específico para tripanosomátidos); en región codif del ARNr: TRF4 y SNAP50
Factores de transcripción
Copyright © 2004, American Society for Microbiology
Mol Cell Biol. 2004 November; 24(21): 9610–9618.
doi: 10.1128/MCB.24.21.9610-9618.2004.
Functional Characterization of a Trypanosoma brucei TATA-Binding Protein-
Related Factor Points to a Universal Regulator of Transcription in TrypanosomesJia-peng Ruan,1 George K. Arhin,2 Elisabetta Ullu,2,3 and Christian Tschudi1,2*
Departments of Epidemiology and Public Health1 Internal Medicine2 Cell Biology, Yale University Medical School, New Haven,
Connecticut3
*Corresponding author. Mailing address: Department of Epidemiology and Public Health, Yale University Medical School, 295 Congress
Ave., New Haven, CT 06536-0812. Phone: (203) 785-7332. Fax: (203) 785-7329. E-mail: [email protected].
Received 2004 May 16; Revised 2004 July 19; Accepted 2004 August 13.
TRF-4 y SNAP50Rol esencial en ARN pol I, II y III
No necesariamente se unen en la región promotora, pero son importante en la transcripción de los genes:
PARP, SL, U-snRNA
•Factor universal de transcripción relacionado con TBP (TRF4: TBP related factor 4)
Finalización de la transcripciónPara ARN-pol II:
Tract de 6 o más “T” en 3’ del SL (similar a pol III) está involucrado en lafinalización de la transcripción, pero no en la transcripción de genes de proteínas(¿diferencia en los complejos que transcriben?)
En PGCs convergentes se separan por varios ARNt ¿la transcripción termina dentrode los genes de ARNt? (ej. Cromosoma 3 L. major)
Variantes de Histonas en regiones switch ¿estructura de la cromatina importa en lafinalización de la transcripción?
Para la ARN-pol III:
Finaliza en varias Ts en el 3’ (nº variable en cada ARNt). No se ha identificadoalguna proteína involucrada
Para la ARN-pol I:
Finaliza en el 3’, en área conteniendo secuencias cortas con potencial de formar unloop (similar a bacteria indep de rho)
En genes de PRO: 3 elementos de secuencias en el 3’ que actúan sinergisticamenteen una manera dependiente de la orientación
••Es responsable de la transcripción de genes Es responsable de la transcripción de genes estructestruct ((actact, , tubulinatubulina), ), de los genes del de los genes del miniexonminiexon (ARN(ARN--ME o ME o SLRNASLRNA) y otros ) y otros snoARNsnoARN
••No parece existir promotores clásicos de eucariotasNo parece existir promotores clásicos de eucariotas
••Expresión constitutiva sinExpresión constitutiva sin gran regulación en el inicio de la gran regulación en el inicio de la transcripción (similar a los TATAtranscripción (similar a los TATA--lessless de eucariotas superiores)de eucariotas superiores)
••Sin Sin intronesintrones ((excepexcep Poli(A) Poli(A) polimpolim. de . de T.bruceiT.brucei, , T.cruziT.cruzi))
••Transcripción Transcripción policistrónicapolicistrónica mRNAmRNA maduro maduro monocistrónicomonocistrónico: : cappingcapping, poli(A), poli(A)
ARN polimerasa IIARN polimerasa IITripartitaTripartita
InrInr
100pb100pb
Inr = CYAC/AYR(+1)
SL-RNA T...TT...T
-60 -30PBP2PBP1
3 subunidadesuna TBP-like
InrInrEvidencia que reclutala pol II
Promotor para ARN-pol II
••Todos los genes de un PGC son transcriptos al mismo Todos los genes de un PGC son transcriptos al mismo nivel como unidad nivel como unidad policistrónicapolicistrónica
••Todos los Todos los ARNmARNm maduros comienzan con la misma maduros comienzan con la misma secuencia de 30secuencia de 30--40 40 ntnt --> > miniexonminiexon (ME (ME -- SL)SL)
••Esa secuencia no se encuentra en las vecindades del gen Esa secuencia no se encuentra en las vecindades del gen que está siendo analizadoque está siendo analizado
••Existen 100Existen 100--200 genes para ME por núcleo en 200 genes para ME por núcleo en tandemtandem
••c/u está presente en un repetido de c/u está presente en un repetido de aproxaprox 1,3 1,3 kbkb
••Su transcripto presenta Su transcripto presenta CapCap 4 (m7G, metilaciones 2’OH 4 (m7G, metilaciones 2’OH ribosas 1ribosas 1--4 y metilaciones en las bases 1 y 4) y es 4 y metilaciones en las bases 1 y 4) y es monocistrónicomonocistrónico
Qué se sabe sobre los pre-ARNm trans-splicing y poliadenilación están acoplados
Generan ARNm maduro para ser exportado del núcleo
ARNm de las sintetasasde aminoacil-tRNA
Si todos los genes del una PGC se transcriben en un mismo transcripto
primario ¿por qué se tiene diferente
concentración de las proteínas codificadas por esos genes?
Incluso ¿diferente concentración de ARNm maduro?
Transcripción constitutiva de genes para proteínas
La principal regulación se da a nivelPOST-TRANSCRIPCIONAL
ElongaciónRegiones intergénicas (ME/poli(A))
Estabilidad ARNm (3’UTR)Traducción
Estabilidad de la proteína
Reg. Cod.Reg. Cod.MEME AAAAA AAAAA nn5’ UTR5’ UTR 3’ UTR3’ UTR
Regulación de la expresiónRegulación de la expresión
• Esta regulación es la clave para los cambios en la expresión génica
• Elementos en las regiones intergénicas (rol de las regiones UTR)
Destinos de los ARNm en
tripanosomátidos (modelo)
ORF
3’UTR
5’UTRCAP4
RBP
GP82: gp de superficie
presente solo en la forma infectiva
•Transcribe ARN pequeños (5S, tARNs, 7SL-ARN y todos snARN) usando snARN
•Básicamente presenta los mismos promotores que eucariotas superiores: estar tanto en la región 3’ como 5’
Promotor para ARNPromotor para ARN--polpol IIIIII
DSE PSE TATA DSE PSE TATA 5’5’
AA CCTipo ITipo I
AA BBTipo IITipo II
Punto de inicioPunto de inicio
ARNrARNr 5S5S
ARNt
U2-U6
TSS/Inr
T. brucei
• Transcribe: ARN ribosomal (nucleolo) y genes de Ags de superficie (VSG y PRO)
• ARNr maduro: 20% 5’PO4 y 80% 5’ OH
• Promotor parecido de los eucariotas superiores
Core promoter
Punto de inicioPunto de inicio
–170 –150 –130 –110 –60 –40 –20 –10 +10 +20Upstream control element
Promotor para ARNPromotor para ARN--polpol II
Dom III (distal) Dom II DomI
Core
Promotor para Promotor para ARN Pol IARN Pol I
Suficiente para transcribir VSG
Se estimula la actividad por la presencia de elementos en el 5’ (UCE)
Aparentemente están siempre activos (regulación de las Aparentemente están siempre activos (regulación de las unidades de VSG y de PRO?).unidades de VSG y de PRO?).
El gen que codifica para la subunidad 28S en eucariotas superiores, en los tripanosomátidos sepresenta en regiones modulares separadas por espaciadores de la transcripción, lo que lleva aun procesamiento “atípico” generando una subunidad mayor de ribosoma conteniendo unmayor número de moléculas de ARN (dos grandes y cuatro pequeñas)
VSGs
T. bruceiT. brucei::IInnmunofluorescencmunofluorescencia ia dede
ffoorrmmaass sanguíneassanguíneasususandoando Acs Acs contracontra
VSGVSG 221221
VSGVSG VO2VO2
Variant Surface GlycoproteinCada VSG es codificada por una copia básica interna
(a >50kb del telómero) o telomérica (a 5-15kb)
VSG(tel-inact)
VSG(interno)
VSG(tel-act)
Expresión algo programada (aparentemente involucra a la cantidad de repetidos de 70pb)
Existen aprox 1000 genes VSG
Sitio de expresión activo (ES)
• Cada cambio se acompaña de un pico de parasitemia
1. Southern blot: ADN de distintas poblaciones del parásito, Digestión con enzimas de restricción, Electroforesis en gel de agarosa, Transferencia a membrana de nylon, Hibridización.
2. Hirbridización con un ADNc de una población (pej. b)
a b c d ...etc
Copia Básica (BC)
Copia ligada a la expresión (ECL)
Más del 50% de los genes VSGs siguen este patrón
Genes VSG: copia ligada a la expresión (ECL)
VSG
Cambio de Expresión
VSG(tel-inact)
VSG(interno)
VSG(tel-act)
VSG(tel-inact)
VSG(interno)
VSG(tel-act)
VSG(tel-inact)
VSG(interno)
VSG(tel-act)
VSG(tel-inact)
VSG(interno)
VSG(copia-act)
VSG(tel-act)
VSG(tel-inact)
VSG(interno)
VSG(tel-act)
VSG(interno)
VSG(tel-inact)
La formación del ELC ocurre por conversión génica
El ADN en el kinetoplasto está distribuído en: maxi-(30-50kb) y mini-(0.8-1.6 kb) círculos
10-30 copias 30000-50000 copiasgenoma mitocondrial ARNguias
No se han encontrado secuencias promotoras consenso
Transcribe ARN poli-cistrónicos que luego se procesa (corte en ARN monocistrónicos seguido/acompañado de editado (+/-U), poli-A para ARNm y poli-U para ARNg)
NOTA: en el núcleo se transcriben:.el ARN kARNpol, que se sintetiza en el citosol (1 subunidad).los ARNt del kinetoplasto y se deben importar
ARN ARN polpol mitocondrial mitocondrial ((kkARNpolARNpol))
RET1 (RNA editingTUTase 1).
(9S y 12S + 150 protcodif ADN nuclear y 1 en kADN-RPS12)
RPS12?
Editado
• Modificación de información génica codificada en el ADN
• Se adicionan o se remueven bases del ARNm (en general se introducen o se sacan “U”)
• Ocurre en la mayor parte de los ARN mitocondrial.
• Se corrige el marco de lectura.
Simple: número pequeño de U en el extremo 5´ cox2 T.brucei
Extensa: 60% del ARNm maduro no codificado por el gen > 50% de los genes de T. brucei mitocondriales, ej. Cox3
• Todos los ARNg tienen su propio gen enel minicírculos mitocondriales (salvo el 3’de COXII)
•Son pequeños (40-70nts) y no sufrenedición.
•El extremo 5’ de cada ARNg escomplementario a la secuencia cercana ala región editada hacia el 3’ del mRNA.
•El extremo 3’ de los gRNAs tienen unacola de U (5-15nts), agregada por unaterminal uridil transferasa (TUTasa).
•La región intermedia contiene lasecuencia complementaria a la porcióneditada del mRNA. (AU, GC y GU)
ARNg
Editado
5’
5’ 3’3’
anclas
Seq guía de edición
pre-ARNm
ARNg
•Editosoma: corta el transcripto y agrega Us (TUTasa), mantiene losextremos abiertos, elimina las Us no apareadas (exoribonucleasa U-específica) y liga los extremos del transcripto mRNA editado.
et al. 1990
TbRGG2
GRBC1/2: Estabiliza el gARN
REMC: interacciona con el complejo mediador de la edición de ARN
PAMC: interacciona con el complejo mediador de la poliadenilación de ARN
Armar marcos de lectura:
- crear codón de inicio y de terminación,
- establecer marcos de lecturas funcionales
La edición es esencial para la diferenciación en T. brucei
Las cantidades relativas de ARNm editado y sin editar varía en los diferentes estadios (¿mec. de regulación?)
Algunas consideraciones
Editado
RET1 (RNA editingTUTase 1).
La edición alternativa del RNAm de la citocromo C oxidasa mitocondrial III (COXIII)en Trypanosoma brucei produce una nueva proteína de unión a ADN: AEP-1.
Se propone que AEP-1 interacciona físicamente con el kADN y cuerpos basalesflagelares.
La expresión en tripanosmátidos…
• el entenderla ayudaría a comprender procesos (diferenciación,virulencia, variación antigénica) y a encontrar blancos clavespara controlar la infección.
•es un mecanismo único (transcrip policistrónica, trans-splicing,editado de ARNm, la ARNpol I sintetiza ARNm).
•La iniciación de la transcripción de genes de proteínas parece sercomparable a los promotores sin caja TATA de humanos y otrosmamíferos (cr 1 de L major).
•La transcripción no parece ser atípica ya que se han identificadodiferentes factores de transcripción generales.
¿PREGUNTAS?