Farm a Cog Nosia

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

DEPARTAMENTO DE FARMACIA

Primera edición 2014 © D.R. Universidad Nacional Autónoma de México. Ciudad Universitaria, Delegación Coyoacán, C.P. 04510, México, Distrito Federal.

La publicación de esta obra fue posible gracias al apoyo de la Coordinación de Comunicación,a través de los Departamentos de Editorial y de Información (Taller de Imprenta).

Diseño de portada: LDCV Vianey Islas Bastida. Diseño de interiores: Maricela Hernández Casasola.Responsable editorial: CME Brenda Álvarez Carreño.

Hecho en México. Prohibida la reproducción total o parcial por cualquier medio, sin la autorización escrita del titular de los derechos patrimoniales.

ISBN: 978-607-02-5508-3

Manual de Prácticasde Laboratorio de Farmacognosia

Isabel Rivero Cruz · Rogelio Pereda Miranda · Mario Alberto Figueroa Saldívar · Abraham Madariaga MazónMaría Isabel Aguilar Laurents · Mabel Fragoso Serrano · Rachel Mata Essayag

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA

ISBN: 978-607-02-5508-3

DEPARTAMENTO DE FARMACIA

FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM

Autores:Isabel Rivero Cruz

Rogelio Pereda Miranda

Mario Alberto Figueroa Saldívar

Abraham Madariaga Mazón

María Isabel Aguilar Laurents

Mabel Fragoso Serrano

Rachel Mata Essayag

FINANCIADO POR: PROYECTO PAPIME 201511Publicación autorizada por el Comité Editorial de la Facultad de Química

Julio 2014

Primera edición 2014 © D.R. Universidad Nacional Autónoma de México. Ciudad Universitaria, Delegación Coyoacán, C.P. 04510, México, Distrito Federal.

La publicación de esta obra fue posible gracias al apoyo de la Coordinación de Comunicación, a través de los Departamentos de Editorial y de Información (Taller de Imprenta).

Diseño de portada: LDCV Vianey Islas Bastida. Diseño de interiores: Maricela Hernández Casasola.Responsable editorial: CME Brenda Álvarez Carreño.Hecho en México. Prohibida la reproducción total o parcial por cualquier medio, sin la autorización escrita del titular de los derechos patrimoniales.

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA

Primera edición: 2014Fecha de edición: 11 de abril de 2014D.R.© 2014 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICOCiudad Universitaria, Delegación Coyoacán,C.P. 04510, México, Distrito Federal.

ISBN: 978-607-02-5508-3

Tamaño: 27.40 MBTipo de impresión: PDFTiraje: 300 “Prohibida la reproducción total o parcial por cualquier medio,sin la autorización escrita del titular de los derechos patrimoniales”.

Impreso y hecho en México

Índice

Introducción .......................................................................................................................................9

Práctica 1. Obtención de la pinocembrina a partir de Dysphania graveolens ...................................... 10

Práctica 2. Separación del alcaloide piperina a partir de Piper nigrum................................................ 16

Práctica 3. Aislamiento de la diligustílida a partir de la raíz de Ligusticum porteri ............................... 22

Práctica 4. Camellia sinensis: obtención de la cafeína del té negro, pruebas de identidad y composición del té verde ............................................................................................. 28

Práctica 5. Control de calidad (pruebas de identidad y de composición) de las hojas de Psidium guajava ......................................................................................................................38

Práctica 6. Métodos para identificar a los compuestos marcadores de la droga cruda y preparados de Cassia senna .....................................................................................44

Práctica 7. Pruebas de identidad de Amphiptherygium adstringens .......................................................... 52

Práctica 8. Obtención del crudo alcaloideo a partir de la especie Datura stramonium ........................ 58

Práctica 9. Preparación de los aceites esenciales de Eugenia caryophyllus, Ligusticum porteri, Lippia graveolens, Poliomintha longiflora y Thymus vulgaris ........................................................ 64

Práctica 10. Obtención de la hesperidina a partir del pericarpio de Citrus sinensis ........................... 70

Práctica 11. Mezcla de esteroles de Glycine max ...................................................................................74

Práctica 12. Obtención de la cerina a partir de Quercus suber.............................................................. 80

Introducción

La calidad del proceso de enseñanza-aprendizaje práctico de la asignatura de Farmacognosia, del plan de estudios de la carrera de Química Farmacéutica Biológica (QFB), depende de la generación del material didáctico apropiado, de tal manera que la adecuación del programa se encuentre en armonía con las necesidades del sector productivo, promovidas por las tendencias en el uso y la regulación de los productos herbolarios y de otros agentes terapéuticos de origen natural.

En este contexto, el seguimiento de protocolos experimentales del programa de prácticas como instrumento que facilite el aprendizaje teórico-práctico de la Farmacognosia, además de ser una im-portante herramienta, ofrecerá una mayor eficiencia, una mejor secuencia didáctica y una motivación, tanto para profesores como para alumnos, durante el complejo proceso de enseñanza-aprendizaje.

El programa vigente del curso de Farmacognosia consta de cuatro unidades, dos de las cuales son teórico-prácticas: la correspondiente a la Unidad II Procedimientos generales para la obtención de los principios activos de origen vegetal y la Unidad IV Metabolitos secundarios de importancia me-dicinal. Los doce protocolos experimentales descritos en este Manual versan sobre los procedimientos específicos utilizados para la obtención de los productos naturales bioactivos a partir de sus fuentes na-turales, incluyendo su identificación química, botánica y biológica (Prácticas 1, 2, 3, 8, 10, 11 y 12). En particular, las Prácticas de la 4 a la 7 cubren aspectos relacionados con el control de calidad de materias primas empleadas en la terapéutica alopática, mismas que gozan de gran prestigio para el alivio de di-versos padecimientos. La realización de la Práctica 9 abarca el estudio de los aceites esenciales, lo cual es de gran relevancia, pues un hecho bien documentado es que la mayoría de las esencias tienen una importante demanda en la industria alimenticia, cosmética y farmacéutica.

Con base en lo expuesto, y de forma colegiada, el grupo de los profesores de Farmacognosia, con el apoyo del Programa de Apoyo a Proyectos para la Innovación y Mejoramiento de la Enseñanza (PAPIME), a través de los financiamientos PE 201504 y PE 201511, presenta este Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia, con el propósito de adecuar el programa de esta asignatura a los requerimien-tos contemporáneos propios de la disciplina, así como a las necesidades inherentes del sector productivo, para que el alumno desarrolle las habilidades necesarias para su futuro desempeño como un especialista de alto nivel, en los distintos quehaceres de la profesión farmacéutica relacionados con los productos naturales medicinales.

Los autores

Práctica 00 11

Práctica 1. Obtención de la pinocembrina a partir de Dysphania graveolens

1.1 Objetivo general

Proporcionar al alumno el entrenamiento práctico en los procedimientos específicos, utilizados para la obtención y la identificación de la pinocembrina del epazote de zorrillo.

1.2 Objetivos particulares

1. Preparar el extracto orgánico del epazote de zorrillo mediante la técnica de reflujo.2. Fraccionar el extracto orgánico mediante una cromatografía en columna abierta.3. Separar y purificar a la pinocembrina, constituyente mayoritario presente en el extracto,

mediante un proceso de cromatografía en capa delgada.4. Establecer la identidad del producto aislado mediante la comparación de sus propiedades

físicas y cromatográficas con aquellas de una muestra auténtica.

1.3 Antecedentes

La especie Dysphania graveolens (Willd.) Mosyakin & Clemants (Amaranthaceae) es una planta erguida y glandulosa, que mide aproximadamente entre 20 y 80 cm de altura. Sus tallos son ramificados, rojizos y con rayas. Sus hojas son ovadas u oblongas, miden entre dos y seis cm de largo por uno a tres cm de ancho, poseen lóbulos oblongos o deltoides, sin pelos o con una cubierta pegajosa en el haz, cubiertas de glándu-las amarillas en el envés y con peciolo delgado. Sus flores son pediceladas con numerosas cimas axilares y muy aromáticas. Esta especie se conoce popularmente como epazote de zorrillo y se encuentra ampliamente distribuida en el continente americano, desde el Sur de los Estados Unidos hasta Argentina. En México, se localiza en el Norte del país en los estados de Chihuahua y Coahuila, pasando por la zona centro (Hidalgo, Estado de México, Morelos y Distrito Federal) hasta el Sur (Chiapas).

La planta se utiliza en las prácticas médicas populares de México y otras regiones del mundo, por sus propiedades antihelmínticas, estomáquicas y carminativas. Uno de los constituyentes activos del epazote de zorrillo es la pino-cembrina, flavanona con actividad fasciolicida, antiprotozoaria y antihelmíntica (Camacho et al., 1991).

Figura 1. Dysphania graveolens (Willd.) Mosyakin & Clemants (Amaranthaceae) y estructura de la pinocembrina.

1

12 Práctica 00

1.4 Procedimiento experimental

1.4.1 Preparación del extracto

Se pesan 50 g de material vegetal en un matraz bola de 500 mL y se adicionan 300 mL de hexano para someterlo a un proceso de reflujo durante una hora. Transcurrido este tiempo, el extracto de hexano se filtra en un embudo Büchner y se concentra a presión reducida hasta sequedad. Posteriormente, el material vegetal se somete a una segunda extracción por reflujo utilizando acetona durante 60 minutos. Al cabo de este proceso, el extracto de acetona obtenido se filtra y se concentra a presión reducida hasta obtener un extracto seco. Finalmente, ambos extractos obtenidos se pesan en una balanza granataria para calcular el rendimiento.

1.4.2 Fraccionamiento preliminar del extracto orgánico

El extracto de acetona (inciso 1.4.1) se fracciona mediante una cromatografía en columna abierta, de acuerdo con el procedimiento que se describe a continuación:

(1) Se pesan 10 g de gel de sílice (fase estacionaria) por cada gramo de muestra y se desactiva con agua al 10% (v/v). Se reserva la octava parte de la fase estacionaria desactivada.

(2) Se disuelve la muestra a cromatografiar en un volumen no mayor de 5 mL de acetona; para favorecer la disolución de la muestra se puede calentar en baño María. A continuación se adsorbe la disolución anterior en la octava parte de la sílice reservada en el punto 1 y se deja secar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

(3) Se suspende la gel de sílice restante en una mezcla de hexano–CHCl3 (9:1) y se vierte en la columna cromatográfica conteniendo 15 mL de la mezcla de elución.

(4) Se siembra la columna con la mezcla adsorbente-muestra (punto 2).(5) Se realiza el proceso de elución utilizando los gradientes entre hexano–CHCl3 que se

indican en el Cuadro 1 y se recolectan las fracciones cromatográficas correspondientes.(6) Por último, las fracciones recolectadas se concentran a presión reducida y se realiza el

análisis cromatográfico en capa delgada, empleando como sistema de elución hexano–CHCl3 (1:1). Para la visualización de los constituyentes de cada fracción, se procede de acuerdo a la técnica que se describe en el inciso 1.4.4.

Cuadro 1. Sistemas de elución utilizados para el desarrollo del proceso cromatográfico en columna abierta.

Núm. de fracción Mezcla de elución Volumen (mL)

1 Hex–CHCl3 (9:1) 120

2 Hex–CHCl3 (8:2) 120

3 Hex–CHCl3 (7:3) 120

4 Hex–CHCl3 (6:4) 120

5 Hex–CHCl3 (1:1) 120

6 Hex–CHCl3 (4:6) 120

1

Práctica 00 13

1.4.3 Separación y purificación de la pinocembrina mediante un proceso de cromatografía en capa delgada

La separación y la purificación de la pinocembrina a partir de la fracción 4 (inciso 1.4.2) se realiza me-diante una cromatografía en capa delgada modalidad preparativa. Para ello, se utilizan placas de vidrio recubiertas de gel de sílice con un espesor de 0.25 mm (gel de sílice F254 Merck), de acuerdo al siguiente procedimiento:

(1) 15 mg de la muestra se disuelven en 0.5 mL de Hex–CHCl3 (6:4). La aplicación de la muestra se realiza con un capilar en forma de banda.

(2) El proceso de elución se lleva a cabo con una mezcla de CH2Cl2–MeOH (95:5). La fase móvil deberá recorrer 18 cm a partir del punto de aplicación para desarrollar la cromatoplaca. Concluido el proceso de elución, se retira la cromatoplaca de la cámara y se deja secar bajo una corriente de aire.

(3) Examinar la cromatoplaca con luz UV (254 y 365 nm) y marcar las zonas de fluorescencia.(4) A continuación, se desprenden las zonas de absorción de interés de la cromatoplaca

mediante el empleo de una espátula. La sílice obtenida se transfiere a un matraz Erlenmeyer de 50 mL y se adicionan aproximadamente 30 mL de CH2Cl2. La suspensión anterior se agita constantemente durante un periodo de 20 minutos y al cabo de este tiempo, la suspensión se filtra y se concentra a presión reducida.

(5) Finalmente, se realiza el análisis cromatográfico cualitativo del compuesto obtenido, como referencia se utiliza a la pinocembrina.

1.4.4 Identificación de la pinocembrina

Se realiza un análisis por cromatografía en capa delgada utilizando la técnica de coelución. Como referen-cia se emplea una muestra comercial de pinocembrina (Figura 2).

Soporte: Gel de sílice F254 Merck.Fase móvil: CH2Cl2–MeOH (95:5).Preparación de la muestra: Se disuelve 1 mg del producto aislado en 0.5 mL de CH2Cl2–EtOH (8:2).Preparación de la muestra de referencia: Se disuelve 1 mg de la referencia de pinocembrina en 0.5 mL de CH2Cl2–EtOH (8:2).Revelador: Solución cromógena de sulfato cérico amoniacal [(NH4)4Ce(SO4)4 · 2H2O (1.2 g); H2SO4 (2.2 mL); hielo picado (35 g)].Procedimiento: (1) Se aplica sobre la superficie de la placa la referencia, la muestra y una mezcla (1:1) de la muestra y la referencia (coelución) en forma de puntos con la ayuda de un capilar, en carriles independien-tes y aproximadamente a un cm del extremo inferior del cromatofolio. Deberá existir una separación de por lo menos 15 mm entre cada aplicación. (2) Se realiza el proceso de elución cromatográfica con la fase móvil indicada. Al término, se seca la cromatoplaca bajo una corriente de aire y se examina bajo una lám-para de luz UV a 254 y 365 nm. Se marcan en el cromatograma las zonas de fluorescencia. (3) Enseguida, se rocía la solución reveladora hasta cubrir la cromatoplaca y se calienta hasta la aparición de manchas co-loridas. Las bandas correspondientes a la muestra, a la referencia y a la coelución (e.g. mezcla de la muestra y la referencia) deben coincidir en su posición (Rf) y coloración.

1

14 Práctica 00

Figura 2. Cromatograma en capa delgada de la pinocembrina aislada a partir del epazote de zorrillo: a) referencia de pinocembrina, b) coelución y c) pinocembrina aislada.

1.5 Resultados

1.5.1 Determine el rendimiento de la pinocembrina con base en el peso seco del material vegetal de acuer-do a la siguiente expresión matemática: (A × 100)/B, en donde: A representa el peso (g) de la pinocembrina y B es el peso (g) del material vegetal seco.

1.5.2 Analice los resultados del cromatograma obtenido en el inciso 1.4.4. Calcule el factor de retención

(Rf) de la pinocembrina (muestra de referencia y muestra aislada) en el cromatofolio.

1.6 Bibliografía

- Camacho, M.R.; Sánchez, B.; Quiroz, H.; Contreras, J.L.; Mata, R. J. Ethnopharmacol. 1991, 31, 383–389.

1.7 Material y equipo

Número de sesiones: 3

Sesión 1

Material1 matraz bola de 500 mL parrilla de calentamiento1 refrigerante recto con mangueras perlas de ebullición1 embudo Büchner rotaevaporador1 matraz kitasato de 500 mL material vegetal (epazote de zorrillo)1 espátula cromo-níquel1 varilla de vidrio1 probeta graduada de 500 mL

Reactivos

hexano (C6H14)

acetona (CH3COCH3)

1

Práctica 00 15

Sesión 2

Material3 vasos de precipitados de 250 mL cámara de elución1 espátula cromo-níquel bomba de aspersión1 varilla vidrio aspersor1 probeta graduada de 100 mL lámpara de luz UV1 probeta graduada de 10 mL balanza granataria1 columna cromatográfica rotaevaporador2 pinzas de tres dedos con nuez capilares2 matraces bola de 250 mL algodón2 pipetas Pasteur con bulbo pliego de papel filtro1 vidrio de reloj parrilla de calentamiento1 embudo de filtración rápida placas cromatográficas de

aluminio de 20 × 20 cm6 matraces Erlenmeyer de 250 mL

Reactivos

cloroformo (CHCl3)hexano (C6H14)acetona (CH3COCH3)sulfato cérico amoniacal (NH4)4Ce(SO4)4 · 2H2Ogel de sílice

Sesión 3

Material1 espátula cromo-níquel rotaevaporador2 matraces bola de 250 mL aspersor2 pipetas Pasteur con bulbo cámara de elución de 20 × 20 cm2 vasos de precipitados de 150 mL balanza granataria1 embudo de filtración rápida lámpara de luz UV1 probeta graduada de 10 mL algodón

pliego de papel filtrobomba de aspersión

placas cromatográficas de vidrio de 20 × 20 cmplacas cromatográficas de aluminio de 20 × 20 cm

Reactivoshexano (C6H14)

metanol anhidro (MeOH)

etanol absoluto (CH3CH2OH)

cloruro de metileno (CH2Cl2)

cloroformo (CHCl3)

sulfato cérico amoniacal (NH4)4Ce(SO4)4 · 2H2O

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Práctica 00 17

Práctica 2. Separación del alcaloide piperina a partir de Piper nigrum


Proporcionar al alumno el entrenamiento práctico en los procedimientos específicos, para la obtención y la identificación de alcaloides de tipo amida, como la piperina, a partir de la pimienta negra.


1. Obtener el extracto orgánico de la pimienta negra mediante la técnica de extracción continua vía Soxhlet.

2. Fraccionar mediante métodos químicos el extracto orgánico de la pimienta.3. Purificar a la piperina, constituyente mayoritario presente en el extracto, mediante un

proceso de recristalización.4. Establecer la identidad del producto aislado mediante la comparación de sus propiedades


1.3 Antecedentes

La pimienta, Piper nigrum L. (Piperaceae, Figura 1), es una planta perenne que emigró de la India hace más de 4000 años. En la era clásica griega y durante el Imperio Romano se utilizó para pagar tributos y como materia de contrabando. Desde tiempos inmemoriales, los frutos maduros y secos de la especie son altamente apreciados como condimento, quizás la forma más difundida de consumo de esta planta.

El fruto de la pimienta contiene un aceite esencial (1–2.5%) constituido por más de 273 componentes, incluyendo al -pineno, al linalol, a la damascenona, el eugenol, al m-cresol, el guayacol, el escatol, el piperonal, el -cariofileno, el 3-careno, el -felandreno, el -copaeno, el -elemeno, el -humuleno, el -bisaboleno y el limoneno, principalmente. Otros constituyentes presentes pertenecen a la categoría de los esteroides, los lignanos, los flavonoides, algunos ácidos orgánicos, compuestos fenólicos de tipo C6–C3 y más de 100 alcaloides, que en su mayoría son derivados de tipo amida de la piperidina. La pimienta debe su olor característico al aceite esencial y su sabor picante a los alcaloides. El principal alcaloide de la planta es la piperina, una amida generada a partir de la condensación de la piperidina y el ácido pipérico. Este alcaloide posee propiedades depresoras del sistema nervioso central, antiinflamatorias y hepatoprotectoras; también se ha utilizado para incrementar la biodisponibilidad de medicamentos, ya que facilita la absor-ción intestinal.

La pimienta negra también se valora por sus propiedades medicinales. Son muchas las investigaciones científicas que han demostrado la eficacia de sus frutos y algunos de sus constituyentes como agentes bac-tericidas, fungicidas, insecticidas, rubefacientes, antialérgicos y estornutatorios.

2

18 Práctica 00

Figura 1. Piper nigrum L. (Piperaceae) y estructura de la piperina.


1.4.1 Preparación y fraccionamiento del extracto

Se pesan 30 g del material vegetal seco y molido para someterlo a una extracción continua con 200 mL de MeOH en un aparato Soxhlet durante una hora y media. Transcurrido este tiempo, el extracto se filtra y se concentra a presión reducida hasta obtener un extracto semiseco. El residuo resultante se trata con 30 mL de una solución en etanol de KOH al 10%. La solución anterior se deja reposar durante 20 minutos y al cabo de este tiempo se elimina el sólido insoluble que se genera mediante filtración al vacío.

1.4.2 Separación y purificación del alcaloide

La solución de metanol obtenida (inciso 1.4.1) se mantiene en reposo durante una semana para favorecer la formación de cristales amarillos. Posteriormente, los cristales se filtran al vacío, se lavan con 20 mL de agua destilada y se dejan secar durante 20 minutos. Enseguida, éstos se disuelven en la mínima cantidad de una mezcla de hexano–acetona (2:3) en caliente. La solución se deja enfriar a temperatura ambiente durante 15 minutos y, al cabo de este tiempo, se enfría en baño de hielo durante 30 minutos. Finalmente, los cristales se separan de la solución por filtración al vacío y se pesan para obtener el rendimiento.

1.4.3 Identificación de la piperina

Se realiza un análisis por cromatografía en capa delgada utilizando una muestra comercial de piperina como referencia y las siguientes condiciones de análisis (Figura 2):

Soporte: gel de sílice F254 Merck.Fase móvil: benceno–AcOEt (2:1).Preparación de la muestra: se disuelve 1 mg de la referencia de piperina y 1 mg del producto aislado, por sepa-rado, en 0.5 mL de CHCl3.Revelador: Solución del reactivo de Dragendorff (yodobismutato de potasio).

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Práctica 00 19

Procedimiento: (1) Se aplica sobre la superficie de la placa, a un cm de distancia del extremo inferior del cromatofolio, la muestra y la referencia en forma de puntos con la ayuda de un capilar, en carriles indepen-dientes. (2) Se realiza el proceso de elución cromatográfica con la fase móvil indicada. Al término, se seca la cromatoplaca bajo una corriente de aire y se examina bajo una lámpara de luz UV a 254 y 365 nm. Se marcan en el cromatograma las zonas de fluorescencia. (3) Enseguida, se rocía la solución reveladora hasta cubrir la cromatoplaca sin sobresaturarla para permitir la aparición de color. Las bandas correspondientes a la muestra y a la referencia deben de coincidir en su posición (Rf) y coloración.

1.5 Resultados

1.5.1 Determine el rendimiento de la piperina con base en el peso seco del material vegetal de acuerdo a la siguiente expresión matemática: (A × 100)/B, en donde: A es el peso (g) de la piperina y B es el peso (g) del material vegetal seco.1.5.2 Analice los resultados del cromatograma obtenido en el inciso 1.4.3. Calcule los correspondientes factores de retención (Rf) de la muestra y de la referencia.1.5.3 Elabore un diagrama de flujo que esquematice el proceso experimental de obtención de la piperina.

1.6 Bibliografía

– Evans, W. Trease and Evans Pharmacognosy. Edit. W.B. Saunders. 15ta Edición, Londres, Inglaterra, 2009, pp 353–355.

– Ikan, R. Natural Products: A Laboratory Guide. Edit. Academic Press, 2da Edición, San Diego, California, 1991, pp 233–236.

– Scott, I.; Puniani, E.; Jensen, H.; Livesey, J.; Poveda, L.; Sánchez, P.; Durst, T.; Arnason, J. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 1907–1913.

– Srinivasan, K. Crit. Rev. Food Sci. 2007, 47, 735–748.

– Wei, K.; Wei, L.; Koike, K.; Chen, Y.; Nikaido, T.; Nigramides, A. J. Org. Chem. 2005, 70, 1164–1176.

Figura 2. Cromatograma en capa delgada de la piperina aislada a partir de la pimienta: a) referencia de piperina, b) muestra de piperina aislada.

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20 Práctica 00



Sesión 1

Material1 rotaevaporador papel aluminio1 extractor Soxhlet algodón1 espátula cromo-níquel papel filtro1 embudo Büchner frascos viales2 vasos de precipitados de 100 mL propipeta1 pipeta graduada de 10 mL material vegetal (pimienta negra)1 probeta graduada de 10 mL2 pipetas Pasteur con bulbo1 vidrio de reloj1 vaso de precipitados de 250 mL

Reactivosetanol absoluto (EtOH)metanol anhidro (MeOH)hidróxido de potasio (KOH)

Sesión 2

Material1 espátula cromo-níquel placas cromatográficas de aluminio de 20 × 20 cm1 embudo Büchner parrilla de calentamiento1 propipeta bomba de aspersión1 probeta graduada de 10 mL aspersor1 pipeta Pasteur con bulbo lámpara de luz UV1 vidrio de reloj papel filtro2 vasos de precipitados de 250 mL algodón

Reactivos

acetato de etilo (AcOEt)benceno (C6H6)hexano (C6H14)cloroformo (CHCl3)acetona (CH3COCH3)reactivo de Dragendorff

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Práctica 00 23

Práctica 3. Aislamiento de la diligustílida a partir de la raíz de Ligusticum porteri


Proporcionar al alumno el entrenamiento práctico en los procedimientos específicos, utilizados para la obtención y la identificación de los marcadores activos de la raíz de chuchupate.


1. Aplicar la técnica de maceración para elaborar un extracto orgánico de la raíz de chuchupate.2. Utilizar a la cromatografía en columna abierta para el fraccionamiento preliminar del

extracto orgánico.3. Separar y purificar a la diligustílida, constituyente mayoritario presente en el extracto,

mediante un proceso de cristalización.4. Establecer la identidad del producto aislado mediante la comparación de sus propiedades


1.3 Antecedentes

La especie medicinal, Ligusticum porteri Coulter & Rose (Apiaceae) (Figura 1), se conoce popularmente con los nombres de chuchupate, osha, raíz de angélica, raíz del cochino, yerba del cochino, entre otros. Los tarahumaras la designan como wasia. Los preparados de esta planta (infusión, decocción o esencia) se emplean para aliviar dolores de estómago y para tratar la tos, insomnio, resfriados, diarrea y otros desórdenes gastrointestinales. También se ha reportado su uso como agente antiséptico, carminativo, antidiabético y como antídoto con-tra la picadura de alacrán. La planta se puede utilizar en combinación con otras plantas medicinales como Croton niveus, Angelica archangelica, Juliana adstringens y Brickellia cavanillesii, por mencionar algunas.

Esta especie presenta tallos firmes, caulescentes y ramificados que miden entre 50 y 100 cm de altura. Sus raíces son fibrosas, axonomórficas, perennes y presentan pocas raíces de tipo adventicio desde la corona. Las hojas son ovadas, pecioladas y trenado-pinnadas, miden entre 15 y 28 cm de largo y entre 12 y 20 cm de ancho, con lóbulos obtusos o agudos y dentados. Sus inflorescencias en forma de sombrilla son blancas. Sus frutos son esquizocárpicos y oblongos, entre 5 y 8 mm de largo y entre 2 y 4 mm de ancho. Sus semillas son aplanadas dorsalmente en la sección transversal y acanaladas bajo los tubos.

Desde el punto de vista químico, la especie L. porteri ha sido objeto de numerosas investigaciones que han permitido el aislamiento y la caracterización de diversos metabolitos secundarios que incluyen: ftálidas, terpenoides, compuestos de tipo fenólico y cumarinas (Delgado et al., 1988, 1992; Ríos et al., 1992; Zschoke et al., 1998; Hou et al., 2004; Cégiela-Carlioz et al., 2005).

Las ftálidas, Z-ligustílida y diligustílida han sido caracterizadas como los principios mayoritarios con pro-piedades neuroprotectoras, relajantes de la musculatura lisa, antibacterianas, hipoglucemiantes y antisépticas del extracto íntegro de la planta.

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24 Práctica 00


1.4.1 Preparación del extracto orgánico

Se pesan 50 g de material vegetal seco y molido en un matraz bola de un litro y se adicionan 200 mL de una mezcla de CH2Cl2-MeOH (1:1) durante una semana a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, el macerado se filtra y se concentra a presión reducida hasta obtener un extracto seco. Se pesa el extracto en una balanza granataria para calcular el rendimiento.

Figura 1. Ligusticum porteri Coulter & Rose (Apiaceae) y estructuras de la Z-ligustílida y la diligustílida.

1.4.2 Fraccionamiento preliminar del extracto orgánico

El extracto orgánico (inciso 1.4.1) se fracciona mediante una cromatografía en columna abierta, de acuerdo con el procedimiento que se describe a continuación:

(1) Se pesan 10 g de gel de sílice (fase estacionaria) por cada gramo de muestra y se desactiva con agua al 10% (v/v). Se reserva la octava parte de la fase estacionaria desactivada.

(2) Se disuelve la muestra a cromatografiar en un volumen no mayor de 5 mL de CH2Cl2-MeOH (1:1); para favorecer la disolución de la muestra se puede calentar en baño María. A continuación, se adsorbe la disolución anterior en la octava parte de la sílice reservada en el punto 1 y se deja secar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

(3) Se suspende la gel de sílice restante en una mezcla de hexano–CH2Cl2 (9:1) y se vierte en la columna cromatográfica conteniendo 15 mL de la mezcla de elución.

(4) Se siembra la columna con la mezcla adsorbente-muestra (punto 2).(5) Se realiza el proceso de elución utilizando los gradientes entre hexano–CH2Cl2 que se

indican en el Cuadro 1 y se recolectan las fracciones cromatográficas correspondientes.(6) Por último, las fracciones recolectadas se concentran a presión reducida y se realiza el

análisis cromatográfico en capa delgada empleando como sistema de elución CH2Cl2. Para la visualización de los constituyentes de cada fracción, se procede de acuerdo a la técnica que se describe en el inciso 1.4.3.

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Práctica 00 25

Cuadro 1. Sistemas de elución para el desarrollo del proceso cromatográfico en columna abierta.

Núm. de fracción Mezcla de elución Volumen (mL)

1 Hex–CH2Cl2 (9:1) 120

2 Hex–CH2Cl2 (8:2) 120

3 Hex–CH2Cl2 (7:3) 120

4 Hex–CH2Cl2 (6:4) 120

5 Hex–CH2Cl2 (1:1) 120

6 Hex–CH2Cl2 (4:6) 120

1.4.3 Análisis cromatográfico

El extracto orgánico, las fracciones primarias y/o los compuestos puros se analizan mediante una croma-tografía en capa delgada utilizando las siguientes condiciones de análisis (Figura 2):Soporte: gel de sílice F254 Merck.Fase móvil: CH2Cl2.Preparación de las muestras: se disuelve 1 mg del extracto orgánico, de las fracciones primarias y/o de los com-puestos puros, por separado, en 0.5 mL de hexano–CH2Cl2 (1:1).Revelador: solución cromógena de sulfato cérico amoniacal.Procedimiento: (1) Se aplica sobre la superficie de la placa las muestras en forma de puntos con la ayuda de un capilar, en carriles independientes y aproximadamente a un cm del extremo inferior del cromatofolio. Deberá existir una separación de por lo menos 15 mm entre cada aplicación. (2) Se realiza el proceso de elución cromatográfica con la fase móvil indicada. Al término, se seca la cromatoplaca bajo una corriente de aire y se examina bajo una lámpara de luz UV a 254 y 365 nm. Se marcan en el cromatograma las zonas de fluorescencia. (3) Enseguida, se rocía la solución reveladora hasta cubrir la cromatoplaca y se ca-lienta hasta la aparición de manchas coloridas. Las bandas correspondientes a los productos mayoritarios presentes en cada muestra deben de coincidir en su posición (Rf) y coloración.

Figura 2. Cromatograma en capa delgada del: a) extracto orgánico de la droga cruda de chuchupate y b) referencia (diligustílida).

3

26 Práctica 00

1.5 Resultados

1.5.1 Determine el rendimiento de la diligustílida con base en el peso seco del material vegetal de acuerdo a la siguiente expresión matemática: (A × 100)/B, en donde: A es el peso (g) de la diligustílida y B es el peso (g) del material vegetal seco.1.5.2 Analice los resultados de los cromatogramas obtenidos. Calcule los correspondientes factores de retención (Rf) de las muestras y de las referencias utilizadas.1.5.3 Compare las constantes físicas y cromatográficas generadas experimentalmente con las descritas previamente en la literatura especializada.

1.6 Bibliografía

– Cégiela-Carlioz, P.; Bessiere, J.M.; David, B.; Mariotte, A.M.; Gibbons, S.; Dijoux-Franca, M.G. J. Flavour Fragr. 2005, 20, 671-675.

– Martínez, M. Las plantas medicinales de México. Edit. Botas, 6ta Edición, México, 1989.

– Delgado, G.; Reza-Garduño, R.G.; Toscano, R.A.; Bye, R.; Linares, E. Heterocycles, 1988, 27, 1305-1312.

– Delgado, G.; Reza-Garduño, R.G.; Ríos, M.Y.; Del Río, F. Planta Med. 1992, 58, 570-571.

– Hou, Y.Z.; Zhao, G.R.; Yang, J.; Yuan, Y.J.; Zhu, G.G.; Hiltunen, R. Life Sci. 2004, 75, 1775–1786.

– Zschoke, S.; Liu, J.H.; Stuppner, H.; Bauer, R. Phytochem. Anal. 1998, 9, 283–290.



Sesión 1

Material1 matraz Erlenmeyer de 1000 mL 1 espátula cromo-níquel1 varilla de vidrio 1 probeta graduada de 1000 mL

material vegetal (raíz de chuchupate)Reactivosmetanol anhidro (MeOH)

cloruro de metileno (CH2Cl2)

3

Práctica 00 27

Sesión 2

Material3 vasos de precipitados de 250 mL cámara de elución1 espátula cromo-níquel bomba de aspersión1 varilla de vidrio aspersor1 probeta graduada de 100 mL lámpara de luz UV1 probeta graduada de 10 mL balanza granataria1 columna cromatográfica rotaevaporador2 pinzas de tres dedos con nuez capilares2 matraces bola de 250 mL algodón2 pipetas Pasteur con bulbo pliego de papel filtro1 vidrio de reloj parrilla de calentamiento1 embudo de filtración rápida placas cromatográficas de

aluminio de 20 × 20 cm6 matraces Erlenmeyer de 250 mLReactivoscloruro de metileno (CH2Cl2)hexano (C6H14)sulfato cérico amoniacal (NH4)4Ce(SO4)4 · 2H2Ogel de sílice

3

Práctica 00 29

Práctica 4. Camellia sinensis: obtención de la cafeína del té negro, pruebas de identidad y composición del té verde

1.1 Objetivos generales

Proporcionar al alumno el entrenamiento práctico en los procedimientos específicos, utilizados para la obtención de la cafeína a partir del té negro (Camellia sinensis).

Introducir al alumno en la realización de pruebas de identidad y de composición sencillas, para establecer un control de calidad adecuado de las drogas crudas.


1. Aplicar la técnica de decocción para la obtención del extracto acuoso del té negro.2. Separar y purificar a la cafeína presente en el extracto acuoso, mediante la combinación de

métodos químicos y procesos de reparto.3. Establecer la identidad de la cafeína presente en la muestra analizada mediante la reacción

de la muréxida y por comparación de sus propiedades físicas y cromatográficas con aquellas de una muestra auténtica.

4. Obtener una mezcla de flavan-3-oles a partir de la infusión del té verde, mediante un proceso de reparto.

5. Establecer la identidad de los derivados de flavan-3-oles presentes en las muestras analizadas, mediante la comparación de sus propiedades cromatográficas con aquellas de una muestra auténtica y la determinación del contenido de derivados de catequinas utilizando el método de Folin-Ciocalteu.

1.3 Antecedentes

El té, Camellia sinensis (L.) Kuntze (Theaceae), es un arbusto originario de las regiones tropicales y subtropicales de Asia. La especie es un árbol de hoja perenne y elíptica, con flores blancas y frutos capsulares con tres se-millas negras (Figura 1). En estado silvestre el árbol puede alcanzar hasta 10 m de altura, aunque las plantas cultivadas se podan constantemente para limitar su altura a 1.5 m del suelo, circunstancia que favorece la formación de hojas más grandes y así se facilita su cosecha. Existen cuatro tipos principales de té (blanco, verde, rojo y negro) que dan origen a más de 3000 variedades en todo el mundo. El té verde está constituido por las hojas jóvenes desecadas de la especie C. sinensis. Los constituyentes activos en hojas son las metilxan-tinas [cafeína, teofilina y teobromina], los derivados de catequinas [(-)-epi-galocatequina, (+)-catequina, (-)-epi-catequina, (-)-galato de epi-galocatequina y (-)-galato de epi-catequina]; los flavonoles (apigenina y 3-vincenina) y la amida teanina (Figura 2).

Se ha demostrado que el té verde contiene una gran cantidad de compuestos antioxidantes (flavan-3-oles), que ayudan a disminuir los efectos de los radicales libres. En consecuencia, el té es un agente que ayuda a prevenir enfermedades que involucran el estrés oxidativo y reduce los efectos propios del envejecimiento.

4

30 Práctica 00

Figura 2. Estructuras de los principales metabolitos presentes en las hojas de Camellia sinensis.

Figura 1. Camellia sinensis (L.) Kuntze (Theaceae).

4

Práctica 00 31


1.4.1 Obtención de la cafeína

En un vaso de precipitado de 250 mL, se colocan 20 g de té negro, 5 g de carbonato de sodio y 100 mL de agua destilada. La mezcla se calienta durante 20 minutos utilizando una parrilla de calentamiento. Si es necesario se adiciona agua para mantener constante el volumen inicial de la solución. Transcurrido el tiempo de extracción, la solución se filtra en caliente mediante filtración rápida. Posteriormente, el filtrado se neutraliza cuidadosamente, mediante la adición gota a gota de ácido sulfúrico concentrado en condiciones de agitación. Enseguida, esta solución se somete a un proceso de reparto utilizando CH2Cl2

(3 ´ 50 mL). Las fases orgánicas se combinan y se evapora el disolvente utilizando un rotaevaporador. Finalmente, se pesa la cafeína obtenida en una balanza granataria, para calcular el rendimiento con base en el peso de la droga cruda utilizada.

1.4.2 Ensayos de identidad

1.4.2.1 Identificación cromatográfica de la cafeína

Se realiza un análisis por cromatografía en capa delgada utilizando la técnica de coelución. Como referen-cia se emplea una muestra comercial de cafeína (Figura 2).

Soporte: gel de sílice F254 Merck.Fase móvil: CH2Cl2-MeOH (95:5).Preparación de la muestra: se disuelve 1 mg de la cafeína aislada en 0.5 mL de CH2Cl2.Preparación de la muestra de referencia: se disuelve 1 mg de la referencia de cafeína en 0.5 mL de CH2Cl2.Revelador: como agente cromógeno se utiliza una solución de yodo en HCl (Solución A: mezclar 1 g de yo-duro de potasio y 2 g de yodo en 10 mL de etanol absoluto. Solución B: mezclar 50 mL de HCl y 50 mL de etanol absoluto).Procedimiento: (1) Se aplica sobre la superficie de la placa la referencia, la muestra y una mezcla (1:1) de la muestra y la referencia (coelución) en forma de puntos con la ayuda de un capilar, en carriles indepen-dientes y aproximadamente a un cm del extremo inferior del cromatofolio. Deberá existir una separación de por lo menos 15 mm entre cada aplicación. (2) Se realiza el proceso de elución cromatográfica con la fase móvil indicada. Al término, se seca la cromatoplaca bajo una corriente de aire y se examina bajo una lámpara de luz UV a 254 y 365 nm. Se marcan en el cromatograma las zonas de fluorescencia. (3) Ense-guida, se rocía la solución reveladora A sobre la cromatoplaca hasta saturación, posteriormente se rocía la solución reveladora B y se calienta hasta la aparición de manchas coloridas. La cafeína desarrolla una coloración marrón característica. Las bandas correspondientes a la muestra, a la referencia y a la coelución deben de coincidir en su posición (Rf) y coloración.

4

32 Práctica 00

1.4.2.2 Prueba de la muréxida

En una cápsula de porcelana, se coloca una pequeña cantidad de cafeína (~10 mg) y se adicionan tres gotas de HNO3 concentrado. Esta solución ácida se evapora a sequedad en una parrilla de calentamiento. Posteriormente, se adicionan dos gotas de NH4OH concentrado. Si la muestra analizada corresponde a la cafeína, se observará un residuo morado en el fondo de la cápsula de porcelana.

1.4.3 Identificación y cuantificación de los fenoles totales presentes en el té verde

1.4.3.1 Preparación del extracto

Se colocan 5 g de té verde en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y se adicionan 100 mL de agua en ebu-llición. La solución anterior se deja en reposo durante 30 minutos y se filtra a través de papel filtro. Ense-guida, el filtrado se somete a un proceso de reparto empleando AcOEt (3 ´ 75 mL). Las fases orgánicas se combinan, se secan sobre sulfato de sodio anhidro y se evapora el disolvente a presión reducida sin dejar a sequedad. Este mismo procedimiento se repite utilizando el extracto estandarizado de las hojas de té verde.

1.4.3.2 Análisis cromatográfico

Las fracciones orgánicas de acetato de etilo y la referencia de catequina se analizan mediante una croma-tografía en capa delgada utilizando las siguientes condiciones de análisis (Figura 3):

Soporte: gel de sílice F254 Merck.Fase móvil: tolueno-acetona-ácido fórmico (9:9:2).Preparación de la muestra: se disuelven 5 mg de las fracciones orgánicas de acetato de etilo en 1 mL de metanol, por separado.Preparación de la muestra de referencia: Se disuelve 1 mg de la referencia de catequina en 0.5 mL de metanol.Revelador: Solución de vanillina sulfúrica al 5%.Procedimiento: (1) Se aplica sobre la superficie de la placa la referencia, las muestras y una mezcla (1:1) de la muestra y la referencia (coelución) en forma de puntos con la ayuda de un capilar, en carriles independien-tes y aproximadamente a un cm del extremo inferior del cromatofolio. (2) Se realiza el proceso de elución cromatográfica con la fase móvil indicada. Al término, se seca la cromatoplaca bajo una corriente de aire

Figura 2. Cromatograma en capa delgada de la cafeína aislada a partir del té negro: a) referencia de cafeína, b) coelución, c) cafeína aislada.

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Práctica 00 33

Figura 3. Cromatograma en capa delgada de los preparados del té verde: a) fracción de AcOEt de la droga cruda, b) coelución, c) referencia de catequina y d) fracción de AcOEt del preparado estandarizado.

y se examina bajo una lámpara de luz UV a 254 y 365 nm. Se marcan en el cromatograma las zonas de fluorescencia. (3) Enseguida, se rocía la solución reveladora sobre la cromatoplaca y se calienta hasta la aparición de manchas coloridas. Las bandas correspondientes a las muestras, a la referencia y a la coelu-ción desarrollan una coloración roja intensa y deben de coincidir en su posición (Rf).

1.4.3.3 Determinación del contenido de fenoles totales presentes en el té verde

Transferir 1 mL de la fracción de acetato de etilo obtenido en el inciso 1.4.3.1 a un tubo de ensayo. Ense-guida, se adicionan 5 mL de agua destilada, 0.5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu y 2 mL de una solución de Na2CO3 (20%, p/v), en ese orden, y se lleva a un volumen final de 10 mL con agua destilada. Por otra parte, se prepara el blanco de reacción, utilizando 1 mL de metanol y los reactivos empleados en la prepa-ración de la muestra en el mismo orden de adición. Ambas mezclas se dejan en reposo durante dos horas a temperatura ambiente y protegidas de la luz. Al término de este tiempo, se determina la absorbancia de la muestra a 760 nm, ajustando el equipo con el blanco de reacción. Calcular el contenido de fenoles totales utilizando la curva de calibración del ácido gálico indicada en la Figura 4. Los resultados se expresan como equivalentes de ácido gálico (EAG) por microgramo de muestra. Este mismo procedimiento se repite utilizando la muestra del preparado estandarizado de las hojas de té verde.

Figura 4. Curva de calibración para la cuantificación de fenoles totales presentes en el té verde.

4

34 Práctica 00

1.5 Resultados

1.5.1 Analice los resultados en los distintos análisis cromatográficos realizados a lo largo del procedimiento experimental. Calcule los correspondientes factores de retención (Rf) de los constituyentes mayoritarios presentes en las muestras analizadas.1.5.2 Elabore un diagrama de flujo que sintetice el proceso de obtención de la cafeína y de los derivados de catequina a partir del té negro y del té verde, respectivamente. En particular, analice el uso del carbonato de sodio durante el proceso de extracción de la cafeína.1.5.3 Indique, mediante reacciones químicas, el fundamento de la prueba de identidad de la muréxida.1.5.4 Explique el fundamento del ensayo de Folin-Ciocalteu utilizado para la realización de la prueba de composición del té verde.1.5.5 Determine y analice el contenido de fenoles totales presentes en las muestras analizadas. Exprese los resultados en equivalentes de ácido gálico por microgramo de muestra.

1.6 Bibliografía

– British Pharmacopoeia. Her Majesty’s Stationery Office, London, 2002, pp 2441-2443.

– Bruneton, J. Farmacognosia, Fitoquímica, Plantas Medicinales. Edit. Acribia, 2da Edición, Zaragoza, 2001, pp 422-425.

– Cheng, Z.; Moore, J.; Yu, L. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 7429-7436.

– Heinrich, M.; Barnes, J.; Gibbons, S.; Williamson, E. Fundamentals of Pharmacognosy and Phytotherapy, 2nd Edition. Churchill Livingstone, Londres, 2012, pp 340.

– Kozuca, H.; Koyama, M.; Okitsu, T. Chem. Pharm. Bull. 1982, 20, 941-945.

– Sharangi, A.B. Food Res. Int. 2009, 42, 529-535.

– WHO, Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials. World Health Organization, Gèneva, 1999, pp 250-258.

4

Práctica 00 35



Sesión 1

Material1 rotaevaporador 1 cápsula de porcelana3 pipetas graduadas de 1 mL 1 embudo de separación de 500 mL1 matraz bola de 250 mL balanza granataria2 vasos de precipitados de 250 mL bomba de aspersión1 probeta graduada de 100 mL lámpara de luz UV1 espátula cromo-níquel papel filtro1 propipeta placas cromatográficas de

aluminio de 20 × 20 cm2 embudos de filtración rápidamaterial vegetal (té negro) parrilla de calentamiento

Reactivoscloruro de metileno (CH2Cl2)



yoduro de potasio (KI)

carbonato de sodio (Na2CO3)

ácido sulfúrico (H2SO4)

ácido clorhídrico (HCl)

ácido nítrico (HNO3)

hidróxido de amonio (NH4OH)

Sesión 2

Material1 rotaevaporador material vegetal (té verde)3 pipetas graduadas de 5 mL tubos de ensayo3 pipetas graduadas de 1 mL balanza granataria1 matraz bola de 100 mL bomba de aspersión2 vasos de precipitados de 250 mL lámpara de luz UV1 probeta graduada de 100 mL papel filtro1 espátula cromo-níquel placas cromatográficas de

aluminio de 20 × 20 cm1 propipeta2 embudos de filtración rápida parrilla de calentamiento1 matraz Erlenmeyer de 250 mL celdas para espectrofotómetro1 embudo de separación de 500 mL

4

36 Práctica 00

Reactivosacetato de etilo (AcOEt)



tolueno (C6H5CH3)

acetona (CH3COCH3)



ácido fórmico (HCOOH)

reactivo de Folin-Ciocalteu

ácido gálico (C6H2(OH)3)COOH

vanillina (C8H8O3)

4

Práctica 00 39

Práctica 5. Control de calidad (pruebas de identidad y de composición) de las hojas de Psidium guajava


Proporcionar al alumno el entrenamiento práctico para realizar las pruebas de control de calidad de las hojas del guayabo.


1. Aplicar la técnica de extracción continua por Soxhlet para la obtención de los extractos alcohólicos a partir de las hojas del guayabo y preparados herbolarios.

2. Establecer la identidad de los flavonoides presentes en las muestras analizadas mediante la comparación de sus propiedades cromatográficas con aquellas de muestras auténticas y la determinación del contenido de fenoles totales utilizando el método de Folin-Ciocalteu.

1.3 Antecedentes

El guayabo, Psidium guajava L. (Myrtaceae), es un árbol o arbusto pequeño que mide entre 4 y 10 m de altura, con extensas ramas, su corteza es café, lisa y delgada. Las hojas perennes son duras, más anchas en su punta que en el centro, con envés velloso y de nervadura realzada. Las flores son solitarias, blancas o cremosas y olorosas, con numerosos estambres. Sus frutos son globosos de aroma característico con numerosas semillas y pulpa amarilla o rosada (Figura 1; Biblioteca Digital de la Medicina Tradicional Mexicana, 2009).

Psidium guajava se encuentra ampliamente distribuida en Centro y Sudamérica, Europa, África y Asia. Crece en áreas tropicales y subtropicales, y se adapta a diferentes condiciones climáticas, pero prefiere los climas secos. Sus usos medicinales para el tratamiento de la diarrea, enfermedades infecciosas de la piel y de la cavidad bucal, paludismo, tos, cáncer, enfermedades antiinflamatorias, diabetes, hipertensión, dolor y fiebre, entre otros, se encuentran bien documentados (Pérez-Gutiérrez et al., 2008).

Las hojas del guayabo contienen un aceite esencial rico en mono- y sesquiterpenos [-pineno, -pineno, limoneno, mentol, acetato de terpenilo, alcohol isopropílico, -cariofileno, -bisaboleno, cineol, óxido de cariofileno, -copaneno, farneseno, humuleno, curcumeno y nerolidol]. También se ha demostrado que las hojas contienen compuestos de tipo flavonoides, saponinas, esteroles, ácidos triterpénicos, taninos, fenilpro-panoides y otros compuestos aromáticos simples de tipo C6-C1, por mencionar a los más importantes. Los flavonoides activos y mayoritarios presentes en la planta son la miricetina, la quercetina, el 3--galactósido de quercetina, la luteolina, la luecocianidina, la guaijaverina y el campferol (Figura 2).

En México, las hojas del guayabo se comercializan para el tratamiento de la colitis y otros padecimientos estomacales. El producto más conocido elaborado con hojas del guayabo, comercializado bajo la forma de cápsulas, es el QG-5, un extracto acuoso estandarizado que contiene 1 mg de quercetina por cada 500 mg de extracto seco, cuya eficacia ha sido comprobada científicamente (Astudillo et al., 2009).

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40 Práctica 00

Figura 1. Psidium guajava L. (Myrtaceae).

Figura 2. Estructuras de los principales flavonoides presentes en las hojas del guayabo.


1.4.1 Obtención del extracto de metanol a partir de las hojas secas del guayabo

Se pesan 20 g del material vegetal seco y molido y se someten a una extracción continua con 200 mL de MeOH en un aparato de Soxhlet durante una hora. Transcurrido este tiempo, el extracto se filtra y se concentra a presión reducida hasta obtener un extracto seco.

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Práctica 00 41

1.4.2 Obtención del extracto orgánico a partir de un preparado fitofarmacéutico

Se pesan cinco tabletas del preparado fitofarmacéutico y se trituran en un mortero para someterlo a una extracción por maceración, utilizando 15 mL de una mezcla CH2Cl2-MeOH (1:1) durante una hora. Transcurrido este tiempo, el extracto resultante se filtra y se concentra a presión reducida hasta sequedad.

1.4.3 Ensayos de identidad


Los extractos de metanol obtenidos a partir de las hojas del guayabo se analizan mediante una cromato-grafía en capa delgada utilizando las siguientes condiciones de análisis (Figura 3):

Soporte: gel de sílice F254 Merck.Fase móvil: CH2Cl2-MeOH (95:5).Preparación de la muestra: se disuelve 1 mg de los extractos orgánicos en 0.5 mL de metanol.Preparación de las muestras de referencia: se disuelve 1 mg de la quercetina y 1 mg de avicularina, por separado, en 0.5 mL de etanol.Reveladores: como agentes cromógenos se utilizarán una solución de aldehído anísico (1%, v/v; en ácido acético glacial y 1 mL de ácido sulfúrico concentrado).Procedimiento: (1) Se aplica sobre la superficie de la placa las muestras de los extractos de metanol obtenidos y de las referencias de quercetina y de avicularina en forma de puntos con la ayuda de un capilar, en carriles independientes y aproximadamente a un cm del extremo inferior del cromatofolio. Deberá existir una se-paración de por lo menos 15 mm entre cada aplicación. (2) Se realiza el proceso de elución cromatográfica con la fase móvil indicada. Al término, se seca la cromatoplaca bajo una corriente de aire y se examina bajo una lámpara de luz UV a 254 y 365 nm. Se marcan en el cromatograma las zonas de fluorescencia. (3) Enseguida, se rocía la solución reveladora hasta cubrir la cromatoplaca y se calienta hasta la aparición de manchas coloridas. Los flavonoides desarrollan una coloración amarilla intensa y deben de coincidir en su posición (Rf).

Figura 3. Cromatograma en capa delgada del extracto orgánico obtenido a partir de las hojas del guayabo: a) extracto de MeOH de la droga cruda, b) extracto de MeOH del preparado

fitofarmacéutico, c) referencia de avicularina, d) referencia de quercetina.

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42 Práctica 00

1.4.4 Identificación y cuantificación de los fenoles totales presentes en las hojas del guayabo

Transferir 1 mL del extracto de metanol obtenido en el inciso 1.4.1 a un tubo de ensayo, enseguida, se adicionan 5 mL de agua destilada, 0.5 mL del reactivo de Folin-Ciolcateu y 2 mL de una solución de Na2CO3 (20%, p/v), en ese orden, y se lleva a un volumen final de 10 mL con agua destilada. Por otra parte, se prepara el blanco de reacción, utilizando 1 mL de metanol y los reactivos empleados en la prepa-ración de la muestra en el mismo orden de adición. Ambas mezclas se dejan en reposo durante dos horas a temperatura ambiente y protegidas de la luz. Al término de este tiempo, se determina la absorbancia de la muestra a 760 nm ajustando el equipo con el blanco de reacción. Calcular el contenido de fenoles totales utilizando la curva de calibración del ácido gálico indicada en la Figura 4. Los resultados se expresan como equivalentes de ácido gálico (EAG) por microgramo de extracto. Este mismo procedimiento se repite utilizando el extracto del preparado fitofarmacéutico de las hojas del guayabo, obtenido en el inciso 1.4.2.

Figura 4. Curva de calibración para la cuantificación de fenoles totales presentes en las hojas del guayabo.

1.5 Resultados

1.5.1 Analice los resultados en los distintos análisis cromatográficos realizados a lo largo del procedimiento experimental. Calcule los correspondientes factores de retención (Rf) de los constituyentes mayoritarios presentes en las muestras analizadas. Compare los valores observados para las muestras de referencia e indicar si los preparados comerciales analizados contienen en su formulación hojas de guayabo como in-grediente activo.1.5.2 Explique el fundamento del ensayo de Folin-Ciocalteu utilizado para la realización de la prueba de composición de las hojas del guayabo.1.5.3 Determine y analice el contenido de fenoles totales presentes en las muestras analizadas. Exprese los resultados en equivalentes de ácido gálico por microgramo de extracto orgánico analizado.

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Práctica 00 43

1.6 Bibliografía

– Astudillo, A.; Mata, R.; Navarrete, A. Rev. Latinoam. Quim. 2009, 37, 7-43.

– Biblioteca Digital de la Medicina Tradicional Mexicana (2009), disponible en http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx.

– Cheng, Z.; Moore, J.; Yu, L. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 7429-7436.

– Pérez-Gutiérrez, R.; Mitchell, S.; Vargas, B. J. Ethnopharmacol. 2008, 117, 1–27.



Sesión 1

Material1 extractor Soxhlet tubos de ensayo3 pipetas graduadas de 5 mL balanza granataria3 pipetas graduadas de 1 mL bomba de aspersión1 matraz bola de 100 mL lámpara de luz UV1 matraz bola de 500 mL papel filtro2 vasos de precipitados de 250 mL placas cromatográficas de

aluminio de 20 × 20 cm1 probeta graduada de 100 mL1 espátula cromo-níquel parrilla de calentamiento1 propipeta celdas para espectrofotómetro1 embudo de filtración rápida material vegetal (hojas de guayabo)1 rotaevaporador

Reactivoscloruro de metileno (CH2Cl2)





ácido acético glacial (CH3COOH)

aldehído anísico (C8H8O2)

reactivo de Folin-Ciocalteu

ácido gálico (C6H2(OH)3)COOH

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Práctica 00 45

Práctica 6. Métodos para identificar a los compuestos marcadores de la droga cruda y preparados de Cassia senna

1.1 Objetivo general Proporcionar al alumno el entrenamiento práctico para realizar las pruebas de control de calidad (pruebas de identidad y de composición), descritas en la Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos (FHEUM), para la identificación de los compuestos marcadores presentes en las hojas de sen.


1. Aplicar la técnica de reflujo para la obtención de los extractos acuosos a partir de las hojas de sen y preparados herbolarios.

2. Establecer la identidad química de las antraquinonas presentes en los extractos de sen mediante la prueba de Bortränger y por cromatografía en capa delgada.

3. Cuantificar a los senósidos presentes en la droga cruda utilizando un método espectrofoto-colorimétrico.

1.3 Antecedentes El sen, Cassia senna L. (sinónimo Cassia angustifolia) (Leguminosae) (Figura 1), es un arbusto originario de las regiones tropicales de África y la India. Sus hojas están compuestas por cuatro u ocho pares de foliolos oblongos o lanceolados con fuerte nervadura en el envés verde amarillento. Sus flores son amarillas reu-nidas en racimos terminales largamente peciolados. Sus frutos son vainas o legumbres, oblongas, planas y membranosas, marrón grisácea que miden aproximadamente 1.5 cm de ancho por un centímetro de largo. Las hojas de sen contienen alrededor del 2 al 5% de derivados de antraquinonas; siendo los componentes más importantes los senósidos A-D (Figura 1). Estos productos, o los extractos estandarizados de las hojas, se utilizan en la terapéutica como agentes laxantes y purgantes.

6

46 Práctica 00

Figura 1. Cassia senna L. (Leguminosae) y estructuras de los compuestos marcadores presentes en las hojas de sen.


1.4.1 Preparación de los extractos orgánicos

Se pesan 50 g de material vegetal en un matraz bola de 500 mL y se adicionan 250 mL de agua para some-terlo a un proceso de reflujo durante 15 minutos. Al término de la extracción, el extracto acuoso resultante se deja enfriar, se filtra y se le adiciona 1 mL de HCl 1 N. Enseguida, esta solución ácida se somete a un proceso de reparto utilizando hexano (3 ´ 100 mL). Las fases orgánicas se combinan y se alcalinizan adicionando un gramo de NaHCO3, la solución anterior se agita suavemente durante tres minutos y se evapora el disolvente a sequedad. Este mismo procedimiento se sigue para los preparados herbolarios objeto de análisis.

6

Práctica 00 47

1.4.2 Ensayo de identidad

1.4.2.1 Prueba de Bortränger

En una cápsula de porcelana, se pesan 500 mg del material vegetal y se tratan con 10 mL de una solución

en etanol de KOH (10%, p/v) durante dos minutos calentando a ebullición. Al cabo de este tiempo, se adi-

cionan 10 mL de agua y la mezcla se filtra a través de papel filtro. El filtrado se acidifica mediante la adición

gota a gota de HCl concentrado hasta obtener un valor de pH~2. Esta solución acuosa ácida, se somete

a un proceso de reparto con éter etílico (3 ´ 20 mL). Al término del proceso de reparto, las soluciones

orgánicas se reúnen y se tratan con 5 mL de NH4OH 6 N durante cinco minutos agitando suavemente.

El desarrollo de una coloración naranja o rosa azulado es indicativo de una prueba positiva para la presencia

de antraquinonas.


Se realiza un análisis por cromatografía en capa delgada de los extractos orgánicos obtenidos en el inciso 1.4.1 y las referencias de los senósidos A y B.

Soporte: Gel de sílice F254 Merck.Fase móvil: CH3COOH-H2O-AcOEt-propanol (1:30:40:40).Preparación de la muestra: 500 mg de material vegetal se someten a ebullición durante cinco minutos utilizan-do una mezcla de EtOH-H2O (1:1). Al cabo del proceso de extracción, la mezcla resultante se filtra para realizar el análisis por cromatografía en capa delgada.Preparación de la muestra de referencia: Se disuelve 1 mg de las referencias de los senósidos A y B en 0.5 mL de CHCl3, por separado.Revelador: Como agente cromógeno se utiliza una solución de ácido nítrico y de KOH en etanol (Solución A: preparar una solución de HNO3 (20%, v/v). Solución B mezclar 0.25 g de KOH en 50 mL de etanol ab-soluto al 50%).Procedimiento: (1) Se aplica sobre la superficie de la placa las muestras a analizar y las referencias de senósidos A y B en forma de puntos con la ayuda de un capilar, en carriles independientes y aproximadamente a un cm del extremo inferior del cromatofolio. (2) Se realiza el proceso de elución cromatográfica con la fase móvil indicada. Al término, se seca la cromatoplaca bajo una corriente de aire y se examina bajo una lám-para de luz UV a 254 y 365 nm. Se marcan en el cromatograma las zonas de fluorescencia. (3) Enseguida, se rocía la solución reveladora A y se calienta hasta la aparición de manchas coloridas. Posteriormente, se rocía la cromatoplaca con la solución reveladora B hasta la aparición de color.

1.4.3 Determinación del contenido de senósidos

Se pesan 150 mg de la droga cruda en un matraz bola de 100 mL y se adicionan 30 mL de agua. Se toma el peso del contenido de este matraz y enseguida se calienta a reflujo durante 15 min. Una vez transcurrido el tiempo de extracción, se deja enfriar la solución y se filtra a través de papel filtro. Posteriormente, 20 mL de este filtrado se transfieren a un embudo de separación de 50 mL y se le adicionan 0.1 mL de HCl 1 N y se somete a un proceso de reparto con cloroformo (3 × 20 mL). Al término de este proceso, la fase acuosa se trata con 100 mg de NaHCO3 y se agita suavemente durante 3 min.

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48 Práctica 00

La solución acuosa tratada se filtra y se trasfieren 10 mL de ésta a un matraz bola de 100 mL y se tratan con 20 mL de FeCl3 calentando a reflujo durante 20 min. Al cabo de este tratamiento, se enfría la solución, se adiciona 1 mL de HCl 1 N y se calienta durante otros 20 min agitando suavemente para evitar la forma-ción de un precipitado. La solución así tratada se enfría y se somete a un proceso de reparto con éter etílico (3 × 30 mL). Las fases orgánicas combinadas, finalmente se lavan con agua (3 × 60 mL) y se trasfieren a un matraz volumétrico de 100 mL y se afora a este volumen. Las capas etéreas se combinan y se lavan con dos porciones de agua (2 × 60 mL). Se transfieren 10 mL de la solución etérea a una cápsula de porcelana y se evaporan a sequedad. El residuo obtenido se suspende en 10 mL de Mg(CH3COO)2 (5 mg/mL en metanol) y enseguida se determina la absorbancia a una longitud de onda de 515 nm, utilizando metanol como blanco.

El contenido de los derivados de hidroxiantraceno, expresados como senósido B, se calcula mediante la siguiente expresión matemática: 1.25 A/m en donde: A es la absorbancia a 515 nm y m la masa en gramos del material examinado.

1.5 Resultados

1.5.1 Analice los resultados obtenidos en los distintos cromatogramas. Calcule los correspondientes fac-tores de retención (Rf) de los constituyentes mayoritarios presentes en las muestras analizadas. Compare los valores observados para las muestras de referencia e indicar si los preparados comerciales analizados contienen en su formulación hojas de sen como ingrediente activo.

1.5.2 Determine el contenido de senósidos en las muestras analizadas.

1.6 Bibliografía

– Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos (FHEUM). 2da Edición. Secretaría de Salud, Comi-sión Permanente de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 2013.

– WHO, Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials. World Health Organization Gèneva, 1999, pp 250-258.

– British Pharmacopoeia. London, Her Majesty´s Stationery Office, 2002, pp 2441-2443.


– Shao-Wen, S.; Hsiu-Ting, S. J. Pharm. Biomed. Anal. 2002, 29, 881-894.

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Práctica 00 49



Sesión 1

Material1 rotaevaporador material vegetal (hojas de sen)3 pipetas graduadas de 5 mL preparados fitofarmacéuticos3 pipetas graduadas de 10 mL bomba de aspersión2 matraces bola de 100 mL balanza granataria2 matraces bola de 500 mL lámpara de luz UV2 refrigerantes rectos con mangueras parrilla de calentamiento2 vasos de precipitados de 250 mL perlas de ebullición1 probeta graduada de 100 mL papel filtro1 espátula cromo-níquel placas cromatográficas de

aluminio de 20 × 20 cm2 embudos de filtración rápida1 embudo de separación de 250 mL pipeta Pasteur

Reactivoshexano (C6H14)

acetato de etilo (AcOEt)etanol absoluto (CH3CH2OH)propanol (CH3CH2CH2OH)bicarbonato de sodio (NaHCO3)hidróxido de potasio (KOH)ácido acético (CH3CO2H)ácido clorhídrico (HCl)acido nítrico (HNO3)hidróxido de amonio (NH4OH)

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50 Práctica 00

Sesión 2

Material

3 pipetas graduadas de 5 mL material vegetal (hojas de sen)

3 pipetas graduadas de 10 mL preparados fitofarmacéuticos

2 embudos de separación de 50 mL tubos de ensayo

2 matraces bola de 100 mL balanza granataria

2 refrigerantes rectos con mangueras bomba de aspersión

2 vasos de precipitados de 250 mL lámpara de luz UV

1 probeta graduada de 100 mL papel filtro

1 espátula cromo-níquel placas cromatográficas de

aluminio de 20 × 20 cm1 propipeta

2 embudos de filtración rápida parrilla de calentamiento

1 matraz Erlenmeyer de 500 mL perlas de ebullición

2 matraces aforados de 100 mL celdas para espectrofotómetro

1 cápsula de porcelana

Reactivos

cloroformo (CHCl3)


éter etílico (CH3CH2)2O

ácido clorhídrico (HCl)

bicarbonato de sodio (NaHCO3)

cloruro férrico (FeCl3)

acetato de magnesio Mg(CH3COO)2

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Práctica 00 53

Práctica 7. Pruebas de identidad de Amphiptherygium adstringens


Proporcionar al alumno el conocimiento práctico para la identificación de los principios bioactivos y/o compuestos marcadores de la droga cruda y preparados herbolarios obtenidos a partir de una planta de amplio uso en la medicina popular de México.

1.2 Objetivo particular

1. Establecer la identidad de los compuestos mayoritarios (ácidos masticadienónico y 3-hidroxi masticadienónico) presentes en los extractos obtenidos por reflujo de la droga cruda y preparados herbolarios, mediante la comparación de sus propiedades cromatográficas con aquellas de muestras auténticas.

1.3 Antecedentes

El cuachalalate, Amphiptherygium adstringens Schiede ex Schlech. (Julianaceae), es un árbol de aproximadamente seis metros de altura; su corteza es gris marrón. Sus hojas están compuestas por cinco hojuelas sésiles, aserra-das, con dientecillos redondeados, abovedadas, verde opaco en el anverso y verde grisáceo en el reverso. Sus frutos son nueces alongadas, abultadas, aladas de 2.5 a 5 cm de largo y verde pálido (Figura 1). La especie es originaria de la selva baja caducifolia de los estados de Michoacán, Guerrero, Puebla y Oaxaca y es utilizado ampliamente en las prácticas médicas populares de México y otras regiones del mundo, como desintoxicante sanguíneo por sus propiedades astringentes. La infusión de la corteza se utiliza como enjuague bucal para el tratamiento de úlceras bucales, dolor de muelas y estomatitis, y junto con el árnica y otras hierbas, es utilizada para curar la inflamación del estómago, gastritis crónica y úlcera gástrica. Finalmente, es bien conocido el uso de la corteza como agente antiinflamatorio, cicatrizante, analgésico e hipoglucemiante.

La corteza de cuachalalate está constituida principalmente por triterpenoides de tipo tirucalano; los más abundantes son el ácido masticadienónico y el ácido 3-hidroxi masticadienónico. Estudios farmacológi-cos realizados in vivo han permitido establecer la actividad hipocolesterolemiante, antitumoral, inhibitoria de las secreciones gástricas y antiinflamatoria del extracto de la planta y sus productos mayoritarios (Nava-rrete et al., 1998; Olivera et al., 1999).

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54 Práctica 00

Figura 1. Amphiptherygium adstringens Schiede ex Schlech. (Julianaceae) y estructuras de los principales triterpenoides presentes en el cuachalalate.



Se pesan 50 g de material vegetal en un matraz bola de 500 mL y se adicionan 250 mL de hexano para someterlo a un proceso de reflujo durante 90 minutos. Al término de la extracción, el extracto resultante se deja enfriar, se filtra y se concentra a presión reducida hasta sequedad. Este mismo procedimiento se sigue para la preparación de los extractos orgánicos a partir de los preparados herbolarios objeto de análisis.


Se realiza un análisis por cromatografía en capa delgada de los extractos de hexano obtenidos en el inciso 1.4.1. Como referencia se emplean los ácidos masticadienónico y 3-hidroxi masticadienónico (Figura 2).

Soporte: Gel de sílice F254 Merck.Fase móvil: CHCl3–MeOH (9:1).Preparación de la muestra: Se disuelve 1 mg de la muestra en 0.5 mL de hexano.Preparación de la muestra de referencia: Se disuelve 1 mg de los ácidos masticadienónico y 3-hidroxi mastica-dienónico por separado, en 0.5 mL de CHCl3.Revelador: Solución cromógena de sulfato cérico amoniacal.Procedimiento: (1) Se aplica sobre la superficie de la placa las muestras a analizar y referencias de los áci- dos masticadienónico y 3-hidroxi masticadienónico en forma de puntos con la ayuda de un capilar, en carriles independientes y aproximadamente a un cm del extremo inferior del cromatofolio. Deberá existir una separación de por lo menos 15 mm entre cada aplicación. (2) Se realiza el proceso de elución croma-tográfica con la fase móvil indicada. Al término, se seca la cromatoplaca bajo una corriente de aire y se examina bajo una lámpara de luz UV a 254 y 365 nm. Se marcan en el cromatograma las zonas de fluo-rescencia. (3) Enseguida, se rocía la cromatoplaca con la solución reveladora y se calienta hasta la aparición

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Práctica 00 55

de manchas coloridas. Las bandas correspondientes a las muestras y referencias deben de coincidir en su posición (Rf) y coloración.

1.5 Resultados

1.5.1 Analice los resultados del cromatograma obtenido a lo largo del procedimiento experimental. Cal-cule los factores de retención (Rf) de los ácidos masticadienónico y 3-hidroxi masticadienónico. Compare los valores observados para las muestras de referencia e indicar si los preparados comerciales analizados contienen en su formulación corteza de cuachalalate como ingrediente activo.

1.6 Bibliografía

– Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos (FHEUM). 2da Edición, Secretaría de Salud, Comisión Permanente de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 2013.

– Argueta, A. Atlas de las Plantas de la Medicina Tradicional Mexicana I. 1ra Edición, Instituto Nacional Indi-genista, México D.F., 1994, pp 542–543.

– Navarrete, A.; Martínez, U.; Reyes, B. Phytother. Res. 1998, 12, 1–4.

– Olivera, G.; Soto, M.; Martínez, M. J. Ethnopharmacol. 1999, 68, 109–113.

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Figura 2. Cromatograma en capa delgada de los extractos de hexano de la droga cruda y de los preparados herbolarios del cuachachalate: a) referencia del ácido masticadienónico; b) referencia del ácido 3-hidroxi masticadienónico; c) extracto de hexano de la corteza; d) extracto de hexano del preparado herbolario.

56 Práctica 00



Sesión 1

Material1 rotaevaporador 1 embudo de filtración rápida2 matraces bola de 500 mL placas cromatográficas de aluminio de 20 × 20 cm2 refrigerantes rectos con mangueras bomba de aspersión1 parrilla de calentamiento aspersor2 anillos metálicos lámpara de luz UV4 pinzas de tres dedos con nuez capilares1 probeta graduada de 100 mL algodón2 vasos de precipitados de 250 mL papel aluminio1 vidrio de reloj piedras de ebullición3 pipetas Pasteur con bulbo material vegetal (corteza cuachalalate)1 espátula cromo-níquel preparados fitofarmacéuticos (corteza cuachalalate)Reactivoscloroformo (CHCl3)hexano (C6H14)metanol anhidro (MeOH)


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Práctica 00 59

Práctica 8. Obtención del crudo alcaloideo a partir de la especie Datura stramonium


Proporcionar al alumno el conocimiento práctico en los procedimientos generales utilizados para la obten-ción e identificación de fitoalcaloides de carácter básico de amplio uso en la terapéutica.


1. Aplicar la técnica de maceración alcalina para elaborar un extracto orgánico de las partes aéreas (frutos, semillas, hojas y tallos) del toloache.

2. Obtener el crudo de alcaloides a partir del extracto orgánico del toloache mediante la aplicación de un proceso de reparto ácido-base.

3. Establecer la identidad de los componentes mayoritarios presentes en el crudo de alcaloides (atropina y escopolamina) mediante la prueba de Vitali Morin y por la comparación de sus propiedades cromatográficas con aquellas de muestras auténticas.

1.3 Antecedentes

El toloache, Datura stramonium L. (Solanaceae), es una especie vegetal de origen americano que se ha utiliza-do con un sinfín de propósitos desde antes de la llegada de los españoles al nuevo mundo. D. stramonium es una planta herbácea de 50 cm a 1 m de altura; presenta un tallo verde-morado y de olor fuerte; las hojas son alargadas y con bordes divididos; las flores son solitarias y nacen en la horqueta del tronco, su color oscila del blanco al azuloso. El fruto de forma esférica está cubierto de prolongaciones espinosas (Figura 1). El toloache contiene del 0.2 al 0.45% de alcaloides; siendo la hiosciamina y la escopolamina los compo-nentes mayoritarios. Ambos alcaloides son de tipo tropánico y se biosintetizan a partir del aminoácido ornitina, la ruta de los policétidos y la del ácido siquímico. La escopolamina es un agente anticolinérgico y es el alcaloide más utilizado en la terapéutica por sus propiedades narcóticas, antiespasmódicas y en la prevención de ataques de asma.

Aunque el toloache posee propiedades narcóticas y tóxicas, se le da un importante uso medicinal en gran parte del país donde se emplea para calmar diversos problemas como dolores musculares, de cabeza, de cintura, de espalda y de muelas. También se usa para tratar padecimientos reumáticos, erisipela y come-zón, paperas, resfriado, gota, almorranas, para lavar heridas, y como agente antihelmíntico y tranquilizan-te para conciliar el sueño. También, se emplea en curas psicológicas como sustos y enamoramientos.


1.4.1 Ensayo de identidad (Reacción de Vitali Morin)

Se pesa 1 g del material vegetal y se trata con 10 mL de H2SO4 0.1 N durante 2 min en agitación constante. Al cabo de este tiempo, la mezcla se filtra a través de papel filtro. El filtrado se trata con 1 mL de NH4OH (concentrado) y 5 mL de agua. A la solución anterior, se le adicionan 15 mL de éter etílico y se agita suave-mente durante 10 min. Al término de la extracción, se separa la fase etérea y se evapora a sequedad en una

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60 Práctica 00

cápsula de porcelana utilizando una parrilla de calentamiento. Al residuo obtenido se le adicionan 0.5 mL de HNO3 fumante y se evapora a sequedad en una parrilla de calentamiento. Posteriormente, se adicionan 10 mL de acetona y, gota a gota, una solución en etanol de KOH (3%, p/v). El desarrollo de una coloración violeta es indicativo de una prueba positiva para la identificación de alcaloides tipo atropina.

Figura 1. Datura stramonium L. (Solanaceae) y estructuras de los principales alcaloides presentes en el toloache.

1.4.2 Preparación y fraccionamiento del extracto orgánico

Se pesan 200 g del material vegetal seco y fragmentado y se someten a un proceso de alcalinización con 100 mL de una solución acuosa de KOH (10%, p/v). El material se macera con 500 mL de CH2Cl2

durante un periodo de siete días. Al término de la maceración, el extracto resultante se concentra a presión reducida. Posteriormente, el extracto se suspende en 30 mL de CH2Cl2 y se somete a un fraccionamiento preliminar mediante un proceso de reparto ácido-base con HCl 1 N (3 × 30 mL). La solución acuosa ácida se alcaliniza mediante la adición cuidadosa de NH4OH concentrado hasta obtener un valor de pH~10. Esta solución se somete a un segundo proceso de reparto con CH2Cl2 (3 × 100 mL). Las soluciones orgáni-cas se secan sobre Na2SO4 anhidro y se concentran a presión reducida hasta sequedad.

1.4.3 Análisis cromatográfico del crudo alcaloideo

Se realiza un análisis por cromatografía en capa delgada del crudo de alcaloides y las referencias de atro-pina y de escopolamina (Figura 2).

Soporte: Gel de sílice F254 Merck.Fase móvil: CHCl3-MeOH-NH4OH (9:1:1).Preparación de la muestra: Se disuelven 5 mg del crudo de alcaloides en 1 mL de CH2Cl2.Preparación de la muestra de referencia: Se disuelve 1 mg de las referencias de atropina y de escopolamina, por separado, en 0.5 mL de MeOH.Revelador: Solución del reactivo de Dragendorff (yodobismutato de potasio).Procedimiento: (1) Se aplica sobre la superficie de la placa las muestras a analizar y las referencias de atropina y de escopolamina en forma de puntos con la ayuda de un capilar, en carriles independientes y aproxima-damente a un cm del extremo inferior del cromatofolio. Deberá existir una separación de por lo menos 15 mm entre cada aplicación. (2) Se realiza el proceso de elución cromatográfica con la fase móvil indicada. Al término, se seca la cromatoplaca bajo una corriente de aire y se examina bajo una lámpara de luz UV a

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escopolamina atropina

Práctica 00 61

254 y 365 nm. Se marcan en el cromatograma las zonas de fluorescencia. (3) Enseguida, se rocía con la so-lución reveladora la cromatoplaca hasta la aparición de color. Las bandas correspondientes a las muestras y referencias deben de coincidir en su posición (Rf) y coloración.

1.5 Resultados

1.5.1 Indique mediante una serie de reacciones químicas el fundamento de la prueba de Vitali Morin, prueba farmacopéica ampliamente utilizada como ensayo de identidad de las drogas crudas utilizadas para la obtención de atropina y de escopolamina.

1.5.2 Analice el resultado del cromatograma obtenido. Calcule los correspondientes factores de retención

(Rf) de los alcaloides mayoritarios presentes en el toloache y de las referencias utilizadas.1.5.3 Elabore un diagrama de flujo que esquematice el proceso de obtención del crudo de alcaloides a partir del toloache. Analice el fundamento del método de fraccionamiento utilizado.

1.5.4 Indique el fundamento de la reactividad de los alcaloides frente al reactivo de Dragendorff.

1.6 Bibliografía

– Evans, W. Trease and Evans. Pharmacognosy. Edit. W.B. Saunders, 15ta Edición, Londres, 2002.


– Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos (FHEUM). 2da Edición, Secretaría de Salud, Comisión Permanente de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 2013.

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Figura 2. Cromatograma en capa delgada del crudo de alcaloides obtenido a partir del toloache: a) referencia de escopolamina; b) crudo de alcaloides; c) referencia de atropina.

62 Práctica 00



Sesión 1

Material1 matraz Erlenmeyer de 1000 mL1 espátula cromo-níquel1 varilla de vidrio1 probeta graduada de 1000 mL

material vegetal (toloache)Reactivoscloruro de metileno (CH2Cl2)hidróxido de potasio (KOH)

Sesión 2

Material1 rotaevaporador placas cromatográficas de aluminio

de 20 × 20 cm1 cápsula de porcelana1 espátula cromo-níquel capilares1 pipeta graduada de 10 mL parrilla de calentamiento1 pipeta graduada de 5 mL bomba de aspersión1 propipeta aspersor1 probeta graduada de 50 mL lámpara de luz UV1 embudo de filtración rápida papel filtro1 embudo de extracción de 1000 mL papel pH3 vasos de precipitado de 250 mL pipeta Pasteur con bulbo1 vidrio de reloj anillo metálico

material vegetal (toloache)Reactivoscloruro de metileno (CH2Cl2)cloroformo (CHCl3)éter etílico (C4H10O)etanol absoluto (CH3CH2OH)metanol anhidro (CH3OH)acetona (CH3COCH3)sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)hidróxido de amonio (NH4OH)hidróxido de potasio (KOH)ácido clorhídrico (HCl)ácido sulfúrico (H2SO4)acido nítrico (HNO3)reactivo de Dragendorff

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Práctica 00 65

Práctica 9. Preparación de los aceites esenciales de Eugenia caryophyllus, Ligusticum porteri, Lippia graveolens, Poliominthalongiflora y Thymus vulgaris


Proporcionar al alumno el entrenamiento práctico para la preparación de diferentes tipos de esencias de uso medicinal.


1. Obtener el aceite esencial de las especies Eugenia caryophyllus, Ligusticum porteri, Lippia graveolens, Poliomintha longiflora y/o Thymus vulgaris mediante una hidrodestilación simple.

2. Determinar la presencia del principio activo mayoritario en cada una de las esencias mediante una cromatografía en capa delgada.

1.3 Antecedentes

La especie, Eugenia caryophyllus (Sprengel) Bullock & Harr. (sinónimo: Syzygium aromaticum; Figura 1) es un árbol aromático de hasta 15 m de altura que pertenece a la familia de las mirtáceas y se cultiva princi-palmente en Indonesia, Madagascar, Tanzania, Sri Lanka, Malasia y la Isla de Granada. El clavo posee un aroma fuerte y agradable, con sabor acre y picante. Sus hojas son parecidas al laurel y sus flores son amarillas formadas por cinco pétalos. La esencia de la planta contiene un aceite esencial rico en eugenol (80%), el cual es el constituyente mayoritario, es utilizada en la terapéutica como agente antiséptico local y como analgésico suave y adicionalmente se emplea con frecuencia para aliviar el dolor de muelas. Otros componentes importantes presentes son el acetileugenol y el -cariofileno.

El clavo es una especie muy apreciada con fines medicinales y se utiliza principalmente en México y en otras partes del mundo, como agente carminativo y estimulante digestivo para aliviar síntomas como el vómito, las flatulencias y las náuseas. Debido a sus propiedades digestivas, el clavo es una de las especias más utilizadas en la culinaria, principalmente en la elaboración de postres.

En México, un número importante de hierbas aromáticas se designan con el nombre común de “oréganos”; estas plantas pertenecen a varios géneros de las familias Lamiaceae (Calamintha, Hedeoma, Hyptis, Mesosphaerum, Monarda, Origanum, Plectranthus y Poliomintha) y Verbenaceae (Lantana y Lippia), así como algunas especies de las familias Asteraceae (Brickellia) y Fabaceae (Dalea). De todas éstas, las más importantes desde el punto de vista comercial son las especies de Origanum vulgare, O. majorana, Poliomintha longiflora y Lippia graveolens.

P. longiflora y L. graveolens son los oréganos mexicanos mas importantes por su frecuencia de uso; la primera especie arbustiva, es pequeña de hasta 1 m de altura, bisexual y perenne que habita en climas áridos o semisecos. Sus hojas son ovaladas o rómbicas, miden entre 6 y 9 mm de largo por 4–5 mm de ancho, con base atenuada, aguda en el ápice, verde oscuro, pecíolos delgados de hasta 1 mm, de venación inconspicua. Las flores solitarias miden 3 mm de largo y entre uno y cuatro mm de ancho y son rosadas con cáliz amór-ficos, con pedicelos delgados de 3 mm de largo, con tallos ramosos, glabrosos y tomentosos (Figura 1). P. longiflora es el orégano más comercializado en el norte de México (Alanís Flores et al., 2008). L. graveolens,

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66 Práctica 00

especie dominante del complejo orégano, es un arbusto delgado restringido a zonas áridas del Centro- Norte de México. Los usos medicinales y en la culinaria de esta especie datan desde el siglo XVIII. Las hojas y las inflorescencias de la planta se utilizan como condimento para la elaboración de una gran variedad de platillos mexicanos; se exportan alrededor del mundo como saborizantes de pizzas y salchi-chas. Las aplicaciones medicinales más comunes de L. graveolens incluyen el tratamiento de enfermedades de las vías respiratorias y digestivas (Rivero-Cruz et al., 2011).

Desde el punto de vista farmacológico, las especies P. longiflora y L. graveolens han sido estudiadas para esta-blecer su potencial antibacteriano, antinociceptivo, espasmolítico y antidiabético (Rivero-Cruz et al., 2011). El carvacrol y el timol son los principios activos mayoritarios en P. longiflora y L. graveolens, respectivamente (Figura 1). Otros compuestos de interés identificados en ambas especies son el -terpineno, el limoneno, el p-cimeno, el eucaliptol, el -terpineno y el acetato de carvacrilo.

Thymus vulgaris (Lamiaceae) es un arbusto perenne, aromático, de aproximadamente 30 cm de alto y con tallos rígidos. Sus hojas son estrechas y lanceoladas. Las flores tienen corolas bilabiadas con coloraciones distintas, del blanco hasta púrpura; se agrupan en espiguillas o racimos terminales densos (Figura 1). Esta especie es originaria de la cuenca mediterránea occidental y se encuentra en forma silvestre en las laderas secas y soleadas de las montañas del Continente Euroasiático, desde el norte de China hasta la península arábiga, alcanzando zonas de África oriental como Etiopía. También, se cultiva exitosamente en el Conti-nente Americano.

Al igual que otras especies de la familia Lamiaceae, el tomillo se utiliza ampliamente en las prácticas mé-dicas populares de México y otras regiones del mundo para aliviar la tos, trastornos digestivos (e. g. la flatu-lencia y las digestiones pesadas) y la inapetencia. Es un remedio eficaz contra la diarrea leve, el mal aliento y los parásitos intestinales. Por vía externa, esta planta es un buen desinfectante. Debido a sus propiedades aromáticas, el tomillo es una de las hierbas más utilizadas como condimento en la culinaria.

El aceite esencial del tomillo (1.5-2.5%) es rico en compuestos aromáticos y terpenoides. Los constituyentes

principales son el timol y el carvacrol. Los antecedentes correspondientes a la especie L. porteri se propor-cionan en el protocolo experimental correspondiente a la Práctica 3.


1.4.1 Obtención del aceite esencial

Se pesan 50 g del material vegetal seco y se fragmenta mediante el empleo de tijeras para someterlo a una destilación simple (Figura 2) con 500 mL de agua destilada durante 90 minutos.

1.4.2 Separación del aceite esencial

El hidrodestilado obtenido en el inciso 1.4.1 se coloca en un embudo de separación y se somete un proceso de reparto con CH2Cl2. Este procedimiento se repite tres veces (3 ´ 100 mL). Las fracciones orgánicas re-sultantes se juntan y se concentran a presión reducida. Si es necesario, se adiciona sulfato de sodio anhidro para eliminar la humedad remanente.

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Práctica 00 67


El aceite esencial se analiza mediante una cromatografía en capa delgada utilizando las siguientes condi-ciones de análisis. Como referencias se emplearán muestras auténticas de los componentes mayoritarios presentes en cada una de las diferentes esencias analizadas.

Soporte: Gel de sílice F254 Merck.Fase móvil: hexano–CH2Cl2 (25:75).Preparación de la muestra: Se disuelven 2.5 mg de la esencia a analizar en 0.5 mL de CH2Cl2.Preparación de la muestra de referencia: Se disuelve 1 mg de la referencia correspondiente proporcionada por el profesor en 0.5 mL de CH2Cl2.Revelador: Solución cromógena de sulfato cérico amoniacal.Procedimiento: (1) Se aplica sobre la superficie de la placa la esencia objeto de estudio y la referencia corres-pondiente al producto mayoritario presente en la misma en forma de puntos con la ayuda de un capilar, en carriles independientes y aproximadamente a un cm del extremo inferior del cromatofolio. Deberá existir una separación de por lo menos 15 mm entre cada aplicación. (2) Se realiza el proceso de elución cromatográfica con la fase móvil indicada. Al término, se seca la cromatoplaca bajo una corriente de aire y se examina bajo una lámpara de luz UV a 254 y 365 nm. Se marcan en el cromatograma las zonas de fluorescencia. (3) Enseguida, se rocía la solución reveladora hasta cubrir la cromatoplaca y se calienta hasta la aparición de manchas coloridas. Las bandas correspondientes a la muestra y referencia deben coincidir en su posición (Rf) y coloración.

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Figura 1. a) E. caryophyllus, b) P. longiflora, c) L. graveolens y d) T. vulgaris y estructura de los compuestos activos y mayoritarios presentes en las esencias de estas especies.

68 Práctica 00

Figura 2. Equipo para la obtención de aceites esenciales mediante hidrodestilación simple.

1.5 Resultados

1.5.1 Determine el rendimiento del aceite esencial con base en el peso seco del material vegetal de acuerdo a la siguiente expresión matemática: (A × 100)/B en donde: A representa el peso (g) de la esencia y B es el peso (g) del material vegetal seco.1.5.2 Analice los resultados del cromatograma obtenido. Calcule los correspondientes factores de reten-ción (Rf) de los componentes mayoritarios presentes en las esencias analizadas y de las referencias utilizadas.

1.6 Bibliografía

– Alanís Flores, G.; Alanís Fuentes, I.; Calderón Vargas, E. Los oréganos de Nuevo León, México. Planta, 2008, 6, 16–17.


– Cañigueral, S.; Vila, R.; Wichtl, M. Plantas Medicinales y Drogas Vegetales para infusión y tisana. Un manual de base científica para Farmacéuticos y Médicos. OEMF Internacional, Milán, 1998, pp 133-135, 521-524.

– Rivero-Cruz, I.; Duarte, G.; Navarrete, A.; Bye, R.; Linares, E.; Mata, R. J. Food Sci. 2011, 76, 309–317 y referencias allí citadas.

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Práctica 00 69



Sesión 1

Material1 rotaevaporador 1 vidrio de reloj1 refrigerante con mangueras 3 pipetas Pasteur con bulbo1 parrilla de calentamiento 3 pinzas de tres dedos con nuez2 anillos metálicos placas cromatográficas de

aluminio de 20 × 20 cm1 conexión de tubo de vidrio2 tapones de hule bomba de aspersión1 matraz Erlenmeyer de 500 mL aspersor1 embudo de separación de 1000 mL lámpara de luz UV1 probeta graduada de 100 mL algodón2 vasos de precipitados de 250 mL papel aluminio1 matraz Erlenmeyer de 250 mL capilares3 matraces Erlenmeyer de 50 mL agitador1 espátula cromo-níquel piedras de ebullición

1 embudo de filtración rápida material vegetal (clavo, tomillo, orégano)

Reactivoshexano (C6H14)cloruro de metileno (CH2Cl2)sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)


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Práctica 00 71

Práctica 10. Obtención de la hesperidina a partir del pericarpio de Citrus sinensis


Proporcionar al alumno el entrenamiento práctico en los procedimientos generales utilizados para la ob-tención y la identificación de flavonoides de interés terapéutico mediante el aislamiento de la hesperidina a partir de la cáscara del naranjo dulce.


1. Obtener el extracto orgánico del naranjo dulce mediante el método de reflujo.2. Separar y purificar a la hesperidina, constituyente mayoritario, presente en el extracto

orgánico del pericarpio de la naranja, mediante un proceso de cristalización.3. Establecer la identidad de la hesperidina mediante la comparación de sus propiedades

cromatográficas con aquellas de una muestra auténtica.

1.3 Antecedentes

El naranjo dulce, Citrus sinensis (L.) Osbeck. (Rutaceae), es un árbol pequeño que mide aproximadamente hasta cinco metros de altura. Sus hojas son perennes, elípticas alargadas, con el borde entero y el pecíolo claramente alado en la parte superior. Sus flores son perfumadas, blancas, con simetría radiada, compuestas por cinco pé-talos punteados (cavidades secretoras con esencia) y numerosos estambres, cuyos filamentos están soldados en la base formando anchos haces. Sus frutos son una baya plurilocular, llamado hesperidio (Figura 1).

El naranjo dulce es ampliamente cultivado en Europa Meridional y en zonas de clima subtropical. La decocción de las hojas de la especie es utilizada ampliamente en las prácticas médicas populares de México y otras regiones del mundo, como tónico para la pérdida del apetito y como agente tranquilizante, antiespasmódico y febrífugo.

El pericarpio del naranjo dulce contiene un aceite esencial (0.2-0.5%) constituido principalmente por el antranilato de metilo. También está constituido por flavonoides de tipo flavanona, siendo la hesperidina el principio activo y componente mayoritario. Estudios farmacológicos han permitido establecer el potencial antibacteriano y su uso en el tratamiento de la fragilidad capilar de la hesperidina presente en la especie.

Figura 1. Citrus sinensis (L.) Osbeck. (Rutaceae) y estructura de la hesperidina.

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72 Práctica 00


1.4.1 Obtención y aislamiento de la hesperidina

Se pesan 50 g de material vegetal en un matraz bola de un litro y se adicionan 300 mL de hexano para some-terlo a un proceso de reflujo durante 60 minutos. Al término de la extracción, el extracto de hexano se deja enfriar y se filtra a través de un embudo Büchner y el sólido obtenido se seca a temperatura ambiente. Poste-riormente, el sólido se coloca en un matraz bola de un litro y se adicionan 300 mL de metanol para someterlo a una segunda extracción por reflujo durante 60 minutos. El extracto de metanol resultante se filtra en calien-te y se concentra a presión reducida hasta obtener un extracto seco. Posteriormente, el extracto obtenido se reconstituye en una solución de ácido acético (10%, v/v) en caliente y se deja enfriar a temperatura ambiente. Finalmente, el precipitado formado se separa de la solución ácida mediante filtración al vacío.

1.4.2 Identificación de la hesperidina

Se realiza un análisis por cromatografía en capa delgada utilizando la técnica de coelución. Como referen-cia se emplea una muestra comercial de hesperidina (Figura 2).

Soporte: Gel de sílice F254 Merck.Fase móvil: CH2Cl2-MeOH (8:2).Preparación de la muestra: Se disuelve 1 mg de la hesperidina aislada en 0.25 mL de MeOH y 10 L de NaOH (1 N).

Preparación de la muestra de referencia: Se disuelve 1 mg de la referencia de hesperidina en 0.25 mL de MeOH

y 10 L de NaOH (1 N).Revelador: Solución cromógena de sulfato cérico amoniacal.Procedimiento: (1) Se aplica sobre la superficie de la placa, la muestra y una mezcla (1:1) de la muestra y la referencia (coelución) en forma de puntos con la ayuda de un capilar, en carriles independientes y aproxi-madamente a un cm del extremo inferior del cromatofolio. Deberá existir una separación de por lo menos 15 mm entre cada aplicación. (2) Se realiza el proceso de elución cromatográfica con la fase móvil indica-da. Al término, se seca la cromatoplaca bajo una corriente de aire y se examina bajo una lámpara de luz UV a 254 y 365 nm. Se marcan en el cromatograma las zonas de fluorescencia. (3) Enseguida, se rocía la solución reveladora hasta cubrir la cromatoplaca y se calienta hasta la aparición de manchas coloridas. Las bandas correspondientes a la muestra y a la referencia de hesperidina deben coincidir en su posición (Rf) y desarrollar una coloración café intensa.

Figura 2. Cromatograma en capa delgada de la hesperidina aislada a partir del naranjo dulce: a) referencia de hesperidina; b) hesperidina aislada.

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Práctica 00 73

1.5 Resultados

1.5.1 Analice los resultados obtenidos en el análisis cromatográfico realizado a lo largo del procedimiento experimental. Calcule el factor de retención (Rf) de la hesperidina (muestra de referencia y muestra aislada) en el cromatograma.

1.5.2 Elabore un diagrama de flujo que sintetice el proceso de obtención de la hesperidina.

1.6 Bibliografía


– Ikan, R. Natural Products: A Laboratory Guide. Edit. Academic Press. 2da Edición, San Diego, California, 1991, pp 9–12.

– Cañigueral, S.; Vila, R.; Wichtl, M. Plantas Medicinales y Drogas Vegetales para infusión y tisana. Un manual de base científica para Farmacéuticos y Médicos. OEMF Internacional, Milán, 1998, pp 91–92.




Sesión 1

Material1 rotaevaporador 2 vasos de precipitados de 250 mL1 matraz bola de 1 L 1 espátula cromo-níquel1 refrigerante recto con mangueras 1 embudo Büchner1 parrilla de calentamiento placas cromatográficas de aluminio de 20 × 20 cm2 anillos metálicos bomba de aspersión2 pinzas de tres dedos con nuez aspersor1 vidrio de reloj lámpara de luz UV2 pipetas Pasteur con bulbo capilares1 probeta graduada de 100 mL material vegetal (cáscara de naranja)

Reactivoshexano (C6H14)cloruro de metileno (CH2Cl2)metanol anhidro (MeOH)hidróxido de sodio (NaOH)ácido acético (CH3COOH)


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Práctica 00 75

Práctica 11. Mezcla de esteroles de Glycine max


Proporcionar al alumno el conocimiento práctico en las técnicas de aislamiento generales para la obtención y la identificación de fitoesteroles de importancia en la industria farmacéutica.


1. Obtener el crudo de esteroles a partir del aceite de soya mediante un reflujo en condiciones básicas.

2. Establecer la presencia de esteroides en el crudo mediante la prueba de Liebermann-Burchard.

3. Identificar a los esteroides mayoritarios a partir de un crudo de esteroles bajo la forma de derivados acetilados mediante técnicas cromatográficas.

1.3 Antecedentes

La soya es una planta perenne que pertenece a la familia de las leguminosas, es de origen asiático y cuenta con más de 300 variedades cultivadas principalmente en países como China, India, Estados Unidos y Mé-xico. Sus tallos son ramificados y pubescentes, las hojas son alternas y compuestas por tres folios. Las flores son blancas, amarillas o violáceas dependiendo de la variedad (Figura 1).

Las semillas contienen alrededor del 15 al 22% de aceites y del 0.2 al 0.5% de esteroles. Los aceites poseen una gran importancia en la industria alimenticia debido a su elevado valor nutricional. En la industria cosmética se utilizan ampliamente en la elaboración de glicerina, pinturas, jabón y lubricantes. Los estero-les presentes, en forma libre (40%) y en forma de glucósidos o ésteres de ácidos grasos, se emplean como materia prima en la semisíntesis de esteroides con aplicación terapéutica, siendo los mayoritarios el estig-masterol, el -sitosterol y el campesterol.

El aceite de soya se utiliza popularmente en México y otras partes del mundo, principalmente como agente hipocolesterolemiante, para aliviar los síntomas de la arteriosclerosis y prevenir algunas enfermedades del corazón, la hiperplasia prostática y el desarrollo de las neoplasias de mama, endometrio y colon, entre otras.

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76 Práctica 00

Figura 1. Glycine max L. (Leguminosae) y estructuras de los principales esteroles presentes en el aceite de soya.


1.4.1 Preparación del crudo de esteroles

Se colocan 5 g del aceite de soya, 50 mL de etanol absoluto y 15 g de KOH disueltos en un mínimo volu-men de agua, en un matraz bola de 250 mL para someterlo a un proceso de reflujo durante 90 min.

Al término de la extracción, la solución resultante se deja enfriar, se reconstituye en 50 mL de agua y se somete a un proceso de reparto con AcOEt (3 × 100 mL). Al término del proceso de reparto, las soluciones orgánicas se reúnen y se concentran a presión reducida hasta sequedad. El residuo resultante se reconsti-tuye en éter de petróleo y se deja reposar durante siete días. Al cabo de este tiempo, el sólido que se genera se filtra al vacío, se pesa para obtener su rendimiento y se determina su punto de fusión (literatura: p.f. 138-140°C).


1.4.2.1 Reacción de Liebermann-Burchard

Se mezcla 1 mL de anhídrido acético y 1 mL de cloroformo. Esta solución se enfría a 0°C y se adiciona una gota de ácido sulfúrico concentrado. Posteriormente, se adicionan 5 mg del crudo de esteroles (inciso 1.4.1) y se agita suavemente. El desarrollo de una coloración azul o verde, al cabo de 30 min, es indicativo de una prueba positiva para la identificación de esteroles.

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Práctica 00 77

1.4.2.2 Reacción de acetilación

Se pesan 50 mg del crudo de esteroles (inciso 1.4.1) en un matraz bola de 250 mL y se adicionan 1 mL de anhídrido acético y 1 mL de piridina. La mezcla de reacción se somete a un proceso de reflujo por 1 h. Al término de la reacción, la mezcla obtenida se reconstituye en 15 mL de agua y se somete a un proceso de reparto con 15 mL de AcOEt (3 × 15 mL). Posteriormente, la solución orgánica resultante se lava con- secutivamente con HCl 1 N (3 × 45 mL), con una solución de NaHCO3 (10%, p/v) (3 × 45 mL) y finalmente con agua destilada. Al término de este proceso, los restos de humedad en la fase orgánica se eliminan me-diante un tratamiento con Na2SO4 anhidro y la solución resultante se concentra a presión reducida hasta sequedad.

1.4.3 Identificación del estigmasterol y -sitosterol

Se realiza un análisis por cromatografía en capa delgada del crudo de esteroles. Como referencias se em-plean muestras comerciales de estigmasterol y de b-sitosterol.

Soporte: Gel de sílice F254 Merck.

Fase móvil: Hex–AcOEt (7:3).Preparación de la muestra: Se disuelven 5 mg del crudo de esteroles acetilado en 1 mL de AcOEt.Preparación de la muestra de referencia: Se disuelve 1 mg de estigmasterol y de b-sitosterol por separado, en 0.5 mL de CH2Cl2.Revelador: Solución cromógena de sulfato cérico amoniacal.Procedimiento: (1) Se aplica sobre la superficie de la placa el crudo de esteroles acetilado y las referencias en forma de puntos con la ayuda de un capilar, en carriles independientes y aproximadamente a un cm del extremo inferior del cromatofolio. Deberá existir una separación de por lo menos 15 mm entre cada apli-cación. (2) Se realiza el proceso de elución cromatográfica con la fase móvil indicada. Al término, se seca la cromatoplaca bajo una corriente de aire y se examina bajo una lámpara de luz UV a 254 y 365 nm. Se marcan en el cromatograma las zonas de fluorescencia. (3) Enseguida, se rocía la solución reveladora hasta cubrir la cromatoplaca y se calienta hasta la aparición de manchas coloridas. Las bandas correspondientes a la muestra y referencias deben de coincidir en su posición (Rf) y coloración.

1.5 Resultados

1.5.1 Elabore un diagrama de flujo que sintetice el proceso de obtención del crudo de esteroles a partir del aceite de soya. Analizar el uso del KOH en etanol al inicio del proceso de extracción.1.5.2 Analice los resultados del cromatograma obtenido en el inciso 1.4.3. Calcule el factor de retención (Rf) del estigmasterol y del b-sitosterol en el cromatofolio.1.5.3 Explique brevemente mediante reacciones químicas el fundamento de la prueba de Liebermann-Burchard, reacción ampliamente utilizada como ensayo de identidad de las drogas crudas que contienen esteroles.

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78 Práctica 00

1.6 Bibliografía

– Bruneton, J. Farmacognosia, Fitoquímica, Plantas Medicinales. Edit. Acribia. 2a Edición, Zaragoza, España, 2001, pp 679–680.

– Ikan, R. Natural Products: A Laboratory Guide. Edit. Academic Press. 2a Edición, San Diego, California, 1991, pp 136–139.

– Piironen, V.; Lindsay, D.G.; Miettinen, T.A.; Toivo, J.; Lampi, A.M. J Sci. Food Agric. 2000, 80, 939–966.



Sesión 1

Material1 rotaevaporador 1 probeta graduada de 100 mL1 matraz bola de 250 mL 1 espátula cromo-níquel1 refrigerante recto con mangueras propipeta1 embudo de separación de 1000 mL parrilla de agitación y calentamiento2 matraces Erlenmeyer de 125 mL papel filtro1 agitador magnético aceite de soya1 pinza de tres dedos con nuez1 anillo metálico1 embudo Büchner

Reactivosacetato de etilo (AcOEt)etanol (CH3CH2OH)éter de petróleosulfato de sodio anhidro (Na2SO4)hidróxido de potasio (KOH)

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Práctica 00 79

Sesión 2

Material1 matraz bola de 50 mL placas cromatográficas de

aluminio de 20 × 20 cm1 refrigerante recto con mangueras 2 matraces Erlenmeyer de 125 mL parrilla de calentamiento1 pinza de tres dedos con nuez bomba de aspersión2 tubos de ensayo aspersor1 embudo de filtración rápida lámpara de luz UV1 espátula cromo-níquel papel filtro1 propipeta papel aluminio1 pipeta graduada de 10 mL algodón1 pipeta graduada de 5 mL capilares1 parrilla de agitación y calentamiento equipo de medición de punto de fusión1 embudo de separación de 1000 mL1 rotaevaporadorReactivos

ácido clorhídrico (HCl)ácido sulfúrico (H2SO4)anhídrido acético (CH3CO)2O

piridina (C5H5N)

acetato de etilo (AcOEt)

hexano (C6H14)

cloroformo (CHCl3)

bicarbonato de sodio (NaHCO3)

sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)


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Práctica 00 81

Práctica 12. Obtención de la cerina a partir de Quercus suber


Proporcionar al alumno el conocimiento práctico en las técnicas de aislamiento generales para la obtención y la identificación de terpenoides selectos de importancia en la industria farmacéutica.


1. Aplicar los métodos de extracción continua y de recristalización para la obtención de la cerina a partir del corcho.

2. Establecer la identidad del producto aislado mediante la comparación de sus propiedades físicas y cromatográficas con aquellas de una muestra auténtica.

1.3 Antecedentes

Quercus suber L. (Fagaceae) es un árbol mediano, de hoja perenne, nativo de Europa y del norte de África que vive entre 150 y 250 años. Sus hojas miden de 4 a 7 cm de longitud, pueden ser lobuladas o aserradas, verde oscuro en el haz y más claras por el envés. Su fruto es una bellota de 2 a 3 cm de longitud. Tiene una corteza gruesa y rugosa de la que se obtiene el corcho. La recolección del corcho no daña en absoluto al árbol, ya que puede volver a producir una nueva capa, haciendo el recurso totalmente renovable. El árbol se cultiva ampliamente en España, Portugal, Argelia, Marruecos, Francia, Italia y Túnez. La industria eu-ropea del corcho produce 340,000 toneladas al año, por un valor de 2.5 millones de euros.

El desarrollo del corcho parece ser fruto de la evolución de la especie para la protección contra el fuego, frecuente en climas de veranos muy secos. Una parte importante de la industria de corcho reside en Espa-ña, en donde se obtiene alrededor del 30% de la producción mundial.

El corcho es altamente apreciado por su corteza suberificada, la cual se utiliza en la industria de tapones, artículos de pesca, aislantes sonoros y térmicos; la industria del calzado, etc. La corteza es rica en taninos y goza de mucho prestigio para curtir cueros. El corcho es un material muy complejo formado por suberina (45%), polifenoles como la lignina y taninos (33%), celulosa (12%), ceras (5%) y otros compuestos de tipo triterpenoide como la cerina y la friedelina con propiedades antimicrobianas importantes.

Figura 1. Quercus suber L. (Fagaceae) y estructura de la cerina presente en el corcho.

O

cerina

HO

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82 Práctica 00


1.4.1 Preparación y fraccionamiento del extracto

Se pesan 75 g del material vegetal seco y molido y se adicionan 500 mL de hexano para someterlo a una extracción continua utilizando un aparato de Soxhlet durante 60 min. El extracto resultante se filtra y concentra a sequedad.

1.4.2 Purificación de la cerina

El extracto obtenido en el inciso 1.4.1 se reconstituye en el volumen mínimo de CHCl3 caliente y se al-macena durante 24 horas. El sólido resultante se recristaliza utilizando hexano caliente y se deja reposar por 20 minutos. Al cabo de este tiempo, los cristales formados se filtran al vacío, se pesan para obtener su rendimiento y se determina su punto de fusión (literatura: p.f. 255-256°C).

1.4.3 Identificación de la cerina

Se realiza un análisis por cromatografía en capa delgada utilizando la técnica de coelución. Como referen-cia se emplea una muestra comercial de cerina.

Soporte: Gel de sílice F254 Merck.Fase móvil: CH2Cl2–Hex–AcOEt (8:1:1).Preparación de la muestra: Se disuelve 1 mg de la cerina aislada en 0.5 mL de CHCl3.

Preparación de la muestra de referencia: Se disuelve 1 mg de la referencia de cerina en 0.5 mL de CHCl3.Revelador: Solución cromógena de aldehído anísico en ácido sulfúrico.Procedimiento: (1) Se aplica sobre la superficie de la placa la referencia, la muestra y una mezcla (1:1) de la muestra y la referencia (coelución) en forma de puntos con la ayuda de un capilar, en carriles independien-tes y aproximadamente a un cm del extremo inferior del cromatofolio. Deberá existir una separación de por lo menos 15 mm entre cada aplicación. (2) Se realiza el proceso de elución cromatográfica con la fase móvil indicada. Al término, se seca la cromatoplaca bajo una corriente de aire y se examina bajo una lám-para de luz UV a 254 y 365 nm. Se marcan en el cromatograma las zonas de fluorescencia. (3) Enseguida, se rocía la solución reveladora hasta cubrir la cromatoplaca y se calienta hasta la aparición de manchas co-loridas. Las bandas correspondientes a la muestra, a la referencia y a la coelución (e. g. mezcla de la muestra y la referencia) deben de coincidir en su posición (Rf) y coloración.

1.5 Resultados

1.5.1 Determine el rendimiento de la cerina con base en el peso seco del material vegetal de acuerdo a la siguiente expresión matemática: (A × 100)/B en donde: A representa el peso (g) de la cerina y B es el peso (g) del material vegetal seco.1.5.2 Analice los resultados del cromatograma obtenido en el inciso 1.4.3. Calcule el factor de retención (Rf) de la cerina (muestra de referencia y muestra aislada) en el cromatofolio.

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Práctica 00 83

1.6 Bibliografía

– Ikan, R. Natural Products: A Laboratory Guide. Edit. Academic Press. 2da Edición, San Diego, California, 1991, pp 217–220.

– Castola, V.; Bighelli, A.; Rezzi, S.; Melloni, G.; Gladiali, S.; Desjobert, J.M.; Casanova, J. Ind. Crops Prod. 2002, 15, 15–22.

– Ghosh, P.; Mandal, A.; Chakrabortya, M.; Saha, A. J. Chem. Pharm. Res. 2010, 2, 714–721.

– Coquet, C.; Ferré, E.; Peyronel, D.; Dal Farra, C.; Farnet. A.M. C. R. Biologies, 2008, 331, 853–858.



Sesión 1

Material

1 rotaevaporador papel aluminio1 extractor Soxhlet algodón

1 espátula cromo-níquel papel filtro

1 embudo Büchner frascos viales

2 vasos de precipitados de 100 mL propipeta

1 pipeta graduada de 10 mL material vegetal (corcho)

1 probeta graduada de 10 mL

2 pipetas Pasteur con bulbo

1 vidrio de reloj1 vaso de precipitado de 250 mL

Reactivoshexano (C6H14)cloroformo (CHCl3)metanol anhidro (MeOH)acetato de etilo (AcOEt)cloruro de metileno (CH2Cl2)ácido sulfúrico (H2SO4)

anisaldehído (C8H8O2)

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Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosiaes una obra editada por la Facultad de Química.

Se utilizaron en la composición los tiposAvalon y Times New Roman puntaje 9 y 11 pts

Tipo de impresión PDFLa publicación de esta obra fue posible gracias al apoyo de la Coordinación de Comunicación

a través de los Departamentos de Editorial y de Información (Taller de Imprenta).El cuidado de la edición estuvo a cargo de

CME Brenda Álvarez Carreño.Diseño de interiores: Maricela Hernández Casasola

Diseño de portada: LDCV Vianey Islas Bastida

Publicación autorizada por el Comité Editorial de la Facultad de Química.

Julio de 2014

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