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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
ESCUELA DE BIOLOGÍA
Tesis para la obtención del Título de
Biólogo
“EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN CAFÉ (Coffea canephora y Coffea arabica) PARA SU APLICACIÓN Y ADOPCIÓN DE
SISTEMAS DE MICROPROPAGACIÓN MASAL.”
José Andrés Acosta Andrade
GUAYAQUIL - ECUADOR
2015
ii
© Derecho de Autor
José Andrés Acosta Andrade
2015
iii
…………………………………………..
M.Sc. Mónica Armas Soto Directora de Tesis
iv
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
ESCUELA DE BIOLOGÍA
Calificación que otorga EL TRIBUNAL que recibe la SUSTENTACION Y DEFENSA DEL TRABAJO INDIVIDUAL DE TITULACION: Tesis Titulada
“EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA EN CAFÉ (Coffea canephora
y Coffea arabica) PARA SU APLICACIÓN Y ADOPCIÓN DE
SISTEMAS DE MICROPROPAGACIÓN MASAL”
Autor: José Andrés Acosta Andrade Previo a obtener el título de BIÓLOGO
Miembros del Tribunal CALIFICACIÓN
Blga. Mónica Armas Soto, MSc. ……………………….. PRESIDENTA DEL TRIBUNAL
Blgo. Xavier Cornejo Sotomayor, MSc. ……………………….. MIEMBRO DEL TRIBUNAL
Blga. María del Carmen Terán Zavala, MSc. ……………………….. MIEMBRO DEL TRIBUNAL
Sustentación y Defensa del Trabajo de Titulación realizado en la Sala
de Maestría de la Facultad
Fecha: ……………………….................. CERTIFICO
Abg. Jorge Solórzano Cabezas
SECRATARIO FACULTAD
v
DEDICATORIA
Este trabajo está dedicado a mis padres el Sr. José K. Acosta y la Sra.
Betty Andrade quienes me demostraron todo el esfuerzo que un padre puede
hacer para ayudar a sus hijos, a mis hermanos Jazmín y Diego Acosta quienes
me ven como alguien a imitar y les devuelvo la mirada queriendo ser como ellos.
Todo el esfuerzo y apoyo que me brindaron fue la inspiración necesaria
para alcanzar esta meta.
vi
AGRADECIMIENTOS
Agradeciendo primeramente a Dios, por mis estudios, por la guía que me
ha brindado y por las personas que puso en mi camino para poder seguir con mi
titulación.
A mis Padres, a quienes les reconozco el enorme esfuerzo que han hecho
por ayudarme en todo lo que han podido para conseguir este logro y a mis
hermanos quienes de una u otra manera inspiraron mi camino.
Agradezco a la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad de
Guayaquil, a mi Directora de Tesis, la M.Sc. Mónica Armas Soto, Directora de la
Escuela de Biología, por sus acertados criterios y observaciones y sobre todo por
su amistad.
Agradezco a INIAP y de manera especial a la Estación Experimental
Enrique Ampuero Pareja, institución que me acogió y me guió en esta
investigación.
Al Ph.D. Walter Reyes Borja, el mismo que fue mi maestro, guía y amigo
durante toda mi estadía en la estación experimental Dr. Enrique Ampuero Pareja.
Y sin duda alguna un grande pero muy grande agradecimiento a la Ing.
María Eugenia Romero R. y la Ing. Elena Corozo A. por toda su amistad,
confianza, entusiasmo y colaboración que brindaron a este humilde servidor.
GRACIAS A TODOS.
vii
RESUMEN
El presente trabajo se enfocó en probar distintas dosis hormonales en 4
cultivares de café, con el objetivo de encontrar una técnica apropiada para la
inducción de Embriogénesis Somática en tejido foliar de estas 4 variedades de
café de alta productividad y estandarizarla para así lograr una propagación masal
de plántulas de café y cubrir la creciente demanda de café a nivel nacional.
Se aplicaron doce tratamientos con dosis hormonales que iban de 1 a 6
mg/L. de un medio de cultivo Murashige y Skoog normal y otros doce tratamientos
con las mismas concentraciones fitohormonales pero con la diferencia de que los
macronutrientes en el M/S estaban reducidas en un 50%, mismos que se
aplicaron a cada uno de las variedades de café seleccionadas.
De los 24 tratamientos probados para cada cultivar se obtuvo que los más
indicados para la producción de callos primarios fueron los tratamientos 1,2,3,4,5
y 6 los cuales representan las cantidades de 1,2,3,4,5 y 6 mg/L de AIA (Ácido
Indol Acético) y 1,2,3,4,5 y 6 mg/L de 2,4-D respectivamente. A pesar de que un
considerable número de tratamiento permitió la generación de callos primarios no
se logró desdiferenciar estas masas callosas para que estas produzcan
embriones, por lo cual se presentó la necesidad de hacer un reajuste en los
tratamientos experimentales en busca de un mejor resultado, pero, esto no ocurrió
debido a que el material vegetal parece no ser apto para utilizar con esta técnica,
o al menos no responde con los tratamientos experimentados durante el proyecto
dejando la pista para probar nuevas dosis y también experimentar con variedades
diferentes.
Palabras clave: Embriogénesis, somática, café, Coffea canephora, Coffea arabica, explante / callo,
embriogénico.
viii
SUMMARY
The present work was focused on testing different hormone doses on four
cultivars of coffee, with the aim of finding an appropriate technique for the
induction of somatic embryogenesis in leaf tissue of these four coffee varieties
with high productivity and standardize to achieve so spread masal coffee
seedlings and meet the growing demand for coffee nationwide.
Twelve treatments with hormonal doses ranging from 1 to 6 mg / liter of
culture medium Murashige Skoog and twelve treatments therewith phytohormonal
concentrations but with the difference that the macronutrients in the M / S were
reduced in were applied 50%, this would apply to each selected coffee varieties.
The most suitable for the production of primary callus of the 24 treatments
tested for each cultivar were 1,2,3,4,5 and 6 which represent the amounts of 1-2-
3-4-5 and 6 mg / L AIA and 1-2-3.4-5 and 6 Mg / L 2,4-D respectively. Although a
considerable number of treatment present generation of primary callus was not
possible to dedifferentiate those big masses to produce embryos, so an
adjustment were made looking for a better result, but this did not occur because
the plant material appears to be unsuitable for use with this technique; same
results with some international authors regarding the different responses found in
the application of this technique in different varieties of the same species.
Key words: Somatic, embryogenesis, coffe, Coffea canephora, Coffea arabica, Explant, Callus,
Embryogenic
ix
Índice General
Contenido Página
Resumen vii
Summary Viii
Índice de Gráficos Xii
Índice de Tablas Xiii
Índice de Cuadros xiv
1. Introducción 1
1.1. Objetivos 3
1.2. Hipótesis 4
2. Revisión de Literatura 5
2.1. Taxonomía del café 5
2.2. Diversidad genética 5
2.3. Historia y distribución 7
2.4. Producción de café en Ecuador 8
2.5. Factores que alteran el desarrollo del café 9
2.6. Cultivo de tejidos en café 10
2.6.1. Microestacas 13
2.6.2. Embriogénesis somática 13
2.7. Reguladores de crecimiento 13
2.8. Resultados en otros países 13
3. Materiales y Métodos 15
3.1. Localización 15
3.2. Factores en estudio 15
x
3.2.1. Cultivares 16
3.2.2. Etapas de desarrollo 18
3.3. Etapa de inducción de callos de primera generación 18
3.3.1. Etapa de inducción de callos de segunda
generación
18
3.3.2. Suspensiones celulares 21
4. Manejo del Ensayo 22
4.1. Colección y desinfección de las muestras de hoja 22
4.2. Etapas de crecimiento de los explantes 23
4.2.1. Etapa de inducción de callos de primera
generación
23
4.2.2. Etapa de inducción de callos de segunda
generación
23
4.2.3. Suspensiones celulares 24
4.3. Variables evaluadas 25
4.3.1. Porcentaje de explantes que presentaron callos en
los
tratamientos aplicados
25
4.3.2. Producción de embriones somáticos a partir de
células callosas
25
4.3.3. Disgregación de células embriogénicas 25
5. Resultados 26
5.1. Inducción de callos de primera generación 26
5.2. Inducción de callos de segunda generación 32
xi
5.3. Nuevos tratamientos frente al cultivar NP 3056 37
5.4. Nuevos tratamientos frente al cultivar NP 2044 39
6. Discusión 40
7. Conclusión 43
8. Recomendación 45
9. Literatura citada 46
10. Anexos 51
xii
Índice de Gráficos
Página
Gráfico 1. Evaluación de los 4 cultivares vs. 24 tratamientos de inducción de callos de primera generación……….…….…31
Gráfico 2. Evaluación de tratamientos vs. cultivares,
en la Inducción de callos secundarios………………………..35 Gráfico 3. Comparación entre los tratamiento con nuevas
dosis hormonales frente al cultivar NP 3056…………………38
Gráfico 4. Comparación entre los tratamiento con nuevas
dosis hormonales frente al cultivar NP 3056…………………39
xiii
Índice de Tablas
Página
Tabla 1. Porcentaje de formación de callos primarios 27 en el cultivar Sarchimor común
Tabla 2. Porcentaje de formación de callos primarios 28
en el cultivar Sarchimor mejorado Tabla 3. Porcentaje de formación de callos primarios 29 en el cultivar NP 2044 Tabla 4. Porcentaje de formación de callos primarios 30
en el cultivar NP 3056 Tabla 5. Promedio general de la respuesta callogénica 31
de los 4 cultivares frente a los 24 tratamientos Tabla 6. Porcentaje de respuesta de callos primarios de 32
sarchimor común a la inducción de callos secundarios Tabla 7. Porcentaje de respuesta de callos primarios de 33
sarchimor mejorado a la inducción de callos secundarios Tabla 8. Porcentaje de respuesta de callos primarios de 33
NP 2044 a la inducción de callos secundarios Tabla 9. Porcentaje de respuesta de callos primarios de 34
NP 3056 a la inducción de callos secundarios Tabla 10. Promedio general de respuesta de los 4 cultivares 35
de café a la inducción de callos secundarios Tabla 11. Comparación porcentual general de los nuevos 37
tratamientos probados con el cultivar NP3056 Tabla 12. Comparación porcentual general de los nuevos 39
tratamientos probados con el cultivar NP 2044
xiv
Índice de Cuadros
Página
Cuadro 1. Combinación de los tratamientos utilizados en los cultivares de café………………………….………..........17
Cuadro 2. Variación de la concentración de los macronutrientes fitohormonas y aditivos entre tratamientos………………….…19 Cuadro 3. Variación de la concentración del ácido indol acético
y 2, 4 D de acuerdo a los resultados del primer ensayo.............20 Cuadro 4. Variación de la concentración del ácido indol acético
y 2, 4 D de acuerdo a los resultados del segundo ensayo, utilizando 50% y 100% de los macronutrientes de MS normal…………………………………………………..….....21
1
1. INTRODUCCIÓN
En Ecuador existen alrededor de 199.215 hectáreas de café, de las
cuales 62.830 ha son de Coffea canephora Pierre ex A. Froehner y 136.385 ha
de Coffea arabica L. La industria cafetera ecuatoriana procesa cada año
aproximadamente 102.300 toneladas de café (Cofenac, 2011), especialmente
como materia prima para café soluble.
El cultivo de café en Ecuador se basa en su mayoría en C. arabica la
cual se cultiva en el país desde zonas próximas al nivel del mar hasta los 2000
m de altura, distribuidas principalmente en las provincias Manabí, Loja, El Oro,
Zamora Chinchipe, Pichincha, Guayas, Los Ríos, Bolívar, Imbabura,
Esmeraldas y Napo. De esta especie algunas variedades como Typica y
Caturra rojo se han adaptado bien y producen en zonas tropicales secas donde
muchas otras especies no crecen satisfactoriamente. La especie C. canephora
se cultiva en zonas tropicales húmedas, por debajo de los 600 msnm,
principalmente en las provincias Esmeraldas, Santo Domingo de los Tsáchilas,
Los Ríos, Napo, Sucumbíos y Orellana.
En la actualidad el gobierno ecuatoriano está impulsando un proyecto de
siembra de 50.000 hectáreas con café “Robusta” lo cual significarían alrededor
de 37.000 toneladas por año. La disponibilidad de material vegetal para esta
siembra es deficiente al momento por lo que se necesitarían más de 125
millones de plantas para el área requerida.
2
La multiplicación vegetativa de “Robusta” es lenta, por lo que es
necesario utilizar otras alternativas de multiplicación como lo es la propagación
in vitro. En esta área existen varias tecnologías que pueden aplicarse para
dicha propagación. Dentro de estas técnicas, la embriogénesis somática es, sin
duda, el método más viable de micropropagación como técnica para la
producción masiva de plantas.
En café pocos trabajos se han realizado en los que describen la
obtención de embriones somáticos a partir de la inducción de callos
embriogénicos formados de segmentos de hojas. Staritsky (1970) fue el
primero en reportar el desarrollo de embriones somáticos en Coffea canephora
a partir de tallos ortotrópicos. Posteriormente Sondhall y Sharp (1977)
describen un procedimiento para obtener un callo embriogénico a partir de
explantes foliares de Coffea arabica.
La técnica de producción de embriones somáticos se puede destinar a
programas de mejoramiento o a la propagación a gran escala de genotipos
superiores, especialmente en cultivos perennes de alto valor. La embriogénesis
somática se puede desarrollar de forma directa sobre la superficie de un tejido
organizado (hoja, tallo, microsporas, etc.) o por vía indirecta a través de una
etapa intermedia de formación de callos o suspensión celular.
3
1.1. OBJETIVOS
1.1.1. General
Evaluar la técnica de embriogénesis somática para la multiplicación in
vitro en cultivares de café “Arábigo” y café “Robusta”.
1.1.2. Específicos
Generar una metodología de propagación rápida a partir de hojas de 2
variedades de Coffea arabica y 2 variedades de Coffea canephora.
A partir de la metodología de propagación rápida generada, producir
callos primarios y secundarios de C. canephora y C. arabica para su
multiplicación en medio líquido.
4
1.2. HIPÓTESIS
1.2.1. Hipótesis Afirmativa
Los cultivares de café Coffea arabica y Coffea canephora seleccionados para
este estudio responden favorablemente a la inducción de embriones somáticos.
1.2.2. Hipótesis Nula
Los cultivares de café Coffea arabica y Coffea canephora seleccionados para
este estudio no responden a la inducción de embriones somáticos.
5
2. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. Taxonomía del café
EL café pertenece al género Coffea con aproximadamente 104 especies.
No obstante, únicamente tres de estas se mencionan como cultivadas
comercialmente, destacándose las dos primeras en el siguiente orden: Coffea
arabica, Coffea canephora y por último la especie Coffea liberica Bull ex Hiern.
La taxonomía de acuerdo a Alvarado y Rojas (1994) es:
Reino: Plantae
División: Magnoliophyta
sub.-División: Angiospermae
Clase: Magnoliatae
sub.-Clase: Asteridae
Orden: Rubiales
Familia: Rubiaceae
Género: Coffea
2.2. Diversidad genética
Los recursos fitogenéticos del café que poseen un genoma común están
conformados por 104 especies descritas en el género Coffea y las especies
menos conocidas del género Psilanthus (Anthony, et al. 1999; Davis, et al.
2006; Bridson, 1987). Entre estas especies que constituyen los recursos
genéticos del cultivo de café existe una alta variabilidad, por ejemplo en un
6
estudio con microsatélites, Ponce, et al. (2004) encontraron alta diversidad
genética y alto índice de loci polimórficos (más de 80%) en C. canephora y C.
pseudozanguebariae.
Según el número cromosómico el género Coffea se divide en dos
grupos, el grupo grande de las especies diploides (2n=22 cromosomas)
conformado por C. canephora, C. liberica C. stenophyla, C. racemosa y
otros, y el grupo de los tetraploides (2n=4x=44 cromosomas) conformado por
C. arabica (Regalado, 2006). C. arabica es una especie alotetraploide
producto de una cruza interespecífica natural entre dos especies diferentes con
un número básico de cromosomas x=11 (Regalado, 2006).
Los recursos genéticos de una planta cultivada corresponden a la
totalidad de las plantas con las que ella puede intercambiar genes. Todas estas
especies poseen un genoma de base común que permite la obtención de
híbridos y la transferencia de genes entre las especies (Francois, Astorga y
Bertrand, 2000).
2.3. Historia y distribución
El café es uno de los productos más importantes en el mercado
internacional, y uno de los que muchos países dependen para obtener divisas.
Ésta especie representa una importante fuente de ingresos para millones de
personas relacionadas con el cultivo de la misma, desde el punto de vista
comercial, sólo dos especies de café se cultiva extensivamente: C. arabica
7
(Arábica) y C. canephora (Robusta); C. arabica es nativa de las tierras altas del
sudoeste de Etiopía, y fue traído de África tropical y se introdujo en el
continente americano en las primeras décadas del siglo XVIII. Ha contribuido al
desarrollo económico y cultural de los países donde se ha cultivado. Café
arábico, representa aproximadamente el 75% del café del mundo comercial y
para toda la producción de café en América Latina. Por otro lado, C. canephora
tiene una distribución geográfica muy amplia, que se extiende desde el oeste
hacia las regiones centrales tropicales y subtropicales del continente africano,
de Guinea y Liberia, el Sudán y el bosque de Uganda, con una alta
concentración de tipos en la República Democrática del Congo (Carneiro,
1999).
El género Coffea incluye 104 especies; no obstante únicamente se citan
cuatro en cultivo comercial, con marcado énfasis en las dos primeras según el
siguiente orden: C. arabica L., C. canephora P., C. liberica Hiern y C. dewevrei.
La especie C. arabica se cultiva en un 85 % de los países caficultores. En el
continente americano es donde ha tenido mayor difusión. En cuanto a la
especie C. canephora (Robusta), el auge de su cultivo es debido a su gran
resistencia a La Roya Hemileia vastatrix (Rojas, 1987).
2.4. Cultivo de café en Ecuador
En términos generales se distinguen cuatro zonas de producción de café
arábigo: 1) Manabí-Guayas, de 300 a 700 msnm (las partes altas del sistema
8
montañoso Chongón Colonche); 2) la zona sur, de 500 a 2.000 msnm (El Oro-
Loja); 3) las estribaciones occidentales, de 500 a 1750 msnm (vertiente
occidental de Los Andes); y, 4) las estribaciones orientales, de 500 a 1500
metros de altura, en la parte centro-norte, y de 1000 a 1800 msnm, en la parte
suroriental (Anecafé, 2002 ; Cofenac, 2012).
El café robusta se adapta en las zonas tropicales húmedas de la costa y
la Amazonía ecuatoriana, cultivándose principalmente en las provincias Los
Ríos, Santo Domingo de los Tsáchilas, Esmeraldas, Sucumbíos, Napo y
Orellana; desde alturas cercanas al nivel del mar hasta los 600 msnm.
Todas estas áreas antes mencionadas abarca una superficie total de
199.215 ha en todo el país, de este total la provincia de Manabí es la que
posee la mayor superficie cafetalera (70.050 ha) y así mismo la mayor área de
producción efectiva (52.538 ha) a nivel nacional. En los últimos años se está
evaluando la posibilidad de producir café robusta usando irrigación en las
zonas tropicales secas de Guayas y Santa Elena (Cofenac, 2012).
2.5. Factores que afectan el desarrollo del café
Como todos los vegetales, el café también tiene rangos óptimos de
factores climáticos para su mejor desarrollo, muchas veces la falta de definición
de estos umbrales afecta la producción y el desarrollo de las plantas.
9
La intensidad lumínica tiene una influencia directa con el número y el
tamaño de las hojas de la planta de café, dado el caso que a más exposición
solar tenga el cultivo las hojas serán de menor tamaño pero a la vez habrá
mayor número de hojas y nudos en las plantas (Carvajal, 1972); el fotoperiódo
necesario para los cultivos de este género es corto, menos de 13 horas de luz
solar diaria acentuándose en la mayoría de cultivos un promedio que va de 4,4
a 5,6 horas de luz por día con una temperatura media de 17 – 23 °C (Valencia,
2005).
Carvajal (1972) nos sugiere que la precipitación óptima media anual
debe estar entre los 1600 y los 1800 mm, soportando una mínima de hasta
1000 mm anuales considerando que el establecimiento de un periódo seco
favorece al crecimiento del café, especialmente en el desarrollo de la raíz. Por
otra parte la humedad relativa es un factor de importancia debido a que cuando
es mayor al 85% se propicia el ataque de enfermedades fungosas que se ven
notablemente favorecidas (Rojas, 1987).
Para la etapa de siembra es apropiado tener en cuenta los niveles de
densidad que se encuentran establecidos entre 3.000 y 4.000 plantas por
hectárea en cafetales arábigos y 1.111 plantas por hectárea en plantaciones de
robusta, ya que si se sobrepasa de los niveles apropiados tendremos
consecuencias como el crecimiento lento y desarrollo disparejo de manera muy
marcada entre planta y planta (Cofenac, 2012)
10
2.6. Cultivo de tejidos en café
El cultivo de tejidos se define como el conjunto de técnicas que permiten
cultivar un explante con potencial de diferenciación en un medio de
composición química definida, bajo condiciones de asepsia y bajo condiciones
ambientales controladas (Abdelnour y Escalant, 1994).
En café, varios trabajos se han realizado en los que describen la
obtención de embriones somáticos a partir de la inducción de callos
embriogénicos formados de segmentos de hojas. Staritsky (1970) fue el
primero en reportar el desarrollo de embriones somáticos en Coffea canephora
a partir de tallos ortotrópicos. Posteriormente, Sondahl y Sharp (1977)
describieron un procedimiento para obtener un callo embriogénico de alta
frecuencia a partir de explantes foliares de Coffea arabica.
A partir del trabajo pionero de Staritsky (1970), quien indujo con éxito la
embriogénesis somática en Coffea canephora, se han descrito varias técnicas
aplicadas al cultivo in vitro del café, tales como el cultivo de meristemos
embriones cigóticos, anteras o polen, suspensiones celulares y el cultivo de
protoplastos (Carneiro, 1999).
Las técnicas de cultivos de tejidos son utilizados en café principalmente
con dos fines: 1) recortar el ciclo de selección para Coffea arabica L. por medio
de la micropropagación de híbridos y por la utilización de plantas haploides. 2)
11
multiplicar rápidamente los genotipos de Coffea canephora en las regiones en
donde la multiplicación por esquejes presenta problemas, o bien, para acelerar
la instalación de jardines clonales (Berthouly, 1997).
La multiplicación vegetativa del café utilizando las técnicas de cultivo in
vitro se puede llevar a cabo por dos vías: las microestacas y la embriogénesis
somática (Berthouly, 1997).
2.6.1. Microestacas
La propagación in vitro por microestacas, consiste en el cultivo de un
nudo o entrenudo proveniente de la planta, con el fin de obtener nuevos
vástagos mediante el desarrollo de yemas preexistentes o neoformadas, las
cuales podrán, a su vez, proporcionar nuevos esquejes, o ser enraizados,
obteniéndose así múltiples plantas, idénticas a la planta madre (García y
Rafael, 1989).
2.6.2. Embriogénesis somática
La embriogénesis somática es la más grande expresión de totipotencia
celular enunciado por Haberland en 1902 (Etienne, 2006). La totipotencia, es la
capacidad de las células vegetales para formar un nuevo individuo
genéticamente idéntico al que proporcionó la célula madre (Berthouly, 1997).
12
Dublin (1991) describe al proceso de embriogénesis somática como el
método por medio del cual se obtiene embriones perfectamente organizados a
partir de las células somáticas. Estos embriones somáticos se desarrollan al
pasar por las fases: globular, torpedo y cotiledonar en dicotiledóneas.
Los embriones somáticos presentan una estructura bipolar, con
meristemos apicales y radicales en extremos de un mismo eje, en los cuales
las características morfológicas son idénticas a las encontradas en los
embriones cigóticos (Abdelnour y Escalant, 1994). Además los embriones
somáticos se caracterizan por no tener conexión vascular con el tejido materno
(Litz y Jarret, 1991).
2.7. Reguladores de crecimiento
La mayoría de los sistemas embriogénicos requieren, para la inducción
de los embriones, de una concentración alta de auxinas (generalmente 2,4 D)
en el medio de cultivo. Otras auxinas sintéticas tales como el Picloram, el 2,4,5
T, el ácido 2-benzothiazol acético, y el ácido paraclorofenoxiacetico han
demostrado ser muy efectivas. La concentración usual de 2,4-D está dentro del
rango de 0,5 – 27,6 µM (Evans, Sharp y Flick, 1981).
13
2.8. Resultados en otros países
En varios países se han realizado investigaciones sobre la
embriogénesis somática del café, tal es el caso de la investigación que se
realizó en el estado de Chiapas-México en la cual evaluaron el potencial
callogénico que poseían tres diferentes tipos de explantes provenientes de
hojas inmaduras, jóvenes y maduras. Esta investigación nos muestra que el
tejido con mayor potencial callogénico es el extraído de hojas inmaduras e
incluso poseen menor probabilidades de contaminación, aunque nos indica
también que las probabilidades que los explantes se oxiden son altas, pero de
igual manera nos dice que la obtención de embriones a través de esta técnica
es viable (Gómez, et al., 2010).
En otro trabajo realizado en Venezuela se reportó la estabilidad genética
en las plantas de café cv. “Catimor” regeneradas por embriogénesis somática.
(Menéndez y Ríos, 2008). Por su parte, Moncada, Vielma y Mora (2005)
trataron de optimizar la embriogénesis somática en Coffea arabica L. variedad
Catuai Amarillo, observando que en el medio de inducción de embriones
somáticos (MS + BAP) estimula el desarrollo de embriones somáticos. El BAP y
el 2,4-D juntos promueven el desarrollo de callos con raíces y con potencial
embriogénico; las concentraciones bajas de estos dos reguladores de
crecimiento inducen un mayor desarrollo de callos embriogénicos. Sin
embargo, al ser llevados a un medio sin ANA y KNO3 desarrollaron embriones
somáticos pero en muy baja cantidad.
14
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Localización
La presente investigación se realizó en el Laboratorio de Biotecnología
de la Estación Experimental del Litoral Sur “Dr. Enrique Ampuero Pareja” del
Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP). La
estación está ubicada en las coordenadas geográficas 2º 15’ 15’’ S. y 79º 30’
40’’ O. en el km. 26 al este de Guayaquil en la vía Durán – Tambo, parroquia
Virgen de Fátima, cantón Yaguachi, provincia del Guayas.
3.2. Factores en estudio
3.2.1 Cultivares
Los cultivares utilizados fueron: las variedades de la especie C.
canephora P., “NP 2044” y “NP 3056”, y las variedades “Sarchimor Mejorado” y
“Sarchimor Común” de C. arabica L. Estos materiales genéticos son cultivares
seleccionados del INIAP altamente productivos y adaptados en condiciones de
zonas cafetaleras del Ecuador.
15
3.2.2 Tratamientos
Se realizaron dos ensayos, uno para cada especie: C. canephora y C.
arabica. En este ensayo los factores estudiados fueron: 4 variedades de café y
24 medios de cultivo más 4 testigos (blanco).
En el Cuadro 1 se describen los tratamientos utilizados en el
experimento el mismo que se repite para todas las variedades en estudio.
16
Cuadro 1. Combinación de los tratamientos utilizados en los cultivares de
café.
ENSAYOS
Numero de
tratamiento
Variedades Medio
de
cultivo
Numero de
tratamiento
Variedades Medio
de
cultivo
1 V1 M1 1 V2 M1
2 V1 M2 2 V2 M2
3 V1 M3 3 V2 M3
4 V1 M4 4 V2 M4
5 V1 M5 5 V2 M5
6 V1 M6 6 V2 M6
7 V1 M7 7 V2 M7
8 V1 M8 8 V2 M8
9 V1 M9 9 V2 M9
10 V1 M10 10 V2 M10
11 V1 M11 11 V2 M11
12 V1 M12 12 V2 M12
13 V1 M13 13 V2 M13
14 V1 M14 14 V2 M14
15 V1 M15 15 V2 M15
16 V1 M16 16 V2 M16
17 V1 M17 17 V2 M17
18 V1 M18 18 V2 M18
19 V1 M19 19 V2 M19
20 V1 M20 20 V2 M20
21 V1 M21 21 V2 M21
22 V1 M22 22 V2 M22
23 V1 M23 23 V2 M23
24 V1 M24 24 V2 M24
25 T1 M25 T1 25 T2 M25 T2
Abreviaturas utilizadas: V1, Sarchimor común; V2, Sarchimor mejoradoo; T,
Testigos absolutos.
17
3.3. Etapas de Desarrollo
3.3.1 Etapa de inducción de callos de primera generación
Para la obtención de callos de primera generación, los explantes de
hojas de café fueron sometidos a los tratamientos de medios de cultivo, como
se mencionan en el Cuadro 1. En los doce tratamientos se aplicó la
concentración de los macronutrientes en un 50 % de lo que corresponde a un
Medio de Cultivo Murashige y Skoog (1962) normal. También variaron las
concentraciones del ácido indol acético de 1,2,3,4,5 y 6 mg/L y del 2,4 D en las
mismas proporciones. Se incluyó un control (Blanco) el cual es un medio de
cultivo M/S sin hormonas en cada uno de los ensayos (Cuadro 2).
3.3.2 Etapa de inducción de callos de segunda generación
Posterior a la formación de callos de primera generación (30 – 60 días
en dependencia del avance de los callos según el genotipo y el medio de
cultivo), se realizó el cambio de medio de cultivo para la inducción de callos de
segunda generación o callos embriogénicos.
Los tratamientos utilizados se describen en el Cuadro 3.
18
Cuadro 2. Variación de la concentración de los macronutrientes, fitohormonas y aditivos entre tratamientos.
Soluciones (mL) Tratamientos
Testigo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
1 0 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
3 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
4 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9
5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
6 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Fitohormonas mg/L
7 (AIA) 0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
8 (Kinetina) 0 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
9 (BAP) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
10 (2,4D) 0 1 2 3 4 5 6 6 5 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 6 5 4 3 2 1
Aditivos
Inositol (mg) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Acidoascórb. (mg) 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75
Sacarosa (mg) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30
Agua Coco (mL) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Gellangum (g) 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7
19
Cuadro 3.Variación de la concentración del ácido indol acético y 2, 4 D de acuerdo a los resultados del primer ensayo.
Soluciones TRATAMIENTOS PARA CAFÉ 2° ETAPA
BLANCO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
1 (mL) 0 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25
2 (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
3 (mL) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
4 (mL) 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9
5 (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
6 (mL) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
7 (AIA mg) 0 Mejor concentración resultante del experimento anterior Mejor concentración resultante del experimento anterior
8 (Kinetina mg) 0 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
9 (BAP mg) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
10 (2,4D mg) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1
Inositol (mg) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Acido ascórb. (mg) 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75
Sacarosa (mg) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30
Agua Coco (mL) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Gellan gum (g) 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7
21
3.4.3 Suspensiones celulares
En esta fase, las células embriogénicas que se encontraban
aglomeradas en masas callosas, fueron separadas mediante la agitación en un
medio de cultivo líquido en un shaker a 110 rpm. Los tratamientos a utilizados
se basaron en los resultados de la fase anterior, como se mencionan en el
cuadro 4.
Cuadro 4.Variación de la concentración del ácido indol acético y 2, 4 D de
acuerdo a los resultados del segundo ensayo, utilizando 50% y 100% de los
macronutrientes de MS normal.
TRATAMIENTOS PARA CAFÉ 3° ETAPA
Soluciones BLANCO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 (mL) 0 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 12,5 25 25 25 25 25 25
2 (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
3 (mL) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
4 (mL) 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9
5 (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
6 (mL) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
7 (AIA mg) 0 Concentración resultante del experimento anterior
8 (Kinetina mg) 0 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
9 (BAP mg) 0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
10 (2,4D mg) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Inositol (mg) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Acido ascórb. (mg) 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75 75
Sacarosa (mg) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30
Agua Coco (mL) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Gellan gum (g) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
22
4. MANEJO DEL ENSAYO
4.1. Colección y desinfección de las muestras de hojas
Se tomaron las hojas jóvenes y completas de café de plantas donantes
que se encontraban en buenas condiciones fitosanitarias. Para la desinfección
se realizó el siguiente proceso:
Lavado con agua potable.
Enjuague en una solución de povidin (10mL por 100mL de solución) + 15
mg de clorhidrato de tetraciclina.
Posteriormente se trabajó en cámara de flujo laminar (ambiente estéril)
siguiendo los pasos descritos a continuación:
Se sumergió las hojas desinfectadas en una solución igual a la anterior
(povidin + tetraciclina) durante 5 minutos en agitación constante.
Se cambiaron a una solución de peróxido de hidrógeno al 0.5 % en
agitación constante durante 4 minutos; y, sin desechar la solución anterior
se agregó hipoclorito de sodio al 5% y se mantuvo en agitación constante
durante 3 minutos, se desechó el sobrenadante.
Se realizaron 3 enjuagues con agua destilada estéril, con esto el material
quedó listo para la siembra en el medio de cultivo.
23
4.2. Etapas de crecimiento de los explantes
4.2.1 Etapa de inducción de callos de primera generación
En el material vegetal desinfectado se realizaron cortes de
aproximadamente 1cm2, que fueron sembrados en envases conteniendo los
medios de cultivo. Los callos se formaron aproximadamente en 10 semanas
después de la siembra, luego se procedió a cambiarlos para someterlos a los
medios de inducción de callos de segunda generación.
Se determinó la capacidad de inducción de callos mediante la
observación semanal sobre los cultivares de café, se calculó el porcentaje de
producción de callos de los explantes presentes al final de las 10 semanas y se
seleccionaron aquellos que presentaron el mejor resultado.
4.2.2. Etapa de inducción de callos de segunda generación
Una vez concluida la primera etapa, fueron seleccionadas las
concentraciones hormonales con mejor respuesta (1 – 6 mg/L de AIA) las
mismas que se repitieron en la siguiente etapa de producción de callos, para
aumentar el número de callos transformados a segunda generación. Se
procedió a cambiar los explantes a un medio de cultivo fresco para lograr la
formación de callos de segunda generación, pasándolos cada seis semanas a
un nuevo medio de cultivo.
24
Se evaluaron los porcentajes de los callos de segunda generación
encontrando un desarrollo desmesurado de las masas callosas y los cambios
de coloración. Los callos que se desarrollaron a pesar de no haber inducido
embriones somáticos fueron pasados a un nuevo medio de cultivo líquido en el
cual se esperaba la disgregación celular de los mismos.
4.2.3. Suspensiones celulares
Luego del traspaso de los callos desarrollados en el medio de cultivo
M/S para callos de segunda generación, aproximadamente en 4 semanas las
masas callosas empezaron a crecer y a disgregarse formando un líquido
espeso en las fiolas en donde se encontraban.
25
4.3. Variables evaluadas
4.3.1 Porcentaje de explantes que presentaron callos en los tratamientos
aplicados
De todos los explantes en cada uno de los recipientes fueron
contabilizados aquellos que produjeron callos, este número representó el
porcentaje de aparición de callos somáticos.
4.3.2 Producción de embriones somáticos a partir de las células callosas
Del total de callos somáticos que se han generado se calculó el
porcentaje de callos que han formado embriones.
4.3.3 Disgregación de las células embriogénicas
La disgregación de las células embriogénicas se calculó porcentualmente
en función de los callos embriogénicos generados y que formaron una
suspensión celular.
26
5. RESULTADOS
Los resultados obtenidos se presentan en función de la respuesta de los
cultivares a los medios de cultivo utilizados en cada una de las etapas
propuestas para cada uno de los ensayos.
5.1 Inducción de callos de primera generación
Para determinar el porcentaje de explantes de mayor respuesta a los
tratamientos propuestos, se probaron 24 combinaciones entre macronutrientes
y hormonas sintéticas y se hicieron 5 repeticiones por cada tratamiento. Para
todos los cultivares se establecieron tres ensayos en diferentes fechas. La
Tabla 1, 2, 3 y 4 muestran los resultados promedios de todas las introducciones
(3) para la inducción a la formación de callos de los cultivares Sarchimor
común. Sarchimor mejorado, NP2044 y NP 3056 respectivamente.
La manifestación de callos de primera generación, para el cultivar
sarchimor común (Tabla 1) se dio entre las semanas 4 y 7 con un promedio
de 23 % para el mejor tratamiento en el que se aplicaron 2mg/L de AIA y 2
mg/L de 2,4 D con sales completas de MS (Anexo, Foto 1).
27
.Tabla 1. Porcentaje de formación de callos primarios en el cultivar Sarchimor común
sarchimor común
R1 R2 R3 R4 R5 PROMEDIO
T1 30,00 32,50 30,00 12,50 2,50 21,50
T2 40,00 30,00 23,75 7,50 13,75 23,00
T3 31,25 20,00 17,50 10,00 5,00 16,75
T4 26,25 23,75 6,67 5,00 7,50 13,83
T5 20,00 17,50 15,00 8,75 17,50 15,75
T6 20,00 32,50 12,50 7,50 15,00 17,50
T7 2,50 0,00 2,50 0,00 0,00 1,00
T8 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T9 2,50 2,50 0,00 0,00 5,00 2,00
T10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T11 0,00 0,00 2,50 2,50 0,00 1,00
T12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T13 0,00 2,50 0,00 0,00 0,00 0,50
T14 2,50 0,00 2,50 0,00 0,00 1,00
T15 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T16 0,00 0,00 0,00 2,50 0,00 0,50
T17 0,00 2,50 0,00 0,00 0,00 0,50
T18 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T19 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T20 2,50 0,00 0,00 2,50 0,00 1,00
T21 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T22 0,00 0,00 2,50 0,00 0,00 0,50
T23 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T24 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
En cuanto al cultivar sarchimor mejorado los resultados de la primera
generación de callos se muestra en la Tabla 2, donde se refleja como el mejor
tratamiento el T5 en el que se utilizó una carga hormonal de 5 mg/L de AIA y 5
mg/L de 2,4 D, generando un 18,67% de reacción callogénica. Dichos
resultados se evaluaron a partir del aparecimiento de los primeros callos a las 5
semanas, siendo como máximo tiempo de reacción 8 semanas (Anexo, Foto
2).
28
Tabla 2. Porcentaje de formación de callos primarios en el cultivar sarchimor mejorado
R1 R2 R3 R4 R5 PROMEDIO
T1 5,00 13,33 3,33 23,33 8,33 10,67
T2 36,67 10,00 33,33 5,00 6,67 18,33
T3 16,67 23,33 18,33 3,33 11,67 14,67
T4 20,00 18,33 6,67 16,67 3,33 13,00
T5 45,00 16,67 0,00 20,00 11,67 18,67
T6 3,33 21,67 20,00 3,33 20,00 13,67
T7 0,00 0,00 0,00 6,67 0,00 1,33
T8 0,00 0,00 3,33 0,00 6,67 2,00
T9 0,00 0,00 3,33 0,00 0,00 0,67
T10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T11 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T12 3,33 0,00 0,00 0,00 0,00 0,67
T13 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T14 0,00 0,00 3,33 0,00 0,00 0,67
T15 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T16 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T17 0,00 3,33 0,00 0,00 0,00 0,67
T18 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T19 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T21 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T22 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T23 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T24 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Los resultados para el cultivar NP 2044 en cuanto al porcentaje de
aparición de callos de primera generación, se muestran en la Tabla 3. El mejor
tratamiento fue el T3 con un 22,67% de respuesta callogénica. Dicho
tratamiento estuvo compuesto por sales completas de MS y 3 mg/L de AIA y
3mg/L de 2,4 D (Anexo, Foto 3).
29
Tabla 3. Porcentaje de formación de callos primarios en el cultivar NP2044
R1 R2 R3 R4 R5 PROMEDIO
T1 15,00 22,50 22,50 11,25 21,25 18,50
T2 15,00 30,00 23,33 11,67 18,33 19,67
T3 10,00 20,00 13,33 26,67 43,33 22,67
T4 21,67 13,33 3,33 26,67 20,00 17,00
T5 16,67 16,67 16,67 20,00 36,67 21,33
T6 20,00 15,00 3,33 0,00 3,33 8,33
T7 0,00 3,33 6,67 0,00 6,67 3,33
T8 0,00 3,33 0,00 3,33 0,00 1,33
T9 0,00 0,00 0,00 3,33 3,33 1,33
T10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T11 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T13 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T14 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T15 0,00 3,33 0,00 0,00 0,00 0,67
T16 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T17 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T18 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T19 0,00 0,00 0,00 6,00 4,00 2,00
T20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T21 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T22 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T23 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T24 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
El porcentaje de formación de callos de primera generación para el
cultivar NP 3056 se muestra en la Tabla 4. El mejor tratamiento fue el T1 con
un 39%, en el cual se aplicó una carga hormonal de 1 mg/L tanto de AIA como
de 2,4 D (Anexo, Foto 4).
30
Tabla 4. Porcentaje de formación de callos primarios en el cultivar NP 3056
R1 R2 R3 R4 R5 PROMEDIO
T1 45,71 20,00 49,29 51,43 28,57 39,00
T2 53,57 17,14 40,00 17,14 12,86 28,14
T3 34,29 51,43 20,00 38,57 27,14 34,29
T4 31,43 50,00 35,71 41,43 27,14 37,14
T5 35,00 18,57 0,00 45,71 18,57 23,57
T6 17,14 28,57 24,29 14,29 21,43 21,14
T7 0,00 1,11 0,00 1,11 0,00 0,44
T8 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T9 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T11 0,00 4,29 0,00 0,00 0,00 0,86
T12 0,00 0,00 0,00 0,00 1,43 0,29
T13 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T14 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T15 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T16 0,00 4,29 0,00 4,29 0,00 1,71
T17 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T18 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T19 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T20 4,29 0,00 0,00 0,00 0,00 0,86
T21 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T22 4,29 0,00 0,00 4,29 0,00 1,71
T23 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
T24 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
En la Tabla 5 asi como en el gráfico 1 se muestra la comparación de los
resultados obtenidos entre los cuatro cultivares y los 24 tratamientos, marcando
a NP 3056 como el mejor cultivar en cuanto a la respuesta callogénica.
31
Tabla 5. Promedio general de la respuesta callogénica de los 4 cultivares frente a los 24 tratamientos
SC SM NP 2044 NP 3056 Promedio
T1 21,5 10,7 18,5 39,0 22,4
T2 23,0 18,3 19,7 28,1 22,3
T3 16,8 14,7 22,7 34,3 22,1
T4 13,8 13,0 17,0 37,1 20,2
T5 15,8 18,7 21,3 23,6 19,8
T6 17,5 13,7 8,3 21,1 15,2
T7 1,0 1,3 3,3 0,4 1,5
T8 0,0 2,0 1,3 0,0 0,8
T9 2,0 0,7 1,3 0,0 1,0
T10 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
T11 1,0 0,0 0,0 0,9 0,5
T12 0,0 0,7 0,0 0,3 0,2
T13 0,5 0,0 0,0 0,0 0,1
T14 1,0 0,7 0,0 0,0 0,4
T15 0,0 0,0 0,7 0,0 0,2
T16 0,5 0,0 0,0 1,7 0,6
T17 0,5 0,7 0,0 0,0 0,3
T18 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
T19 0,0 0,0 2,0 0,0 0,5
T20 1,0 0,0 0,0 0,9 0,5
T21 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
T22 0,5 0,0 0,0 1,7 0,6
T23 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
T24 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Prom gral. 4,8 4,0 4,8 7,9 5,4
Gráfico1. Evaluación de los 4 cultivares vs. 24 tratamientos de inducción de callos de primera generación.
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
45,0
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 T17 T18 T19 T20 T21 T22 T23 T24
SC SM NP 2044 NP 3056
32
5.2. Inducción de callos de segunda generación
Para la inducción de callos de segunda generación se tomaron los
callos primarios y se sometieron a diferentes concentraciones hormonales
basadas en los resultados de la etapa anterior en la que se determinó que las
mejores dosis fueron entre 1 y 6 mg/L tanto de AIA como de 2,4 D. A
continuación se muestran las Tablas 6, 7, 8 y 9 donde se detallan los
porcentajes de respuesta en la inducción de callos de segunda generación de
los cultivares sarchimor común, mejorado, NP 2044 y NP 3056
respectivamente. Aquí se observa que todos los cultivares presentaron
respuesta en el crecimiento desmesurado en el tamaño de los callos,
obtuvieron una forma de esponja la cual consumía el medio con gran rapidez
una vez que empezaba su desarrollo. Esta respuesta apareció en todos los
cultivares sometidos a todos los tratamientos.
Tabla 6. Porcentaje de respuesta de callos primarios de sarchimor común a la inducción de callos secundarios
R1 R2 R3 R4 R5 PROMEDIO
T1 100,00 50,00 100,00 50,00 100,00 80,00
T2 66,67 100,00 100,00 100,00 100,00 93,33
T3 0,00 25,00 25,00 25,00 25,00 20,00
T4 66,67 50,00 25,00 50,00 25,00 43,33
T5 50,00 50,00 25,00 50,00 50,00 45,00
T6 75,00 75,00 50,00 50,00 75,00 65,00
Todas las concentraciones de fitohormonas en el medio de cultivo
indujeron a la formación de unas grandes masas de callos los cuales
presentaron apariencia esponjosa siendo la respuesta obtenida en el T2 (2
mg/L de AIA y 0.2 mg/L de 2,4 D) las más representativas (Tabla 6)
33
Por otro lado tenemos los resultados obtenidos por el cultivar sarchimor
mejorado plasmados en la Tabla 7, mismo que se comportó de mejor manera
frente a los tratamientos 1 y 6 los cuales contenían una concentración de 1 y 6
mg/L de AIA y 0,1 y 0,6 mg/L de 2,4 D.
Tabla 7. Porcentaje de respuesta de callos primarios de sarchimor mejorado a la inducción de callos secundarios
R1 R2 R3 R4 R5 PROMEDIO
T1 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00
T2 100,00 100,00 0,00 100,00 100,00 80,00
T3 100,00 75,00 100,00 100,00 100,00 95,00
T4 0,00 50,00 50,00 50,00 50,00 40,00
T5 100,00 100,00 100,00 0,00 100,00 80,00
T6 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00
Para el cultivar NP 2044 fue un poco distinto en el momento de la
obtención de callos secundario, si bien es cierto como se ve en la Tabla 8
encontramos respuesta en todos los cultivares pero un nivel de respuesta
inferior a los dos cultivares de C arabica, manifestándose los tratamientos T2 y
T3 como los de mayor inducción, en estos tratamientos se aplicó 2 y 3 mg/ de
AIA y 0,2 y 0,3 mg/L de 2,4 D
Tabla 8. Porcentaje de respuesta de callos primarios de NP 2044 a la inducción de callos secundarios
R1 R2 R3 R4 R5 PROMEDIO
T1 60,00 20,00 40,00 60,00 20,00 40,00
T2 66,67 33,33 50,00 66,67 33,33 50,00
T3 33,33 50,00 66,67 33,33 66,67 50,00
T4 20,00 20,00 20,00 33,33 20,00 22,67
T5 66,67 66,67 66,67 33,33 33,33 53,33
T6 40,00 40,00 0,00 0,00 40,00 24,00
34
En la segunda variedad de Coffea canephora hay una mejor respuesta
en comparación a los tres cultivares anteriormente mencionados, de esta
manera se aprecia en la Tabla 9 que el cultivar NP 3056 se comportó de mejor
manera con el tratamiento 1 en el cual se sometió el tejido a 1 mg/L de AIA y
0,1 mg/L 2,4 D
Tabla 9. Porcentaje de respuesta de callos primarios de NP 3056 a la inducción de callos secundarios
R1 R2 R3 R4 R5 PROMEDIO
T1 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00
T2 100,00 91,67 100,00 100,00 100,00 98,33
T3 83,33 100,00 91,67 100,00 100,00 95,00
T4 100,00 100,00 25,00 100,00 100,00 85,00
T5 83,33 83,33 66,67 37,50 58,33 65,83
T6 100,00 0,00 83,33 50,00 83,33 63,33
En la Tabla 10 se encuentra la comparación del comportamiento que
tuvieron cada uno de los cultivares frente a cada uno de los tratamientos, por
medio de esta evaluación es el T1 el tratamiento con mayor inducción de callos
secundarios y el mejor cultivar es el NP 3056 con un mayor índice de respuesta
a los tratamientos experimentados. (Gráfico 2).
Tabla 10. Promedio general de respuesta de los 4 cultivares de café a la inducción de callos secundarios
SC SM NP 2044 NP 3056 Promedio
T1 80,00 100,00 40,00 100,00 80,00
T2 93,33 80,00 50,00 98,33 80,42
T3 20,00 95,00 50,00 95,00 65,00
T4 43,33 40,00 22,67 85,00 47,75
T5 45,00 80,00 53,33 65,83 61,04
T6 65,00 100,00 24,00 63,33 63,08
Prom. Gral. 57,78 82,50 40,00 84,58 66,22
35
Gráfico 2. Evaluación de tratamientos vs. cultivares, en la Inducción de callos secundarios.
Finalizada la evaluación se procedió a realizar el traspaso de los callos
obtenidos, hacia un medio de cultivo líquido en el que se buscaba la
disgregación de estas células conglomeradas de los callos provenientes de los
tratamientos anteriores. En este medio de cultivo líquido se mantuvo la
concentración de AIA, y se agregó dosis de 1 – 6 mg/L de BAP, pero el
resultado obtenido en ésta fase fue completamente nulo ya que no se logró
formar una suspensión celular con embriones somáticos, lo que se obtuvo fue
un desarrollo en tamaño aun mayor de los callos secundarios y el medio de
cultivo se tornó de coloración café claro con apariencia grumosa la cual no fue
viable para la obtención de embriones somáticos.
Debido a esta pérdida de material vegetal con el que se trabajó durante
dos etapas del estudio, se buscó reformular los tratamientos para obtener
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
T1 T2 T3 T4 T5 T6
SC SM NP 2044 NP 3056
36
mejores resultados, estos cambios fueron directamente en las hormonas
basándose en los resultados inicialmente obtenidos. Se redujo las
concentraciones de AIA y de 2,4 D, con el objetivo de obtener mayor cantidad
de explantes que produzcan callos.
Los resultados obtenidos en esta nueva introducción se detallan a
continuación.
5.3. Resultados de los nuevos tratamientos frente al Cultivar NP 3056
Para la inducción de callos primarios se plantearon tratamientos
hormonales los cuales se describen en la Tabla 11.
Tabla 11. Comparación porcentual general de los nuevos tratamientos probados con el cultivar NP3056
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 PROMEDIO
T1 0,25 2,4D 66,67 33,33 46,67 46,67 83,33 66,67 100,00 100,00 0,00 33,33 57,67
T2 0,50 2,4D 100,00 66,67 83,33 66,67 100,00 100,00 100,00 66,67 33,33 100,00 81,67
T3 1 2,4D 16,67 33,33 16,67 50,00 60,00 83,33 73,33 33,33 6,67 30,00 40,33
T4 0,5 AIA 33,33 0,00 0,00 0,00 33,33 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 6,67
T5 1 AIA 0,00 0,00 20,00 0,00 33,33 0,00 0,00 13,33 13,33 0,00 8,00
Los resultados promedio que constan en la Tabla 11 y en el Gráfico 3
indican que la mejor respuesta a la inducción corresponde al tratamiento 2 el
cual tenía la concentración de 0,5 mg/L de 2,4 D y logró un 81,67 % de
producción callogénica mientras que el tratmiento 5 (1 mg/L de AIA) fue el
menos exitoso con apenas 8% de producción de callos (Anexo, Foto 5).
37
Gráfico 3. Comparación entre los tratamiento con nuevas dosis hormonales
frente al cultivar NP 3056
Posterior a la inducción, se estableció el ensayo de inducción de
suspensiones celulares para el mismo cultivar NP3056. En este ensayo se
utilizaron diferentes dosis hormonales como 1, 2, 3 mg/L de BAP y 0,25; 0,5:
Y 075 mg/L de 2,4 D; las mismas que fueron combinadas buscando un mejor
efecto en la disgregación celular pero no produjo ningún resultado debido a
que los callos colocados en estos medios de cultivo se necrosaron a los 4
días de haberlos cambiado.
5.4 Resultados de los nuevos tratamientos frente al Cultivar NP 2044
Para el cultivar NP 2044 se probaron los mismo tratamientos que se
utilizaron con el otro cultivar. Los resultados constan en la Tabla 12 en la que
se muestra el porcentaje de respuesta a la inducción (Anexo Foto 6).
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10
T1 0,25 2,4D
T2 0,50 2,4D
T3 1 2,4D
T4 0,5 AIA
T5 1 AIA
38
Gráfico 4. Comparación entre los tratamiento con nuevas dosis hormonales frente al cultivar NP 3056
En ese ensayo se reflejó nuevamente que el tratamiento 2 es el mejor
estimulante de callos somáticos y también se confirma que el menos exitoso
fue el tratamiento 5.
En el gráfico 4 se observa la marcada diferencia de producción callogénica
que se obtuvo en el tratamiento 2 con el cultivar NP 2044.
0
20
40
60
80
100
120
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10
T1 0,25 2,4D
T2 0,50 2,4D
T3 1 2,4D
T4 0,5 AIA
T5 1 AIA
Tabla 12. Comparación porcentual general de los nuevos tratamientos probados con el cultivar NP 2044
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 Promedio
T1 0,25 2,4D 75 25 30 15 50 55 15 10 40 25 34
T2 0,50 2,4D 100 80 100 55 20 65 30 55 50 35 59
T3 1 2,4D 25 30 25 15 15 25 35 20 15 35 24
T4 0,5 AIA 5 10 0 25 10 0 30 15 10 0 10,5
T5 1 AIA 10 0 10 5 5 5 15 15 10 0 7,5
39
6. DISCUSIÓN
Uno de los factores que determina el éxito en los sistemas de
micropropagación es el estado fisiológico de la planta donadora del explante
(Gatica, 2002), por ello se inició la colecta a partir tejido joven y en buen
estado.
Para la ejecución de esta investigación fue necesario desarrollar un
protocolo de desinfección que nos ofreció el menor índice de contaminación
con el tejido que vino del campo ya que esto es un aspecto básico para el
cultivo de tejidos (Mroginski y Roca, 1991). Coincidicendo con Abdelnour y
Escalant, 1994; Leifert y Casseles, 2001 quienes determinan que el desarrollo
y proliferación de microrganismos contaminantes dentro de los medios de
cultivo perjudican el desarrollo de los explantes al competir por los nutrientes
del medio, por la toxicidad que puedan generar o por variaciones de pH.
Los cultivares estudiados de las especies C. canephora y C. arabica no
presentaron un buen desempeño en el cultivo in vitro, todos los cultivares
fueron probados con los diferentes medios de cultivo planificados, pero
ninguno de los tratamientos formulados generó tejido embriogénico
concordando con Girón (1998) quien menciona lo complejo que es ajustar la
etapa de inducción o desdiferenciación ya que muchas veces dentro de una
misma especie, las distintas variedades tendrán diferentes reacciones. Así,
un método establecido para un cultivar no podrá aplicarse a otra variedad a
pesar que pertenezca a la misma especie.
40
Considerando las concentraciones relativamente altas de hormonas se
discrepa con el trabajo de Cevallos, et al. (2002) en el que utilizaron 2 mg y
hasta 13 mg de 2,4 D por litro de medio de cultivo y en este trabajo de
investigación se pudo apreciar que las concentraciones hormonales altas (2 –
6 mg/L) no son útiles para los cultivares estudiados, reafirmando lo que
menciona Moncada, et al. (2005) el cual indica que las concentraciones bajas
de hormonas son las más beneficiosas para la inducción de callos en tejido
foliar de café.
El oscurecimiento de los callos somáticos por posible fenolización se vio
en algunos de los tratamientos probados en esta investigación sin embargo
dicha reacción tuvo un comportamiento negativo para la generación de
embriones, en contraste con lo mencionado por García y Menéndez, 1987;
Quiroz – Figueroa, et al. (2002; 2001) quienes indican que las sustancias
fenólicas son necesarias para la inducción de la embriogénesis somática
incluso señalan también que podrían actuar como inductoras o inactivar
sustancias inhibidoras para la embriogénesis somática.
Dado la problemática presentada con los tratamientos planteados
inicialmente, se propusieron nuevos tratamientos con dosis bajas de
hormonas (0,25; 0,50; 1 mg/L de 2,4 D y 0,5; 1 mg/L de de AIA) mismos que
generaron un notable incremento en la producción de callos primarios lo que
nos confirma que es mejor el uso de dosis bajas de fitohormonas tal como lo
menciona Moncada, et al. (2005).
41
En uno de los tratamientos derivados de la reformulación de
concentraciones hormonales el cual poseía 0,5 mg/L de 2,4D se generó la
aparición de embriones directamente sobre el explante, contrario a lo citado
por Paz (2000), quien acota que es necesaria una dosis alta de hasta 9 mg de
citoquininas para lograr la producción de embriones directamente sobre el
tejido.
42
7. CONCLUSIONES
Los tratamientos reformulados T1, T2, y T3 con concentraciones de 0,25 a
1 mg de 2,4D (hormona reguladora de crecimiento), fueron los que presentaron
una mejor respuesta del tejido foliar con la formación de callos primarios lo que
permitió el desarrollo de estructuras proembrionarias de café.
Los dos cultivares de Coffea arabica tuvieron una buena adaptación, y
desarrollo en vivero, lo que favoreció la donación de un buen tejido foliar
durante esta investigación. Sin embargo los dos cultivares de Coffea canephora
provenientes de la Amazonía ecuatoriana, debido a las complicaciones de
adaptabilidad dificultaron el proceso de introducción al cultivo in vitro por el
hecho de que las plantas nunca estuvieron en óptimo estado para ser las
mejores donantes de tejido foliar, a pesar de recibir riego constante y
fertilización adecuada.
Los tratamientos planteados inicialmente en el trabajo de investigación no
fueron los indicados para el desarrollo de la Embriogénesis somática en los
cultivares de café que se encontraban en estudio.
Los cultivares de café, Sarchimor común, Sarchimor mejorado, NP2044 y
NP3056 seleccionados no son aptos para este tipo de tecnología y por tal
razón no respondieron adecuadamente a pesar de las modificaciones en los
tratamientos.
43
8. RECOMENDACIONES
Reformular los tratamientos hormonales a dosis más bajas de auxinas ya
que las dosis probadas al ser muy elevadas no tuvieron el efecto esperado.
Realizar el experimento con otros cultivares con mayor adaptabilidad a la
zona litoral sur donde se encuentra ubicada la estación experimental ya que si
las plantas se encuentra en buen estado fisiológico las respuestas del tejido
extraído va a ser mejor.
Trabajar con dosis bajas de fitohormonas ya que en rangos bajos hay un
mejor resultado en el tejido introducido.
44
9. LITERATURA CITADA
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3%B3n%20y%20fertilizaci%C3%B3n%20del%20cafeto.pdf
49
ANEXOS
Foto 1: Desarrollo de los explantes de Coffea arabica var. Sarchimor Común:
(A) recipientes con tejido de café arábico. (B) recipiente con tejido foliar de café
arábico vista superior. (C) vista inferior de recipiente a las 6 semanas de haber
sido sembrado. Y (D) callo desarrollado después de 5 semanas de haber sido
transferido a medio de cultivo líquido.
A D C
B
50
Foto 2: Desarrollo de los explantes de Coffea arabica var. Sarchimor Mejorado:
(A) introducción de tejido de café arabico cv. Sarchimor mejorado. (B)
presencia de actividad callogénica a las 6 semanas de la introducción. (C) callo
desarrollado en medio de cultivo liquido 5 semanas después de su traspaso.
Foto 3: Desarrollo de los explantes de Coffea canephora var. NP 2044: (A)
introducción de material vegetal de café canéfora cv. NP 2044. (B) presencia
de callos después de 6 semanas de cultivo. (C) callo de cv. NP 2044, después
de 5 semanas de su traspaso a medio de cultivo líquido.
A B C
A B C
51
Foto 4: Desarrollo de los explantes de Coffea canephora var. NP 3056: (A)
siembra de tejido vegetal de café cv. NP3056 (B) presencia de callos a las 6
semanas de cultivo. (C) callos desarrollados después de 5 semanas de
cultivo en medio líquido.
Foto 5: Estructuras proembrionarias de Coffea Canephora var. NP 2044 Y NP
3056 obtenidas con los tratamientos hormonales reajustados: (A),(B)callos
primarios de café canefora (NP 2044) a las 5 semanas de cultivo. (C),callos de
café canefora (NP 2044) disgregados en el medio de cultivo. (D),(E),callos
primarios de café canefora (NP 3056) a las 6 semanas de cultivo.(F),embrion
somático obtenido a las 10 semanas directamente sobre el tejido sembrado en
medio de inducción de callos primarios.
A B C
A
F E D
C B
52
Foto 6: Reacción callogénica y fenolización de los mismos, obtenidos a partir
de tejido vegetal de Coffea arabica: (A) callos primarios la cuarta semana
después de la siembra en el medio cv. Sarchimor común
(B) fenolización de los callos a partir de la séptima semana, cv. Sarchimor
Mejorado
Foto 7: Explantes de hojas de café fenolizados, variedad NP3056 a la sexta
semana después de la siembra.
A B
