UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI PISA

FACOLTA' DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALIDIPARTIMENTO DI NEUROSCIENZE

CORSO DI LAUREA IN SCIENZE BIOLOGICHE

L’ATTIVITÀ DI AGONISTA PARZIALE DEGLI ANTIPSICOTICI ARIPIPRAZOLO,  BIFEPRUNOX, N­DESMETILCLOZAPINA,  S33592 E PRECLAMOLO PER IL  

RECETTORE DOPAMINERGICO D2L È MODIFICATA DALLA CO­TRANSFEZIONE CON IL RECETTORE D3:                                                                              RUOLO 

POTENZIALE DELLA FORMAZIONE DI ETERODIMERI

RELATOREProf. Roberto Maggio

CANDIDATAMaria Laura Grieco

ANNO ACCADEMICO 2005/2006

1

ABSTRACT

By   analogy   to   preclamol,   the   novel   antipsychotics,   aripiprazole   and   bifeprunox,   the   major 

metabolite of clozapine, N­desmethylclozapine, and the benzopyrollidine derivative, S33592, all 

behave as partial agonists at D2 and, though less well­characterised, D3 receptors. However their 

actions at D3/D2 heterodimers have not, to date, been examined, an issue addressed in COS­7 

cells expressing recombinant, dopamine D2L and/or D3 receptors. Employing [3H]nemonapride, all 

ligands showed comparable affinity for D3 and D2L sites, except aripiprazole which revealed 10­

fold preference for the latter. In D2L  receptor­expressing cells co­transfected with a D3  receptor­

insensitive,   chimeric   adenylyl   cyclase­V/VI,   all   drugs   reduced   forskolin­stimulated   cAMP 

production by 15­25% as compared to quinpirole (48%). Further, quinpirole­induced inhibition 

was attenuated by aripiprazole and S33592 to a level corresponding to their effects alone. In 

cells co­transfected with D3 and D2L  receptors, quinpirole displayed similar potency and efficacy 

as in D2L­transfected cells, whereas aripiprazole, S33592, bifeprunox, N­desmethylclozapine and 

preclamol   were   inactive:   furthermore,  aripiprazole   and   S33592   abolished   the   actions   of 

quinpirole. Corroborative data were acquired with D2  trunk/D3  tail and D3  trunk/D2  tail chimeras 

where the agonist actions of quinpirole were similarly blocked by aripiprazole and S33592 which 

were, like bifeprunox, N­desmethylclozapine and preclamol, inactive alone. By contrast, when a 

12 amino acid  sequence  in   the   third   intracellular   loop of  D3  receptors  was  replaced by  the 

corresponding   sequence   of   D2L  receptors,   aripiprazole,   S33592,   bifeprunox,  N­

desmethylclozapine  and   preclamol   behaved   as   partial   agonists   (ca   20%)   as   compared   to 

quinpirole (42%). Moreover, at D2L  receptor­expressing cells co­transfected with modified D3i3(D2) 

receptors, all drugs partially  inhibited  AC­V/VI activity compared to quinpirole. To summarize, 

aripiprazole,   S33592,   bifeprunox,   N­desmethylclozapine   and   preclamol   behave   as   partial 

2

agonists at D2L receptors coupled to AC: their antagonist actions upon co­expression of D3 with 

D2L  receptors   probably   reflects   physical   association   (heterodimer   formation)   and   weakened 

coupling  efficacy.  These   findings  have  interesting  implications   for   the   functional  and  clinical 

profiles of these antipsychotic agents.

3

1. INTRODUZIONE

1.1 Dopamina 

La dopamina è  il neurotrasmettitore che nel sistema nervoso centrale (SNC) dei mammiferi ha un ruolo importante in 

numerose funzioni tra cui l’attività motoria, l’apprendimento, l’emozioni, la gratificazione, la motivazione e la secrezione di 

alcuni ormoni come la prolattina. Inoltre, possiamo ipotizzare anche una funzione endogena della dopamina nel sistema 

nervoso periferico (SNP) per la presenza di recettori dopaminergici a livello della muscolatura liscia vascolare a livello 

renale, a livello del sistema gastroenterico ed infine a livello delle fibre gangliari del sistema simpatico.

L’importanza del sistema dopaminergico centrale nel controllo dell’attività motoria è chiaramente dimostrata nella malattia 

di Parkinson dove la degenerazione di neuroni dopaminergici presenti nell’area A9 del mesencefalo (nigra pars compacta) 

è la causa principale della malattia.

Alterazioni a carico del sistema dopaminergico sono anche ipotizzate in disturbi psichiatrici  di tipo psicotico, come la 

schizofrenia, dove l’uso di antagonisti dei recettori D2 dopaminergici risulta essere uno dei trattamenti farmacologici più 

efficaci.

L’uso invece di antagonisti dopaminergici poco liposolubili, che non passano la barriera ematoencefalica, nel trattamento 

di disturbi di tipo gastro­enterico o come farmaci antiemetici dimostra l’importanza del sistema dopaminergico anche a 

livello periferico.

Negli   ultimi   anni   è   stato   chiaramente   indicato   come   il   sistema   dopaminergico   è   anche   coinvolto   nei   meccanismi 

neurofisiologici che sono alla base delle tossicodipendenze.

I precursori della sintesi di dopamina nel neurone dopaminergico sono gli aminoacidi tirosina e fenilalanina che sono 

assunti con le proteine presenti nella dieta. Questi due aminoacidi attraversano la barriera emato­encefalica grazie ad un 

trasportatore   di   membrana   per   gli   L­aminoacidi   aromatici   e   successivamente   sono   captati   all’interno   del   neurone 

dopaminergico attraverso lo stesso trasportatore. All’interno del neurone, l’aminoacido fenilalanina è trasformato in tirosina 

e successivamente quest’ultima è  convertita  dall’enzima  tirosina  idrossilasi   in  L­3,4­  diidrossifenilalanina (L­Dopa).  La 

tirosina idrossilasi è un marker istologico specifico dei neuroni catecolaminergici e la sua attività è finemente regolata, 

diventando così l’enzima limitante la sintesi delle catecolamine.

4

La dopamina sintetizzata ex­novo, è immagazzinata nelle vescicole sinaptiche mediante un trasportatore vescicolare e da 

qui rilasciata nel vallo sinaptico per esocitosi Ca++­dipendente in seguito all’arrivo di stimoli eccitatori che depolarizzano il 

neurone  (Fig. 1).

Fig . 1. Trasmissione dopaminergica

5

Infine,   dopo   aver   svolto   la   sua   azione   legandosi   ai   recettori   specifici,   essa   è   captata   dal   neurone   dopaminergico 

presinaptico dove può essere nuovamente immagazzinata nelle vescicole o può essere catabolizzata per opera di due 

isoforme enzimatiche delle monoaminoossidasi (MAO)­A e  MAO­B. Una via metabolica alternativa di degradazione della 

dopamina è quella operata dall’enzima catecol­O­metiltransferasi (COMT) all’esterno del neurone presinaptico (Fig. 2). 

Queste due vie  metaboliche operano congiuntamente e convergono portando alla   formazione dell’acido omovanillico 

(HVA), il metabolita principale del catabolismo della dopamina (Vedi Testo Farmacologia generale e molecolare, Clementi;  

UTET, 1999).

La   dopamina   inoltre   può   subire   una   trasformazione   non   enzimatica   per   ossidazione   e   dar   luogo   a   composti 

potenzialmente neurotossici. Gli eventi cellulari e molecolari coinvolti nella tossicità della dopamina all’interno dei neuroni 

dopaminergici potrebbero dare origine a fenomeni degenerativi che determinano morte cellulare (Corsini et al., 2002).

Gli effetti di questa catecolamina a livello del sistema nervoso centrale sono mediati dalla sua interazione con i recettori 

dopaminergici. Questi fanno parte della grande famiglia di proteine di membrana rappresentata dai recettori accoppiati a 

proteine G, G­protein­coupled receptors (GPCR)s.

6

Fig . 2.   Sintesi e metabolismo della dopamina.

1.2   Recettori accoppiati a proteine G : Struttura

   

I  recettori  accoppiati a proteine G (GPCRs) rappresentano il  sistema di  traduzione del  segnale più  diffuso nel regno 

animale.

La   maggior   parte   delle   molecole   che   fungono   da   messaggeri   tra   cellula   e   cellula   (ormoni,   neurotrasmettitori, 

neuromodulatori) inducono risposte combinandosi a recettori accoppiati a proteine G.

Le diverse famiglie di GPCRs  hanno tra loro una struttura molto simile, ciò risulta evidente dall’esame delle sequenze 

primarie.

I  GPCRs   sono costituiti  da una singola catena polipeptidica che attraversa sette volte  la membrana con  l’estremità 

ammino­terminale   extracellulare e quella carbossi­terminale intracellulare. Le sette regioni transmembrana ad  ­elica,α  

unite tra loro da tre loops intracellulari e tre extracellulari, si dispongono a formare un core idrofobico.

Tra   le  diverse   famiglie   le  caratteristiche  strutturali   che  variano  sono   la   composizione  e   la   lunghezza  del   terzo   loop 

citosolico e dell’estremità carbossi­terminale.

Il legame con ligandi specifici avviene tramite interazioni multiple tra gruppi funzionali del ligando e aminoacidi altamente 

conservati presenti nei domini extracellulari e/o  nei domini transmembrana del recettore.

7

Fig.3. struttura di un recettore accoppiato a proteina G

Esistono   tre   classi   di   recettori   accoppiati   a  proteine   G che   tengono conto  delle  diversità   dovute   sia  alla   sequenza 

aminoacidica sia alla modalità d’interazione con il ligando (Bockaert et al., 1999).

8

La   famiglia   1   raggruppa   la   maggior   parte   dei   recettori,   tra   cui   la   rodopsina,   ed   è   ulteriormente   suddivisa   in   tre 

sottofamiglie. La famiglia 1a comprende i recettori per i ligandi piccoli, come i muscarinici, i dopaminergici o gli adrenergici 

ed il sito di legame è localizzato all’interno della tasca recettoriale formata dai sette segmenti transmembranali. La famiglia 

1b   è   rappresentata   da   recettori   per   i   peptidi,   il   cui   sito   di   legame   è   presente   nella   parte   N­terminale,   nelle   anse 

extracellulari  e nella parte superiore dei  segmenti   transmembrana; nella classe 1c troviamo i  recettori per  gli  ormoni 

lipoproteici  caratterizzati  da un’estremità  N­terminale   lunga che  insieme alla parte  esterna del  primo e secondo  loop 

extracellulare costituiscono il sito di legame.

All’interno della famiglia 2, i recettori accoppiati a proteine G hanno una morfologia simile a quella del gruppo 1c ma non 

ne condividono la stessa similitudine nella sequenza aminoacidica. I ligandi fisiologici per i recettori di questo gruppo sono 

ormoni ad alto peso molecolare come il glucagone o la secretina. Infine, la famiglia 3 include i recettori metabotropici al 

glutammato, i recettori sensibili al Ca++, recettori GABAb  e i  recettori per alcuni ferormoni. In questa famiglia,  la lunga 

estremità N­terminale è determinante per l’interazione con i ligandi endogeni.

Un contributo importante per la comprensione della struttura tridimensionale dei recettori accoppiati alle proteine G è stato 

dato grazie alla determinazione della struttura cristallina del recettore per la rodopsina (Palczewski et al., 2000; Fig. 4).

9

 

10

Fig . 4. Struttura tridimensionale del recettore per la rodopsina vista lateralmente (A) e dal basso (B e C).

1.3  Recettori accoppiati a proteine G : traduzione del segnale

L’interazione ligando­recettore induce un cambiamento conformazionale della proteina recettoriale, in particolare a livello 

del secondo loop citoplasmatico (Burstein et al., 1998; Kozell et al., 1994), delle estremità N­ e C­terminale del terzo loop 

citoplasmatico e della coda C­terminale citosolica.

La  traduzione del  segnale coinvolge, oltre  al   recettore,  due elementi:  una proteina G eterotrimerica (costituita da  tre 

subunità:  ,   e  ) che lega i nucleotidi guanosinici GDP e GTP, e un bersaglio proteico che funge da effettore.α β γ

Il legame con il neurotrasmettitore promuove interazioni allosteriche tra il recettore e la proteina G inducendo lo scambio 

del nucleotide guanosinico GDP con il GTP sulla subunità   . Questo destabilizza il complesso trimerico   conα αβγ  

conseguente dissociazione della subunità   , legata al GTP, dal dimero  . La proteina G “attivata” è così in grado diα βγ  

agire sull’effettore (Fig. 5).  

La fine del segnale avviene tramite idrolisi del GTP in GDP per merito della stessa subunità   .α

Esistono vari tipi di proteine G (almeno una ventina sono note) suddivise in base al tipo di risposta che inducono, come ad 

esempio:  

Gs, attivazione dell’enzima adenilato ciclasi

Gi, inibizione dell’adenilato ciclasi e apertura di canali al K+ 

Go, inibizione di canali al Ca++ voltaggio­dipendenti

Gq, attivazione della fosfolipasi Cβ

Dopo che la proteina G ha interagito con uno dei suddetti effettori, vengono prodotti secondi messaggeri (cAMP, IP3/DAG, 

acido arachidonico) che sono responsabili della risposta cellulare conseguente allo stimolo recettoriale.

La parte C­terminale della subunità   della proteina G sembra essere determinante nel conferire selettività all’interazioneα  

col recettore (Conklin et al., 1993; Conklin et al., 1996), sebbene un ruolo ausiliare può essere svolto anche dal complesso 

 (βγ Florio e Sternweiss, 1985; Butkerait et al., 1995).

11

Nonostante l’interazione recettore­proteina G sia piuttosto selettiva, alcuni recettori sono in grado di attivare più di un tipo 

di proteina G (Ganze t al., 1990; Eason et al., 1992; Eason e Ligget, 1995).

Questa promiscuità nell’accoppiamento è dovuta soprattutto al corredo di proteine G che una determinata linea cellulare 

esprime, poiché il legame tra un recettore con una bassa selettività per una determinata proteina G può essere forzato se 

in  quella   cellula  è  espresso  prevalentemente  un   tipo  di   proteina  G.  Per  esempio   i   recettori  dopaminergici   possono 

mostrare alcune proprietà tradizionali in certi tipi cellulari che non sono confermate in altre linee, a dimostrazione della 

complessità e della varietà di interazione coinvolte tra recettore e proteine G.

12

Fig . 5.  Eventi intracellulari attivati dalle proteine G.

La specificità del recettore verso le varie proteine G è determinata soprattutto dalle parti N­ e C­terminale del terzo loop 

citoplasmatico (Wess et al., 1997). Questi dati sono stati confermati da esperimenti condotti su chimere recettoriali D1/D2 

(Kozell et al., 1994) e D2/D3 (Lachowicz et al., 1997; Filteau et al., 1999). Inoltre, un ruolo importante per l’accoppiamento 

tra recettore e proteina G è stato dimostrato anche per il secondo loop intracellulare (Kozell et al., 1994).

Recenti studi hanno dimostrato come, attraverso la loro capacità di regolare effettori specifici, i recettori accoppiati alle 

proteine G possono indurre eventi intracellulari simili a quelli attivati dai recettori per i fattori di crescita ad attività tirosina 

chinasica (Vedi Testo Clementi; UTET, 1999). Una delle più importanti conseguenze di questa stimolazione è l’attivazione 

di   alcune   chinasi   specifiche   chiamata   MAP   chinasi   (Mitogen­activated   protein   kinases),   che   svolgono   un   ruolo 

fondamentale nel controllo della proliferazione e del differenziamento cellulare. I recettori accoppiati alle proteine G sono 

in grado di attivare le MAP chinasi con meccanismi molteplici tuttora oggetto di studio. Una prima possibilità, utilizzata 

soprattutto  dai   recettori   accoppiati   alle  proteine  Gi,   sembra  coinvolgere   il   complesso    ed  agisce  sulle  proteineβγ  

adattatrici Shc. Un’altra possibilità è quella di indurre una fosforilazione nei residui tirosinici dei recettori per i fattori di 

crescita con un meccanismo ancora da caratterizzare definito “transattivazione”.

I recettori accoppiati a proteine Gi possono stimolare le MAP chinasi grazie anche all’azione sulla proteina chinasi C, che è 

in grado di fosforilare la proteina Raf, attivando la cascata di fosforilazioni intracellulari senza interagire con la proteina di 

membrana Ras (Fig.6).

13

Fig . 6.  Attivazione di MAP chinasi indotta dai GPCRs.

14

1.4  Recettori dopaminergici

La prima evidenza sperimentale, che ha dimostrato l’esistenza dei recettori per la dopamina nel sistema nervoso centrale 

(SNC), risale a studi biochimici compiuti nel 1972 che rilevarono la capacità del neurotrasmettitore di stimolare l’enzima 

adenilato ciclasi (Kebabian et al., 1979)

In seguito, sulla base di risultati farmacologici, i recettori dopaminergici sono stati classificati in due classi dette D 1 e D2 

(Spano et al., 1978).

L’avvento delle nuove tecnologie di DNA ricombinante ha consentito di riconoscere l’esistenza di diversi sottotipi recettoriali 

dopaminergici che,  in base sia alle omologie di sequenza che al profilo funzionale e   farmacologico, possono ancora 

essere suddivisi nelle due classiche famiglie D1 e D2.

Appartengono alla famiglia D1  (D1­like) i recettori D1e D5 e alla famiglia D2 (D2­like) i recettori D2, D3 e D4.

I recettori D1­like sono sensibili alla dopamina, apomorfina e ad altri agonisti come il fenoldopam e bloccati da antagonisti 

specifici come lo SCH23390. I recettori dopaminergici D2 e D3 sono stimolati da vecchi e nuovi farmaci antiparkinsoniani 

come bromocriptina, pergolite, apomorfina, pramipexolo e cabergolina, anche se è possibile rilevare una certa preferenza 

d’affinità verso i recettori D3. Una buona selettività nei confronti del recettore D3 è mostrata anche da alcuni composti di 

sintesi   come   il   quinpirolo   e   il   7­OH­DPAT.   Per   quanto   riguarda   gli   antagonisti   recettoriali,   i   neurolettici   sulpiride   e 

aloperidolo presentano una preferenza verso  il  sottotipo recettoriale D2, mentre  i recettori D4  sono molto sensibili  alla 

clozapina (Fig. 7) .

La difficoltà nel differenziare farmacologicamente i vari sottotipi recettoriali D2­like è dovuta soprattutto all’elevata omologia 

di sequenza aminoacidica.

I recettori D1 e D5  mostrano una elevata omologia nelle sequenze di aminoacidi nei domini transmembrana (80%), regioni 

deputate al legame dei farmaci.

Per quanto riguarda le regioni transmembrana dei D2­like, i recettori D2 e D3 mostrano una omologia di sequenza per il 

72%, mentre i D2 e D4 per il 53%. L’estremità amino­terminale consiste di un numero simile di aminoacidi in tutti i sottotipi 

recettoriali e presenta una quantità variabile di siti di glicosilazione. La coda carbossi­terminale è circa sette volte più lunga 

nei   recettori   D1­like   rispetto   ai   D2­like   ed   è   ricca   di   residui   di   serina   e   treonina.   La   difficoltà   nel   differenziare 

farmacologicamente i vari sottotipi recettoriali D2­like è dovuta soprattutto all’elevata omologia di sequenza aminoacidica.

15

Al contrario, i recettori D2­like hanno il terzo loop intracellulare più lungo, caratteristico dei recettori che interagiscono con 

la proteina Gi, mentre quello dei D1­like è più corto come in molti recettori che legano la proteina Gs. 

Fig . 7. Classificazione farmacologica dei recettori dopaminergici nel SNC

FAMIGLIA GENICA SOTTOTIPOSISTEMA

DI TRASDUZIONEAGONISTI ANTAGONISTI

D1D1 ↑adenilato ciclasi

apomorfina

fenoldopam

pergolide

SCH­39930

bromocriptina

lisurideD5 come D1 come D1 come D1

D2

D2

(long e short)

↓adenilato ciclasi

↑canali K+

↓canali Ca++

apomorfina

pergolide

pramipexolo

aloperidolo

sulpiride

raclopride

D3 come D2

come D2

quinpirolo

7­OH DPAT

come D2

D4 come D2 come D2

come D2

clozapina

16

1.4.1  I Recettori D1like

Sottotipo D1

Il recettore D1  è una glicoproteina con due siti di glicosilazione, uno nella parte N­terminale e l’altro nel secondo loop 

extracellulare. Presenta   inoltre un sito di fosforilazione cAMP­dipendente nel terzo loop citoplasmatico e un residuo di 

cisteina   nella   estremità   carbossi­terminale   (altamente   conservato   nei   GPCRs)   che   viene   complessato   con   l’acido 

palmitico.  Questo legame con l’acido palmitico, che àncora la coda C­terminale del recettore alla membrana, forma il 

quarto   loop   intracellulare.  Ulteriori   siti  di   fosforilazione possono  essere   i   residui  di   serina  e   treonina  che  si   trovano 

all’estremità C­terminale.

Questo sottotipo recettoriale è quello maggiormente espresso tra  i diversi recettori dopaminergici a livello del sistema 

nervoso centrale sia di ratto che di uomo (Missale et al., 1998). La presenza di mRNA del recettore D1 è stata determinata 

nel nucleo caudato e nel putamen (nuclei del sistema extrapiramidale), nel nucleo accumbens e nel tubercolo olfattorio 

(che fanno parte del sistema limbico) ed inoltre è stato identificato in minor quantità nella corteccia cerebrale, nel talamo e 

nell’ipotalamo.

Da un punto di vista funzionale il recettore D1 è accoppiato alla proteina Gs, per cui attiva l’adenilato ciclasi. Il recettore D1 

sembra essere  in  grado di  modulare  i   livelli  di  calcio  intracellulare attraverso differenti  meccanismi.   In alcuni  sistemi 

cellulari il meccanismo di azione coinvolge la produzione di IP3 grazie alla attivazione della fosfolipasi C, mentre in altri  

sistemi   l’effetto   sulla   concentrazione  di  Ca++  intracellulare  sembra  passare  da un  meccanismo diverso che consiste 

nell’attivazione della PKA attraverso l’aumento di cAMP.

Aumenti dell’attività di alcune MAP chinasi per azione del recettore D1  sono stati riportati su p38 e JNK in alcune linee 

cellulari ma non su ERK1­2 (Zhen et al., 1998), anche se l’effetto del cAMP nelle cellule COS sull’attivazione di ERK1­2 

lascia  pensare che  il   recettore D1  potrebbe attivare anche ERK1­2  (Faure et  al.,  1994).  Un  effetto  del   recettore D1 

sull’attivazione di ERK1­2 è stato recentemente riportata in vivo su un modello di parkinsonismo animale, dove la carenza 

di dopamina nello striato induce una particolare sensibilità ad agonisti D1 selettivi (Gerfen, 2002).

Sottotipo D5

17

Il  recettore D5 è stato isolato e clonato da Sunahara et al. (1991). È omologo per il 50% al recettore D1 e nelle sequenze 

transmembrana l’omologia aumenta fino all’80%. Vari agonisti e antagonisti hanno simile affinità per i due recettori ad 

eccezione della dopamina che è più affine di circa dieci volte verso il recettore D5 rispetto a quello D1.

Questo recettore è localizzato per lo più nell’ippocampo e nell’ipotalamo, ma in generale i suoi livelli di espressione sono 

molto inferiori rispetto a quelli del sottotipo D1.

Le caratteristiche funzionali di questo recettore sono simili a quelle del recettore D5, soprattutto per quanto riguarda la 

formazione di cAMP.

18

1.4.2  I Recettori  D2like

Sottotipo D2

Il     recettore     D2  presenta   i   sette   domini   transmembrana   tipici   dei   GPCRs,   all’estremità   N­terminale   ha   tre   siti   di 

glicosilazione, all’estremità C­terminale ha una cisteina per il legame con l’acido palmitico e nel terzo loop intracellulare ha 

un  sito  di   fosforilazione  per  una  chinasi  cAMP­dipendente.   Inoltre   sul   terzo   loop  citoplasmatico,   ci   sono  altri   siti   di 

fosforilazione importanti nella regolazione del turnover recettoriale (Missale et al., 1998).

Esso è presente in due diverse varianti chiamate D2long e D2short che sono originate da uno splicing alternativo di un esone di 

87 bp localizzato tra gli introni 4 e 5. Le proteine D2long e D2short  si differenziano rispettivamente per la presenza o meno di 

una sequenza di 29 aminoacidi nel terzo loop intracellulare. Per queste due isoforme non è ancora stata identificata una 

differenza farmacologica, ma solo una lieve diversità funzionale. Esse mostrano un simile pattern di distribuzione, ma la 

forma D2short è meno abbondantemente rappresentata nei tessuti.

Il   recettore  D2  è  maggiormente   localizzato  nei   nuclei   caudato   e   putamen  (quindi   a   livello  dello   striato),   nel   nucleo 

accumbens e nel tubercolo olfattorio. Nel 50% circa dei neuroni di media grandezza del caudato, il D2 è coespresso con il 

D1. Inoltre, è stato dimostrato che la co­localizzazione D1/D2 porta ad un’azione sinergica dei due recettori (Pomelli et al.,  

1991).

Il  D2  è   presente   anche   nelle   cellule   lattotrope   ipofisarie,   dove  media   l’inibizione   dopaminergica   della   secrezione   di 

prolattina.

Da un punto di vista funzionale il recettore D2 è accoppiato alla proteina Gi e quindi inibisce la formazione di AMP ciclico.

In diversi tipi cellulari, come i neuroni mesencefalici o in cellule provenienti dall’ipofisi anteriore, il recettore dopaminergico 

D2  fa aumentare l’uscita dello ione potassio con conseguente iperpolarizzazione della cellula, attraverso l’attivazione di 

proteine G sensibili alla tossina della pertosse. Il significato funzionale della iperpolarizzazione mediata dai recettori D2 in 

questi  neuroni  sembra  essere   l’inibizione del  release  di  dopamina.  Questi   recettori   in  questi   neuroni   funzionano  da 

autorecettore dopaminergici.

Sono stati riportati anche effetti del recettore sulle correnti al Ca++, soprattutto di tipo inibitorio, e sulla cascata dell’acido 

arachidonico.   Il   recettore   D2  è   in   grado   di   potenziare   il   rilascio   di   acido   arachidonico   indotto   dall’aumento   di   Ca++ 

intracellulare (Missale et al., 1998).

19

Numerose evidenze sperimentali hanno dimostrato come i recettori D2­like, in particolare il recettore D2, siano coinvolti 

anche  nella mitogenesi e nel differenziamento cellulare. Inoltre, il recettore D2 è in grado di stimolare l’attività di ERK1­2 in 

differenti   linee   cellulari   come   le   CHO,   COS   e   C6.   Se   il   recettore   D2  viene   espresso   in   cellule   mesencefaliche 

“immortalizzate”, l’effetto di dopamino­agonisti è quello di influenzare la vitalità neuronale intesa come numero di neuriti 

(Swarzenski et al.,1993), probabilmente grazie all’attivazione delle MAP chinasi. Tuttavia, in uno studio dove sono state 

utilizzate colture primarie di neuroni mesencefalici, gli agonisti dopaminergici non hanno avuto effetto sulla sopravvivenza 

o sul differenziamento di queste cellule (Van Muiswinkel et al., 1993). 

Nel modello di emiparkinsonismo di ratto trattato con 6­OH­DA, l’effetto della rotazione controlaterale indotta dall’agonista 

D2  selettivo   è   bloccata   dall’inibizione   di   MAP   chinasi   dimostrando   un   ruolo   importante   di   tale   proteina   nell’effetto 

comportamentale dovuto alla somministrazione di farmaci antiparkinsoniani (Cai et al., 2000).

Sottotipo D3

Il recettore D3  è stato inizialmente clonato da una libreria di cDNA di ratto usando sonde derivate dalla sequenza del 

recettore dopaminergico D2  (Sokoloff et al.,1990). È  infatti  un recettore molto simile al D2  sia per quando riguarda   la 

sequenza aminoacidica che per l’organizzazione strutturale nella membrana..

Anche per   il   recettore D3  sono state   identificate  varianti  di  splicing.  Nel   topo esistono due varianti  con uno splicing 

alternativo di 21 amminoacidi a livello del terzo loop citoplasmatico (Fishburn et al.,  1993) mentre nel ratto e nell’uomo 

esistono altre varianti, forse non funzionali, di cui parleremo in seguito (Seeman e Van Tol, 1994).

Il recettore D3 di ratto è presente soprattutto nello striato ventrale (tubercolo olfattorio, nucleo accumbens, isole di Calleja) 

e nell’ipotalamo a dimostrazione di una sua  importanza nelle funzioni  limbiche dell’animale. Esso si  trova in quantità 

minore  anche   in  altre  aree cerebrali   come  la  substantia  nigra,   lo  striato  dorsale    e   la  corteccia  prefrontale.  Queste 

indicazioni sono state date misurando la quantità di mRNA con la tecnica del Northern­ Blot (Sokoloff et al.,  1990)  e 

utilizzando un composto selettivo marcato come il [3H]­7­OH­DPAT a basse dosi su un tessuto cerebrale (Levesque et al.,  

1992). Se la misurazione di un mRNA del recettore D3 è piuttosto specifica, le indicazioni di binding con il [3H]­7­OH­DPAT 

lasciano adito a qualche dubbio poiché potrebbero essere  influenzate dall’interazione del  ligando radiomarcato con  il 

recettore D2 (Landwehrmeyer et al., 1992). 

Nel ratto e nel topo la quantità del recettore D3 rispetto al D2 misurato con la tecnica del binding è notevolmente inferiore. 

Per  esempio  se  consideriamo  lo   striato  dorsale   la  differenza  è  di   circa  cento  volte,  mentre  nello  striato  ventrale   la 

differenza si riduce a venti volte. Queste misurazioni non escludono comunque la possibilità che in alcuni sottogruppi 

neuronali le differenze di espressione tra D3 e D2  siano minori, come è stato indicato per esempio nello shell del nucleo 

accumbens dell’ animale.

20

Da notare che l’espressione del recettore D3 aumenta in modo rilevante nello striato dorsale denervato per trattamento con 

L­Dopa (Borden et al., 1997 e 2000). Tale aumento evidenziato in un modello di parkinsonismo sperimentale di ratti trattati 

con 6­OH­DA, è stato invocato come possibile causa del fenomeno della sensibilizzazione alla L­Dopa, comportamento 

paragonabile alle discinesie nei primati.

Se passiamo dalla specie dei roditori a quella dei primati, come l’uomo per esempio, assistiamo ad un drastico aumento 

della quantità di recettore D3, tanto che è stato stimato che nell’uomo la sua espressione possa essere inferiore rispetto al 

D2  di solamente 3­5 volte circa (Suzuki et al.,  1998;  Joyce et al., 1999). Inoltre   nell’uomo misurando   la   quantità   di 

mRNA, è  stato  osservato  come  la distribuzione del recettore D3 sia diffusa anche in regioni corticali, nel nucleo caudato 

e putamen, nel talamo, nell’ippocampo e nella substantia nigra pars compacta (Fig. 8).

21

22

Fig . 8. Espressione di mRNA del recettore D3  nell’uomo

Da un punto di vista funzionale il recettore D3  condivide in parte le caratteristiche del recettore D2  e pertanto inibisce la 

formazione di AMP ciclico attraverso  l’attivazione della proteina G i.  Tuttavia  in molti  sistemi cellulari,   il   recettore D3  è 

incapace di inibire l’adenilato ciclasi (Tang et al., 1994; Freedman et al., 1994) e quindi mostra, in generale, d’accoppiarsi 

più debolmente alla proteina Gi rispetto al recettore D2 (Vanhauwe et al.,1999). Un fattore determinante per la funzionalità 

del recettore D3 è probabilmente il tipo di adenilato ciclasi con la quale interagisce. Nelle cellule COS, per esempio, la 

presenza dell’adenilato ciclasi V permette al recettore D3  di funzionare correttamente, mentre esso risulta debolmente 

accoppiato all’adenilato ciclasi di tipo II (Caron et al., 1997).

Questo recettore dopaminergico sembra anche modulare le correnti uscenti di ione potassio, come dimostrato in colture 

cellulari mesencefaliche (Tang et al., 1994). Tale effetto iperpolarizzante è probabilmente responsabile dell’effetto inibitorio 

del recettore sul release di dopamina nelle cellule mesencefaliche.

Il recettore D3, come gli altri recettori D2­like, è coinvolto probabilmente nella mitogenesi e nel differenziamento, come 

dimostrato   in  alcune   linee  cellulari  osservando   l’incorporazione  di   [3H]­timidina   (Griffon  et   al.,  1997).   Il  meccanismo 

attraverso cui il recettore D3  induce l’aumento dell’attività di sintesi del DNA potrebbe essere quello della fosforilazione 

delle MAP chinasi, attraverso la stimolazione di una isoforma di protein chinasi C (Cussan et al., 1999).

 

Sottotipo D4

L’ultimo recettore ad essere stato clonato è il recettore D4 (Gelernter al., 1991). Questo ha una struttura molto simile agli 

altri due recettori D2­like. È localizzato principalmente nella corteccia frontale, nel mesencefalo e nell’amigdala, ma si trova 

in tracce anche nello striato e nel tubercolo olfattorio. I suoi livelli di espressione nel sistema nervoso centrale comunque, 

così come per il sottotipo D3, sono in misura minore rispetto al D2.

Una caratteristica di tale recettore nell’uomo è  la presenza di un polimorfismo genetico a livello del terzo loop citosolico 

che consiste  nella  ripetizione di  16 aminoacidi   (Van Tol  et al.,1992). Tra  le  varie  isoforme genetiche non sono state 

riscontrate differenze funzionali. Le caratteristiche funzionali sono paragonabili al recettore D2.

23

1.5  Dimerizzazione dei recettori accoppiati a proteine G

Negli ultimi anni un numero considerevole di lavori ha dimostrato l’esistenza di recettori accoppiati alle proteine G in forma 

omodimerica ed eterodimerica (Agnati et al., 2005; Bouvier et al., 2001).

Numerose evidenze sperimentali  di   tipo biofisico e biochimico hanno confermato  la presenza di  numerosi  complessi 

recettoriali   in  cellule   “viventi”  supportando   l’idea che  la  dimerizzazione  possa essere un processo  importante per   la 

biogenesi e la funzione dei recettori accoppiati alle proteine G.

Se da una parte  l’omodimerizzazione apre nuove questioni  sui  meccanismi molecolari  coinvolti  nella  trasduzione del 

segnale evocato dal neurotrasmettitore, la presenza di eterodimeri potrebbe portare alla formazione di nuove strutture 

recettoriali   con   profili   funzionale   e   farmacologici   nuovi,   contribuendo   in   tal   modo   all’interazione   tra   diversi   sistemi 

neurotrasmettitoriali.

Tenendo conto che i recettori accoppiati a proteine G sono il maggior “target” nel campo farmaceutico, l’esistenza di dimeri 

potrebbe avere delle implicazioni per lo sviluppo di nuovi farmaci.

D’altronde  il   concetto  di  dimerizzazione come fenomeno coinvolto  nell’attivazione di   recettori   transmembrana è  stato 

dimostrato per altre proteine recettoriali e costituisce spesso una tappa decisiva per un’appropriata risposta biologica. Un 

esempio importante è rappresentato dai recettori tirosin­chinasi per i fattori di crescita (EGF­R, PDGF­R e FGF­R) che 

trovano nella dimerizzazione il proprio meccanismo di attivazione.

Per   quanto   riguarda   i   recettori   accoppiati   a   proteine   G,   essi   sembrano   essere   particolarmente   versatili   e   dinamici 

all’interno della propria struttura proteica e ciò potrebbe consentire una più facile interazione recettore­recettore.

Diversi esperimenti hanno dimostrato che i GPCRs sono complessi proteici costituiti da più subunità  indipendenti che 

interagiscono tra loro. È possibile infatti frammentare questi recettori in due parti in grado di riconoscersi e ricongiungersi  

sulla membrana cellulare per ricostituire il recettore originale.

Questo fenomeno è stato dimostrato per diversi recettori, come per esempio il recettore per la rodopsina (Ridge et al., 

1995), quello β2­adrenergico (Kobilka et al., 1998), i recettori muscarinici M2 e M3 (Maggio et al., 1993), il recettore per la 

vasopressina V2 (Shoneberg et al., 1995), quello per l’ormone del rilascio delle gonadotropine (Grosse et al., 1997), quelli 

alle neurochinine NK1 (Nielsen et al., 1998) e il recettore D2 per la dopamina (Scarselli et al., 2000).

Il taglio effettuato a livello del terzo loop intracellulare dà luogo a due distinti frammenti recettoriali: a) il frammento “trunk”,  

contenente   l’estremità   N­terminale,   i   domini   transmembrana   da   I   a   V   e   l’estremità   N­terminale   del   terzo   loop 

24

citoplasmatico; b) il frammento tail cpontenente il C­terminale del terzo loop citoplasmatico le regioni transmembrana VI e 

VII e l’estremità C­terminale del recettore.

I frammenti recettoriali ottenuti sono capaci di riconoscersi e riassociarsi fra di loro ricostituendo il recettore wild­type dal 

quale derivano. Come descritto sotto, questo meccanismo di riconoscimento ed interazione tra i due frammenti recettoriali  

potrebbe essere alla base di uno dei meccanismi di interazione recettore­recettore.

Questo modello di dimerizzazione recettoriale proposto è il cosiddetto “domain swapping” (scambio di domini), in cui la 

parte trunk di uno dei due monomeri  interagisce con quella tail  dell’altro.  Il  risultato è un dimero recettoriale con una 

struttura proteica tetramerica, a quattro subunità, stabilizzata da un numero d’interazioni chimiche praticamente doppio 

rispetto a quello presente nel recettore monometrico.

Questo tipo di interazione è stato proposto per spiegare la dimerizzazione tra due recettori chimerici inattivi formati da 

parte   del   recettore   muscarinico   M3  e   parte   dal   recettore   adrenergico  α2  (Maggio   et   al.,   1993).   Tale   lavoro   è 

particolarmente   importante   perché   ha   dimostrato   per   la   prima   volta   la   possibilità   di   un’interazione   diretta   a   livello 

molecolare tra due recettori accoppiati alle proteine G.

In particolare, la chimera M3/α2 era formata da i primi V segmenti transmembrana del recettore M3 e dai segmenti VI e VII 

del recettore α2, mentre la chimera α2/M3 risultava costruita in modo complementare (Fig. 9).

Le due chimere recettoriali  erano  incapaci di  legare  i vari composti adrenergici e muscarinici ed inoltre erano inattive 

funzionalmente. La  loro co­espressione  invece portava al  recupero funzionale sia del  recettore M3  che di quello α2, 

dimostrando quindi che le due chimere inattive interagivano tra loro ripristinando la funzione dei recettori wild type. Questo 

meccanismo di interazione è suffragato da evidenze sperimentali e da modelli computazionali (Gouldson et al., 1998).

 

25

26

Fig. 9. Meccanismo del “domain swapping” (da: Protein eng. 1998, Vol. 11)

27

1.5.1   Evidenze di dimeri recettoriali

Il primo esempio di eterodimero recettoriale fisiologico evidenziato è stato il recettore GABAb. In questo caso sono state 

individuate e clonate due differenti sequenze geniche del recettore GABAb nel cervello di ratto, GABAbR1 e GABAbR2, 

dimostrando che per ottenere una piena attività recettoriale le due subunità erano entrambe fondamentali (Jones et al., 

1998). La presenza di una sola delle due subunità nella cellula non era sufficiente per ottenere la funzione del recettore 

GABAb, mentre la co­espressione delle due consentiva di ottenere un recettore completamente funzionante. Questo fu il 

primo esperimento che dimostrava come l’interazione tra le due subunità di un recettore fosse un requisito indispensabile 

per il corretto funzionamento della trasduzione del segnale di un neurotrasmettitore a livello sinaptico.

È stato anche dimostrato, utilizzando la microscopia elettronica, come le due subunità recettoriali GABAbR1 e GABAbR2 

fossero colocalizzate in vivo nel ratto a livello delle spine neuronali delle cellule di Purkinje del cervelletto (Kaupmann et 

al., 1998), suggerendo come l’interazione tra i due recettori possa veramente essere un fenomeno fisiologico estendibile 

nel regno animale.

Studi successivi hanno confermato la necessità della presenza di entrambe le subunità per un corretto funzionamento del 

recettore GABAb (Mitrovic et al., 2001; Gelvez et al., 2001; Havlikova et al., 2002), indicando anche gli aspetti molecolari 

di questa interazione. In particolare è stato dimostrato come la presenza di entrambe le subunità sia fondamentale per il 

corretto   “traffincking”   recettoriale  ed   inoltre  sono state   individuate   le   funzioni  dei  sottotipi   recettoriali.  Se  la  subunità 

GABAbR1   è   fondamentale   per   l’iterazione   con   i   ligandi   gabaergici,   la   subunità   GABAbR2   è   essenziale   per 

l’accoppiamento   con   le   proteine   G   e   per   il   raggiungimento   dell’espressione   su   membrana.   Tuttavia,   questa   netta 

distinzione di ruoli delle due subunità non è stata ancora del tutto dimostrata dato che alcuni studi hanno evidenziato 

come nella   struttura  eterodimerica  anche  il   recettore  GABAbR1 contribuisca  all’effetto   funzionale mentre   il   recettore 

GABAbR2 aumenti l’affinità verso alcuni agonisti gabaergici. 

Oggi   gli   studi   eseguiti   sulla   presenza   dell’eterodimero   GABAbR1/GABAbR2   sono   quelli   maggiormente   convincenti, 

confermati e difficilmente confutabili, che incoraggiano fortemente a proseguire su questo filone di ricerca con la speranza 

di scoprire nuovi eterodimeri recettoriali. 

28

Se lo studio sul complesso eterodimerico gabaergico ha aperto la strada nel campo della dimerizzazione dei GPCRs, gli 

esperimenti  sui   recettori  oppiodi   ,    e   ,  hanno  indicato come questo   fenomeno molecolare  di   interazione   fraμ δ κ  

recettori possa dare origine alla formazione di complessi proteici con caratteristiche funzionali e farmacologiche distinte 

dai recettori che li formano (Devi et al., 2000).

L’interazione molecolare diretta di tipo eterodimerico tra i recettori   e   porta alla formazione di un complesso proteicoδ κ  

con caratteristiche funzionali e farmacologiche distinte. Inoltre, l’eterodimero  /  è capace di legare sinergicamente dueδκ  

ligandi oppiodi selettivi potenziando il segnale di trasduzione della fosforilazione di MAP chinasi (Jordan et al., 1999).

La farmacologia di questo sito eterodimerico è differente da quella dei recettori     e     che lo compongono, mentreδ κ  

risulta molto vicina a quella del sottotipo recettoriale precedentemente caratterizzato come recettore κ2. tali indicazioni 

sperimentali danno conferma all’ipotesi che la formazione di eterodimeri potrebbe davvero, in alcuni casi, dare origine a 

nuovi siti recettoriali con caratteristiche farmacologiche proprie.

Esperimenti analoghi sono stati fatti sui recettori   e  , ottenendo risultati simili. La farmacologia del sito eterodimericoμ δ  

/  sembra molto vicina a quella del sottotipo recettoriale μδ δ2 (Gomes et al., 2000). Dal punto di vista funzionale sono 

state rilevate nuove caratteristiche del sito eterodimerico, addirittura in alcuni casi opposte rispetto ai recettori   e   cheμ δ  

lo compongono (Charles et al., 2003).

La scoperta di recettori eterodimerici oppiodi ha portato ad un notevole interesse per eventuali applicazioni cliniche. Per 

esempio è stato dimostrato che somministrando in vivo contemporaneamente agonisti selettivi per i recettori   e   siμ δ  

ottiene un effetto sinergico antidolorifico dovuto ad un potenziamento della funzione recettoriale. La morfina, un potente 

antidolorifico,  è  un agonista      e  può   indurre dipendenza e  tolleranza;  se viene somministrato  congiuntamente unμ  

agonista  , quest’ultimo potrebbe potenziare l’effetto analgesico della morfina consentendo una diminuzione della suaδ  

dose. Una possibile spiegazione dell’effetto sinergico ottenuto, somministrando contemporaneamente un   agonista e unμ  

 agonista, è che entrambi siano in grado di attivare congiuntamente il recettore eterodimerico  / .δ μδ

La formazione di un nuovo sito recettoriale è stata evidenziata anche peri recettori muscarinici M2 e M3. la co­espressione 

dei due recettori muscarinici porta alla formazione di un sito eterodimero con caratteristiche farmacologiche simili a quelle 

di un recettore chimerico formato dalla parte trunk del recettore M3  e dalla parte tail del recettore M2,  indicando come 

meccanismo possibile quello del “domain swapping” (Maggio et al., 1999).

Finora abbiamo trattato dell’interazione tra sottotipi recettoriali che fanno parte dello stesso sistema neurotrasmettitoriale, 

tuttavia esempi d’interazione tra recettori che rispondono a differenti neurotrasmettitore non mancano.

Nel   caso   particolare   è   stato   dimostrato   come   i   recettori   dopaminergici   D2  e   i   recettori   alla   somatostatina   SSTR5 

interagiscano fisicamente attraverso l’eterodimerizzazione creando un nuovo recettore ad alta affinità capace di legare 

29

contemporaneamente   somatostatina   e   agonisti   dopaminergici   (Rocheville   et   al.,   2000).   L’aumento   di   affinità   di   tale 

complesso eterodimerico è circa 30 volte e l’interazione tra i due recettori è stata determinata in cellule viventi utilizzando 

la tecnica della FRET.

Dati di questo tipo sono estremamente interessanti, perché potrebbero contribuire alla spiegazione del fenomeno della 

cotrasmissione. Cotrasmettitori come la somatostatina o altri possono influenzare l’attività di sistemi neurotrasmettitoriali 

classici, come quello della dopamina per esempio, il meccanismo d’interazione potrebbe almeno in parte passare dalla 

formazione di eterodimeri recettoriali in grado di captare la presenza di due ligandi diversi.

l’eterodimerizzazione di recettori accoppiati a proteine G, oltre ad influenzare le funzioni e le affinità dei recettori, potrebbe 

svolgere un ruolo importante nei fenomeni di internalizzazione e desensitizzazione dei recettori sulla membrana cellulare. 

Se vengono coespressi, per esempio, nella stessa cellula recettori oppiodi   e recettori adrenergici, osserviamo cheδ  

l’agonista adrenergico internalizza entrambi i recettori (Jordan et al., 2001). La presenza dell’eterodimero  /δβ2 sensibile 

ad entrambi gli agonisti potrebbe spiegare questo fenomeno di cooperazione.

D’altra parte il fenomeno sopra descritto risulta specifico considerando che in cellule che esprimono sia il recettore   cheκ  

il recettore β2 non si verifica tale interazione.

Indicazioni  della stessa natura sono state suggerite per  i   recettori eterodimerici SSTR2a/  (Pfeiffer  et al.,  2002).  Inμ  

questo caso la stimolazione con somatostatina o con un ligando oppiode del recettore eterodimerico non solo influenza 

l’internalizzazione di entrambi i recettori, ma anche il grado di fosforilazione e desensitizzazione di entrambi.

Quindi   l’eterodimerizzazione tra recettori  accoppiati  a proteine G si  presenta come un  fenomeno biologico funzionale 

importante almeno nei sistemi cellulari sperimentali; rimane da confermare tale indicazione negli organismi animali viventi 

come l’uomo per esempio.

Dati   sperimentali   sull’uomo   del   fenomeno   della   eterodimerizzazione   in   realtà   sono   stati   ottenuti,   ma   non   come 

meccanismo   di   una   funzione   fisiologica   quanto   come   possibile   causa   di   patogenesi.   Questo   non   significa   che 

l’eterodimerizzazione in vivo abbia  solamente un significato fisiopatologico, ma dimostra come tale meccanismo biologico 

sia estremamente diversificato a seconda del sistema recettoriale di cui ci stiamo occupando.

È  stato  dimostrato  come nelle gestanti  che soffrono di  una patologia  come la preeclampsia si  osserva una risposta 

esagerata agli effetti pressori dell’angiotensina II e tale effetto potrebbe passare dalla presenza dell’eterodimero formato 

tra il recettore all’angiotensina II AT1 e il recettore alla bradichinina B2 (Abdalla et al., 2001). l’eterodimerizzazione tra AT1 e 

B2 è correlabile con un aumento di circa cinque volte la quantità del recettore B2; inoltre, l’espressione dell’eterodimero 

AT1/B2   fa  aumentare   la   risposta all’angiotensina   II  e  conferisce   resistenza  al   recettore  AT1 nei  normali  processi  di 

disattivazione indotta delle specie reattive dell’ossigeno.

30

Se finora sono state analizzate interazioni tra recettori accoppiati alle proteine G, uno studio ha evidenziato come sia 

possibile un’interazione diretta anche tra recettori   accoppiati alle proteine G e recettori canale. Tale interazione è stata 

dimostrata tra il recettore dopaminergico D5 e il recettore canale GABAA (Liu et al., 2000). La formazione dell’eterodimero 

D5/GABAA  potrebbe spiegare  in parte alcune interazioni  funzionali  tra  il  sistema neurotrasmettitoriale dopaminergico e 

quello gabaergico.

Da questi esempi di eterodimerizzazione, dal significato così diverso, emerge come questo meccanismo biologico debba 

ancora essere ben caratterizzato e studiato in dettaglio soprattutto in sistemi nativi; tuttavia dalle indicazioni finora ottenute 

possiamo ipotizzare che il fenomeno possa essere importante e costituisca un ulteriore meccanismo di regolazione e 

modulazione nel complesso sistema d’interazione tra neurotrasmettitori e recettori.

1.5.2   Meccanismi di dimerizzazione recettoriale

Per   quanto   riguarda   la   struttura   tridimensionale   dei   dimeri   recettoriali,   l’unica   evidenza   diretta   proviene   da   studi 

cristallografici   sui   recettori   metabotropici   al   glutammato  mGluR1  (Kunishima   et  al.,   2000).   In   questo   studio  è   stata 

determinata la struttura tridimensionale cristallina della parte extracellulare N­terminale sia in presenza che in assenza di 

glutammato. La struttura cristallina ha dimostrato che un ponte di solfuro tra le due cisteine (Cys­140) è responsabile della 

connessione tra i due monomeri, anche se interazioni tra vari segmenti proteici ad  ­elica contribuiscono alla stabilità delα  

dimero. Il complesso omodimerico mostra una certa flessibilità e dinamicità conformazionale ed il ligando stabilizza la 

struttura attiva del recettore.

L’omodimerizzazione di alcuni recettori metabotropici al glutammato e di recettori Ca++­sensibili  avviene quindi con un 

meccanismo di formazione di un ponte disolfuro, ma probabilmente sono coinvolte anche interazioni di tipo idrofobico tra 

differenti segmenti proteici ad  ­elica (α Fig. 10)

Un altro meccanismo di dimerizzazione è stato messo in luce nell’interazine tra due i due sottotipi recettoriali GABAbR1 e 

GABAbR2.   Un’interazione   tra   le   due   code   recettoriali   (Coleid­coil)   a   livello   del   C­terminale   è   stata   ipotizzata   nella 

formazione dell’eterodimero grazie a studi di mutagenesi (Margeta et al., 2001). Questi studi hanno anche dimostrato che, 

sebbene   l’interazione   “coleid­coil”   sia   importante   per   la   corretta   espressione   recettoriale   in  membrana,  essa   non   è 

necessaria per la formazione del dimero. 

31

Il   terzo meccanismo di dimerizzazione tra recettori monomerici è quello che prevede un’interazione soprattutto di tipo 

idrofobico a livello dei segmenti transmembrana come dimostrato da studi di mutagenesi sul recettore β2 adrenergico e 

D2 dopaminergico.  

Insieme   a   questi   studi,   analisi   di   simulazione   computazionale   hanno   suggerito   che   siano   soprattutto   i   domini 

transmembrana V e VI che creano l’interfaccia di interazione tra i due monomeri (Gouldson et al., 1998). 

In realtà il meccanismo di interazione tra le parti transmembrana dei due recettori potrebbe avvenire con due meccanismi 

diversi, uno che prota alla formazione di “Contact Dimers” e l’altro di “Swapping Dimers”.

Nel meccanismo del “domain swapping” (scambio di domini), domini identici di due recettori vengono a scambiarsi tra un 

monomero e l’altro. Il risultato è un dimero recettoriale con una struttura proteica tetramerica, formata da quattro ipotetiche 

subunità che generano due siti recettoriali, stabilizzata da un numero d’interazioni chimiche praticamente doppie rispetto a 

quello presente nel recettore monometrico. 

Questo scambio è reso possibile dalla libertà di movimento che le due porzioni hanno all’interno dello stesso monomero 

recettoriale,   dovuta   sia   alla   lunghezza  del   terzo   loop   intracellulare,   sia  alla   fluidità   del   doppio   strato   fosfolipidico  di 

membrana.

32

 

Fig.  10.  Meccanismo di   interazione  recettoriale:  Domain  swapping  (A),   interazione  tra  segmenti   transmembrana  (B),  

formazione di ponti disolfuro (C) e interazione “coiled­coil” (D).

Un esempio di questo tipo di interazione è stato dimostrato tra i recettori muscarinici M2 e M3. il sito eterodimerico M2/M3 ha 

mostrto una farmacologia paragonabile a quella di un recettore chimerico muscarinico fatto dalla parte trunk del recettore 

M2 e la parte tail del recettore M3.

Nel caso dei “contact dimers” invece, si suppone un’interazione  latero­leterale, in cui  i  recettori monomerici prendono 

contatto tra loro attraverso la parte idrofobia delle regioni transmembrana. Un’interazione di questo tipo è stata ipotizzata 

per   l’eterodimero   formato  dal   recettore  D2 e  quello  SSTR5 per   la  somatostatina.   In  questo   complesso   recettoriale, 

l’agonista dopaminergico determina un potenziamento dell’affinità per la somatostatina di circa trenta volte.  

1.6  SISTEMA DOPAMINERGICO: PATOLOGIE E FARMACI

I neuroni dopaminergici sono rappresentati nel sistema nervoso centrale da diversi gruppi cellulari distinti in base alla loro 

funzione e localizzazione:

• Il  sistema dopaminergico nigro­striatale,  che ha  i  suoi  corpi  cellulari  di origine nel mesencefalo ventrale, 

comprende:   i   neuroni   A10   dell’area   tegmentale   ventrale   (VTA)   mesencefalica,   i   neuroni   A9   della   pars 

compacta della substantia nigra e i neuroni A8 dell’area retro­rubrale in posizione più caudale. I neuroni A9 

nella pars compacta della substantia nigra rappresentano l’origine della componente dorsale del sistema 

meso­striatale. I dendriti di questa popolazione neuronale innervano la pars reticolata della substantia nigra 

dove il  rilascio di dopamina regola  l’attività delle terminazioni afferenti originate dai gangli della base. Gli 

assoni dei neuroni A9 proiettano al nucleo caudato e al putamen che insieme costituiscono il corpo striato.

• Il   sistema   dopaminergico   meso­limbico   e   meso­corticale,   e   la   componente   ventrale   del   sistema 

dopaminergico meso­striatale originano soprattutto nei neuroni A10 della VTA e nella parte mediale della 

substantia   nigra.   Questa   componente   innerva   il   nucleo   accumbens,   il   tubercolo   olfattorio   e   il   nucleo 

interstiziale della stria terminalis. Altre fibre che originano dai neuroni A10 innervano il setto (soprattutto il 

33

nucleo   laterale   del   setto),   l’ippocampo,   l’amigdala,   la   corteccia   entorinale,   la   corteccia   prefrontale,   la 

corteccia peririnale e la corteccia piriforme.

• Il sistema dopaminergico meso­talamico ha i suoi neuroni di origine nell’area A10; questi neuroni innervano 

le strutture del 

Fig. 11. Vie dopaminergiche del sistema nervoso centrale di ratto

ponte, del diencefalo e del telencefalo. Un fascio meso­talamico molto ben caratterizzato origina nella VTA e termina 

nell’abenula, in particolare nelle sue parti laterale e mediale.

• I   sistemi   dopaminergici   tubero­infundibolare   e   tubero­ipofisario   originano   dai   corpi   cellulari   dei   neuroni 

dopaminergici, detti neuroni A12, localizzati nei nuclei arcuato e periarcuato dell’ipotalamo. Il sistema tubero­

ipofisario origina nella parte anteriore dell’area A12 e innerva la parte intermedia e posteriore dell’ipofisi, dove 

inibisce rispettivamente  la secrezione dell’ormone melanocitostimolante (α­MSH) e della  β­endorfina, e  il 

rilascio degli ormoni ossitocina e vasopressina. I neuroni del sistema tubero­infundibolare innervano lo strato 

esterno   dell’eminenza   mediana,   dove   sono   strettamente   in   contatto   con   i   capillari   del   sistema   portale 

ipofisario;   la  dopamina  rilasciata  nel  sistema portale   ipofisario,   raggiunge   l’ipofisi  anteriore  in  cui  media 

l’inibizione della secrezione di prolattina.

A tutti questi livelli, un’alterazione della neurotrasmissione dopaminergica può portare alla genesi di vari disturbi del 

sistema nervoso centrale. Tra questi, il morbo di Parkinson dovuto alla degenerazione dei neuroni dopaminergici del 

34

sistema nigro­striatale; alcune forme di psicosi e la dipendenza psichica verso le sostanze d’abuso, per alterazioni del  

sistema meso­limbico e meso­corticale.

Nella cura del morbo di Parkinson e di alcune psicosi, la terapia farmacologia attualmente disponibile è principalmente 

mirata su composti affini per i recettori D2­like. Nel trattamento del morbo di Parkinson, inoltre, viene utilizzata la L­

DOPA, precursore della biosintesi della dopamina, capace di reintegrare i livelli del neurotrasmettitore che è andato 

perduto a causa della degenerazione dei neuroni dopaminergici. In seguito a trattamenti prolungati questo farmaco 

perde di efficacia e compaiono quelle che vengono chiamate fluttuazioni motorie e discinesie. Sebbene non si conosca 

con precisione  la causa di questa caduta dell’effetto  terapeutico del  farmaco,  l’ipotesi più accreditata è quella che 

presuppone  la drastica  riduzione dei neuroni dopaminergici a  livello nigro­striatale dopo alcuni anni di  trattamento. 

Questo farebbe sì che la maggior parte della L­DOPA non possa venire trasformata in dopamina e accumulata nei 

neuroni dopaminergici della nigra. Una quota esigua di dopamina potrebbe tuttavia originare da una trasformazione 

aspecifica della L­DOPA all’interno di neuroni non dopaminergici. Per questo motivo, la ricerca farmacologica del morbo 

di Parkinson è  molto attiva nel  cercare dei   farmaci  agonisti  dopaminergici  ad azione diretta sui   recettori,  che non 

dipendano per la loro attività da una trasformazione metabolica e quindi dalla presenza di neuroni dopaminergici integri. 

Tra gli agonisti che sono stati sintetizzati e che sono entrati in clinica per il trattamento di questa patologia ricordiamo la 

bromocriptina, la pergolide, l’apomorfina, il ropinirolo e il pramipexolo. Questi farmaci sembrano ritardare l’esordio degli 

effetti collaterali da trattamento cronico con la L­DOPA.

Alcune psicosi come la schizofrenia, al contrario, sembrano derivare da un’iperattività dopaminergica del sistema meso­

limbico, e quindi per la terapia vengono somministrati farmaci con effetto antagonista dopaminergico, conosciuti anche 

come neurolettici. Essi rappresentano una classe di farmaci eterogenea da un punto di vista chimico, ma hanno tutti la 

capacità di antagonizzare i recettori dopaminergici di tipo D2 e D3. I neurolettici vengono distinti in classici e atipici. I 

primi   causano   molti   effetti   collaterali   per   via  dell’inattivazione   indiscriminata   dei   recettori   dopaminergici   striatali   e 

ipofisari con  induzione di sindrome parkinsoniana, amenorrea e ginecomastia. Gli atipici  invece hanno ridotti  effetti 

collaterali di tipo extrapiramidale e ipofisari, inoltre essi hanno un più ampio spettro di attività recettoriale. Al momento 

attuale non è ancora ben chiaro quale sia il meccanismo d’azione dei farmaci neurolettici atipici.

35

2. SCOPO DELLA TESI

Nella mia tesi ho testato come la eterodimerizzazione dei recettori dopaminergici D2 e D3 modifica l’attività farmacologia 

di una serie di agonisti parziali per questi due recettori. I composti che sono stati testati sono: l’aripiprazolo, un nuovo 

farmaco antipsicotico ormai in commercio da alcuni anni, e quattro agonisti parziali usati solo a scopo sperimentale, il 

preclamolo, il bifeprunox, il più importante metabolita dell’antipsicotico atipico clozapina, l’N­desmetilclozapina  e l’ S33592 

(un derivato benzopirrolidinico) sintetizzato dalla casa farmaceutica Servier. L’efficacia di questi agonisti parziali è stata 

valutata sia sui recettori D2 e D3  transfettati singolarmente che sui due recettori co­transfettati nelle stesse cellule.

36

3. MATERIALI E METODI

Il  materiale utilizzato per  il   terreno di  coltura cellulare  (DMEM, L­glutammina, aminoacidi  non essenziali,  penicillina e 

streptomicina,   Glucosio,  Timidina   e   Ipoxantina,   e   Metotrexato   )   è   stato  acquistato   dalla  Sigma  Chemical   Company 

(St.Louis, MO, U.S.A.), il siero fetale bovino dializzato è stato comperato dalla Invitrogen ( Gibco). 

La [3H]Adenina e  la [3H]Nemonapride sono state fornite da DuPont­New England Nuclear (Boston, MA), la forscolina e 

quinpirolo sono state acquistate dalla  Sigma Chemical Company .

Aripiprazolo, preclamolo, S33592, bifeprunox ed N­desmetilclozapina sono state sintetizzate da G. Laville e J­L. Peglion 

(Servire, Paris, France).

NHCOH3

O

N

NC

S 33592

Cl

ClN

NO N

HO

Aripiprazole

OH N

Préclamol                                     

37

      

                 

N

N

NH

Quinpirole

                                                     

                                      

3.1      COLTURE CELLULARI 

Sono stati utilizzati tre tipi cellulari, le cellule COS­7 per le transfezioni transienti e le cellule CHO per quelle stabili. In 

particolare sono state usate delle cellule CHO deficienti per il gene dell’enzima diidrofolato reduttasi (DHFR­) e cellule 

CHO provviste del geni per l’enzima e per il recettore dopaminergico umano D3 (DHFR+/HD3).  I due tipi cellulari CHO 

sono stati forniti dal Dott. Pierre Sokoloff ( Sokoloff  et al. , 1992 ).

Le cellule CHO DHFR­ sono state ottenute in seguito a mutagenesi con Etil Metasulfonato e con raggi   e sono stateγ  

selezionate aggiungendo al medium di coltura Diidrossiuridina triziata e Metotrexato ( Urlaub et al.,1980 ).

Le   cellule  CHO DHFR+ HD3  sono  state  ottenute   trasfettando   cellule  CHO DHFR­   con  un  plasmide  contenente   la 

sequenze per l’enzima diidrofolato redattasi e per il recettore HD3.

Il recettore HD3 è stato ottenuto da screening di librerie di DNA  con sonde costituite da sequenze di recettore D3 di ratto 

e usando la tecnica della polymerase chain reaction (PCR). IL cDNA così ottenuto è stato inserito nel plasmide vettore 

pGEM­4Z (Promega) a livello del sito di restrizione BglΙΙ ( incluso nel primer usato per la PCR).

38

Il   cDNA è   stato  poi   subclonato   in  un  vettore  eucariotico  derivato  dal  plasmide pSV contenente   la  sequenza  per   la 

Diidrofolatoreduttasi (Sokoloff et al., 1990) usando gli enzimi di restrizione KpnΙ e BglΙΙ .

39

L’enzima diidrofolato reduttasi (DHFR) è  responsabile della sintesi dell’acido tetraidrofolico  intracellulare , un cofattore 

necessario per il trasferimento di unità monocarboniose in un gran numero di reazioni biosintetiche in cui questi gruppi 

vengono trasferiti da un metabolita ad un altro.

Alcune di queste complesse reazioni sono state descritte nel metabolismo intermedio degli amino acidi, delle purine e 

delle pirimidine.

Le cellule sono state fatte crescere in flasche da 150 cm2 e una volta raggiunta la confluenza sono state staccate con 

tripsina 0,2 % e seminate in piastre petri da 100 mm.

Negli esperimenti funzionali dopo la transfezione le cellule sono state riseminate in piastre da 24 pozzetti per l’esecuzione 

del saggio dell’adenilato ciclasi che di norma veniva eseguito dopo 48 ore dall’ultima semina.

Le cellule sono state cresciute in atmosfera umidificata al 5 % di CO2 e ad una temperatura di 37ºC.

Per la crescita e la proliferazione delle cellule CHO i mezzi di coltura sono stati adattati come descritto qui di seguito.

40

Il terreno per le CHO DHFR­ contiene : Dulbecco’s modified Eagles Medium (DMEM ) supplementato con Siero fetale 

bovino dializzato (FBS), glucosio, 2% di L­ glutammina 200 mM, 1% di aminoacidi non essenziali (L­alanina, L­asparagina, 

acido L­ aspartico, acido L­glutammico, glicina, L­prolina, L­serina), l’1% di una soluzione di penicillina (100 unità/ml) e 

streptomicina (10 mg/ml). Inoltre a tale terreno è stata addizionata una soluzione di Timidina­Ipoxantina .

Le DHFR­ sono incapaci di sintetizzare  de novo glicina, nucleotidi purinici e timidilato, per questo il mezzo di coltura è 

opportunamente modificato in modo da permettere la crescita cellulare.

Il terreno di coltura delle CHO DHFR+ è uguale a quello per le CHO DHFR­ tranne che per la presenza di Metotrexato 150 

nM e per l’assenza di Timidina­ Ipoxantina. 

Il  Metotrexato è  un analogo del   tetraidrofolato   e blocca  l’attività  della diidrofolatoreduttasi   la cui  sintesi  viene quindi 

incrementata con un meccanismo a feedback . 

41

                           fig12. Immagine di cellule CHO in coltura

3.2 VETTORE PLASMIDICO

Il vettore plasmidico contenente la sequenza codificante per il recettore HD2 è stata fornita dal Guthrie cDNA Resource 

Center.

Il   recettore HD2  (  variante 1  )  è   stato  clonato  in  pcDNA3.1+  (Invitrogen)  ,   l’inserzione è   stata  effettuata  tra   i   siti  di 

restrizione EcoRΙ (5') e XhoΙ (3').

Il vettore contiene il gene per la resistenza alla Neomicina, per la selezione di linee cellulari che stabilmente esprimono il 

plasmide. La selezione è fatta con G418.

Il G418 è un antibiotico aminoglucosidico simile alla Neomicina, che blocca la sintesi proteica nelle cellule di mammifero 

interferendo con la funzione ribosomale.

Uno chema del plasmide è riportato nella figura nella pagina seguente. Il plasmide presenta un sito di riconoscimento per 

la replicazione batterica (pUC­ori), il promotore, il sito di origine e quello di poliadenilazione del virus SV40. Il promotore 

che permette l’espressione della proteina ricombinante inserita nel sito policlonale è quello del Citomegalovirus (Pcmv), 

mentre il sito di poliadenilazione per il distacco dell’enzima   RNA polimerasi dal DNA è quello dell’ormone bovino della 

crescita (BGH pA).

  

42

 

43

44

3.3 TRANSFEZIONE TRANSIENTE

Per la transfezione transiente sono state usate le cellule COS­7. Esse sono state distribuite in piastre Petri di  

100  mm  di   diametro   ad   una   densità   di   4   x  105  cellule   in   10   ml   di   terreno   di   coltura.   Passate   24  ore  dalla 

semina, le cellule sono state lavate per due volte con una soluzione sterile di NaCl allo 0,9%, dopodiché sono 

state transfettate transientemente con il metodo del DEAE­destrano (Cullen 1987). In breve, lo NaCl residuo è 

stato aspirato ed è stata aggiunta una soluzione costituita da: 540  l di tampone salino fosfato (PBS) sterileμ  

(cloruro   di   calcio   0.133   g/l,   cloruro   di   magnesio   0.1   g/l,   fosfato   di   potassio   monobasico   0.2   g/l,   fosfato   di 

potassio dibasico 1.15 g/l, cloruro di sodio 8 g/l, pH 7.4), 28  l di una soluzione di DEAE­destrano (10 mg/l) eμ  

diverse concentrazioni (0.25  g, 0.5  g, 1  g, 2  g, 3  g e 4  g) di DNA plasmidico. Dopo un periodoμ μ μ μ μ μ  

di   incubazione  di   30 minuti  a  37°C,  la  soluzione è   stata   rimossa e sono stati  aggiunti  nelle  piastre  6  ml  di 

terreno di coltura e 60  l di clorochina 8 mM (80  M finale).μ μ

Le piastre sono state nuovamente messe a  incubare per 2 ore e mezzo, dopodiché questa soluzione è stata 

rimossa e  le cellule sono state lavate per due volte con una soluzione sterile di NaCl al 0.9%. Alla fine sono  

stati   aggiunti   10   ml   di   terreno   di   coltura   fresco,   e   le   piastre   sono   state   rimesse   nell’incubatore.   Per   gli 

esperimenti di binding le piastre sono state utilizzate dopo tre giorni, mentre per gli esperimenti funzionali 24 

ore dopo la trasfezione le cellule sono state riseminate in piastre da 24 pozzetti come descritto sopra.

3.4 TRANSFEZIONE STABILE 

Entrambe le linee cellulari CHO sono state trasfettate stabilmente con il recettore HD2 in modo da ottenere cellule CHO 

DHFR­ HD2 e cellule CHO DHFR+ HD3/HD2 .

La trasfezione stabile del vettore contenente il gene per il recettore HD2 è stata ottenuta con il metodo del Calcio Fosfato 

(Jordan et al., 1996 ).

Le cellule sono state coltivate in piastre di 100 mm di diametro ad una densità di circa 105 cellule per piastra in 10 ml di 

mezzo di coltura.

Il giorno seguente è stato aspirato il medium e, senza fare lavaggi , è stato sostituito con 9 ml di medium fresco .

Un’ora dopo è stata effettuata la trasfezione : per ogni piastra è stata preparata una soluzione contenente 50 μl di CaCl2 

2,5 M  e  440 μl di TE Buffer (1mM Tris HCl, 0.1mM EDTA pH 7.7). A questa soluzione sono stati poi aggiunti 10 μg di 

DNA e 500 μl di Hepes 2x (140 mM NaCl , 1.5 mM Na2HPO4 , 50 mM Hepes , pH 7.05). Il tutto è stato lasciato ad  

45

incubare per 30 secondi. La soluzione così preparata è stata aggiunta goccia a goccia ai 9 ml di medium  già presenti 

nelle piastre da trasfettare.

In seguito alla trasfezione in alcune cellule il DNA plasmidico viene integrato permanentemente nel DNA nucleare.

Le   cellule   che   hanno   integrato   stabilmente   il   cDNA   trasfettato   sono   state   selezionate   sfruttando   la   resistenza   alla 

geneticina presente nel plasmide pCDNA3.1.

46

3.5  METODICA PER GLI STUDI DI BINDING DEI RECETTORI                                    

Trascorsi tre giorni dalla transfezione, le piastre sono state lavate per due volte con soluzione fisiologica e trattate con 2 ml  

di tampone ipotonico freddo (Na+­HEPES 1 mM, EDTA 2 mM). Dopo 20 min di incubazione in ghiaccio a 4°C, le cellule 

sono state staccate e trasferite in opportuni tubi per poi essere centrifugate a 17.000 rpm per 20 min a 4°C. I pellets di 

membrana sono stati successivamente omogeneizzati con un politron settato a velocita V per 30 sec in un tampone così 

costituito: Tris­HCl 50 mM, pH 7.4, NaCl 155 mM, albumina bovina 0.01 mg/ml. In seguito i pellets sono stati aliquotati per  

le prove di binding. 

Gli esperimenti di saturazione sono stati condotti utilizzando la [3H]­nemonapride con attività specifica di 82 Ci/mmol. La 

determinazione del binding aspecifico è avvenuta in presenza di dopamina alla concentrazione di 2 mM.

Per quanto riguarda le prove di spiazzamento le membrane sono state risospese nel medesimo tampone addizionato di 

Tris HCl  2 mM, NaCl 7,70 mM pH7,4 e di  acido ascorbico allo 0.025%.

Le sostanze testate negli esperimenti di inibizione sono state: Preclamolo, Aripiprazolo, N­desmetilclozapina, S33592 e 

Bifeprunox.

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in un volume finale di 1 ml. L’incubazione è stata effettuata a temperatura ambiente 

per  1  h,  e  per  separare  il   radioligando  legato  al   tessuto  da quello  non   legato,   i   campioni  sono  stati   filtrati   con  un 

raccoglitore “Brandel Cell Harvester” utilizzando filtri a fibre di vetro (Whatmann, GF/B). Successivamente i filtri sono stati 

lavati tre volte con un tampone freddo (Tris­HCl 10 mM, pH 7.4, NaCl 155 mM).

Infine i filtri sono stati trasferiti in tubi contenenti 4 ml di liquido di scintillazione e la radioattività associata al recettore è 

stata valutata mediante il conteggio con un β­counter. Tutte le prove sono state ripetute tre volte e ogni campione è stato 

fatto in triplicato

3.6     METODICA   UTILIZZATA   PER   DETERMINARE   LA   FUNZIONE   DEI   RECETTORI 

SULL’ENZIMA ADENILATO CICLASI (3HcAMP) :

Il metodo utilizzato per lo svolgimento di questo saggio prevede l’uso di colonne cromatografiche di due tipi secondo il 

protocollo descritto da Avidor­Reiss (1995) e Johnson e Salomon (1991).

Con questa prova funzionale, si fornisce al sistema cellulare adenina triziata che verrà convertita prima in [3H]ATP e quindi 

in  [3H]cAMP attraverso l’enzima adenilato ciclasi.

47

Si valuta  esattamente la quantità di cAMP marcato che viene prodotta rispetto al basale (cioè rispetto alle cellule non 

trattate).

Il primo tipo di colonne utillizzato ha come fase stazionaria la resina  Dowex 50  (AG 50W – X4 resin, 200­400 mesh, 

hydrogen form Bio­Rad Laboratories) che contiene gruppi solfonici caricati negativamente. Il passaggio attraverso queste 

colonne garantisce  la separazione dei prodotti  che vengono dal metabolismo dell’adenina triziata: [3H]ATP, [3H]ADP, il 

[3H]cAMP. Mentre [3H]ATP e [3H]ADP sono eluiti per volumi di fase mobile minori in quanto hanno rispettivamente tre e due 

gruppi fosfato carichi negativamente, il [3H]cAMP viene eluito per volumi di fase mobile maggiori. 

Il secondo tipo di colonne, invece, ha una fase stazionaria di  Allumina (Sigma) che non lega il cAMP ma lega gli altri 

nucleotidi carichi negativamente. Questa caratteristica consente, attraverso opportuni lavaggi con la fase mobile imidazolo 

0,1 M, una più accurata separazione del [3H]cAMP dagli altri nucleotidi. Il [3H]cAMP eluito verrà poi raccolto nelle  vials  

dove è stato precedentemente versato il liquido di scintillazione.Ventiquattro ore dopo la transfezione, le cellule sono state 

tripsinizzate e ridistribuite in piastre da 24 pozzetti contenenti 1 ml di medium di coltura. Dopo 24 h le cellule sono state 

testate con la prova funzionale dell’adenilato ciclasi.

La prova è stata eseguita in triplicato per ogni campione come descritto da Avidor­Reiss et al. (1995). In breve, dopo aver 

rimosso il medium, le cellule sono state incubate per 2 h a 37°C con 0.25 ml/pozzetto di medium fresco contenente [3H]­

adenina (1.25 µL /pozzetto). Successivamente a tale incubazione il medium è stato sostituito con 0.25/pozzetto di DMEM 

contenente 20 mM HEPES, pH 7.4, due inibitori delle fosfodiesterasi, il 3­isobutil­1­metilxantina (IBMX 0.5 mM) e il RO­20­

1724 (0.5 mM).

L’attività dell’enzima adenilato ciclasi è stata stimolata con forskolina (FS 1 µM) per avere un segnale di base più elevato.

L’inibizione dell’attività dell’adenilato ciclasi è stata effettuata tramite stimolazione dei recettori dopaminergici con agonisti 

quali il quinpirolo e il 7­OH DPAT.

Dopo 10 min di   incubazione a 30°C,   il  medium è   stato   rimosso e  la  reazione è  stata  terminata aggiungendo acido 

perclorico al 2.5% contenente cAMP non marcato 0.1 mM e incubando per almeno 30 min a 4°C. L’acido perclorico è stato 

poi neutralizzato con 100 µl di una soluzione KOH 4.2 M e K2CO3 1.85 M; ogni campione raccolto in apposite eppendorf è 

stato centrifugato per due min.

La quantità di  [3H]­cAMP formato è stata determinata tramite una procedura di separazione a due passaggi in colonne 

Dawex e alumina come descritto da Avidor­Reiss et al. (1995).

48

3.7  STATISTICA:       

I dati sono stati presentati come media +/­ l’errore standard di almeno tre esperimenti.

Le curve di saturazione sono state interpolate dall’equazione

a=Bmax∗Xn

KXn(1)

per derivare il coefficiente di Hill (n) e dall’equazione

a=Bmax∗X

K dX(2)

per ottenere la costante di dissociazione Kd e la capacità massima di binding Bmax.

I valori di a e di X nelle due equazioni precedenti rappresentano rispettivamente la quantità di  [3H]­nemonapride legato 

specificatamente al tessuto e la concentrazione dello stesso non legato.

Il coefficiente K nell’equazione (1) rappresenta una costante generica che per n = 1 coincide con la Kd.

I dati degli esperimenti di inibizione sono stati interpolati usando l’equazione

a=100−100∗X n

KXn(3)

per calcolare il coefficiente di Hill (n), e l’equazione

a=100−100∗XIC50X (4)

49

per calcolare il valore di IC50.

La IC50 rappresenta la concentrazione dell’inibitore che sposta il 50% del radioattivo legato specificatamente ai recettori. I 

valori di IC50 sono stati trasformati in Ki con la formula di Cheng e Prusoff  (1973) che è la seguente:

K i=IC 50

1F /K d

(5)

dove F rappresenta la concentrazione della [3H]­nemonapride usata nell’esperimento d’inibizione.

Quando il coefficiente di Hill era diverso da 1, come nel caso di tutti gli agonisti, il valore di IC50 è stato trasformato in IC50 

corretto (IC50 corr) grazie alla formula di Cheng e Prusoff. 

Il programma usato per calcolare tutte le costanti è stato ORIGIN con un computer IBM­compatibile.

50

4.  RISULTATI

4.1 AFFINITA' DEI VARI LIGANDI PER I RECETTORI DOPAMINERGICI D3 E D2 .

In   studi   di   spiazzamento   effettuati   con   [3H]Nemonapride,   aripiprazolo,   S33592,   bifeprunox,   N­desmetilclozapina   e 

preclamolo hanno dimostrato di possedere una affinità significativa sia per il  D2 che per il  D3, sebbene con marcata 

differenza nella loro potenza (Tabella 1).

S33592, NDMC e preclamolo hanno una affinità lievemente maggiore per il D2  rispetto al D3 mentre l’aripiprazolo ha una 

preferenza 10 volte maggiore per il D2.

Si osserva una situazione contraria per il bifeprunox che si lega preferenzialmente, anche se in modo modesto, al D3.

E' stato quindi osservato che Aripiprazolo e Bifepronux sono i  ligandi più potenti rispettivamente per il recettore D2 e D3, 

mentre il Preclamolo è il ligando più debole per entrambi i recettori.

Tabella 1: Profili di Binding degli antipsicotici sui recettori D2 e D3 wild­type e sui recettori chimerici tronchi D2trunk­D3tail  e D3trunk­D2tail.

4.2   INFLUENZA   DEGLI   ANTIPSICOTICI   SULL’ATTIVITA'   DELL’ADENILATO   CICLASI     V/VI 

STIMOLATA CON FORSKOLIN IN CELLULE COS­7 TRANSFETTATE CON I RECETTORI D2 O 

D3.

L’incremento di cAMP sopra i livelli basali dopo la stimolazione con forskolin della adenilato ciclasi endogena contenuta 

nelle   cellule COS­7 è  in media di solo 2 volte. Per poter amplificare la sensibilità del sistema, in tutti gli  esperimenti 

funzionali eseguiti in cellule COS­7 abbiamo co­transfettato una adenilato ciclasi chimerica ACV/VI. Con questa adenilato 

ciclasi, l’incremento medio di cAMP sopra i livelli basali è stato di circa 7 volte (Scarselli et al., 2001; Robinson and Caron, 

1997).

Tutti gli agonisti testati hanno mostrato verso il recettore D3 un’attività nulla (Tabella 2). Al contrario tutti hanno mostrato di 

inibire   l’adenilato   ciclasi   in   presenza  del   recettore   D2.   Il  Quinpirolo   si   comporta   come  un   agonista   pieno   inibendo 

fortemente   l’attività   dell’Adenilato   ciclasi   V/VI   stimolato   con   forskolin   (Tabella   2   e   F1g.   1).   Tutti   gli   altri   composti, 

preclamolo, bifeprunox, NMDC, aripirpazolo e S33592 si sono comportati invece come agonisti parziali nel sopprimere 

D2 (Ki, nM) D2trunk/D3tail (Ki, nM) D3trunk/D2tail (Ki, nM) D3 (Ki, nM)

Aripiprazole 0.74 ± 0.007 14.3 ± 1.79 1.38 ± 0.13 7.61 ± 1.27Bifeprunox 2.26 ± 0.13 1.25 ± 0.12  0.67 ± 0.06 0.73 ± 0.29NDMC 73.4 ± 12.1 88.6 ± 15.3 36.6 ± 6.29 167 ± 15.9S33592 28.6 ± 2.84 227 ± 15.8 10.6 ± 1.12 77.4 ± 6.8Preclamol 273 ± 22.4 1,532 ± 209 133 ± 14.9 702 ± 81.4

51

l’attività dell’enzima indotto dalla forskolina, con un range di inibizione che andava dal 16,3 % per il preclamolo fino al 23 

% per il Bifeprunox (Tabella 2 e Fig. 2, 3, 4, 5 e 6).

L’Aripiprazolo ed il Preclamolo sono risultati essere i ligandi rispettivamente più potente e meno potente nello stimolare il 

recettore D2.

Tabella 2: Influenza degli antipsicotici sull’attività dell’adenilato ciclasi V/VI indotta con Forskolina.

D2L + AC­V/VI

IC50 (nM)

(Emax, %)

D2L + D3 + AC­V/VI

IC50 (nM)

( Emax, %)

D3 + AC­V/VI

IC50 (nM) 

( Emax, %)

Quinpirole2.1 ± 0.5

(48.4 ± 1.89)

1.47 ± 0.71

(43.2 ± 3.33)No inhibition

Aripiprazole4.46 ± 0.73

(18.9 ± 0.53)No inhibition No inhibition

Bifeprunox21.5 ± 4.3

(23.3 ± 0.94)No inhibition No inhibition

N­DMC173 ± 35.3

(22.8 ± 0.92)No inhibition No inhibition

S 3359216.7 ± 8.8

(18.1 ± 1.89)No inhibition No inhibition

Preclamol97.4 ± 40.6

(16.3 ± 1.29)No inhibition No inhibition

52

0 ,0 1 0 ,1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0

50

60

70

80

90

100

110

67891011

 D2L + D3 D2LcA

MP 

accu

mul

atio

n(%

 of 

FK­s

tim

ulat

ed)

Quinpirole ­log[M]

Figura 1: Effetto inibitorio del quinpirolo sull’attività dell’AC V/VI stimolata con forscolina in cellule COS 7 transfettate con il  solo recettore D2L o cotransfettate con entrambi i recettori D2L e D3.

Tutti i farmaci sono stati poi testati su cellule co­transfettate con i recettori D2 e D3. Il Quinpirolo ha avuto un potente 

effetto inibitorio sull’AC V/VI con una potenza paragonabile a quella osservata nelle cellule transfettate con il solo recettore 

D2 (Tabella 2 e Fig. 1). Questo effetto sui recettori D2 e D3 cotransfettati è stato osservato anche con altri agoisti pieni 

quali il Pergolide, il pramipexolo, il Ropinirolo e lo S32504 ( Maggio et al, 2003 ) (Table 3).

53

Tabella 3 : Influenza di alcuni agonisti dopaminergici sull’attività dell’AC V/VI In cellule COS 7 co­transfettate con i recettori  D2 e D3 e su cellule COS  7  transfettate e con il solo D2

Aripiprazolo, S33592, Bifepronux, NMDC e Preclamolo invece non hanno inibito l’attività dell’AC V/VI in cellule transfettate 

con D2 e D3 questo in contrasto con le loro proprietà di agonisti parziali in cellule transfettate con il solo recettore D2 

(Tabella 2 e Fig. 2, 3, 4, 5 e 6).

0 ,0 1 0 ,1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 070

80

90

100

110

67891011

 D2L + D3 D2LcA

MP 

accu

mul

atio

n(%

 of 

FK­s

timul

ated

)

Aripiprazole ­log[M]

D2L + AC­V/VI

IC50 (nM) [Emax, %]

D2L + D3 + AC­V/VI

IC50 (nM) [Emax, %]

S 32504 49.5 [38.2]  1.50 [40.9]

Pramipexolo 21.5 [43.3] 1.98 [52]

Ropinirole 75.5 [33] 3.89 [49.4]

Pergolide 7.86 [30.2] 4.31 [40.7]

54

Figura 2 : effetto dell’aripiprazolo rispettivamente su cellule COS 7 transfettate con il recettore D2 e  su celluleCOS 7  cotransfettate con entrambi i recettori D2 e D3.

0 ,0 1 0 ,1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 070

80

90

100

110

 D2L + D3 D2L

67891011

cAM

P ac

cum

ulat

ion

(% o

f FK

­stim

ulat

ed)

S33592 ­log[M]

Figura 3 : effetto dell’S33592  rispettivamente su cellule COS 7 transfettate con il recettore D2 e  su celluleCOS 7  cotransfettate con entrambi i recettori D2 e D3.

55

0 ,1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 070

80

90

100

110

67891011

 D2L + D3 D2LcA

MP 

accu

mul

atio

n(%

 of 

FK­s

timul

ated

)

Preclamol ­log[M]

Figura 4 : effetto del Preclamolo  rispettivamente su cellule COS 7 transfettate con il recettore D2 e  su celluleCOS 7  cotransfettate con entrambi i recettor D2 e D3.

56

0 ,1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 070

80

90

100

110

67891011

 D2L + D3 D2LcA

MP 

accu

mul

atio

n(%

 of 

FK­s

tim

ulat

ed)

N­Desmethyl Clozapine ­log[M]

 Figura 5 : effetto dell’N­Desmetil Clozapina  rispettivamente su cellule COS 7 transfettate con il recettore D2 e  su  celluleCOS 7  cotransfettate con entrambi i recettori  D2 e D3.

57

4.3 INFLUENZA   DEGLI   ANTIPSICOTICI     SULL’ATTIVITA'   DELL’AC   V/VI   STIMOLATA   CON 

FOESKOLINA   IN   CELLULE  COS­7   COTRANSFETTATE  CON  I  RECETTORI   D2  E   D3  E 

TRATTATE CON QUINPIROLO.

Come  descritto   sopra,   il   quinpirolo   inibisce   l’attività   dell’AC   V/VI   stimolata   con   Forskolina   sia   in   cellule   transfettate 

solamente con D2 che in cellule cotransfettate con D2 e D3. Alla concentrazione di 10 nM l’inibizione che si ottiene è di  

circa 40 %.

Coincubando l’Aripiprazolo con il quinpirolo 10 nM in cellule transfettate con il solo recettore D2 si è avuta una parziale 

riduzione   dell’effetto   inibitorio   del   quinpirolo   senza   però   avere   una   completa   abolizione   dell’inibizione.   In   pratica 

l’aripiprazolo comportandosi da agonista parziale ha prima ridotto  l’effetto del  quinpirolo e a saturazione ha stimolato 

parzialmente il recettore D2 (Fig. 6).

0 ,0 1 0 ,1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 050

60

70

80

90

100

110

Quinpirole 10 nM

10 678

 

 

9

cAM

P a

ccum

ulat

ion

[% F

K­s

tim

ulat

ed]

Aripiprazole ­log[M]

 D2L D2L + D3

58

Figura   6   :   Riduzione   dell’effetto   inibitorio   del   quinpirolo   in   cellule   transfettate   con   il   solo   recettore   D2   e   in   cellule  cotransfettate con i recettori D2 e D3 da parte dell’aripiprazolo.

In cellule cotransfettate con entrambi i recettori D2 e D3, gli effetti inibitori del quinpirolo sono stati aboliti dall’aripiprazolo. 

Questo è dovuto al fatto che come osservato nel paragrafo precedente, l’aripiprazolo sui recettori D2 e D3 co­transfettati si 

comporta come un antagonista invece che come un agonista parziale. Effetti  simili  si sono osservati con  il composto 

S33592.  Quindi  anche con questo composto,  in  cellule  transfettate  con  il  solo  D2 si  è  avuta una  inibizione parziale 

dell’effetto  inibitorio del quinpirolo, mentre    in cellule cotransfettate con D2 e D3 il  S33592 ha completamente  inibito 

l’effetto del quinpirolo (Fig. 7).

0 ,0 1 0 ,1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 050

60

70

80

90

100

110

Quinpirole 10 nM

10 678 

 

9

cAM

P a

ccum

ulat

ion

[% F

K­s

tim

ulat

ed]

S 33592 ­log[M]

 D2L D2L + D3

59

Figura 7  :  Inibizione da parte  dell’S33592 dell’effetto   inibitorio  del  Quinpirolo  su cellule   transfettate  con  il   solo  recettore D2 e su cellule cotransfettate con i recettori D2 e D3.

60

4.4 INFLUENZA   DEGLI   ANTIPSICOTICI   SULL’ATTIVITA'   DELL’ADENILATO   CICLASI   V/VI 

STIMOLATA CON FORSKOLINA IN CELLULE COS­7  TRANSFETTATE CON I RECETTORI 

CHIMERICI FRAMMENTATI D2TRUNK/D3TAIL E D3TRUNK/D2TAIL

In  cellule  cotransfettate  con  i   frammenti   trunk e  tail  dei   recettori    dopaminergici  D2  e  D3:    D2TRUNK e D3TAIL  O 

D3TRUNK eD2TAIL, il quinpirolo ha inibito marcatamente l’attività dell’ AC V/VI stimolata con Forskolina.

Al contrario del quinpirolo, aripiprazolo, S33592, bifeprunox e NMDC non hanno inibito l’attività dell’ AC V/VI stimolata con 

Forskolina in cellule cotransfettate con i frammenti recettoriali D2TRUNK/D3TAIL O D3TRUNK/D2TAIL (Fig.8).

61

Inoltre   tutti   questi   composti   alla   concentrazione   di   100   nM   hanno   inibito   l’effetto   agonista     del   quinpirolo   10   nM 

comportandosi   da   antagonisti   (fig.9). 

FK Quinp. Aripip. S33592 Precla. Bifep. NDMC60

70

80

90

100

110

120

 

 

 

cAM

P ac

cum

ulat

ion

(% o

f FS

­stim

ulat

ed)

 D2trunk/D3tail D3trunk/D2tail

62

figura  8: Attività  del  quinpirolo e degli  antipsicotici  su cellule COS 7 cotransfettate con  i   recettori  D2TRUNK e  D3TAIL  o D3TRUNK eD2TAIL.

Cont. Quin. Quin. + Quin. + Quin. + Quin. + Quin. +60

70

80

90

100

110

120

NDMCBifep.Precla.S33592Aripip.

 

 

 

cAM

P ac

cum

ulat

ion

(% o

f FS

­stim

ulat

ed)

 D2trunk/D3tail D3trunk/D2tail

figura 9: Attività degli antipsicotici alla concentrazione di 100 nM coincubati con quinpirolo 10 nM  su cellule COS 7  cotransfettate con i recettori D2TRUNK e D3TAIL  o D3TRUNK eD2TAIL.

4.5 INFLUENZA   DEGLI   ANTIPSICOTICI   SULL’ATTIVITA'   DELL’ADENILATO   CICLASI   V/VI 

STIMOLATA CON FORSKOLINA IN CELLULE COS­7 TRANSFETTATE CON IL RECETTORE 

D2L ED IL RECETTORE CHIMERICO D3i3(D2)

In questa serie di studi abbiamo impiegato un recettore D3 modificato , il D3i3(D2) in cui il segmento carbossiterminale del 

terzo loop citoplasmatico è stato scambiato con la sezione equivalente del recettore D2l.

63

Questa alterazione incrementa marcatamente l’efficacia di accoppiamento del recettore D3 alla proteina G, senza però 

alterare il profilo di binding del recettore wild type (Filteau et al,1999 ).

Nelle cellule transfettate col recettore D3i3(D2), in contrasto al recettore D3 wild type, il quinpirolo sopprime l’attività dell’ 

AC V/VI stimolata con Forskolina con un’efficacia del 35 %  e questo effetto è simile a quello ottenuto sul recettore D2l 

(Tabella 4 e Fig. 10).

Tabella  4:  Influenza  degli   antipsicotici   sull’attivita'   dell’adenilato   ciclasi  V/VI   stimolata   con   forskolina   in   cellule  transfettate con il recettore D2l ed il recettore chimerico D3i3(D2)

D2L + AC­V/VI

IC50 (nM)

(Emax, %)

D2L + D3/D2i3 + AC­V/VI

IC50 (nM)

( Emax, %)

D3/D2i3 + AC­V/VI

IC50 (nM)

( Emax, %)

Quinpirole1.4 ± 0.25

(41.4 ± 1.0)

1.5 ± 0.21

(45.3 ± 1.3)

1.6 ± 0.45

(34.6 ± 0.98)

Aripiprazole3.6 ± 1.9

(19.3 ± 1.4)

4.6 ± 1.4

(24.8 ± 1.1)

2.2 ± 0.78

(18.7 ± 0.9)

S3359212.1 ± 4.05

(18.8 ± 1.22)

14.1 ± 1.11

(21.4 ± 0.33)

21.7 ± 4.45

(19.6 ± 0.8)

64

0 ,0 1 0 ,1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0

50

60

70

80

90

100

110

67891011

 D2L D2L + D3­i3D2 D3­i3D2

cAM

P ac

cum

ulat

ion

(% o

f FK

­stim

ulat

ion)

Quinpirole ­log[M]

Figura 10: Attività del Quinpirolo sull’attivita' dell’adenilato ciclasi V/VI stimolata con forskolina in cellule COS 7  cotransfettate con il recettore D2l ed il recettore chimerico D3i3(D2), in cellule transfettate con il D3i3(D2) ed in cellule  

transfettate con il D2.

Anche l’Aripiprazolo e l’S33592 su questo recettore mutato inducono una marcata riduzione dell’incremento dei livelli di 

cAMP (Tabella 4 e Fig. 12 e 13).

65

0 ,0 1 0 ,1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 070

80

90

100

110

67891011

 D2L D2L + D3­i3D2 D3­i3D2

cAM

P ac

cum

ulat

ion

(% o

f FK

­sti

mul

atio

n)

Aripiprazole ­log[M]

Figura 11:    Attività  dell’  Aripiprazolo    sull’attivita'  dell’adenilato  ciclasi  V/VI  stimolata con  forskolina  in  cellule  COS 7  cotransfettate con il recettore D2l ed il recettore chimerico D3i3(D2), in cellule transfettate con il D3i3(D2) ed in cellule  transfettate con il D2.

0 ,0 1 0 ,1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 070

80

90

100

110

67891011

 D2L D2L + D3­i3D2 D3­i3D2

cAM

P ac

cum

ulat

ion

(% o

f FK

­stim

ulat

ion)

S 33592 ­log[M]

66

Figura   12:    Attività   dell’S33592   sull’attivita'   dell’adenilato   ciclasi   V/VI   stimolata   con   forskolina   in   cellule   COS   7  cotransfettate con il recettore D2l ed il recettore chimerico D3i3(D2), in cellule transfettate con il D3i3(D2) ed in cellule  transfettate con il D2.

 Lo stesso effetto dei tre agonisti si è osservato in cellule co­transfettate con i recettori D2l e D3i3(D2)  (Tabella 4 e Fig. 

11, 12 e 13).

Quindi la potenza e l’efficacia dei tre ligandi sono comparabili sia in cellule transfettate con i soli D2l o D3i3D2 e sia in 

cellule cotransfettate con entrambi i recettori. 

Anche Bifeprunox, NDMC e Preclamolo hanno mostrato la stessa attività inibitoria sull’AC V/VI in cellule trasfettate o co­

transfettate con i recettori D2l e D3i3(D2) (Tabella 4 e Fig. 13).

60

80

100

120

D3­i3D2D2L + D3­i3D2D2L  

 

 

cAM

P ac

cum

ulat

ion

(% F

K­s

timul

ated

)

 Control   Quinpirole   Aripip.   S33592 Preclamol   Bifeprunox   NDMC

67

Figura 13: influenza degli antipsicotici sull’attivita' dell’adenilato ciclasi v/vi stimolata con forskolina in cellule COS 7 cotransfettate con il recettore D2l ed il recettore chimerico D3i3(D2) e in cellule transfettate con il solo D2l o con il solo D3i3(D2).

68

4.6  ESPERIMENTI SU CELLULE CHO STABILMENTE TRANSFETTATE CON I RECETTORI D2 

E D3

Alcuni esperimenti sono stati ripetuti su cellue stabilmente transfettate con i soli recettori D2 e D3 e cotransfettate con 

ambedue i recettori. 

Il motivo per il quale si sono ripetuti alcuni esperimenti su queste cellule è dovuto al fatto che l’espressione recettoriale in 

queste cellule è stabile e non varia da trasfezione a trasfezione.

In questo sistema cellulare abbiamo provato l’attività agonista parziale dell’aripiprazolo e del S33592. Le Fig. 15 e 16 

dimostrano chiaramente che anche in queste cellule l’effetto agonista parziale è presente solo nelle cellule CHO­D2L 

mentre non è presente nelle cellule CHO­D3 e CHO­D2L/D3.

Figura14: Effetto dell’Aripiprazolo su cellule CHO transfettate stabilmente con i recettori D2l o D3 o cotransfettate  stabilmente con entrambi i recettori.

69

0 ,0 1 0 ,1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 070

80

90

100

110

67891011

 D2L D2L + D3 D3

cAM

P ac

cum

ulat

ion

(% o

f FK

­stim

ulat

ion)

Aripiprazole ­log[M]

Figura 15:Effetto dell’S33592  su cellule CHO transfettate stabilmente con i recettori D2l o D3 o cotransfettate  stabilmente  con entrambi i recettori.

70

0 ,0 1 0 ,1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 070

80

90

100

110

67891011

 D2L D2L + D3 D3

cAM

P ac

cum

ulat

ion

(% o

f FK

­stim

ulat

ion)

S 33592 ­log[M]

5. DISCUSSIONE

In lavori precedenti (Scarselli et al,2001: Maggio et al,2003) è stato osservato come S32504, Pramipexolo, Ropinirolo e 7­

OH­DPAT, agonisti per i recettori D2, inibiscano l’attività dell’ AC V/VI  stimolata con Forskolina  con maggiore potenza in 

cellule cotrasfettate con i recettori D2l e D3. 

Essendo questa isoforma di AC non stimolabile dal recettore D3, questo incremento della potenza degli agonisti è stato 

interpretato con la formazione di eterodimeri D2l/D3.

In  questo  lavoro,  al  contrario,   alcuni  agonisti  parziali  per   il   recettore D2 come Aripiprazolo,  S33592,  Bifeprunox,  N­

Desmetilclozapina e Preclamolo hanno dato risultati differenti, si è osservato infatti un mancato effetto di questi composti 

sulle cellule co­transfettate con i recettori D2 e D3.

5.1 PROFILI DI BINDING DEGLI ANTIPSICOTICI SUI RECETTORI D2 E D3 : confronto tra le 

affinità degli antipsicotici per i siti recettoriali D2l e D3

L’aripiprazolo ha mostrato di possedere una forte affinità per il recettore D2l , mentre la sua affinità per i siti D3 è circa 

dieci volte più bassa, un valore che coincide con l’affinità  valutata precedentemente (9.0 e 9.1 nM). L’aripiprazolo mostra 

quindi di avere preferenza per il sito D2l  rispetto al D3. Il Bifeprunox  ha mostrato una maggiore affinità per il D3 rispetto al 

D2L.

Per quanto riguarda  l’NMDC, sono state osservate  in precedenti  studi  (Burnstein et  al,2005)  affinità  di  89 e 153 nM 

rispettivamente per i siti hD2s e D3 espressi in cellule NIH­737 . Nel presente studio sono stati osservasti dati in linea con 

quelli ottenuti da Burnstein, infatti, le affinità osservate sono di 73 e 153 nM rispettivamente per i siti hD2l e D3.

Per il Preclamolo l’affinità per il recettore hD2l (in cellule CHO) è di norma compresa tra 300 e 1000 nM e il valore che  

abbiamo ottenuto è di 273 nM , in accordo con questo range.

Inoltre   l’affinità   del   preclamolo   per   il   sito   D3   è   comparabile   con   quella   ottenuta   da  Chio   et   al   (1993)  impiegando 

[3H]Spiroperidolo (330nM).

Infine l’affinità dell’S33592   per il sito D2l (29 nM), è simile a quella osservata per tale sito espresso da cellule CHO 

(39nM) (Gobert et al,2000).

Utilizzando [3H]Spiperone, S33592 è più potente sul sito hD3 (11nM) (Gobert et al,2000)   di quanto osservato in questo 

lavoro e la ragione non è ancora chiara.

71

5.2  AZIONE DEGLI ANTIPSICOTICI SUL RECETTORE D2L

L’azione dell’aripiprazolo sui recettori D2L e D2s dipende da diversi   fattori quali  il  segnale  intracellulare,  il  sistema di 

espressione,   la   densità   dei   recettori   e   altri   fattori  (Lawler   et   al,1999;Burris   et   al,2002;Shapiro   et   al,2003;Aihara   et  

al,2004;Burstein et al,2005;Tadori et al,2005).

I   nostri   dati   estendono   queste   osservazioni   mostrando   come   l’aripiprazolo   si   comporti   come   agonista   parziale 

relativamente al quinpirolo in cellule COS 7 che esprimono il recettore D2.

Per il Bifeprunox  non sono disponibili molte informazioni del suo profilo farmacologico, comunque è stata documentata un 

azione di agonista parziale sulla ciclasi, in cellule CHO transfettate con il D2, e un’azione di agonista parziale sempre sul 

recettore D2 per la stimolazione delle MAP­ Kinasi (Van Vliet et al,2000; Bruins Slot et al, 2006).

Il   Bifeprunox   sembra   essere   molto   più   efficace   dell’aripiprazolo   come   agonista   parziale,   questa   osservazione   è 

comparabile con i nostri risultati dove il Bifeprunox sembra essere molto più efficiente dell’aripiprazolo nel l’inibire   l’AC 

V/VI co­transfettata con il recettore D2L.

Un recente studio ha dimostrato le proprietà di agonista parziale dell’NMDC sui recettori hD2s costitutivamente attivati  in 

cellule NIH­3T3 in cui la proteina G o era stata sovraespressa α (Burstein et al, 2005). Inpiegando un protocollo diverso, 

nel presente studio abbiamo approfondito l’azione di agonista parziale dell’NMDC sul recettore D2. L’NMDC nel nostro 

studi è risultato essere un agonista parziale ma in accorso allo studio precedente la sua potenza è risultata minore di 

quella dell’aripiprazolo.

Sempre in analogia con studi precedenti il nostro studio ha mostrato che l’agonista parziale Preclamolo era meno potente 

dell’agonista parziale aripiprazolo.

Il  presente studio  tuttavia  è   il  solo,  a differente di  quelli   fatti   in  precedenza, che paragona direttamente aripiprazolo, 

bifeprunox, NMDC e preclamolo, e dimostra  la loro azione di agonisti parziali per i recettori D2.

Il  nostro studio ha inoltre compreso il  composto S33592. Questo  ligando è stato precedentemente studiato per il  suo 

effetto di  agonista  parziale  per   il   recettore D2 accoppiati  a  Gi/o  e per  la  MAP­Kinasi.   Inoltre  è   stato  studiato   il  suo 

meccanismo di agonista parziale sui recettori D2 cerebrali che controllano il rilascio di prolattina (Gobert et al,2000).

72

5.3   PROFILI   DI   BINDING   DEGLI   ANTIPSICOTICI   TESTATI   SUI   RECETTORI   CHIMERICI 

D2TRUNK/D3TAIL E D3TRUNK/D2TAIL

I   profili   farmacologici   degli  antipsicotici   sui   recettori   frammentati   chimerici  D2trunk/D3tail   e  D3trunk/D2tail   sono  stati 

considerati  in parallelo con  i profili   farmacologici dei recettori D2L e D3. Le affinità di Aripiprazolo e Bifeprunox sono 

risultate maggiori rispetto a S33592 e NMDC e acnor di più rispetto al Preclamolo che è stato il farmaco che ha mostrato 

una minore potenza.

Le attività di questi farmaci sui recettori chimerici frammentati suggeriscono che essi potrebbero svolgere una funzione su 

eterodimeri D2/D3 formati in seguito al meccanismo di domain swapping tra i recettori D2 e D3.

5.4 AZIONI FUNZIONALI DEGLI ANTIPSICOTICI SUI RCETTORI D2L E D3 COTRANSFETTATI E 

SUI RECETTORI CHIMERICI FRAMMENTATI D2TRUNK/D3TAIL E D3TRUNK/D2TAIL

S33592, aripiprazolo, bifeprunox, NMDC e preclamolo  sono risultati   tutti inattivi   in cellule cotransfettate con i recettori 

D2L e D3. Questa mancata funzione è stata osservata sia in cellule COS 7 trasfettate transientemente che in cellule CHO 

transfettate stabilmente. Inoltre gli stessi composti hanno mostrato una mancata attività a livello dei recettori chimerici 

frammentati D2trunk/D3tail  e  D3trunk/D2tail.

Siccome sia l’aripiprazolo che gli altri agonisti perdono efficacia funzionale in cellule cotransfettate con i recettori D2 e D3, 

sembrerebbe che la maggior parte dei recettori D2, venga reclutata dai recettori D3 nella formazione di eterodimeri.

5.5   AZIONE   DEGLI   ANTIPSICOTICI   SU   CELLULE   TRANSFETTATE   CON   IL   RECETTORE 

CHIMERICO D3i3(D2) E SU CELLULE COTRANSFETTATE CON IL RECETTORE D2L E CON IL 

D3i3(D2)

Nel recettore chimerico D3i3(D2), 12 aminoacidi all’estremità carbossi terminale del recettore D3 sono sostituiti con la 

corrispondente sequenza aminoacidica del recettore D2.

Questo   mutante   così   costruito   mantiene   il   profilo   farmacologico   del   recettore   D3   wild­type,   ma   contrariamente   a 

quest’ultimo è funzionalmente attivo.

In accordo con questa sua capacità funzionale, Aripiprazolo, S33592, Bifepronux, NMDC, e Preclamolo, si comportano su 

questo recettore come agonisti parziali.

73

Chiaramente questi ligandi possiedono una significativa, sebbene sub­massimale, attività intrinseca anche sui recettori D3 

anche se questa non è statamessa in evidenza nel nostro sistema sperimentale in quanto la capacità di accoppiamento 

alle proteine G del D3 è nel nostro caso inesistete.

Burstein   et   al(2005)   hanno   riportato   le   proprietà   di   agonista   parziale   dell’aripiprazolo   per   il   D3   in   cellule   che 

sovraesprimono la isoforma della proteina G, G /o. Le proprietà di agonista parziale dell’aripiprazolo sul D3 sono stateα  

osservate anche in uno studio  di Shapiro et al, (2003) studiando l’aperura dei canali al potassio. Inoltre, l’aripiprazolo ha 

mostrato attività di agonista parziale sui recettori D3 misurando la fosforilazione di MAP­Kinasi (Gobert et al,2000).

Non sono disponibili   in  letteratura dati  che riguardino  il  bifeprunox,  esso comunque attiva  in modo sub­massimale  il 

recettore hD3 accoppiato alle MAP­Kinasi ( Gobert et al,2000; Mannouri la Cour C and Millan M.J., unpub.obs.) .

Anche NMDC si comporta come agonista parziale sul recettore D3 accoppiato all’ Ac­II ( Shapiro et al,2003), mentre sono 

documentate le azioni di agonista parziale del preclamolo sul recettore hD3 accoppiato all’attivazione dell’adenilato ciclasi 

e alla mitogenesi.

Sulle  cellule  cotransfettate  con  i   recettori  D3i3(D2) e D2L,  Aripiprazolo,  S33592,  bifeprunox,  NMDC e preclamolo si 

comportano   tutti   come   agonisti   parziali     e   sopprimono   l’attività   dell’   AC   V/VI   stimolata   con   Forskolina.   Inoltre, 

analogamente al quinpirolo, sia l’aripiprazolo che l’S33592 hanno mostrato un effetto inibitorio sulle cellule cotransfettate 

con D3i3(D2) e D2L. Questi dati ottenuti utilizzando il  recettore D3i3D2 suggeriscono che il mancato effetto di questi 

agonisti parziali che abbiamo osservato sul recettore D3 dipende dal fatto che questo recettore è debolmente accoppiato 

alle proteine G e quindi nel nostro sistema non era possibile rilevarne la sua funzione. 

74

5.6   POTENZIALE   AZIONE   DEGLI   ANTIPSICOTICI   SUGLI   ETERODIMERI   D3/D2 

NELL’ENCEFALO

Gli autorecettori D3 e D2s colocalizzati nei neuroni dopaminergici controllano la sintesi ed  il rilascio fasico e tonico della 

dopamina , interagendo con la tiroxina idrossilasi , con il meccanismo di liberazione della dopamina e  con i trasportatori 

della dopamina, anche se il loro  rispettivo ruolo rimane indefinito.

Siccome i recettori presinaptici  D2 e D3  sono molto sensibili, l’effetto di ogni agonista parziale sugli eterodimeri D3/D2 è  

difficilmente definibile.

Infatti  Aripiprazolo,  preclamolo,  S33592,  bifeprunox e  NMDC generalmente  attenuano o non  modificano   l’attività  dei 

neuroni dopaminergici nel ratto.

Sebbene   sia   stato   riscontrato   che   l’aripiprazolo   incrementa   il   rilascio   di   dopamina   nella   corteccia   prefrontale   e 

nell’ippocampo ( Li et al,2004), questa azione riflette principalmente il reclutamento di recettori 5­Ht1A (Shapiro et al,2003;  

Newman Tancredi et al, 2005; Bruins Slot et al,2006).

Analogamente l’elevato rilascio di dopamina causato da NMDC riflette largamente la stimolazione dei recettori muscarinici 

M1 ( Li et al,2005) .

Il blocco degli eterodimeri  degli autorecettori D2/D3, può essere interessante in certe condizioni.

I recettori D3 postsinaptici dei gangli basali sono espressi ad alte concentrazioni nei neuroni positivi per la  sostanza P che 

esprimono   anche   recettori   D1   piuttosto   che   nei   neuroni   positivi   per   l’enkefalina   che   esprimono   i   recettori   D2.   La 

somministrazione di L­Dopa cronicamente  induce  l’espressione dei recettori striatali  D3 ( Bordet et al,1997 and 2000; 

Morisette et al,1998; Quik et al,2000).

Inoltre,  insieme ai recettori  D2, i   recettori D3 sono molto rappresentati nel Nucleo Accumbens e  in altre strutture del 

sistema libico, e la loro densità è maggiore nei primati rispetto ai  roditori  (Meador­Woodruff  et al, 1996; Morisette et al, 

1998; Diaz et al, 2000; Quik et al, 2000; Stanwood et al, 2000; Joyce, 2001). Tutte queste considerazioni indicano che la 

probabilità di formazione degli eterodimeri D2 e D3 è maggiore nei primati rispetto ai roditori.

Nell’uomo un aumento nella densità  dei  recettori  D3 mesolimbici è associato alla schizofrenia e all’abuso di  cocaina 

(Staley and Mash, 1996; Gurevich and Joyce, 1997; Segal et al, 1997; Joyce, 2001).

I  modelli  sperimentali  nei roditori,  e nei  primati, sono  i mezzi migliori per dimostrare  l’importanza della formazione di 

eterodimeri D2 e D3 nell’encefalo e il loro ruolo funzionale.

Aripiprazolo, bifeprunox, ed NMDC esercitano la loro azione anche sui recettori 5­HT1A e su altre classi di recettori     in  

75

vivo, complicando così l’interpretazione della loro azione (Shapiro et al, 2003). 

Di conseguenza S33592, che mostra grande selettività per i recettori D2 e D3 (Gobert et al, 2000; Rivet et al, 2000) può 

essere lo strumento sperimentale più appropriato per indagare sul significato degli eterodimeri D2/D3 nel Sistema Nervoso 

Centrale.

76

6.  CONCLUSIONI

Nell’insieme questi  dati  dimostrano che aripiprazolo,  bifeprunox, NMDC, preclamolo e S33592   si  comportano come 

agonisti parziali nei confronti dei recettori dopaminergici D2.

Al contrario questi antipsicotici si comportano come antagonisti quando il recettore D2 viene espresso insieme al recettore 

D3, e questo è dovuto probabilmente alla loro formazione di eterodimeri. 

Sebbene non sia possibile dedurre la precisa azione dei farmaci su popolazioni discrete di recettori D2/D3 nell’encefalo, 

queste scoperte hanno importanti implicazioni.

Quindi l’azione degli antipsicotici come agonisti parziali potrebbe non riflettere una bassa efficacia nella stimolazione dei 

recettori D2 e/o D3   ma, piuttosto, in analogia con altri antipsicotici, potrebbe riflettere il blocco degli eterodimeri D2/D3 

(e/o dei recettori D3) postsinaptici. Questa intrigante ipotesi giustifica ulteriori indagini.

77

7.  BIBLIOGRAFIA

AbdAlla S., Lother H., Massiery A. and Quitterer U. (2001) Increased AT1 receptor heterodimers in preeclampsia mediate 

enhanced angiotensin II responsiveness. Nat. Med. 7 (9), 1003­1009.

Acquas E., Tanda G. and Di Chiara G. (2002) Differential effects of caffeine on dopamine and acetylcholine transmission 

in brain areas of drug­naive and caffeine­pretreated rats. Neuropsychopharmacology 27, 182­193.

Agnati LF, Ferre S, Lluis C, Franco R, Fuxe K (2003). Molecular mechanisms and therapeutical implications of 

intramembrane receptor . receptor interaction among heptahelical receptors with examples from striatopallidal GABA 

neurons. Pharmacol Rev 55: 509–550.

Aihara K, Shimada J, Miwa T, Tottori K, Burris KD, Yocca FD et al (2004). The novel antipsychotic aripiprazole is a partial 

agonist at short and long isoforms of D2 receptors linked to the regulation of adenylyl cyclase activity and prolactin release. 

Brain Res 1003: 9­17.

Asghari V., Schoots O., Van Kats S., Ohara K., Jovanovic V., Guan H.C., Bunzow J.R., Petronis A., and Van Tol H.H.M. 

(1994) Dopamine D4  receptor repeat: analysis of different native and mutants forms of the human and rat genes.  Mol.  

Pharmacol. 46, 364­373.

Avidor­Reiss   T.,   Bayewitch   M.,   Levy   R.,   Matus­Leibovitch   N.,   Nevo   I.   and   Vogel   Z.   (1995)   Adenylyl   cyclase 

supersensitization in  ­opioid receptor­transfected Chinese hamster ovary cells following chronic opioid treatment. J. Biol.  

Chem. 270, 29732­29738.

 

Bai M., Trivedi S. and Brown E.M., (1998) Dimerization of the extracellularcalcium­sensing receptor (Ca++R) on the cell 

surface of Ca++R­transfected HEK 293 cells. J. Biol. Chem. 273, 23605­23610.

Bassareo V. and Di Chiara G. (1999) Modulation of feeling­induced activation of mesolimbic dopamina transmission by 

appetitive stimuli and its relation to motivational state. Eur. J. Neuro. 11, 4389­4397.

78

Bordet R, Ridray S, Carboni S, Diaz J, Sokoloff R, Schwartz JC (1997). Induction of dopamine D3 receptor expression as a 

mechanism of behavioral sensitization to Levodopa. Proc Natl Acad Sci USA 9: 3363­3367.

Bordet R, Ridray S, Schwartz JC, Sokoloff P (2000). Involvement of the direct striatonigral pathway in levodopa­induced 

sensitization in 6­hydroxydopamine­lesioned rats. Eur J Neurosci 12: 2117­2123.

Bertorello A.M., Hopfield J.F., Aperia A. and Greengard P. (1990) Inhibition by dopamine of (Na+/K+) ATPasi activity in 

neostriatal neurons through D1 and D2 receptor synergism. Nature 347, 386­388.

Bockaert J. and Pin J. (1999) Molecular tinkering of G protein­coupled receptors: An evolutionary success. EMBO J. 18 

(7), 1723­1729.

Bouvier M. (2001) Oligomerization of G­protein­coupled transmitter receptors. Nat. Rev. Neurosci. 2 (4), 274­286.

 Bruins Slot LA, De Vries L, Newman­Tancredi A, Cussac D (2006). Differential profile of antipsychotics at serotonin 5­HT1A 

and dopamine D2S receptors coupled to extracellular signal­regulated kinase. Eur J Pharmacol, in press.

Burris KD, Molski T, Xu C, Ryan E, Tottori K, Kikuchi T et al (2002). Aripiprazole, a novel antipsychotic, is a high affinity 

partial agonist at human dopamine D2 receptors. J Pharmacol Exp Ther  302: 381­389.

Burstein E.S., Spalding T.A., and Brann M.R. (1998) The second intracellular loop of the M5 muscarinic receptor is the 

switch which enable a G­protein coupling. J. Biol. Chem. 273, 24322­24327.

Burnstein ES, Ma J, Wong S, Gao Y, Pham E, Knapp AE et al (2005). Intrinsic efficacy of antipsychotics at human D2, D3, 

and D4 dopamine receptors: identification of the clozapine metabolite N­desmethylclozapine as a D2/D3 partial agonist. J  

Pharmacol Exp Ther 315: 1278­1287.

Butkerait  P.,  Zheng  Y.  and  Hallak  H.   (1995)  Expression  of   the human 5­hydroxytriptamine  A1  receptor   in  Sf9   cells: 

reconstitution of a coupled phenotype by coexpression of a mammalian G proteins subunits. J. Biol. Chem. 270, 18691­

79

18699.

Cai   G.,   Zhen   X.,   Uryu   K   and   Friedman   E.   (2000)   Activation   of   Extracellular   Signal­Regulated   Protein   Kinases   Is 

Associated   with   a   Sensitized   Locomotor   Response   to   D2  Dopamine   Receptor   Stimulation   in   Unilateral   6­

Hydroxydopamine­Lesioned Rats. J. Neuro. 20 (5), 1849­1857.

Calabresi P., Maj R., Mercuri N.B. and Bernardi G. (1992) Coactivation of D1  and D2  receptors is required for longterm 

synaptic depression in the striatum. Neurosci. Lett. 142, 95­99.

Charles A.  et  al.   (2003)  Coexpression of   ­opioid   receptors with   ­receptors  in  GHδ μ 3  cells  changes  the  functional 

response to  ­agonists from inhibitory to excitatory. μ Mol. Pharm. 63 (1), 89­95.

Cheng Y.C. and Prusoff W.H. (1973) Relationship between the inhibition constant (K i) and the concentration of per cent 

inhibition (IC50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22, 3099­3108.

 Chio CL, Lajiness ME, Huff RM (1993). Activation of heterologously expressed D3 dopamine receptors: comparison with 

D2 dopamine receptors. Am Soc Pharmacol Exp Ther 45: 51­60.

Chio C.L., Lajiness M.E. and Huff R.M. (1994) Activation of heterologously expressed D3 dopamine receptors: comparison 

with D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 45, 51­60.

Cichon S., Nothen M.M., Stober G., Schroers R., Albus M., Maier W., Rietschel M., Korner J., Weigelt B., Franzek E.,  

Wildenauer D., Fimmers R. and Propping P. (1996) Systenmatic screening for mutations in the 5’­regulatory region of the 

human dopamine D1  receptor (DRD1) gene in patients with schizophrenia and bipolar affective disorder.  Am. J. Med.  

Genet. 67,424

Civelli O., J.R. Bunzow, and D.K. Grandy (1993) Molecular diversity of the dopamine recptors.  Annu. Rev. Pharmacol.  

80

Toxicol. 32, 281­307.

Clementi C. e Fumagalli G. (1999) Farmacologia generale e cellulare. UTET

Conklin B.R., Farfel Z., Lustig K.D., Julius D. and Bourne H.R. (1993) Substitution of three aminoacids switches receptor 

specificity of Gq  to that of a Gi . Nature 363, 274­276.

Conklin B.R., Herzmark P., Ishida S., Voyno­Yasenetskaya T.A., Sun Y., Farfel Z. and Bourne H.R. (1996) Carboxylterminal 

mutation of Gq  and Gs  that alter the fidelity of receptor activation. Mol. Pharmacol. 50, 885­890.

Corsini   G.U.,   Maggio   R.   and   Vaglini   F.   (2002)   Moleular   and   cellular   events   regulating   dopamine   neuron   survival. 

Handbook of Exp.Pharm. 154 (II),321­386

Crocq M.A., Mant R., Asherson P., Williams J., Hode Y., Mayerova A., Collier D., Lannfelt L., Sokoloff P., Schwartz J.C. 

(1992) Association between schizophrenia and Homozygsity at the dopamine D3 receptor gene. J. Med. Genet. 29, 858

Cullen B.R. (1987) Use of eukaryotic expression technology in the functional analysis of cloned genes. Methods Enzymol.  

152, 684­704.

Cvejic   S.,   and   Devi   L.A.   (1997)   Dimerization   of   the   delta   opioid   receptor,   implications   for   a   function   in   receptor 

internalization. J. Biol. Chem. 272, 26959­26964.

Dal Toso R., Sommer B., Ewart M., Herb A., Pritchett D.B., Bach A., Shivers B.D. and Seeburg P.H. (1989) The dopamine 

receptor: two molecular forms generated by alternative splicing. EMBO J. 8, 4025­4034.

De Camilli P., Macconi D. and Spada A. (1979) Dopamine inhibits adenylate cyclase in human prolactin­secreting pituitary 

adenomas. Nature 278, 252­254.

81

Diaz L,  Pilon  C,  Le Foll  B,  Gross C,  Triller  A,  Schwartz  JC  et  al  (2000).  Dopamine D3  receptors  expressed by  all 

mesencephalic dopamine neurons. J Neurosci 20: 8677­8684.

Eason M.G., Kurose H., Holt B.D., Raymond J.R. and Ligget S.B. (1992) Simultaneous coupling of  2­adrenergic receptors 

to two proteins with opposing effect: subtypes selective coupling of  2c2 adrenergic receptors to Gi and Gs. J. Biol. Chem. 

267, 15795­15801.

Eason M.G. and Ligget S.B. (1995) Identification of a Gs  coupling domain in the amino terminus of the third intracellular 

loop of the  2A adrenergic receptor. J. Biol. Chem. 270, 24753­24760.

Enjalbert A. and Bockaert J. (1983) Pharmacological characterization of the D2 dopamine receptor negatively coupled with 

adenylate cyclase in rat anterior pituitary. Mol. Pharmacol. 53, 576­584.

Filteau F.,  Veilleux F. and Lévesque D.  (1999) Effects of reciprocal  chimeras between  the C­terminal portion of  third 

intracellular loops of the human dopamine D2 and D3 receptors. FEBS Lett. 447, 251­256.

Fishburn C.S., Belleli D., David C., Carmon S. and Fuchs S. (1993) A novel short isoform of the D3 dopamine receptor 

generated by alternative splicing in the third cytoplasmic loop. J. Biol. Chem. 268, 5872­5878.

Florio  V.A.  and Sternweiss P.C.   (1985) Reconstitution of   resolved muscarinic  cholinergic   receptors  with  purified GTP 

binding proteins. J. Biol. Chem. 260, 3477­3483.

Freedman S.B., Patel S., Marwood R., Emms F., Seabrook G.R., Knowles M.R. and McAllister G. (1994) Expression and 

pharmacological characterization of the human D3 dopamine receptor. J. Pharmacol. Exp. Ther. 268, 417­426.

Fukushima Y., Asano T., Saitoh T., Anai M., Funaki M., Ogihara T., Katagigi H., Matsuhashi N., Yazaki Y. and Sugano K. 

(1997) Oligomer formation of histamine H2 receptors expressed in Sf9 and COS­7 cells. FEBS Lett. 409, 283­286.

Galvez T., Duthey B., Kniazeff J., Blahos J., Rovelli G., Bettler B., Prézeau L. and Pin J. (2001) Allosteric interactions 

between GB1 and GB2 subunits are required for optimal GABAb receptor function. EMBO J. 20 (9), 2152­2159.

82

Ganz M.B., Patcher J.A., and Barber D.L. (1990) Multiple receptors coupled to adenylyl cyclase regulate Na+/H+ exchange 

indipendent of cAMP. J. Biol. Chem. 265, 8989­8992.

Gelernter J. et al. (1992) the D4 dopamine receptor (DRD4) maps to distal 11p close to HRAS. Genomics 13, 208.

George S.R.,  Lee S.P.,  Varghese G., Zeman P.R., Seeman P.,  Ng G.Y.K. and O’Dowd B.F. (1998) A transmembrane 

domain­derived peptide inhibits D1 dopamine receptor function without affecting receptor oligomerization.  J. Biol. Chem. 

46, 30244­30248.

Gingrich J.A.,  and Caron M.G. (1993) Recent  advances  in  the molecular  biology of dopamine receptors.  Annu. Rev.  

Neurosci. 16, 299­321.

Giros B.,  Sokoloff  P.,  Martres M.P.,  Riou J.F.,  Emorine L.J. and Schwartz J.C.  (1989) Alternative splicing directs the 

expression of two D2 dopamine receptor isoforms. Nature 342, 923­926.

Glatt C.E. and Snyder S.H. (1993) Cloning and expression of an adenylyl cyclase localized to the corpus striatum. Nature  

(Lond.) 361, 536­538.

Gobert A, Rivet JM, Cussac D, Newman­Tancredi A, Lejeune F, Bosc C et al (2000). S33592, a benzopyranopyrrole partial 

agonist at dopamine D2/D3  receptors and potential  antipsychotic agent:  I.  Modulation of dopaminergic transmission  in 

comparison to aripiprazole, preclamol and raclopride. Am Soc Neurosci 26: 274.

Gouldson P.R. and Reynolds C.A.  (1997) Simulation on dimeric peptides evidence for  domain swapping  in G­protein 

coupled receptors. Biochem. Soc. Trans. 25, 1066­1071.

Gouldson P.R.,  Snell C.R. and Reynolds C.A. (1997) A new approach to docking in the  2­adrenergic receptor   which 

exploits the domain structure of G­protein coupled receptors. J. Med. Chem. 40, 3871­3886.

83

Gouldson P.R.,  Snell C.R.,  Bywater R.P., Higgs C. and Reynolds C.A. (1998) Domain swapping in G­protein coupled 

receptor dimers. Protein eng. 11, 1181­1193.

Grandy D.K., Litt M., Allen L., Bunzow J.R., Marchionni M., Makam H., Reed L., Magenis R.E. and Civelli O. (1989) The 

human dopamine D2  receptor gene is located on chromosome 11 at q22­q23 and identifies a  taqI RFLP.  Am. J. Hum.  

Genet. 45, 778.

Grosse R., Schöneberg T., Schultz G. and Gudermann T. (1997) Inhibition of gonadotropin­realising hormone receptor 

signaling by expression of a splice variant of the receptor. Mol. Endocrinol. 11 (9), 1305­1318.

Gurevich   EV,   Joyce   JN   (1999).   Distribution   of   dopamine   D3  receptor   expressing   neurons   in   the   human   forebrain: 

comparison with D2 receptor expressing neurons. Neuropsychopharmacology 20: 60­80.

Havlickova M., Prézeau L., Duthey B., Bettler B., Pin J. and Blahos J. (2002) The intracellular loops of the GB2 subunit are 

crucial for G­protein coupling of the hetrromeric  ­aminobutyrate B receptor. γ Mol. Pharm. 62, 343­350.

Hulme E.C., Birdsall N.J.M. and Buckley N.J. (1990) Muscarinic receptor subtypes.  Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 30, 

633­673.

Jensen A.A.,  Pederson U.B.,  Kiemer A.,  Din N. and Andersen P.H. (1995) Functional   importance of  the carboxyl   tail 

cysteine residues in the human D1 dopamine receptor. J. Neurochem. 65, 1325­1331.

Jones K.A., Boronsky B., Tamm J.A., Craig D.A., Durkin M.M., Dai M., Yao W.J., Jonson M., Gunwaldsen C., Huang L.Y., 

Tang C., Shen Q., Salon J.A., Morse K., Laz T., Smith K.E., Nagarathnam D., Noble S.A., Branchek T.A. and Gerald C. 

(1998) GABAB receptors function as a heterotrimeric assembly of the subunits GABABR1 and GABABR2. Nature 396, 674­

679.

Jordan M., Schallhorn A., Wurm F.M. (1996)Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting 

calcium­phosphate precipitate formation. Nucleic acids research24 ,596­601.

84

Jordan B.A. and Devi L.A. (1999) G­proteins coupled receptor heterodimerization modulates receptor function. Nature 399, 

697­700.

Jordan   B.A.,   Cvejic   S.   and   Devi   L.A.   (2000)   Opioids   and   their   complicated   receptor   complexes. 

Neuropsychopharmacology 23,  NO.S4.

Jordan B.A., Trapaidze N., Gomes I., Nivarthi R. and Devi L. (2001) Oligomerzation of opioid receptors with β2 adrenergic 

receptors: a role in trafficking and mitogen­actived protein kinase activation. PNAS 98, 343­348.

Joyce JN (2001). Dopamine D3 receptors as a therapeutic target for antipsychotic and antiparkinsonian drugs. Pharmacol  

Ther 90: 231­259.

Karpa K.D., Lin R., Kabbani N. and Levenson R. (2000) The dopamine D3 receptor interacts with itself and the truncated 

D3 splice variant D3nf: D3­D3nf interaction causes mislocalization of D3 receptors. Mol. Pharmacol. 58, 677­683.

Kebabian J.W. and Calne D.B. (1979) Multiple receptors for dopamine. Nature 277, 93­96.

Keefe  K.A.  and  Gerfen  C.R.   (1995)  D1­D2  dopamine   receptor   synergy   in   striatum:  effects  of   intrastriatal   infusion  of 

dopamine agonist and antagonist on immediate early gene expression. Neuroscience 66, 903­913.

Kelly M.A., Rubinstein M., Asa S.L., Zhang G., Saez C., Bunzow J.R., Allen R.G., Hnasko R., Ben­Jonathan N., Grandy 

D.K.  and  Low M.J.   (1997)  Pituitary   lactotroph  hyperplasia  and  chronic  hyperprolactinemia  in  dopamine D2  receptor­

deficient mice. Neuron 19, 103­113.

Kobilka B.K.,  Kobilka T.S.,  Daniel  K.,  Regan J.W.,  Caron M.G. and Lefkowitz  R.J.   (1988) Chimeric   2­,   2­adrenergic 

receptors: delineation of domains involved in effector coupling and ligand binding specificity. Science 240, 1310­1316.

Kojima H., Ohmori O., Shinkai T., Terao T., Suzuki T. and Abe H. (1999) Dopamine D1  receptor gene polimorphism and 

85

schizophrenia in Japan. Am. J. Med. Genet. 88, 116.

Kozell L.B., Macida C.A., Neve R.L. and Neve K.A. (1994) Chimeric D1/D2 dopamine receptors. Distinct determinants of 

selective efficacy, potency and signal trasduction. J. Biol. Chem. 269, 30299­30306.

Kunishima N. et al. (2000) Structural basis of glutamate recognition by dimeric metabotropic glutamate receptors. Nature 

407, 971.

Lachowicz J.E. and Sibley D.R. (1997) Chimeric D2/D3 dopamine receptor coupling to adenylyl cyclase. Biochem. Biophys.  

Res. Commun. 237, 394­399.

Landwehrmeyer B., Mengod G. and Palacios J.M. (1992) Dopamine D3 receptor mRNA and binding sites in human brain. 

Mol. Brain Res. 18, 187­192.

Lawler  CP,  Prioleau  C,  Lewis  MM,  Mak C,  Jiang D,  Schetz  JA  et  al  (1999).  Interactions of   the novel  antipsychotic 

aripiprazole (OPC­14597) with dopamine and serotonin receptor subtypes. Neuropsychopharmacology 20: 612­627.

Lerer B. et al. (2002) Pharmacogenetics of tardive dyskinesia: combined analysis of 780 patients supports association with 

dopamine D3 receptor gene Ser9Gly polymorphism. Neuropsycho­pharmacology 27 (1), 105.

Levesque D., Diaz J., Pilon C., Matres M., Giros B., Souil E., Schott D., Morgat J., Schwartz J., and Sokoloff P. (1992) 

Identification, characterization, and  localization of  the dopamine D3  receptor  in rat brain using 7[3H]­hydroxy­N,N­di­n­

Propyl­2­Aminotetrail. PNAS 89, 8155­8159.

Li Z, Ichikawa J, Dai J, Meltzer HY (2004).  Aripiprazole, a novel antipsychotic drug, preferentially increases dopamine 

release in the prefrontal cortex and hippocampus in rat brain. Eur J Pharmacol 493: 75­83.

86

Lichter J.B., Barr C.L., Kennedy J.L, Van Tol H.H.M., Kid K.K. and Livak K.J. (1993) A hypervariable segment in the human 

dopamine D4 (DRD4) gene. Hum. Mol. Genet. 2, 767­773.

Liu K., Bergson C., Levenson R. and Schmauss C. (1994) On the origin of mRNA encoding the truncated dopamine D3­

type receptor D3nf and detection of D3nf­like immunoreactivity in human brain. Yric J. Biol. Chem. 269, 29220­29226.

Liu K. et al. (2000) Direct protein­protein coupling enables cross­talk between dopamine D5 and  ­aminobutyric acid Aγ  

receptor. Nature 403, 274.

Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. and Randhall R.J. (1951) Protein measurement with the Folin Phenol reagent. J.  

Biol. Chem. 193, 265­275.

Maggio R.,  Vogel Z.  and Wess J  (1993a) Coexpression studies with mutant  muscarinic/adrenergic  receptors provide 

evidence for intermolecular “cross­talk” between G­protein­linked receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3103­3107.

Maggio R., Vogel Z. and Wess J. (1993b) Reconstitution of functional muscarinic receptor by co­expression of amino­ and 

carboxyl­terminal receptor fragments. FEBS Lett. 319, 195­200.

Maggio   R.,   Barbier   P.,   Colelli   A.,   Salvadori   F.,   DeMontis   G.   and   Corsini   G.U.   (1999)   G­protein­linked   receptors: 

pharmacological evidence for the formation of heterodimers. J. Pharmacol.  Exp. Ther. 291, 251­257.

Maggio R, Scarselli M, Novi F, Millan MJ, Corsini GU (2003). Potent activation of dopamine D3. D2 heterodimers by the 

antiparkinsonian agents, S 32504, pramipexole and ropinirole. J Neurochem 87: 631­641.

Maggio R, Novi F, Scarselli M, Corsini GU (2005).  The impact of G­protein­coupled receptor hetero­oligomerization on 

function and pharmacology. FEBS J 272: 2936­2946.

Marek K. et al. (2002) Dopamine trasporter brain imaging to assess the effects of pramipexole vs Levodopa on Parkinson 

Disease Progression. JAMA 287 (13), 1653.

87

McDonald   W.M.,   Sibley   D.R.,   Kilpatrick   B.F.   and   Caron   M.G.   (1984)   Dopaminergic   inhibition   of   adenylate   cyclase 

correlates with high affinity agonist binding to anterior pituitary D2 dopamine receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 36, 201­209.

Meador­Woodruff  JH,  Damask SP, Wang J,  Haroutunian V,  Davis KL,  Watson SJ  (1996).  Dopamine receptor  mRNA 

expression in human striatum and neocortex. Neuropsychopharmacology 15: 17­29.

Monnot C., Bihoreau C., Conchon S., Curnow K.M., Corvol P. and Klauser E. (1996) Polar residues in the transmembrane 

domains of the type 1 angiotensin II receptor are required for binding and coupling. Reconstitution of the binding site by 

coexpression of two deficient mutants. J. Biol. Chem. 271, 1507­1513.

Mons N.  and Cooper D.M.F. (1994) Selective expression of one Ca++­inhibitable adenylyl  cyclase  in dopaminergically 

innervated rat brain regions. Mol. Brain Res. 22, 236­244.

Monsma F.J. Jr, McVittie L.D., Gerfen C.R., Mahan L.C., Sibley D.R., Richardson R.M. and Hosey M.M. (1989) Multiple D2 

dopamine receptors produced by alternative RNA splicing. Nature 342,926­929.

Morissette M, Goulet M, Grondin R, Blanchet P, Bedard PJ, Di Paolo T  et al  (1998).  Associative and limbic regions of 

monkey striatum express high  levels of dopamine D3  receptors: effects of MPTP and dopamine agonist  replacement 

therapies. Eur J Neurosci 10: 2565­2573.

Ng   G.Y.K.,   Mouillac   B.,   George   S.R.,   Caron   M.,   Dennis   M.,   Bouvier   M.   and   O’Dowd   B.F.   (1994)   Desensitization, 

phosphorilation and palmitoylation of the human dopamine D1 receptor. Eur. J. Pharmacol. (Mol. Pharmacol. Sect.) 267, 7­

19.

Nielsen S.M.,  Elling  C.E.  and  Schwartz  T.W.   (1998)  Split­receptors   in   the   tachykinin  neurokinin­1   system­mutational 

analysis of intracellular loop 3. Eur. J. Biochem. 251, 217.

88

Nimchinsky E.A., Hof P.R., Janssen W.G.M., Morrison J.H. and Schmauss C. (1997) Expression of dopamine D3 receptor 

dimers and tetramers in brain and in transfected cells. J. Biol. Chem. 272, 29229­29237.

Obadiah J., Avidor­Reiss T., Fishburn C.S., Carmon S., Bayewittch M., Vogel Z., Fuchs S. and Levavi­Sivan B. (1999) 

Adenylyl cyclase  interaction with the D2  dopamine receptor  family:  differential  coupling to Gi,  Gz and Gs.  Cell.    Mol.  

Neurobiol. 19, 653­664.

O’Dowd B.F. (1993) Structure of dopamine receptors. J. Neurochem. 60, 804­816.

Oliveri R.L., Annesi G., Zappia M., Civitelli D., Montesanti R., Branca D., Nicoletti G., Spadafora P., Pasqua A.A., Cittadella 

R., Andreoli V., Gambardella A., Aguglia U. and Quattrone A. (1999) Dopamine D2 receptor gene polymorphism and the 

risk of levodopa­induced dyskinesias in PD. Neurology 53,1425.

Onali P.L., Schwartz J.P. and Costa E. (1981) Dopaminergic modulation of adenylate cyclase stimulation by vasoactive 

intestinal peptide (VIP) in anterior pituitary. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6531­6534.

Onali P.L., Olianas M.C. and Gessa G.L. (1985) Characterization of dopamine receptors mediating inhibition of adenylate 

cyclase activity in rat striatum. Mol. Pharmacol. 28: 138­145.

Palczewski K. et al. (2000) Crystal structure of rhodopsin: a G protein­coupled receptor. Science 28, 739­745.

Park PS, Filipek S, Wells JW, Palczewski K (2004). Oligomerization of G protein­coupled receptors: past, present, and 

future. Biochemistry 43: 15643­15656.

Pfeiffer   M.   et   al.   (2002)   Heterodimerization   of   somatostatin   and   opioid   receptors   cross­modulates   phosphorylation, 

internalization and desensitation. J.Biol.Cem. 277 (22), 19762­19772.

Pilon C., Levesque D., Dimitriadou V., Griffon N., Martres M.P., Schwartz J.C. and Sokoloff P. (1994) Functional coupling of 

the human dopamine D3  receptor in a transfected NG 108­15 nueroblastoma­glioma hybrid cell line.  Eur. J. Pharmacol. 

268, 129­139.

89

Piomelli D., Pilon B., Giros B., Sokoloff P., Matres M.P. and Schwartz J.C. (1991) Dopamine activation of the arachidonic 

acid cascade as basis for D1/D2 receptor synergism. Nature 353, 164­164. 

Pontieri F. and Di Chiara G. (1995) Intravenous cocaina, morphine and amphetamine preferentially increase extracellular 

dopamin in the “schell” as compared with “core” of the rat nucleus accumbens. PNAS 92, 12304­12308.

Potenza M.N., Graminski G.F., Schmauss C. and Lerner M.R. (1994) Functional expression and characterization of human 

D2 and D3 dopamine receptors. J. Neurosci. 14, 1463­1476.

Quik M, Police S, He L, Di Monte DA, Langston JW (2000). Expression of D(3) receptor messenger RNA and binding sites 

in monkey striatum and substantia nigra after nigrostriatal degeneration: effect of Levodopa treatment. Neuroscience 98: 

263­273.

Richardson R.M. and Hosey M.M. (1992) Agonist­induced phosphorylation and desensitization of human M2 muscarinic 

cholinergic receptors in Sf9 insect cells. J. Biol. Chem. 267, 22249­22255.

Ridge K.D., Lee S.S.J. and Yao L.L. (1995) In vivo assembly of rhodopsin from expressed polypeptide fragments. Procl.  

Natl. Acad. Sci. USA 92, 3204­3208.

Rivet JM, Brocco M, Dekeyne A, Dubuffet T, Lavielle G, Millan MJ  (2000). S33592; a benzopyranopyrrole partial agonist 

at   dopamine   D2/D3  receptors   and   potential   antipsychotic   agent:   II.   Functional   profile   in   comparison   to   aripiprazole, 

preclamol and raclopride. Am Soc Neurosci 26: 272.

Robinson SW, Caron MG (1997). Selective  inhibition of  adenylyl  cyclase Type V by  the Dopamine D3  receptor.  Mol  

Pharmacol 52: 508­514.

Romano C., Yang W.L. and O’Malley K.L. (1996) Metabotropic glutamate receptor 5 is a disulfide­linked dimer.  J. Biol.  

90

Chem. 271, 28612­28616.

Saiardi  A.,  Bozzi  Y.,  Baik J.H.  and Borrelli  E.   (1997) Antiproliferative  role of  dopamine  loss  of  D2  receptors causes 

hormonal dysfunction and pituitary hyperplasia. Neuron 19, 115­126.

Scarselli M., Armogida M., Chiacchio S., DeMontis M.G., Colzi A., Corsini G.U. and Maggio R. (2000) Reconstitution of 

functional dopamine D2s receptor by co­expression of amino­ and carboxyl­terminal receptor fragments. Eur. J. Pharmacol. 

397, 291­296.

Scarselli M, Novi F, Schallmach E, Lin R, Baragli A, Colzi A et al (2001). D2/D3 dopamine receptor heterodimers exhibit 

unique functional properties. J Biol Chem 276: 30308­30314.

Shapiro DA, Renock S, Arrington E, Chiodo LA, Liu LX, Sibley DR et al (2003). Aripiprazole, a novel atypical antipsychotic 

drug with a unique and robust pharmacology. Neuropsychopharmacology 28: 1400­1411.

Schinelli S., Paolillo M. and Corona G.L. (1994) Opposing actions of D1­ and D2­ dopamine receptors on arachidonic acid 

release and cyclic AMP production in striatal neurons. J. Neurochem. 62, 944­949.

Schöneberg T., Liu J. and Wess J. (1995) Plasma membrane localization and functional rescue of truncated forms of G­

protein coupled receptor. J. Biol. Chem. 270, 18000­18006.

Schöneberg T., Yun J., Wenkert D. and Wess J. (1996) Functional rescue of mutant V2  vasopressin receptors causing 

nephrogenic diabetes insipidus by a co­expressed receptor polypeptide. EMBO J. 15, 1283­1291.

Schulz   A.,   Grosse   R.,   Schultz   G.,   Gudermann   T.   and   Schöneberg   T.   (1999)   Structural   implication   for   receptor 

oligomerization from functional reconstitution studies of mutant V2 vasopressin receptors. J. Biol. Chem. 275, 2381­2389.

91

Seabrook G.R., Kemp J.A.,  Freedman S.B.,  Patel S., Sinclair H.A. and McAllister G. (1994) Functional expression of 

human D3 dopamine receptors in differentiated neuroblastoma x glioma NG108­15 cells. Br. J. Pharmacol. 111, 391­393.

Seeman P. and Van Tol H.H.M. (1994) Dopamine receptor pharmacology. TIPS Rev. 15, 264­270.

Snyder L.A., Roberts J. and Sealfon S. (1991) Alternative trascripts of the rat and human dopamine D3 receptor. Biochem.  

Biophys. Res. Commun. 180, 1031­1035.

Segal DM, Moraes CT, Mash DC (1997).  Up­regulation of D3  dopamine receptor mRNA in the nucleus accumbens of 

human cocaine fatalities. Brain Res Mol 45: 335­339.

Sokoloff P., Giros B., Martres M.P., Bouthenet M.L. and Schwartz J.C. (1990) Molecular cloning and characterization of a 

novel dopamine receptor (D3) as a target for neuroleptics. Nature 347, 146­151.

Sokoloff P., Andrieux M., Besancon R., Pilon C., Martres M.P., Giros B.

(1992 ) Pharmacology of Human dopamine D3 receptor expressed in mammalian cell line : comparison with D2 receptor. 

European Jurnal of Pharmacology – Molecular Pharmacology section 225, 331­337.

Spano P.F.,  Govoni S. and Trabucchi  M.  (1978) Studies on  the pharmacological  properties of dopamine receptors  in 

various areas of the central nervous system. Adv. Biochem. Psychopharmacol. 19, 155­165.

Spiegel A.M. (1996) Defects in G­protein­coupled signal transduction in human desease. Annu. Rev. Physiol. 58, 143­170.

Staley JK, Mash DC (1996). Adaptive increase in D3 dopamine receptors in the brain reward circuits of human cocaine 

fatalities. J Neurosci 16: 6100­6106.

Stanwood GD, Artymyshyn RP, Ki_ng MP, Kung HF, Lucki I, McGonigle P (2000). Quantitative autoradiographic mapping 

of rat brain dopamine D3 binding with [125I]7­OH­PIPAT: evidence for the presence of D3  receptors on dopaminergic and 

nondopaminergic cell biodies and terminals. J Pharmacol Exp Ther 295: 1223­1231.

92

Sunahara R.K., Guan H.C., O’Dowd B.F., Seeman P., Laurier L.G., George S.R., Torchia J., Van Tol H.H.M. and Niznik H. 

(1991) Cloning a human dopamine receptor gene (D5) with higher affinity for dopamine than D1. Nature 350, 614­619.

Sunahara R.K., Dessauer C.W. and Gilman A.G. (1996) Complexity and diversity of mammalian adenylyl cyclase. Annu.  

Rev. Pharmacol. Toxicol. 36, 461­480.

Surmeier D.J., Wen­Jie S. and Zhen Y. (1996) Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny 

neurons. J. Neurosci. 16, 6579­6591.

Suzuki M., Hurd Y.L., Sokoloff P., Schwartz J.C. and Sedvall G. (1997) D3 dopamine receptor mRNA is widely expressed in 

the human brain. Brain Res. 779, 58­74.

Swarzenski B., Tang Y.J., Oh Y., O'Malley K.L. and Todd R.D. (1994) Morphogenic potentials of   D2, D3, D4  dopamine 

receptors revealed in trasfected neuronal cell lines. PNAS 91, 649­653.

Tadori Y, Miwa T, Tottori K, Burris KD, Stark A, Mori T et al (2005). Aripiprazole’s low intrinsic activities at human dopamine 

D2L and D2S receptors rendrer it a unique antipsychotic. Eur J Pharmacol 515: 10­19.

Tang L., Todd R.D., O'Malley K.L. (1994) Dopamine D2 and D3 receptors inhibit dopamine release. J.Pharm.Exp.Ther. 268, 

495­502.

Urlaub G., Chasin L.A.,  (1980)  Isolation of Chinese hamster cell  mutants deficient  in dihydrofolate  reductase activity. 

Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77,

4216­4220.

Vallar L., Muca C.M., Albert P., Bunzow J., Meldolesi J. and Livelli O. (1990) Differential coupling of dopaminergic D2 

receptors expressed in different cell types: stimulation of PI 4,5 biphosphate hydrolisis in LTK fibroblasts hyperpolarization 

and cytosolic­free Ca++ concentration decrease in GH4 C1 cells. J. Biol. Chem. 265, 10320­10326.

93

Vanhauwe J., Freyman N., Francken J., Walter H., Luyten M. and Leysen J. (1999) Comparision of the ligand binding and 

signaling properties of Humane dopamine D2 and D3 receptor in Chinese hamster ovary cells. J.Pharm.Exp.Ther.  290, 

908­916.

Van Tol H.H.M., Bunzow J.R., Guan H.G., Sunhara R.K., Seeman P., Niznik H. and Civelli O. (1991) Cloning of the gene 

for a human dopamine D4 receptor with high affinity for the antipsychotic clozapine. Nature 350, 610­614.

Van Tol H.H.M., Wu C.M., Guan H.C., Ohara K., Bunzow J.R., Civelli O., Kennedy J., Seeman P., Niznik H. and Jovanovic 

V. (1992) Multiple dopamine D4 receptor variants in the human population. Nature 358, 149­152.

Van Vliet BJ, Mos J, Van der Heijden JAM, Feenstra R, Kruse CG, Long SK (2000). DU­ 127090: a highly potent, atypical 

dopamine   receptor   ligand   ­   a   putative   potent   full   spectrum   antipsychotic   with   low   EPS   potential.  Eur  

Neuropsychopharmacol 10: P.2.034.

Wang J., Zhuo L. and Chen B. (2001) Association study of dopamine D2, D3  receptors gene polimorphism with motor 

fluctuations in PD. Neurology 56, 1757­1759.

Wess J., Liu J., Blin N., Yun J., Lerche C. and Kostenis E. (1997) Structural basis of receptor/G protein coupling selectivity 

studied with muscarinic receptor as a model systems. Life Sci. 60, 1007­1014.

Wong A.H.C., Buckle C.E. and Van Tol H.H.M. (2000) polimorphism dopamine receptors.What do they tell us ?  Eur. J.  

Pharm 410, 183­203.

Xie Z., Lee S.P., O’Dowd B.F. and George S.R. (1999) Serotonin 5­HT1B  and 5­HT1D  receptors form homodimers when 

expressed alone and heterodimers when co­expressed. FEBS Lett. 456, 63­67.

94

Zawarinsky P., Tallerico T., Seeman V., Lee S.P., O’Dowd B.F. and George S.R. (1998) Dopamine D2  receptor dimers in 

human and rat brain. FEBS Lett. 441, 383­386.

Zhang L.J., Lachowicz J.E. and Sibley D.R. (1994) The D2s and D2l dopamine receptor isoforms are differentially regulated 

in Chinese Hamster Ovary cells. Mol. Pharmacol. 45, 878­889.

Zhu C. C., Cook L. B. And Hinkle P.M. (2002) Dimeritation and phosphorilation of thyrotropin­relesing hormone receptors 

are modulated by agonist stimulation. J. Biol. Chem. 277, 28228­28237.

95

ABBREVIAZIONI

AC V/VI      adenilato ciclasi chimerica V/VI

AMP            adenosina monofosfato

cAMP          AMP ciclico3HcAMP      AMP ciclico triziato

CHO           ovario di criceto cinese

COS7          rene di scimmia verde africana

DA              dopamina

DAG           diacilglicerolo

DEAE          dietilaminoetil

DMEM        medium di Eagle modificato da Dulbecco

DHFR          deidrofolato reduttasi

DNA           acido desossiribonucleico

EDTA          agente chelante il ferro

ERKs           chinasi regolate da segnali extracellulari

FBS              siero fetale bovino

GABA         acido  ­amminobutirricoγ

GPCRs        recettori accoppiati alle proteine G

GTP, GDP, GMP   guanosina trifosfato, guanosina difosfato, guanosina monofosfato

IP3               inositolo trifosfato

i3 loop          terzo loop intracellulare

MAPKs         proteine chinasi attivate da mitogeni

NaCl           cloruro di sodio

N­Dmc        N­Desmetilclozapina

PBS              tampone fosfato salino

PIP2             fosfatidilinositolo bifosfato

PKA             proteina chinasi A

PKC             proteina chinasi C

PLC              fosfolipasi C

SNA             sistema nervoso autonomo

TM               transmembrana

96

97