FERMENTACIJA SIROTKE Z NARAVNO STARTER KULTURO · Fermentacija sirotke z naravno starter kulturo V Fermentacija sirotke z naravno starter kulturo Povzetek Sirotka je stranski produkt

Magistrsko delo

FERMENTACIJA SIROTKE Z NARAVNO STARTER KULTURO

Maribor, 2016 Monika Koroša

Monika Koroša

Fermentacija sirotke z naravno starter kulturo

Magistrsko delo

Maribor, 2016


Magistrsko delo študijskega programa II. stopnje

Študent: Monika Koroša

Študijski program: magistrski študijski program II. stopnje Kemijska

tehnika

Predvideni strokovni naslov: magistrica inženirka kemijske tehnike

Mentor: red. prof. dr. Andreja Goršek

Komentor: doc. dr. Darja Pečar

Maribor, 2016

(Tukaj vstavite originalni izvod sklepa o magistrskem delu. V preostale izvode vstavite kopije oz. skenirane

kopije.)


I

Kazalo

Kazalo ........................................................................................................................................ I Izjava....................................................................................................................................... III Zahvala ................................................................................................................................... IV

Povzetek ................................................................................................................................... V Abstract ................................................................................................................................... VI Seznam tabel ......................................................................................................................... VII Seznam slik .......................................................................................................................... VIII Uporabljeni simboli in kratice ................................................................................................ IX

1 Uvod .................................................................................................................................. 1

1.1 Opredelitev problema ................................................................................................. 1

1.2 Pregled literature ........................................................................................................ 2 1.3 Namen, hipoteze in cilji ............................................................................................. 2

2 Teoretični del ..................................................................................................................... 4 2.1 Sirotka ........................................................................................................................ 4

2.1.1 Sestava sirotke .................................................................................................... 4 2.1.2 Aplikacije sirotke ................................................................................................ 5

2.2 Kefirna zrna................................................................................................................ 7

2.2.1 Sestava kefirnih zrn ............................................................................................ 8 2.2.2 Kefiran ................................................................................................................ 9

2.2.3 Uporaba kefirnih zrn ........................................................................................... 9 2.3 Fermentacija ............................................................................................................. 10

2.3.1 Mikroorganizmi za fermentacije....................................................................... 10

2.3.2 Mlečnokislinske bakterije ................................................................................. 12

2.4 Rast mikroorganizmov ............................................................................................. 13 2.4.1 Rastni cikel mikroorganizmov .......................................................................... 14

3 Metode in materiali ......................................................................................................... 16

3.1 Laboratorijske metode ............................................................................................. 16 3.1.1 Aktivacija kefirnih zrn ...................................................................................... 16

3.1.2 Fermentacija ..................................................................................................... 18 3.1.3 Merjenje pH vrednosti ...................................................................................... 19 3.1.4 Kinetični model ................................................................................................ 20

3.2 Materiali ................................................................................................................... 21 3.3 Računalniški program .............................................................................................. 21

3.4 Uporaba sirotke ........................................................................................................ 22

4 Eksperimentalni del ......................................................................................................... 24

4.1 Optimiranje procesnih parametrov........................................................................... 24 4.1.1 Načrt izvajanja eksperimentov ......................................................................... 24 4.1.2 Postopek izvedbe eksperimentov ...................................................................... 24 4.1.3 Grafična analiza vpliva procesnih parametrov na prirast kefirnih zrn ............. 25

4.2 Modeliranje rastne krivulje ...................................................................................... 25

4.2.1 Računski postopek ............................................................................................ 25 4.2.2 Grafična analiza rastne krivulje kefirnih zrn .................................................... 28

4.3 Vpliv vrtilne frekvence mešala na rast kefirnih zrn ................................................. 29 5 Rezultati in diskusija ....................................................................................................... 30

5.1 Rastna krivulja ......................................................................................................... 30 5.2 Vpliv temperature na rast kefirnih zrn ..................................................................... 31


II

5.3 Parametri rasti kefirnih zrn ....................................................................................... 32 5.3.1 Vpliv temperature na doseženo maksimalno maso kefirnih zrn ....................... 34

5.3.2 Vpliv temperature na proizvodnost ................................................................... 35 5.3.3 Vpliv temperature na lag fazo ........................................................................... 35

5.4 Vpliv temperature na pH vrednost ........................................................................... 37 5.5 Vpliv vrtilne frekvence mešala................................................................................. 38

5.5.1 Primerjava vpliva vrtilne frekvence mešala v sirotki in mleku ........................ 39

5.6 Relativna prirast zrn v sirotki in mleku .................................................................... 40 5.7 Gompertz-ova enačba ............................................................................................... 41 5.8 Kefirna zrna skozi proces eksperimentov ................................................................ 42

6 Zaključek ......................................................................................................................... 44 7 Literatura.......................................................................................................................... 46

8 Življenjepis ...................................................................................................................... 48


III

Izjava

Izjavljam, da sem magistrsko delo izdelal/a sam/a, prispevki drugih so posebej označeni.

Pregledal/a sem literaturo s področja magistrskega dela po naslednjih geslih:

Vir: Web of Knowledge (apps.webofknowledge.com)

Gesla: Število referenc

1 whey in kefir grains 104

2 whey in kefir grains in fermentation 33

3 whey in kefir grains in kinetics 3

Vir:COBISS/OPAC (http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?ukaz=getid, COBIB.SI)

Gesla: Število referenc

1sirotka 93

2 kefirna zrna 32

3 sirotka in fermentacija 3

Skupno število pregledanih člankov: 10

Skupno število pregledanih knjig: 11

Maribor, september 2016 Monika Koroša


IV

Zahvala

Iskrena zahvala mentorici red. prof. dr Andreji Goršek za

pomoč, spodbudo in usmerjanje pri izdelavi magistrske naloge.

Enaka zahvala gre somentorici doc. dr Darji Pečar, obenem pa se

ji zahvaljujem za pomoč v laboratoriju.

Posebna zahvala družini, ki me je podpirala in mi stala ob strani

skozi vsa leta študija ter prijateljem, ki so me spodbujali in mi

študijska leta naredili vesela in nepozabna.

»Vse kar počneš delaj s srcem, umom in dušo. To je skrivnost

uspeha.«

(Swami Sivananda)


V


Povzetek

Sirotka je stranski produkt mlečne industrije pri proizvodnji sira. Predstavlja veliko okoljsko

težavo, zaradi strožjih okoljskih ukrepov in gospodarskih pritiskov se iščejo in razvijajo

nove alternative za nadaljnjo uporabo sirotke. Ker ima visoko hranilno vrednost je največ

raziskav opravljenih na področju živil, pijač in prehranskih dodatkov.

Kefirna zrna so naravna starter kultura, katerih izvor do danes še ni poznan. Največ se

uporabljajo v proizvodnji tradicionalnega napitka, kefirja, obetajo se tudi nove aplikacije.

V magistrskem delu smo najprej izvajali fermentacije sirotke s kefirnimi zrni, preučevali

smo rast in obnašanje samih zrn. Želeli smo izdelati kinetični model rasti kefirnih zrn, za

katerega smo morali doseči ponovljivost rezultatov. Po opravljenih eksperimentih smo zbrali

meritve in zasnovali rastno krivuljo s katero smo lahko izdelali kinetični model rasti zrn v

sirotki. Pri eksperimentih nas je najbolj zanimal vpliv temperature na rast zrn, spremljali smo

tudi spreminjanje pH vrednosti sirotke in primerjali meritve pri različnih vrtilnih frekvencah

mešala v reaktorju za fermentacijo. Za potrditev sirotke kot uporabnega substrata za gojenje

kefirnih zrn smo rezultate primerjali z že objavljenimi rezultati raziskav fermentacije mleka s

kefirnimi zrni.

Ključne besede: sirotka, kefirna zrna, fermentacija, kinetični model, rastna krivulja,

Gompertz-ov model

UDK: 637.344(043.2)


VI

Whey fermentation with natural starter culture

Abstract

Whey is by-product in production of cheese that is produced in large amounts. It represents a

major source of environmental pollution, because of economical and environmental pressure

considerable efforts have been made to explore alternative outlets for whey utilization. Due

to its high nutritional value most studies have been completed in the area of food, drinks and

dietary supplements.

Kefir grains are natural starter culture, the origin of which has not yet known. Most are used

in the production of the traditional beverage, kefir, promising to new applications.

In the present study fermentations were performed by inoculating kefir grains in whey, we

studied growth and behavior of the grains themselves. The aim was to create a kinetic

growth model for kefir grain biomass. To create model first we had to achieve repeatability

of results. Once measurements were gathered we designed growth curve to create kinetic

model. We devoted to the influence of temperature on kefir grains, and monitored the change

of pH values of whey, and compare results given at different speed of stirrer. To confirm

whey as a useful substrate for culturing kefir grains results are compared with previously

published research results of fermentation of milk with kefir grains.

Keywords: whey, kefir grains, fermentation, kinetic model, growth curve, Gompertz

function

UDK: 637.344(043.2)


VII

Seznam tabel

Tabela 2-1: Sestava sladke in kisle sirotke. [10] ...................................................................... 4

Tabela 4-1: Procesni parametri fermentacije sirotke pri T = 24 °C. ....................................... 26

Tabela 4-2: Procesni parametri fermentacije sirotke pri T = 28 °C. ....................................... 27

Tabela 4-3:Procesni parametri fermentacije sirotke pri T = 32 °C. ........................................ 27

Tabela 4-4: Procesni parametri fermentacije sirotke pri različnih vrtilnih frekvencah mešala

na prirast kefirnih zrn.............................................................................................................. 29

Tabela 5-1: Kinetični parametri fermentacije sirotke s kefirnimi zrni - Gompertz-ov model 32

Tabela 5-2: Spremembe pH vrednosti v določenih časovnih intervalih pri temperaturah

fermentacij T = 24 °C, T =28 °C in T =32 °C. ........................................................................ 38

Tabela 5-3: Izmerjene končne mase kefirnih zrn pri različnih temperaturah in različnih

vrtilnih frekvencah mešala. ..................................................................................................... 38

Tabela 5-4: Spremembe pH vrednosti pri različnih vrtilnih frekvencah mešala pri T =24 °C,

T = 28 °C in T =32 °C. ............................................................................................................ 39

Tabela 5-5: Začetne in končne masne koncentracije ter masne koncentracije prirasti kefirnih

zrn v odvisnosti od temperature [26]. ..................................................................................... 40


VIII

Seznam slik

Slika 2-1: Shema komercialne izrabe sirotke. [10] ................................................................... 6

Slika 2-2: Kefirna zrna. ............................................................................................................. 7

Slika 2-3: SEM slika notranjosti kefirnega zrna. [4, 16] .......................................................... 8

Slika 2-4: Bakterija iz vrst laktobacilov (Lactobacillusdelbrueckii), ki se uporablja pri

proizvodnji jogurta. [20] ......................................................................................................... 11

Slika 2-5: Kvasovka Saccharamycescerevisiae. [21] ............................................................. 11

Slika 2-6: Plesen iz rodu Penicillium, camembertii, uporablja se pri proizvodnji sira

camembert in brie. [22] ........................................................................................................... 12

Slika 2-7: Faze rasti mikroorganizmov (rimske številke) pri šaržni fermentaciji. [18] .......... 15

Slika 3-1: Aktivacija kefirnih zrn v sirotki. ............................................................................ 17

Slika 3-2: Sušenje zrn pred tehtanjem..................................................................................... 17

Slika 3-3: Trivratni reaktor s sirotko in kefirnimi zrni pred izvedbo fermentacije. ................ 18

Slika 3-4: Fermentacija sirotke v trivratnem termostatiranem mešalnem reaktorju. .............. 19

Slika 3-5: Merjenje pH vrednosti sirotke. a – elektroda, b – sirotka, c – magnetno mešalo, d –

pH meter. ................................................................................................................................. 20

Slika 4-1: Določene mase kefirnih zrn pri različnih temperaturah v odvisnosti od časa. ....... 28

Slika 5-1: Rastna krivulja kefirnih zrn pri T = 24 °C, T = 28 °C in T = 32 °C. ...................... 30

Slika 5-2: Rastna krivulja pri izbranih temperaturah (24 °C in 28 °C). .................................. 31

Slika 5-3: Rastna krivulja dobljena z Gompertz-ovim modelom pri T = 24 °C. .................... 32

Slika 5-4: Rastna krivulja dobljena z Gompertz-ovim modelom pri T = 28 °C. .................... 33

Slika 5-5: Rastna krivulja dobljena z Gompertz-ovim modelom pri T =32 °C. ..................... 33

Slika 5-6: Maksimalna dosežena masa v odvisnosti od temperature. ..................................... 34

Slika 5-7: Maksimalna proizvodnost v odvisnosti od temperature. ........................................ 35

Slika 5-8: Čas trajanja lag faze v odvisnosti od temperature. ................................................. 36

Slika 5-9: pH vrednost ob začetku in koncu fermentacij pri T = 24 °C, T = 28 °C in T = 32

°C. ........................................................................................................................................... 37

Slika 5-10: Masna koncentracija prirasti kefirnih zrn v odvisnosti od vrtilne frekvence

mešala v mleku in sirotki pri izbranih temperaturah. [9] ........................................................ 39

Slika 5-11: Relativna prirast v odvisnosti od temperature za posamezno kulturo. [26] ......... 41

Slika 5-12: Kefirna zrna po 1 mesecu, slabih 3 mesecih in 6 mesecih uporabe. .................... 42

Slika 5-13: Kefirna zrna po polovici izvedenih eksperimentov. Med zrni že prevladujejo

manjše kroglice. ...................................................................................................................... 43


IX

Uporabljeni simboli in kratice

Simboli a izbran faktor (rast substrata, temperatura)

b izbran faktor (na primer inhibitor)

Δt sprememba časa (h)

Δx sprememba mase biomase (g)

f vrtilna frekvenca mešala (min-1

)

mk končna masa kefirnih zrn (g)

mz začetna masa kefirnih zrn (g)

pH vrednost pH (/)

pHk končna vrednost pH (/)

pHz začetna vrednost pH (/)

rmax maksimalna proizvodnost (g/h)

t čas trajanja fermentacije (h)

T temperatura (°C)

tL čas trajanja lag faze (h)

Δm prirast kefirnih zrn (g)

Δmmax maksimalna prirast kefirnih zrn (g)

ΔpH sprememba vrednosti pH (/)

Grški simboli

z,k končna masna koncentracija kefirnih zrn (g/L)

z,z začetna masna koncentracija kefirnih zrn (g/L)

Δz,r relativna prirast kefirnih zrn (%)

Kratice B2 vitamin riboflavin

BPK5 biološka potreba po kisiku po 5 dneh

KPK kemijska potreba po kisiku

MKB mlečnokislinske bakterije

SCP Single-Cell Protein / enocelični proteini


X


1

1 Uvod

Sirotka je stranski produkt, ki nastaja pri proizvodnji sira. Nekoč je bila v poletnih mesecih

priljubljena osvežilna pijača, uporabljala se je za krmo živali, tako v planinah kot naseljih.

Pastirji v planinah so ob posameznih obrokih pili studenčnico ali sirotko. V Prekmurju so

sirotko, ki je nastala ob izdelavi skute, uporabljali za gnetenje krušnega testa, testa za pogače

ali za pripravo raznih sirovih ali kiselkastih juh. [1]

Odstranjevanje nastale sirotke v proizvodnji sira iz mleka predstavlja velik del

onesnaževanja okolja, saj le 10 % mleka preide v sir, ostane pa od (80 - 90) % sirotke. Poleg

velikih količin sirotke, ki nastane, je problem odstranjevanja tudi v visokem deležu

organskih snovi, ki jih vsebuje. [2, 3]

Nekoč so odpadno sirotko preprosto izpuščali v kanalizacijo, v zadnjem času se iščejo nove

možnosti za njeno rabo, tako v prehranske kot v druge namene. Novi načini rabe temeljijo

predvsem na visokih hranilnih vrednostih sirotke, saj predstavlja vir laktoze in drugih

hranilnih snovi pomembnih za mikrobiološko rast. [2, 3]

Osnovna starter kultura kefirja so kefirna zrna. Do zdaj še vedno ni znano kako natančno so

omenjena zrna nastala, edini vir za razlago njihovega nastanka so razne legende in

predvidevanja. Kefirna zrna predstavlja kopica mlečnokislinskih in ocetnokislinskih bakterij,

ki se skupaj s kvasovkami nahajajo v matrici sestavljeni iz polisaharidov in proteinov. Do

sedaj so uspešno preučili gojenje mikroorganizmov kefirnih zrn v sirotki za proizvodnjo

alkohola, pekovskega kvasa, polisaharidov, celičnih proteinov, fermentiranih pijač, starterjev

za proizvodnjo sira, hidrolizata beljakovin in protimikrobnih spojin. [3, 4]

1.1 Opredelitev problema

Sirotka je glavni in največji stranski produkt v mlečni industriji. Letna svetovna proizvodnja

sirotke je ocenjena na 1,6 ∙ 1011

kg z letnim prirastkom od 1 do 2 %. Odstranjevanje sirotke

brez predhodnega dragega čiščenja predstavlja ogromen vir onesnaževanja. V zadnjih letih je

zaznan velik napredek pri raznih raziskavah za nadaljnjo rabo sirotke in posledično tudi

zmanjšanje onesnaževanja. Z mikroorganizmi, ki pretvarjajo laktozo v alkohol lahko sirotko

poleg proizvodnje pitnega alkohola uporabimo tudi v proizvodnji žganih pijač in pijač

podobnim kefirju. [5, 6]

V sirotki se ohrani 55 % hranilnih snovi iz mleka. Največ od teh snovi predstavljajo laktoza,

topni proteini, maščobe in minerali. Zaradi gospodarskih in okoljskih pritiskov, večina

obratov za proizvodnjo sira razvija postopke za ponovno uporabo vseh ostankov snovi iz

mleka. Dandanes v večini večjih obratov za proizvodnjo sira sirotko sušijo ali jo

frakcionirajo z membranskimi procesi za nadaljnjo uporabo v prehrambni in farmacevtski

industriji. Manjši obrati in obrati v manj razvitih državah si opreme za tako predelavo sirotke

ne morejo privoščiti, zato jo porabijo kot gnojilo, hrano za živali ali jo preprosto zavržejo.


2

Zato je interes mlečne industrije razvoj cenejših alternativ uporabe sirotke, kjer se izkoristijo

njene hranilne lastnosti in se posledično dvigne njena tržna vrednost. [7]

Zaradi visoke vsebnosti laktoze in prisotnost hranilnih snovi, bistvenih za mikrobiološko

rast, bi se lahko sirotka uporabljala kot surovina v fermentacijskih procesih pri proizvodnji

dragocenih snovi. Med zanimive alternative za njeno uporabo poleg alkoholnega vrenja,

povzročenega s kvasovkami, spadata proizvodnja alkoholnih pijač, med drugim tudi žganja

in proizvodnja kefirnih napitkov na osnovi sirotke. Obetajoča je tudi proizvodnja glicerola iz

sirotke. Uporablja se lahko v proizvodnji hrane, hranil (biomase, maščobe) in proizvodnji

citronske kisline. Cilj našega raziskovalnega dela je bila fermentacija sirotke s kefirnimi zrni.

Želeli smo potrditi učinkovitost sirotke kot substrata za gojenje kefirnih zrn. [4, 8]

1.2 Pregled literature

Po pregledu literature smo ugotovili, da so se v preteklih raziskavah [3, 5, 8] največ

posvečali sestavi sirotke po končani fermentaciji s kefirnimi zrni. Na podlagi tega so

ugotavljali uporabnost sirotke kot potencialne surovine za proizvodnjo napitkov, podobnih

kefirju in za proizvodnjo polisaharidov, ki nastanejo z razgradnjo laktoze. Pri raziskavah so

spremljali vpliv pH na stopnjo porabe laktoze [3], z dodanimi izbranimi beljakovinami in

proteini so zasledovali rast kefirnih zrn, spremembo kefirnih zrn po dodatkih določenih

subkultur pri različnih temperaturah [17]. Pri nekaterih študijah o rasti kefirnih zrn v sirotki

so uporabljali različne temperature, vendar se v nobeni niso osredotočili na potek rasti

kefirnih zrn od začetka fermentacije naprej pri različnih temperaturah, oziroma v nobeni od

omenjenih raziskav nismo zasledili modeliranja rastne krivulje in zasnove kinetičnega

modela rasti kefirnih zrn v sirotki.

1.3 Namen, hipoteze in cilji

Cilj magistrskega dela je bil doseči ponovljivost rezultatov fermentacije sirotke z naravno

starter kulturo, kefirnimi zrni. Šele na osnovi tega smo lahko izdelali kinetični model rasti

kefirnih zrn v sirotki. Za izdelavo kinetičnega modela smo spremljali časovni potek

fermentacije sirotke pri treh različnih temperaturah. Spremljali smo rast kefirnih zrn in na

osnovi njihovih masnih koncentracij dobili končno rastno krivuljo. Z rastnimi krivuljami in

izbranim Gompertz-ovim modelom smo določili parametre rasti, s katerimi smo zasnovali

kinetični model rasti kefirnih zrn v sirotki v določenem temperaturnem območju. Parametri

rasti so maksimalna dosežena prirast zrn, maksimalna proizvodnost zrn in čas trajanja lag

faze oziroma faze prilagajanja. Dobljene meritve in rezultate smo primerjali z rezultati,

pridobljenimi s fermentacijami v mleku. Tako smo lahko potrdili primernost sirotke za

gojenje kefirnih zrn.

Glede na obnašanje kefirnih zrn v mleku in rezultatih že opravljenih raziskav smo

predvidevali, da bodo kefirna zrna hitreje rastla in se razmnoževala pri višjih temperaturah.

Mlečnokislinske bakterije ne preživijo pri temperaturah višjih od 45 °C, vendar imajo

posamezni rodovi različne temperaturne optimume pri katerih je njihovo delovanje najboljše.


3

Podobno velja tudi za kvasovke, ki rastejo in se razmnožujejo v temperaturnem območju

(20 - 37) °C. Tako mlečnokislinske bakterije kot kvasovke so glavne komponente mikroflore

kefirnih zrn. Zaradi omenjenih različnih temperaturnih optimumov in nepoznavanja točne

sestave mikrobiote kefirnih zrn, smo bili še posebej pozorni na obnašanje in spremembe,

zaznane pri kefirnih zrnih pri najvišji izbrani temperaturi, to je 32 °C. [9]


4

2 Teoretični del

2.1 Sirotka

Sirotka je stranski produkt pri predelavi mleka, rahlo rumeno-zelene barve. Je vodna faza, ki

se loči od sesirjenega mleka. Svetovna letna proizvodnja sirotke je ocenjena na nekje

82 milijonov ton. V splošnem sta znani dve vrsti sirotke: sladka in kisla sirotka. [10, 11]

2.1.1 Sestava sirotke

Sestava in lastnosti sirotke so odvisne od tehnološkega postopka predelave in kakovosti

uporabljenega mleka. Sladka sirotka je tista, pri kateri se kazein izloča z encimsko

koagulacijo (s pomočjo sirišča), kisla sirotka je posledica kislinske koagulacije mleka. V

tabeli 2-1 je prikazana sestava posameznih vrst sirotke. [10, 12]

Tabela 2-1: Sestava sladke in kisle sirotke. [10]

Parameter ws(%) wk (%)

Suha snov 6,50 6,00

Laktoza 4,50 4,20

Protein 0,70 0,80

Maščoba 0,40 0,20

Pepel 0,50 0,60

Sirotka je sestavljena iz suhe snovi, laktoze, proteinov, maščob, raznih mineralnih snovi

(kalcij, fosfor in kalij) ter železa, tiamina, riboflavina, niacina in askorbinske kisline. Sladka

sirotka ima pH v območju (5,1 – 4,3), kisla v območju (4,5 – 4,7). [2, 12]

Približno 50 % suhe snovi mleka med predelavo preide v sirotko. Laktoza predstavlja

največji delež suhe snovi (70 %), manj je sirotkinih proteinov, mineralov in maščob.

Količina proteinov je v sladki in kisli sirotki zelo podobna (tabela 2-1), saj so proteini

neobčutljivi na kislinsko (kisla) in encimsko (sladka sirotka) razgradnjo, med koagulacijo

mleka tako ostanejo nespremenjeni. Po ločevanju kazeina preidejo proteini v celoti v sirotko.

Nasprotno od proteinov, se delež prostih aminokislin precej razlikuje, odvisen je od stopnje

hidrolize kazeina. [10]

Zaradi različnih biokemijskih procesov, ki se uporabljajo v tehnologiji proizvodnje sirov, je

v obeh vrstah sirotke najbolj različna sestava mineralnih snovi. V sirotko prehajajo skoraj vsi

elementi in raztopljene soli, tudi tiste dodane med samo proizvodnjo sira. V kazeinu sira se

delno zadržita le kalcij in fosfor, ostale snovi se nahajajo v sirotki v istih deležih kot v

mleku. [10]


5

V sirotko iz mleka med drugim prehajajo vodotopni vitamini, vitamini topni v maščobah pa

le delno. Delež vitaminov se spreminja, najbolj je odvisen od načina shranjevanja sirotke.

Sirotka vsebuje precej vitaminov B-skupine, zaradi velike količine riboflavina (B2) se

uporablja za pridobivanje koncentriranega riboflavina in ima značilno rumeno-zeleno barvo.

[10]

Pomembna sestavina sirotke je laktoza, disaharid sestavljen iz glukoze in galaktoze. Iz

sirotke jo lahko pridobivamo čisto ali pomešano z drugimi snovmi. Če je namen izkoriščanja

sirotke kot kompleksnega hranila, je bolje pustiti sirotko da se skisa, saj mnogi organizmi

lažje izkoristijo mlečno kislino kot laktozo. Med novejšimi najbolj donosnimi alternativnimi

izrabami laktoze iz sirotke se smatrajo procesi gojenja mikrobnih kultur (kot so kefirna

zrna). [10]

2.1.2 Aplikacije sirotke

Ker pri proizvodnji 1 kg sira nastane 9 kg sirotke in bo po napovedih proizvodnja sira v

prihodnosti naraščala, je iskanje novih in boljših načinov izkoriščanja sirotke prioriteta

mlečne industrije. Zaradi visoke vrednosti BPK5 (40 000 mg/L) je sirotka eden izmed

glavnih onesnaževalcev okolja. Z ultrafiltracijo ali diafiltracijo iz sirotke izperemo laktozo in

minerale, vendar deproteinizirana sirotka oziroma permeat sirotke, ki nastane, še vedno

predstavlja količinsko velik odpadek, več kot 70 % začetne odpadne sirotke. Na sliki 2-1 je

prikazana shema komercialne izrabe sirotke. Z belimi kvadrati so označeni procesi, s

katerimi sirotko obdelamo, v oranžnih kvadratih so dobljene snovi, namenjene nadaljnji

uporabi. [8, 12]

V zadnjih letih je opazno veliko prizadevanja za različne nove načine uporabe sirotke s

čimer bi se zmanjšala količina odpadkov v mlečni industriji. Zaradi visoke vsebnosti laktoze

in prisotnost hranilnih snovi bistvenih za mikrobiološko rast, bi se lahko sirotka potencialno

uporabljala kot surovina v fermentacijskih procesih pri proizvodnji dragocenih snovi. Med

alternative za uporabo sirotke spadata proizvodnja alkoholnih pijač, tudi žganja in

proizvodnja kefirnih napitkov na osnovi sirotke. Za ustrezno se je že izkazala proizvodnja

etanola iz sirotke s pomočjo fermentacije, obetajoča je tudi proizvodnja glicerola. Uporablja

se lahko pri proizvodnji hrane, hranil in proizvodnji citronske kisline. Za prehrano se

najpogosteje uporabljajo beljakovine, pridobljene iz sirotke, kot je sirarska ali albuminska

skuta, ki se uživa v svežem stanju, konzervirana ali posušena. Iz beljakovin se lahko

izdelujejo tudi siri, kot je italijanski Mascarpin, v skandinavskih deželah je znana sladica

“Mysost”, ki je podobna medu in prav tako pridelana iz sirotke. [4, 8, 10]

Sirotka ima posebno mesto v smislu zdravja. Zelo ugodno deluje na peristaltiko črevesja,

smatrajo jo kot “diuretikum” in je posledično uspešno zdravilo pri ledvičnih boleznih.

Sirotka je uspešno dražilo za lažje izločanje žolča. Ribo- in laktoflavin, sestavini sirotke,

ugodno vplivata na prebavo. [10]


6

Slika 2-1: Shema komercialne izrabe sirotke. [10]

Pomembno je, da sirotka pri nadaljnji uporabi ne vsebuje nitratov. V primeru, da mleku za

sir dodamo do 20 g nitratov na 100 L, preide približno 90 % KNO3 v sirotko. Še večji

problem se pojavi, če tako sirotko sušimo in se njen prah uporablja kot dodatek drugim

živilom, saj ta vsebuje sedemnajstkrat več nitratov, kot je dovoljeno. Zaradi tega je potrebno

sirotko, onesnaženo z nitrati, predhodno očistiti, kar dosežemo s pomočjo anionskih

izmenjevalnih kolon. [2]

Sirotka kot gojišče

Sirotka predstavlja ugodno okolje za rast in proizvodnjo mikroorganizmov, kar je razvidno

iz hitre kvarljivosti toplotno neobdelane sirotke.

S pomočjo mikroorganizmov dobimo velik del industrijskih proizvodov, ki so nujni za

življenje človeka. Ekonomska, vedno bolj tehnološka in okoljevarstvena logika nas pri izbiri

tehnologij sili v izbor biotehnologij namesto kemijske sinteze. Za okolje je biološka

alternativa v smislu nastajanja odpadnih toplot, toksičnih zračnih emisij in tehnoloških

odplak manj obremenjujoča, hkrati je energetsko varčnejša.


7

Dokazano je, da proteini, koncentrirani iz sirotke, spodbujajo rast in aktivnost nekaterih

mlečnokislinskih bakterij, najbolj vrste Lactobacillus in Streptococcus. Tako se lahko

koncentrati sirotkinih proteinov, pridobljenih z ultrafiltracijo, uporabljajo za pripravo

mikrobnih kultur. [10]

2.2 Kefirna zrna

V prehrambni industriji je v zadnjih letih poraslo zanimanje za izkoriščanje in uporabo novih

starter kultur. Glavni razlog so proizvodnja raznolikih živil z značilnimi nadgrajenimi

senzoričnimi lastnostmi, proizvodnja bakteriocinov (beljakovinski toksini, ki zavirajo razvoj

podobnih ali bližnje sorodnih bakterij), doseganje probiotičnih lastnosti in višjih hranilnih

vrednosti živil. Iz omenjenih razlogov je bilo preizkušenih več različnih starter kultur, ki

vsebujejo mlečnokislinske bakterije. Kefirna zrna se uporabljajo že več stoletij za pripravo

tradicionalne fermentirane pijače (kefir), ena izmed njihovih pomembnih komponent so

mlečnokislinske bakterije. Obetavni rezultati se kažejo pri fermentaciji z zrni v proizvodnji

kruha, sira, pri fermentaciji mleka. [13, 14]

Kefirna zrna so nepravilne oblike, bele do rahlo rumene barve in elastične zgradbe, vidimo

jih na sliki 2-2. Po obliki so lahko ravna kot papir, zavihana, v obliki zvitkov, v obliki cveta

cvetače ali kot zrna prosa. Zrna so rezultat močne in specifične simbioze med

mikroorganizmi in rastejo kot biološko samostojne enote. Aktivne jih ohranjamo s

shranjevanjem v mleku, katerega dnevno zamenjamo s svežim. S tem zagotovimo rast in

razmnoževanje mikroorganizmov v zrnih; v 20 h se jim masa poveča za približno 25 %.

Kljub velikemu trudu tvorbe novih kefirnih zrn z raznimi kombinacijami mikroorganizmov

izoliranih iz samih zrn so bili do sedaj vsi poskusi neuspešni. [4, 15]

Slika 2-2: Kefirna zrna.

https://sl.wikipedia.org/wiki/Beljakovina

https://sl.wikipedia.org/wiki/Toksin


8

2.2.1 Sestava kefirnih zrn

Mikroorganizmi, ki so del osnovne simbiotske mikroflore kefirnih zrn, so: streptokoki

mlečnih kislin, laktobacili, mezofilne heterofermantivne mlečnokislinske bakterije, kvasovke

in ocetnokislinske bakterije. Koncentracije omenjenih mikroorganizmov variirajo od

različnih kultur kefirnih zrn, razen streptokokov, katerih ni mogoče zaznati v vseh zrnih. Na

sliki 2-3 je prikazana notranjost kefirnega zrna, kjer so označeni laktobacili, kvasovke ter

matrica zrn. [4]

Slika 2-3: SEM slika notranjosti kefirnega zrna. [4, 16]

Mlečnokislinske bakterije (MKB) so glavna skupina mikroorganizmov, ki se uporabljajo v

fermentaciji živil. Mlečni proizvodi, kot sta jogurt in sir, mesni proizvodi, alkoholne pijače,

fermentirane žitarice in kruh iz kislega testa so eni izmed najpomembnejših fermentiranih

živil, ki nastanejo s pomočjo mlečnokislinskih bakterij. Raziskave so pokazale, da MKB

skozi proces kisanja prispevajo k ohranjanju hrane in mikrobiološki zaščiti. Med drugim so

sposobne tudi proizvesti pomembne presnovne proizvode, kot so ocetna kislina, etanol,

komponente arom, bakteriocine, eksopolisaharide in razne encime, ki izboljšajo teksturo in

okus hrane. [14]

Mikroorganizmi kefirnih zrn so vgrajeni v vlaknasti matrici zrn, sestavljeni iz koaguliranega

kazeina, polisaharidov, maščob in liziranih celic. Suha snov kefirnega zrna predstavlja 10 %

celotne teže in ima naslednjo sestavo: (30 - 34) % proteinov, (3 - 4) % maščobe, (7 - 12) %

odpada in (45 - 60) % polisaharidov. [4]


9

2.2.2 Kefiran

S kislinsko hidrolizo polisaharidov, ki sestavljajo matrico zrn, nastanejo samo D-glukoze in

D-galaktoze v približno enakih količinah. Specifična optična rotacija je + (65 ± 4) °. Noben

drugi znani polisaharid nima takšnih lastnosti, omenjen novi polisaharid je bil imenovan kot

“kefiran”. [4]

Kefiran je sestavni del vlaknaste matrice zrn in je topen v vroči in netopen v hladni vodi. Ima

konstantno viskoznost skozi široko pH območje, z encimi ga ni mogoče hidrolizirati.

Omenjene lastnosti so bistvene za ohranjanje določene oblike kefirnih zrn skozi ponavljajoče

se fermentacije. [4]

Ima pomembno vlogo kot aditiv v proizvodnji živil in v proizvodnji embalažnih materialov,

zaradi njegovih znanih zdravilnih učinkov. Z rastjo kefirnih zrn se povečuje tudi količina

kefirana. [17]

2.2.3 Uporaba kefirnih zrn

Industrija kruha

Kefirna zrna predstavljajo pomembno alternativo v pripravi navadnega ali kislega testa za

peko kruha. Raziskave so pokazale pozitivni vpliv kefirnih zrn, mikrobiološko zaščito in

zagotovljeno kakovost pri kruhu, kjer so fermentacije potekale s kefirnimi zrni. [15]

Uporaba v proizvodnji sira

Izdelana je bila študija o oceni feta sira, proizvedenega s pomočjo liofiliziranih kefirnih zrn.

Z uporabo kefirja so se povečale koncentracije mlečne kisline v siru, zrna so pozitivno

vplivala na stopnjo ohranitve videza sira. [15]

Izkoriščanje odpadkov iz industrije agrumov s fermentacijo na podlagi kefirnih zrn

Izvedeni so bili poskusi fermentacije s kefirnimi zrni v ostankih odpadkov iz industrije

agrumov z aerobnimi procesi. Rezultati so pokazali, da so zrna uspešno, z visokimi prirastki

in pretvorbami, rastla v odpadkih iz citrusov. Novonastale kvasovke, sestavljene iz kefirjeve

biomase in pomarančnih trdnih snovi in kaše, so bile uspešno uporabljene pri proizvodnji

kruha, z izboljšano aromo in okusom v primerjavi s komercialnim kruhom. [15]

Tehnološki vidik

Mikroorganizmi kefirnih zrn so sposobni izkoristiti laktozo, prisotno v sirotki, ki predstavlja

velik odpadek mlečne industrije z visoko ekološko obremenitvijo. Izkoriščanje take vrste

odpadka z uporabo kefirnih zrn zmanjšuje onesnaževanje okolja in strošek za gojenje

kefirnih zrn, kar naredi uporabo kefirnih zrn kot starter kulturo še atraktivnejšo. Med drugim

je bila izvedena raziskava o proizvodnji kefirana s fermentacijo sirotke s kefirnimi zrni. Na

1 L sirotke so proizvedli 103 mg kefirana v 120 h pri T = 43 °C. [14, 15]


10

Pridobivanje etanola

Z imobiliziranimi celicami kvasovk iz kefirnih zrn na celulozo (brez lignina) lahko iz

glukoze pridobivamo etanol v temperaturnem območju od (5 - 30) °C. [14]

2.3 Fermentacija

Fermentacija se uporablja pri predelavi hrane že tisoče let in še vedno je ena izmed glavnih

tehnologij pri proizvodnji živil. Fermentirana živila so okusna in zdrava, pripravljena iz

nepredelanih surovin. Značilna so po prijetnem okusu, aromi, teksturi in predelovalnih

lastnostih. Za izvedbo fermentacije so pomembni kriteriji, kot sta nadzor in usmerjenost v

končni produkt. Pomembna sta pravilna izbira tako substrata kot mikroorganizma (starter

kultura), saj s tem dobimo želen proizvod z velikim donosom, zmanjša se tveganje za

neuspelo fermentacijo. Poleg pravilne izbire starter kulture je pomembna tudi njena pravilna

uporaba. [14]

Metode proizvodnje fermentiranih živilih so neznane in so dejansko nastale po naključju.

Nekatere od bolj znanih in očitnih fermentiranih izdelkov, sadja in zelenjave, so alkoholne

pijače – piva in vina. Vendar več fermentiranih sadnih in zelenjavnih produktov nastane s

fermentacijo mlečne kisline in so izredno pomembni pri doseganju prehranske potrebe velike

večine prebivalstva po celotnem svetu. [18]

2.3.1 Mikroorganizmi za fermentacije

Mikroorganizmi se prilagodijo na različna okolja, zaradi česar jih lahko uporabljamo za

poceni obnovljive vire, kot so odpadki in stranski produkti kmetijstva in petrokemijske

industrije, ki nastopajo v procesih kot primarni vir ogljika. [18]

Najpogostejše skupine mikroorganizmov, ki so vključeni v fermentacijo živil so [18, 19]:

bakterije,

kvasovke,

plesni in

glive.

V živilih je prisotnih več različnih družin bakterij, večina od njih je povezanih s

kvarljivostjo hrane. Prav zaradi tega je pomembna vloga bakterij pri fermentaciji živil

pogosto spregledana. Najpomembnejše bakterije, katerih prisotnost je zaželena pri

fermentaciji hrane, so laktobacili, ki imajo sposobnost, da proizvajajo mlečno kislino iz

ogljikovih hidratov. Na sliki 2-4 je prikazana vrsta bakterij iz družine laktobacili. Druge

pomembne bakterije so acetobakterije, ki proizvajajo ocetno kislino in so prisotne pri

fermentaciji zelenjave in sadja. [19]


11

Slika 2-4: Bakterija iz vrst laktobacilov (Lactobacillusdelbrueckii), ki se uporablja pri proizvodnji

jogurta. [20]

Kvasovke in kvasovkam podobne glive so zelo razširjene v naravi. Prisotne so v

sadovnjakih, vinogradih, zraku, zemlji in v prebavnem traktu živali. Tako kot bakterije in

plesni imajo koristne in nekoristne vplive na živila. Najkoristnejše kvasovke v smislu

fermentacije hrane so iz družin Saccharomyces, zlasti S. cerevisiae, ki je prikazana na sliki

2-5. Kvasovke so enocelični organizmi, ki se razmnožujejo nespolno z brstenjem. V

splošnem so kvasovke večje od večine bakterij. Igrajo pomembno vlogo v prehrambni

industriji, saj proizvajajo encime, ki podpirajo želene kemične reakcije, kot je vzhajanje

kruha, proizvodnja alkohola in invertnega sladkorja. [19]

Slika 2-5: Kvasovka Saccharamycescerevisiae. [21]


12

Podobno kot za kvasovke in bakterije, velja tudi za plesni, ki so tako uničevalci, kot

ohranjevalci živil. Nekatere izmed plesni proizvajajo nezaželene toksine in tako prispevajo k

kvarjenju živil. Vrste Aspergillus so pogosto odgovorne za nezaželene spremembe v hrani.

Najdemo jih v živilih, ki lahko prenašajo visoke koncentracije soli in sladkorja. Vendar

nekatere plesni dajejo značilne arome živilom, druge proizvajajo encime, kot so amilaze za

peko kruha. Plesni iz rodu Penicillium, na sliki 2-6, so povezane z zorenjem in okusom sira.

Plesni so aerobni mikroorganizmi, kar pomeni da za rast potrebujejo kisik. Imajo največ vrst

encimov, lahko se naselijo in rastejo na večini vrst hrane. Pri fermentaciji sadja in zelenjave

nimajo nobene pomembne vloge. [19]

Slika 2-6: Plesen iz rodu Penicillium, camembertii, uporablja se pri proizvodnji sira camembert in

brie. [22]

Mikroorganizmi med rastjo in presnovo proizvajajo stranske produkte. Pri fermentaciji živil

imajo omenjeni stranski produkti pomembno vlogo pri ohranjanju in spreminjanju teksture

ter okusa substrata. Na primer, ocetna kislina je stranski produkt fermentacije izbranega

sadja. Ta kislina ne vpliva samo na okus končnega produkta, ampak deluje tudi kot

konzervans. Pri fermentaciji živil so mikroorganizmi pogosto klasificirani po stranskih

produktih, ki jih proizvajajo. Pri fermentaciji mleka v jogurt so prisotne mlečnokislinske

bakterije (MKB, vrste Lactobacillus). To je splošno ime za vse bakterije, ki med rastjo

proizvajajo mlečno kislino. Kisla živila so manj občutljiva kot nevtralna in bazična, torej jim

kislina pomaga pri ohranitvi proizvoda. S fermentacijo lahko pride do spremembe v strukturi

snovi, kot je na primer mleko, kjer kislina povzroči obarjanje mlečnega proteina do trdne

skute. [19]

2.3.2 Mlečnokislinske bakterije

So raznovrstna skupina mikroorganizmov, njene prednosti izkoriščamo že stoletja. Najdemo

jih v fermentiranih živilih, kot tudi v prebavnem traktu ljudi in živali. [23]


13

Mlečnokislinske bakterije so Gram pozitivne, v obliki kokov ali palčk, ki proizvajajo mlečno

kislino kot glavni končni produkt fermentacije ogljikovih hidratov. Med mlečnokislinske

bakterije prištevamo predstavnike rodov: Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus,

Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus in

Weissela. [23]

Najpomembnejše lastnosti [23]:

mlečnokislinske bakterije so sestavni del mleka,

proizvajajo produkte, kot so mlečna in ocetna kislina, aromatične snovi, ogljikov dioksid

in polisaharide,

so sposobne rasti v različnih temperaturnih območjih,

določeni sevi bakterij izražajo probiotične aktivnosti, ki pozitivno prispevajo k zdravju,

so sestavni del avtohtone mikroflore človeškega in živalskega prebavnega trakta, kjer

preprečujejo razmnoževanje patogenih bakterij in uravnavajo mikrofloro črevesja,

industrijsko so zaradi sposobnosti fermentacije in zdravju ugodnih prehranskih učinkov

pomembni organizmi.

Mlečnokislinska fermentacija

Med proizvodnjo fermentiranih mlečnih živil je glavni proces pretvorba laktoze v mlečno

kislino in druge snovi, kot so organske kisline, ogljikov dioksid, vodikov peroksid, diacetil,

acetaldehid in aminokisline. Najpogosteje se uporabljajo mikroorganizmi iz rodov

Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus, Pediococcus, Streptococcus in Carnobacterium.

Mlečna kislina, ki nastaja med fermentacijo, znižuje pH vrednost proizvoda in posledično

podaljšuje obstojnost izdelkov. [23]

V preteklosti so mlečnokislinske fermentacije potekale kot spontan proces, pozneje so

ugotovili, da lahko s spreminjanjem pogojev fermentacije in pravilnim izborom

mikroorganizmov, proces nadzirajo do končnega fermentiranega izdelka standardnih

lastnosti in visoke kakovosti. Na tak način danes kot starter kulture uporabljajo izbrane

mlečnokislinske bakterije v skrbno nadzorovanih in kontroliranih procesih proizvodnje

fermentiranih živil. [23]

2.4 Rast mikroorganizmov

Raznolikost fermentacijskih procesov lahko pripišemo različnim faktorjem, kot so razmerje

med površino in volumnom, možnost porabe širokega spektra virov dušika in ogljika. Veliko

razmerje med površino in volumnom spodbuja večjo presnovo, kot je v primeru kvasovk

Saccharomycescerevisiae, ki sintetizira beljakovine v veliko večjih količinah v primerjavi z

rastlinami. [18]


14

2.4.1 Rastni cikel mikroorganizmov

Osnovna enačba, ki opisuje rast mikroorganizmov [18]:

b

a

t

m

(2.1)

kjer je:

m masa biomase

t čas

a in b sta faktorja.

Enačba (2.1) pomeni, da se biomasa spreminja s časom in da je razmerje Δm/Δt sorazmerno

vrednosti izbranega faktorja (a), kot je rast substrata ali temperatura, in obratno sorazmerno

vrednosti faktorja (b), kot je na primer inhibitor. Faktorja (a) in (b) sta neodvisna od časa,

faktor sorazmernosti lahko v bistvu zanemarimo. V začetni fazi katerekoli fermentacije je

prirast biomase neomejena, rast nato sledi avtokatalitični reakciji prvega reda

(avtokatalitična rast), do točke, kjer na obeh straneh enačba postane negativna in pride do

avtokatalitske smrti (avtokatalitičnost je mehanizem povratne zanke, kroženje snovi). [18]

Pri fermentaciji, ki poteka v šaržnem reaktorju, opazimo tipično krivuljo rasti

mikroorganizmov, oziroma rastni cikel mikroorganizmov. V samem ciklu ločimo različne

faze rasti, ki so prikazane na sliki 2-7 [18]:

I. Lag faza oziroma prilagajanje

II. Faza pospešene rasti celic

III. Eksponentna rast celic

IV. Faza zaviranja rasti celic

V. Stacionarna faza celic

VI. Pospešena faza umiranja celic

VII. Eksponentna faza umiranja celic

VIII. Faza preživetja/smrti


15

Slika 2-7: Faze rasti mikroorganizmov (rimske številke) pri šaržni fermentaciji. [18]

Lag faza

V lag fazi oziroma fazi prilagajanja se organizem privaja na novo okolje. Omenjena faza v

industrijskem vidiku ni zaželena, zaradi visokih stroškov, ki jih predstavlja. Med lag fazo in

eksponentno fazo je faza pospešene rasti celic. [18]

Eksponentna rast celic

V fazi eksponentne rasti celic vsaka celica zraste, v ugodnih pogojih se razdeli v dve

posamezni celici, katere nato spet zrastejo in se delijo, cikel rasti in deljenja celic se nato

nadaljuje. Organizem oziroma celica ne more vzdrževati ravnotežja za dalj časa, zato se

specifična hitrost rasti celic začne zmanjševati, dokler celica ne doseže stacionarne faze. Do

padca hitrosti rasti lahko pride zaradi različnih faktorjev, kot so omejena zaloga hranil,

kopičenje inhibitorjev in/ali faktor izrivanja, kjer se z naraščanjem populacije organizmov

zmanjšuje specifična hitrost rasti. [18]

Stacionarna faza in celična smrt

Ko se eksponentna rast približa koncu, vstopi organizem v stacionarno fazo, tej sledi smrt

celic. Mikroorganizmi se različno odzivajo na omejenost zaloge hranil v stacionarni fazi.

Medtem ko del populacije v omenjeni fazi odmre, jih precej, kljub stradanju, ostane pri

življenju. Zmožnost preživetja, kljub stradanju, je prednost, saj je veliko mikroorganizmov v

naravi večkrat podvrženih pomanjkanju hranil. [18]


16

3 Metode in materiali

3.1 Laboratorijske metode

Za izvedbo eksperimentalnega dela smo uporabili naslednje laboratorijske metode:

aktivacijo kefirnih zrn,

fermentacijo,

merjenje pH vrednosti.

3.1.1 Aktivacija kefirnih zrn

Za izvedbo eksperimentalnega dela je potrebno kefirna zrna najprej aktivirati. Z aktivacijo

poskrbimo, da je delovanje zrn v mediju s substratom optimalno. Aktivacijo smo izvajali pet

dni pred samim začetkom eksperimenta. Kefirna zrna, shranjena v mleku, smo s plastičnim

cedilom odcedili in sprali z mrzlo vodo. Na tak način smo s površine zrn sprali vse

novonastale produkte. S papirnatimi brisačami smo jih osušili in zatehtali 20 g. Posušena in

stehtana zrna smo prenesli v čašo, čez nje smo nalili 500 mL sladke sirotke ter pokrili z

urnim steklom, da smo preprečili onesnaževanje iz zunanjega okolja, obenem dostop kisika

ni bil oviran. Po 24 h vzdrževanja zrn pri sobni temperaturi smo zrna ponovno odcedili in jih

sprali z mrzlo vodo. Ker so med časom zadrževanja v sirotki zrna rasla, smo jih ponovno

posušili s papirnato brisačo in zatehtali 20 g. Prenesli smo jih v čašo, prelili s 500 mL sladke

sirotke in pokrili z urnim steklom. Postopek smo ponavljali 5 d, peti dan smo začeli z

eksperimentalnim delom. Na sliki 3-1 je prikazana omenjena aktivacija zrn v sirotki. Z

aktivacijo smo začeli v sredo, v ponedeljek so bila zrna pripravljena za fermentacijo.


17

Slika 3-1: Aktivacija kefirnih zrn v sirotki.

Za optimalno aktivacijo so pomembni konstantni pogoji (enak volumen substrata, masa

kefirnih zrn, temperatura) skozi celoten čas aktivacije. Pomembno je, da zrna vedno osušimo

enako, tako je količina natehtanih zrn vsakokrat enaka, saj vlaga vpliva na težo zrn. Na sliki

3-2 je viden postopek sušenja kefirnih zrn na papirnati brisači.

Slika 3-2: Sušenje zrn pred tehtanjem.


18

3.1.2 Fermentacija

Fermentacijo, oziroma eksperimentalni del, smo razdelili na dva dela. V prvem delu smo

zasledovali prirast kefirnih zrn in spremembo pH vrednosti pri različnih temperaturah in

enaki vrtilni frekvenci mešala, v drugem delu smo spreminjali temperaturo in vrtilno

frekvenco mešala.

Za izvedbo fermentacije smo si pripravili steklen trivratni reaktor v katerega smo nalili

500 mL sladke sirotke, kot je prikazano na sliki 3-3. Sirotki smo predhodno izmerili začetno

pH vrednost. Reaktor smo postavili v vodno kopel, kot je na sliki 3-4, s katero smo dosegli

konstantno želeno temperaturo. Zrna, ki smo jih najprej aktivirali s pet dnevno aktivacijo,

smo odcedili, sprali z mrzlo vodo in osušili s papirnatimi brisačami. 20 g osušenih zrn smo

prenesli v reaktor s sirotko. Reaktor smo opremili z mehanskim mešalom. Fermentacije so

potekale v različnih časovnih intervalih, od 15 min do 24 h. Po izteku izbranega časovnega

intervala smo iz reaktorja kefirna zrna odcedili, sprali z mrzlo vodo, osušili in stehtali.

Sirotki iz reaktorja smo določili končni pH oziroma pH vrednost po fermentaciji.

Slika 3-3: Trivratni reaktor s sirotko in kefirnimi zrni pred izvedbo fermentacije.


19

Slika 3-4: Fermentacija sirotke v trivratnem termostatiranem mešalnem reaktorju.

3.1.3 Merjenje pH vrednosti

Pred vsakim merjenjem pH vrednosti smo pH meter uravnali. Najprej smo sprali elektrodo z

destilirano vodo, jo potopili v pufer s pH 4, ponovno sprali in potopili v pufer spH 7.

Elektrodo smo nato sprali z destilirano vodo in jo potopili v čašo s sirotko in magnetnim

mešalom. Meritve pH sirotke smo ponavljali pred in po fermentaciji, kot je prikazano na

sliki 3-5.


20

Slika 3-5: Merjenje pH vrednosti sirotke. a – elektroda, b – sirotka, c – magnetno mešalo, d – pH

meter.

3.1.4 Kinetični model

Za določitev parametrov hitrosti proizvodnje produkta, maksimalno masno koncentracijo

produkta in čas trajanja lag faze smo uporabili obstoječ Gompertz-ov kinetični model. Izbran

model je bil predhodno preverjen na fermentaciji mleka s kefirnimi zrni.

1)(

)1exp(expexp

max

maxmax tt

m

rmm L (3.1)

kjer so:

Δm prirast kefirnih zrn [g]

Δmmax maksimalna dosežena prirast kefirnih zrn [g]

rmax maksimalna dosežena proizvodnost [g/h]

tL trajanje lag faze [h]

t čas [h]

Prileganje eksperimentalnih podatkov Gompertz-ovemu modelu smo izvajali z

matematičnim programom Matlab, z orodjem za prileganje krivulj (funkcija programa).

Zaradi dobrega prileganja ni bilo potrebno definirati dodatnih pogojev in začetnih točk.


21

3.2 Materiali

Laboratorijska oprema:

digitalna tehtnica,

termostat,

mehansko mešalo,

papirnate brisače,

plastična žlica,

PVC cedilo,

urno steklo,

čaše različnih velikosti,

magnetno mešalo,

trivratni reaktor,

pH meter.

Uporabljene kemikalije:

kefirna zrna iz mlekarne Krepko, Logatec,

sladka sirotka iz Ljubljanskih mlekarn d.d., obrat Maribor,

mleko iz Ljubljanskih mlekarn d.d., obrat Maribor,

deionizirana voda,

pufri s pH 4 in pH 7.

3.3 Računalniški program

Za parametrično analizo smo uporabili že razvit Gompertz-ov model, katerega smo vpisali v

računalniški matematični program Matlab. Matlab je programsko orodje, namenjeno

računanju v znanosti in tehniki. Leta 1970 ga je napisal matematik Cleve Moler kot

programski jezik za pisanje programov, ki vsebujejo veliko matričnih izračunov. Program je

namenjen numeričnemu računanju, drugače povedano, računanje izvaja tako, kot jih izvaja

človek s pisalom na papir. Druga skupina programskih jezikov, kot sta Mathematica ali

Maple (sestavni del Matlaba), je namenjena simboličnemu računanju. [24]

Matlab je sodoben programski jezik, ki se intenzivno razvija. Njegova največja prednost je

preko 1000 funkcij, ki so vgrajene v osnovno verzijo programa. [24]

Matlab je zaradi enostavne uporabe postal orodje, ki se na široko uporablja tako v industriji

kot na univerzah. Ima nekaj značilnih prednosti pred ostalimi numeričnimi knjižicami [25]:

omogoča hitro in enostavno pisanje programov,

na razpolago so kakovostna orodja za vizualizacijo,

deluje na več operacijskih sistemih,

v Maplovem jedru, kot sestavnim delom Matlaba, lahko računamo simbolično,


22

na voljo so posebni programski sklopi za posamezna področja – za procesiranje signalov,

slik, simbolično računanje, statistiko, itd.,

na spletu lahko najdemo mnogo programov za Matlab, ki so brezplačni in jih prispevajo

uporabniki programa,

večina raziskovalcev na področju numerične linearne algebre dovoljuje vgrajevanje

najnovejših algoritmov, tako da so v Matlabu vedno prisotne novosti na tem področju.

3.4 Uporaba sirotke

Sirotka spada med glavne odpadne stranske produkte v mlečni industriji in nastaja v

ogromnih količinah. Njena nadaljnja uporaba oziroma predelava postaja zaradi večje

okoljske osveščenosti in strožjih zakonov o čiščenju odpadkov zelo pomembna. Posamezne

glavne komponente sirotke, kot so proteini, laktoza in permeat, dobimo z ultrafiltracijo ali

reverzno osmozo. Z deproteinizacijo dobimo koncentrat sirotkinega proteina, ki gre v

prodajo. Preostali permeat koncentriramo, da dobimo približno 60 % suhe snovi, sledi

kristalizacija laktoze. Očiščena laktoza je primerna za prodajo, končni permeat predstavlja

odpadek. Ostanka (permeata) ni mogoče posušiti zaradi visoke vsebnosti raznih soli, njegovo

čiščenje je drago, zaradi visoke kemijske potrebe po kisiku (KPK), saj zaostrena zakonodaja

povečuje stroške za odstranjevanje. Potreben je razvoj novih metod in nadaljnje raziskave za

proizvodnjo novih izdelkov iz omenjenega permeata ali za realizacijo odstranjevanja z

dodatnimi ugodnostmi, kot je proizvodnja bioplina, obnovljivega vira energije. [11]

Možnosti za nadaljnjo predelavo sirotke je veliko [11]:

proizvodnja etanola iz sirotke,

demineralizacija, kot nadaljnja biološka obdelava permeata,

obarjanje kalcijevega fosfata, s čimer dosežemo lažjo razgradljivost sirotke,

obarjanje fosfatov in sulfatov v permeatu,

ionska izmenjava, s katero bi lahko odstranili do 95 % mineralov iz sirotke,

odstranitev soli in baz z elektrodializo,

nanofiltracija.

Alternativne uporabe sirotke [11]:

alkoholno vrenje z žiti ali melaso,

proizvodnja amonijevega laktata,

proizvodnja enoceličnega proteina (angl. SCP),

proizvodnja pekovskega kvasa,

proizvodnja bioplina,

napitki iz sirotke.


23

V literaturi je omenjena široka paleta načinov fermentacije z uporabo laktoze kot glavne

surovine ali kot dodatka. Produkti, pridobljeni iz fermentacij z laktozo [11]:

proteolitični encimi,

β-galaktozidaza,

antibotiki,

organske kisline,

kruh iz sirotke, obogatene z propionatom (fermentacija s Propionibacterium sp.),

vitamini,

amino kisline,

2,3-butanediol, osnovni material v kemijski industriji,

želirna sredstva,

starter kultura,

vino, po demineralizaciji,

dodatek pekovskim izdelkom.

V naši raziskovalni nalogi smo raziskovali možnosti uporabe sirotke za proizvodnjo starter

kulture, kefirnih zrn.


24

4 Eksperimentalni del

Eksperimentalni del je v osnovi potekal v dveh delih: najprej je bila potrebna aktivacija

kefirnih zrn, nato je sledila izvedba serije eksperimentov v laboratoriju.

Eksperimente smo izvajali v dveh delih:

v prvem delu smo pri enaki vrtilni frekvenci mešala spreminjali temperaturo fermentacije.

v drugem delu smo hkrati spreminjali temperaturo in vrtilno frekvenco mešala.

Pri vseh izvedenih serijah eksperimentov smo zasledovali vrednosti pH in prirast kefirnih

zrn.

4.1 Optimiranje procesnih parametrov

Za optimalne rezultate je pomembno vzdrževanje konstantnih procesnih parametrov. V

našem primeru so to bili izbrana temperatura, vrtilna frekvenca mešala, volumen substrata

(sirotke) in masa kefirnih zrn. Kefirna zrna, uporabljena v eksperimentih, so izhajala iz ene

šarže, med izvedbami eksperimentov jih nismo nadomeščali z drugimi.

4.1.1 Načrt izvajanja eksperimentov

Vsak posamezni eksperiment zahteva 5-dnevno aktivacijo, sledi fermentacija, kar pomeni da

za izvedbo enega eksperimenta porabimo najmanj pet in največ, v našem primeru, šest dni.

Zato je pred začetkom eksperimentalnega dela pomembno izdelati načrt izvajanja

eksperimentov. Najprej smo izbrali temperature, pri katerih smo želeli določiti prirast

kefirnih zrn, vrtilne frekvence mešala in časovne intervale. Za lažjo in hitrejšo izvedbo smo

izvedli serijo eksperimentov z različnimi časi trajanja fermentacijpri prvi temperaturi, sledile

so serije eksperimentov pri drugi in tretji temperaturi. Število eksperimentov, ki so se

izvajali posamezni dan oziroma teden, je bilo odvisno od velikosti časovnega intervala

posamezne fermentacije. Od posameznih fermentaciji so bili odvisni poteki in začetki

aktivacije kefirnih zrn.

4.1.2 Postopek izvedbe eksperimentov

Najprej smo izvedli serijo eksperimentov pri temperaturi 24 °C in vrtilni frekvenci mešala

100 min-1

. Serijo smo izvedli tako, da so bile fermentacije različno dolge, vse od 15 min pa

do 24 h. Pred vsako fermentacijo je potrebna 5-dnevna aktivacija kefirnih zrn, da se zrna

navadijo na novo okolje, sirotko. Aktivacija kefirnih zrn in fermentacija sta podrobneje

opisani v podpoglavjih 3.1.1 in 3.1.2.


25

Sledile so serije eksperimentov pri T = 28 °C in vrtilni frekvenci mešala 100 min-1

. Na

podlagi zbranih rezultatov iz prve serije smo lahko pri drugi in tretji seriji zmanjšali število

izvedb eksperimentov.

Serijo eksperimentov smo ponovili še pri T = 32 °C in 100 min-1

, sledil je drugi

eksperimentalni del. V drugem eksperimentalnem delu smo ponovili eksperimente pri vseh

treh izbranih temperaturah in različnih vrtilnih frekvencah mešala (150 in 200) min-1

, v

enakem časovnem intervalu, 24 h.

4.1.3 Grafična analiza vpliva procesnih parametrov na prirast kefirnih zrn

Za grafično analizo smo opazovali vpliv različnih procesnih parametrov. Opazovali smo

spremembe pH vrednosti in prirasti kefirnih zrn v odvisnosti od različnih temperatur, vrtilnih

frekvenc mešala in časa fermentacije. Z zasledovanjem prirasti kefirnih zrn pri različnih

temperaturah v različnih časovnih intervalih smo lahko nato z grafično analizo izdelali rastno

krivuljo.

4.2 Modeliranje rastne krivulje

Za modeliranje rastne krivulje smo zasledovali rast kefirnih zrn v različnih časovnih

intervalih, vse od 15 min pa do največ 24 h pri različnih temperaturah.

4.2.1 Računski postopek

Eksperimente smo ponovili pri treh različnih temperaturah (24, 28 in 32) °C. Z enačbama 4.1

in 4.2 smo dobili vrednosti, ki so zapisane v tabeli spodaj.

Sprememba mase kefirnih zrn po fermentaciji:

zk mmm (4.1)

kjer so:

Δm sprememba mase kefirnih zrn [g]

mk masa kefirnih zrn po koncu fermentacije [g]

mz masa kefirnih zrn na začetku fermentacije, [g]


26

Sprememba pH vrednosti sirotke po fermentaciji

kz pHpHpH (4.2)

kjer so:

ΔpH sprememba pH vrednosti sirotke po končani fermentaciji

pHz pH vrednost sirotke pred začetkom fermentacije

pHk pH vrednosti sirotke po koncu fermentacije

V tabelah 4-1, 4-2 in 4-3 so prikazane izmerjene vrednosti parametrov in izračunane prirasti

kefirnih zrn ter spremembe pH vrednosti pri različnih temperaturah.

Tabela 4-1: Procesni parametri fermentacije sirotke pri T = 24 °C.

Št. meritve t [h] pHz pHk ΔpH Δm [g]

1 0,25 4,302 4,270 0,032 -2,46

2 0,5 4,318 4,209 0,109 -2,25

3 0,75 4,324 4,198 0,126 -1,71

4 1 4,216 4,124 0,092 -1,24

5 3 4,420 4,014 0,406 -0,68

6 4 4,397 3,908 0,489 0,49

7 5 4,179 3,787 0,392 0,63

8 7 4,302 3,752 0,55 1,48

9 8 4,249 3,767 0,482 1,83

10 11 4,250 3,667 0,583 3,05

11 18 4,282 3,528 0,754 3,73

12 24 4,444 3,574 0,870 3,82


27

Tabela 4-2: Procesni parametri fermentacije sirotke pri T = 28 °C.


1 0,5 4,167 4,137 0,030 -2,46

2 1 4,169 4,007 0,162 -0,99

3 2 4,167 3,931 0,236 -0,53

4 3 4,454 3,919 0,535 -0,09

5 4 4,199 3,762 0,437 0,78

6 5 4,362 3,769 0,593 1,51

7 18 4,290 3,419 0,871 4,68

8 24 4,159 3,382 0,777 4,75

Tabela 4-3:Procesni parametri fermentacije sirotke pri T = 32 °C.


1 4 4,110 3,562 0,548 -0,91

2 5 4,391 3,538 0,853 -0,30

3 6 4,068 3,509 0,559 1,37

4 19 4,256 3,288 0,968 3,25

5 24 4,093 3,328 0,765 4,23


28

4.2.2 Grafična analiza rastne krivulje kefirnih zrn

Za grafični prikaz rasti smo uporabili mase kefirnih zrn po končani fermentaciji v odvisnosti

od časa, kar prikazuje slika 4-1.

Slika 4-1: Določene mase kefirnih zrn pri različnih temperaturah v odvisnosti od časa.

Iz slike 4-1 je razvidno da dobljene vrednosti pri T = 32 °C ne sledijo trendu, ki je opažen pri

nižjih temperaturah (24 in 28) °C, saj končna masa kefirnih zrn, dosežena po 24 h ni večja

od tiste, dosežene pri T = 28 °C, preseže le tisto pri T = 24 °C.

V literaturi smo zasledili, da se po več zaporednih inkubacijah oziroma fermentacijah

kefirnih zrn v sirotki pri višjih temperaturah (30 °C in več) lahko spremeni kemijska sestava

samih zrn, poruši se ravnotežje v mikroflori, njihova rast se zaradi zmanjšanja aktivnosti

upočasni. Meritve pri T = 32 °C potrjujejo dejstva omenjenih raziskav. [3]

Glede na obliko krivulje na sliki 4-1 smo za parametrično analizo izbrali že razvit

Gompertz-ov model, ki ga predstavlja enačba 3.1.

Izbran model omogoča določitev hitrosti proizvodnje produkta, maksimalno masno

koncentracijo produkta in čas trajanja lag faze. Omenjene parametre smo določali z

matematičnim programom Matlab pri izbranih temperaturah.

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

mk [g]

t [min]

24 °C

28 °C

32 °C


29

4.3 Vpliv vrtilne frekvence mešala na rast kefirnih zrn

Opazovali smo spreminjanje mase kefirnih zrn in spremembe pH vrednosti v enakih

časovnih intervalih pri treh različnih vrtilnih frekvencah mešala in treh različnih

temperaturah. Zbrane meritve so prikazane v tabeli 4-4.

Tabela 4-4: Procesni parametri fermentacije sirotke pri različnih vrtilnih frekvencah mešala na prirast

kefirnih zrn.

T[°C] t [h] f [min-1

] pHz pHk mk

24 24 100 4,444 3,574 23,82

24 24 150 4,060 3,280 22,53

24 24 200 4,031 3,253 24,32

28 24 100 4,159 3,382 24,75

28 24 150 4,041 3,221 22,09

28 24 200 4,039 3,228 23,89

32 24 100 4,093 3,328 24,23

32 24 150 4,702 3,147 23,59

32 24 200 4,306 3,195 24,02


30

5 Rezultati in diskusija

5.1 Rastna krivulja

Izmerjene mase kefirnih zrn v odvisnosti od časa fermentacije smo grafično prikazali na sliki

5-1, kjer je z neprekinjenima krivuljama prikazano prileganje modelnih krivulj

eksperimentalnim vrednostim pri T = 24 °C in T = 28 °C ter s prekinjeno krivuljo prileganje

pri T = 32 °C.

Slika 5-1: Rastna krivulja kefirnih zrn pri T = 24 °C, T = 28 °C in T = 32 °C.

Iz slike 5-1 je razvidno, da je trend rasti kefirnih zrn pri T = 32 °C drugačen in odstopa od

tistih, dobljenih pri T = 24 °C in T = 28 °C, kar pripisujemo višji temperaturi fermentacije.

Študije (povzeto po [3]) so pokazale, da zrna, ki nastanejo po treh mesecih shranjevanja v

mleku (vsak dan zamenjanim s svežim) pri sobni temperaturi ali pri T = 4 °C po sestavi niso

enaka svežim zrnom pred shranjevanjem. Dobljeni rezultati potrjujejo dejstva pridobljena iz

omenjenih raziskav.

Potek dela je bil zasnovan tako, da smo s fermentacijami začeli pri najnižji temperaturi, torej

pri T = 24 °C, s svežimi kefirnimi zrni. Ker za primerjavo rezultatov in ponovljivost

potrebujemo popolnoma enaka zrna, oziroma enako sestavo zrn, smo skozi celoten potek

dela uporabljali isto šaržo kefirnih zrn. Laboratorijsko delo je potekalo od spomladi pa do

konca poletja, kar pomeni, da so na sama zrna vplivale tudi zunanje temperature, ki so se

neprestano višale, kot so se višale tudi temperature fermentacij (od T = 24 °C, nato T = 28 °C

in na koncu T = 32 °C). Kljub zagotovljenim konstantnim pogojem v laboratoriju

18

19

20

21

22

23

24

25

26

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

mk [g]

t [min]

24 °C

28 °C

32 °C


31

(uravnavanje temperature s klimo), je temperatura vseeno vplivala na zrna, ki so na koncu,

ko so potekale fermentacije pri T = 32 °C nekoliko spremenile svoj zunanji videz in

strukturo. Ker takšne raziskave zahtevajo delo tudi čez vikend (aktivacija kefirnih zrn), ko

laboratorij ni dostopen, se je občasno menjalo tudi okolje (namesto laboratorija domače

okolje). Menjava okolja predstavlja spremembo temperature (predvsem v poletnih mesecih)

kljub hitremu odzivu in skrbi, da so pogoji ves čas enaki, kar vpliva tudi na sestavo in

strukturo sirotke ter posledično kefirnih zrn. Tako lahko zaključimo, da so temperature nad

T = 30 °C neprimerne za rast kefirnih zrn v sirotki, saj se njihova rast in delovanje na tej

točki zmanjšujeta

5.2 Vpliv temperature na rast kefirnih zrn

V poglavju 5.1 smo pojasnili, da, rasti kefirnih zrn pri višjih temperaturah, zaradi

spremembe njihove kemijske sestave in izgube ravnotežja mikroflore, ne moremo primerjati

z rastjo zrn pri nižjih temperaturah. Za lažji prikaz vpliva temperature na rast zrn sta na sliki

5-2 prikazani samo rastni krivulji pri T = 24 °C in T = 28 °C.

Slika 5-2: Rastna krivulja pri izbranih temperaturah (24 °C in 28 °C).

Opravljene raziskave so pokazale, da pri višjih temperaturah fermentacija poteka hitreje in

tudi zrna bolj rastejo. Običajno kefirna zrna gojimo v mleku pri sobni temperaturi, ki znaša

po navadi med T = 20 °C in T = 25 °C. To so tudi temperature, ki so največkrat omenjene v

raziskavah. Za fermentacijo kefirnih zrn smo uporabili sirotko, ki predstavlja manj raziskano

področje, zato smo vzeli večji razpon temperatur, saj nas je zanimal trend obnašanja zrn pri

najbolj optimalnih temperaturah (glede na fermentacije v mleku) in v višjih temperaturah.

Glede na dobljene rezultate, vidimo da se tudi v primeru sirotke rast kefirnih zrn z višanjem

temperature povečuje, vendar pa ima zgornjo mejo, ko zrna zaradi visoke temperature

spremenijo svojo kemijsko sestavo, zunanji videz in strukturo. Do T = 28 °C se rast kefirnih

zrn s temperaturo povečuje, pri temperaturi T = 32 °C in več se rast upočasni, sklepamo da

se pri dovolj visoki temperaturi popolnoma ustavi.

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

mk [g]

t [min]

24 °C

28 °C


32

5.3 Parametri rasti kefirnih zrn

Z uporabo Gompertz-ovega modela in matematičnega programa Matlab smo določili tri

pomembne kinetične parametre, maksimalno doseženo maso zrn, oziroma prirast,

maksimalno doseženo proizvodnost in čas trajanja lag faze za tri različne temperature, kot je

razvidno iz tabele 5-1. Parametre smo določili s prileganjem krivulje našim

eksperimentalnim podatkom. Krivulje prirasti kefirnih zrn (v g) v odvisnosti od časa (h) so

prikazane na slikah 5-3, 5-4, in 5-5, vsaka krivulja za posamezno temperaturo, T = 24 °C,

T = 28 °C in T = 32 °C.

Tabela 5-1: Kinetični parametri fermentacije sirotke s kefirnimi zrni - Gompertz-ov model

T [°C] f [min-1

] Δmmax[g] rmax[g/h] tL[h]

24 100 3,867 0,4364 3,563

28 100 4,723 0,7865 3,085

32 100 5,156 0,1977 0,4549

Slika 5-3: Rastna krivulja dobljena z Gompertz-ovim modelom pri T = 24 °C.


33

Slika 5-4: Rastna krivulja dobljena z Gompertz-ovim modelom pri T = 28 °C.

Na slikah 5-3 in 5-4 sta razvidni rastni krivulji z vsemi fazami rasti, ki potekajo pri rasti

mikroorganizmov: a) lag faza oziroma faza prilagajanja, b) pospešena faza rasti,

c) eksponentna faza rasti, d) zaviralna faza rasti in e) stacionarna faza rasti, po določenem

času bi sledila še faza odmiranja. Iz dobljenih krivulj vidimo, da je pri T = 28 °C prej

dosežena točka maksimalne prirasti kefirnih zrn, stacionarna faza je nastopila po nekje 13 h

fermentacije, med tem ko je stacionarna faza pri T = 24 °C nastopila po približno 11 h. Če bi

za eksperimente uporabili še nižjo temperaturo (na primer 20 °C) bi se, glede na dobljene

rezultate, lahko zgodilo, da po 24 h ne bi dosegli maksimalne prirasti samih zrn, saj se z

nižanjem temperature rast upočasni. Z zniževanjem temperature (še nižje kot 20 °C) bi

dosegli točko popolne ustavitve rasti zrn, saj zrna pri dovolj nizkih temperaturah mirujejo,

do aktivacije ne pride.

Slika 5-5: Rastna krivulja dobljena z Gompertz-ovim modelom pri T =32 °C.

Na sliki 5-5 je prikazana rastna krivulja kefirnih zrn pri T = 32 °C. Na sliki ni razvidna

običajna oblika rastne krivulje bakterij, faz rasti ne moremo določiti. Običajno obliko

krivulje smo poskusili dobiti z uporabo pogojev in začetnih točk v programu Matlab, vendar


34

je kljub temu trend krivulje ostal enak. Razloga za to sta lahko dva, prvi je premajhna

količina podatkov, vendar smo pri modelu za T = 28 °C, kjer dobljena krivulja popolnoma

ustreza vzorcu, imeli le en podatek več. Drugi razlog je dejanska sprememba v rasti,

obnašanju in strukturi kefirnih zrn pri tako visoki temperaturi, zaradi česar je tudi manj

podatkov, saj je bilo delo s takimi zrni veliko težje (zaradi izgube kompaktnosti jih je bilo

težje osušiti na brisači in stehtati pri enakih pogojih. kot pri ostalih eksperimentih). Ta

krivulja potrjuje dejstvo, da se pri višjih temperaturah spremeni kemijska sestava kefirnih

zrn, zaradi česar se podre ravnotežje v mikroflori in posledično se zmanjša njihova rast.

5.3.1 Vpliv temperature na doseženo maksimalno maso kefirnih zrn

Prvi parameter rasti, ki smo ga določili z Gompertz-ovim modelom, je maksimalna dosežena

masa kefirnih zrn v odvisnosti od temperature. Izračunane vrednosti maksimalnih mas

kefirnih zrn v odvisnosti od temperature so prikazane na sliki 5-6.

Slika 5-6: Maksimalna dosežena masa v odvisnosti od temperature.

Iz grafa je razvidno, da se maksimalna masa, ki jo lahko dosežemo pri določeni fermentaciji

z višanjem temperature zvišuje, kar smo dokazali že z grafično analizo rasti kefirnih zrn.

Krivulja rasti oziroma Gompertz-ov model zasnovan tako, da se prilega običajni krivulji rasti

bakterij, zato v tem primeru rezultati kažejo, da je najvišja rast kefirnih zrn pri najvišji

temperaturi (T =32 °C), čeprav smo že dokazali, da se pri tako visokih temperaturah rast

upočasni. Temu je tako, ker krivulja sledi splošni S-obliki (kot je zasnovan tudi

Gompertz-ov model) in kot je razvidno iz slike 5-6, ta še ni dosegla faze upočasnjene rasti,

še vedno je usmerjena navzgor, kar pomeni, da je parameter maksimalne rasti tu najvišji. Je

pa razvidno iz grafične analize rasti (rastna krivulja, slika 5-1), da pri T =32 °C ne dosežemo

najvišje prirasti kefirnih zrn, krivulja nima splošne oblike rastne krivulje, česar model ne

upošteva.

23

23,5

24

24,5

25

25,5

22 24 26 28 30 32 34

mmax [g]

T [°C]


35

5.3.2 Vpliv temperature na proizvodnost

Maksimalna proizvodnost, ki jo lahko dosežemo s fermentacijo je drugi parameter, ki smo

ga dobili z že zasnovanim Gompertz-ovim modelom. Maksimalna proizvodnost je

proizvodnost, ki jo lahko dosežemo pri optimalnih pogojih in predstavlja prirast kefirnih zrn

v izbrani časovni enoti. Na sliki 5-7 je prikazano spreminjanje izračunanih proizvodnosti v

odvisnosti od temperature.

Slika 5-7: Maksimalna proizvodnost v odvisnosti od temperature.

Maksimalna proizvodnost narašča z naraščanjem temperature, na neki točki doseže optimum

oziroma maksimum, nato se začne zmanjševati. Rezultati, ki smo jih dobili z

Gompertz-ovim modelom se skladajo z opravljenimi meritvami. Parameter se v tem primeru

ne nanaša na celotno obliko krivulje, kot se v primeru določanja maksimalne dosežene mase,

temveč temelji na prirasti v posamezni izbrani časovni enoti (v našem primeru je to 1 h) v

pospešeni fazi rasti. Največjo proizvodnost smo dosegli pri T = 28 °C, maksimalna

proizvodnost je za skoraj enkrat večja od tiste pri T = 24 °C. Na podlagi tega parametra

lahko zaključimo, da je optimalna temperatura, za rast kefirnih zrn v sirotki T =28 °C.

5.3.3 Vpliv temperature na lag fazo

V času trajanja lag faze je rast bakterij ničelna, ker se bakterije navajajo in privajajo na novo

okolje oziroma kulturo, ki je v njem. Dobljene začetne vrednosti mase kefirnih zrn,

prikazane v tabelah 4-1, 4-2 in 4-3, so negativne oziroma manjše od začetne mase kefinih

zrn. Čas, v katerem smo zasledili negativno prirast, smo označili za lag fazo (fazo

prilagajanja). Zaradi neznane točne sestave kefirnih zrn in premalo opravljenih raziskav na

tem področju (večina raziskav, opravljenih na to temo izvaja fermentacije po 24 h in več) je

težko pojasniti, čemu so začetne vrednosti mase kefirnih zrn negativne, zagotovo pa je to

način prilagajanja zrn na novo okolje.

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

22 24 26 28 30 32 34

rmax [g/h]

T [°C]


36

Prilagajanje na glukozo kot edini vir ogljika, je relativno enostaven, v primerih prilagajanja

na drugačne vire ogljikov, kot je laktoza, se pojavi zahteva po iniciaciji ali proizvodnji

določenega seta encimov, ki so potrebni za katalizo transporta in hidrolizo substrata.

Neodvisno od mehanizmov potrebnih za prilagajanje, je končni rezultat stacionarne faze

celica, ki je sposobna presnavljati kemikalije v biomaso. Lahko sklepamo, da so vrednosti v

lag fazi med drugim negativne zaradi omenjenega mehanizma prilagajanja, saj je sirotka vir

laktoze. Na sliki 5-8 je prikazana odvisnost dobljenih trajanj lag faz z omenjenimi izbranimi

temperaturami. [17]

Slika 5-8: Čas trajanja lag faze v odvisnosti od temperature.

Rezultati kažejo, da se z zniževanjem temperature čas trajanja lag faze krajša, kar je bilo

pričakovano, glede na to, da se prirast s temperaturo povečuje. Pri T =32 °C je trajanje lag

faze občutno krajše, točka na grafu nekoliko izstopa v primerjavi z ostali dvema. Parameter

trajanja lag faze se določi glede na rastno krivuljo, ki jo pridobimo z Gompertz-ovim

modelom, za katero smo že omenili, da v primeru T =32 °C nima prave S – oblike, zato

lahko sklepamo, da ta parameter, enako kot prvi (maksimalna dosežena masa), ne kaže

realnega stanja. Na osnovi pridobljenih meritev (tabela 4-3) vidimo, da je lag faza trajala

nekje med (2 - 3) h, kjer je preskok iz negativne prirasti v pozitivno, računsko določeno

trajanje lag faze pa je 0,4549 h. Razlike med omenjenima vrednostima kažejo na neskladnost

rezultatov, dobljenih pri T =32 °C na podlagi rastne krivulje, z meritvami in realnim stanjem.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

22 24 26 28 30 32 34

tL [h]

T [°C]


37

5.4 Vpliv temperature na pH vrednost

Na sliki 5-9 so prikazane pH vrednosti sirotke pred začetkom fermentacije in po končani

fermentaciji. Najbolj nas je zanimala razlika med začetno in končno vrednostjo, oziroma

sprememba pH, saj začetna pH vrednost sirotke nikoli ni bila enaka, saj je sirotki pH

vrednost nekoliko padala iz dneva v dan.

Slika 5-9: pH vrednost ob začetku in koncu fermentacij pri T = 24 °C, T = 28 °C in T = 32 °C.

Zgornje krivulje na sliki 5-9 predstavljajo pH vrednost na začetku fermentacij, spodnje

krivulje pa pH vrednost sirotke po končanih fermentacijah. Največ fermentacij smo naredili

v prvi seriji pri T =24 °C, saj nas je zanimalo kako se kefirna zrna obnašajo v sirotki,

najmanj ponovitev je pri T =32 °C, kjer so bila zrna zaradi njihove spremenjene strukture že

drugačna. Za lažjo primerjavo rezultatov so v tabeli 5-2 zbrani rezultati spremembe pH

vrednosti tistih fermentacij, katere smo glede na trajanje fermentacije opravili pri vseh treh

temperaturah.

3,2

3,4

3,6

3,8

4

4,2

4,4

4,6

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

pH

t [min]

24 °C

24 °C

28 °C

28 °C

32 °C

32 °C


38

Tabela 5-2: Spremembe pH vrednosti v določenih časovnih intervalih pri temperaturah fermentacij

T = 24 °C, T =28 °C in T =32 °C.

24 °C 28 °C 32 °C

t [h] Δ pH

4 0,489 0,437 0,548

5 0,392 0,593 0,853

24 0,870 0,777 0,765

Iz slike 5-9 in tabele 5-2 je razvidno, da med fermentacijo pH vrednost pada, kar je posledica

pretvorbe laktoze v mlečno kislino, zato je padec pH vrednosti po 24 h največji. Glede na

zbrane rezultate v tabeli 5-2 lahko vidimo, da se spremembe v pH vrednostih z višanjem

temperature povečujejo, od tega odstopajo le spremembe pH po 24 h, kjer je največja

sprememba pri T =24 °C, najmanjša pa pri T = 32 °C, vendar razlike niso velike. Najvišjo

pH vrednost je imela sveža sirotka, po 1 tednu (časovni interval po katerem smo staro sirotko

zamenjali s svežo) je pH vrednost padla. Sklepamo, da so razlike v spremembah pH

vrednosti med posameznimi fermentacijami odvisne od starosti in sestave sirotke, saj kljub

konstantnemu dobavitelju sirotke, težko dobimo sirotko popolnoma enake sestave prejšnji.

Torej pH vrednosti niso odvisne od temperature, temveč le od časa trajanja fermentacije, saj

s časom pH vrednost pada.

5.5 Vpliv vrtilne frekvence mešala

V tabeli 5-3 so zbrane eksperimentalno določene prirasti kefirnih zrn pri različnih

temperaturah in različnih vrtilnih frekvencah mešala.

Tabela 5-3: Izmerjene končne mase kefirnih zrn pri različnih temperaturah in različnih vrtilnih

frekvencah mešala.

Δm[g]

f [min-1

] 24 °C 28 °C 32 °C

100 3,82 4,75 4,23

150 2,53 2,09 3,59

200 4,32 3,89 4,02

Iz tabele 5-3 je razvidno, da je pri frekvenci 150 min-1

prirast najmanjša pri vseh izbranih

temperaturah, nato se pri 200 min-1

spet poveča. Pomembno je dejstvo, da smo poskuse pri

100 min-1

izvedli v začetku aprila (T = 24 °C), začetku junija (T = 28 °C) in začetku julija

(T = 32 °C), poskuse pri 150 in 200 min-1

pa v začetku septembra (za vse tri temperature), ko

je na zrna že nekoliko vplivala višja temperatura (T = 32 °C) in čas gojenja zrn.

Ob zasledovanju prirasti kefirnih zrn smo zasledovali tudi spremembe pH vrednosti sirotke

po končani fermentaciji. Podatki so zbrani v tabeli 5-4.


39

Tabela 5-4: Spremembe pH vrednosti pri različnih vrtilnih frekvencah mešala pri T =24 °C,

T = 28 °C in T =32 °C.

Δ pH

f [min-1

] 24 °C 28 °C 32 °C

100 0,870 0,777 0,765

150 0,780 0,820 1,555

200 0,7878 0,811 1,111

Iz dobljenih rezultatov je razvidno da vrtilna frekvenca mešala na spremembe pH vrednosti

pri T =24 °C in T =28 °C ni imela velikega vpliva, pri T =32 °C je bila pri 150 min-1

zabeležena največja sprememba pH, nekoliko manjša pri 200 min-1

. Lahko sklepamo, da je

za tako spremembo kriva tudi višja temperatura, ki vpliva med drugim na kemijsko sestavo

kefirnih zrn in posledično kompaktnost zrn. Občutek je bil da se zrna oziroma komponente

zrn razgrajujejo, matrica je izgubila kompaktnost. Pri višji vrtilni frekvenci mešala je

mogoče, da so zrna, zaradi hitrosti mešanja bila bolj izpostavljena spremembam, in so

določene komponente, ki so se izločile iz zrn zaradi razpadanja matrice vplivale na celotno

pH vrednost sirotke.

5.5.1 Primerjava vpliva vrtilne frekvence mešala v sirotki in mleku

Na sliki 5-10 so prikazane krivulje masne koncentracije prirasta kefirnih zrn po 24 h v mleku

(T =25 °C, podatki povzeti po [9]) in sirotki (T =24 °C, T =28 °C in T =32 °C).

Slika 5-10: Masna koncentracija prirasti kefirnih zrn v odvisnosti od vrtilne frekvence mešala v

mleku in sirotki pri izbranih temperaturah. [9]

0

5

10

15

20

25

0 50 100 150 200

Δγz,r [%]

f [min-1]

Mleko, 25 °C

Sirotka 24 °C

Sirotka, 28 °C

Sirotka, 32 °C


40

Modra krivulja predstavlja prirast kefirnih zrn v mleku, ostale krivulje prirast zrn v sirotki.

Eksperimenti v sirotki in mleku sicer niso bili izvedeni pri enakih vrtilnih frekvencah

mešala, vendar je iz poteka krivulje razvidno, da je obnašanje zrn med (100 – 160) min-1

podobno v obeh primerih. Med (80 – 100) min-1

je prirast največja, nato se pri 150 min-1

oziroma 160 min-1

zmanjša. Pri višjih obratih je zmanjšanje prirasti zaradi razbitja zrn

(povzeto po [9]). Zvišanje prirasta pri 200 min-1

je bilo nepričakovano. Eksperimenti pri

200 min-1

so bili izvedeni zadnji, ko se je zunanji videz zrn močno spremenil. Iz začetnih

velikih zrn nepravilnih oblik, so na koncu prevladovala zrna v obliki manjših kroglic, močno

se je zmanjšala njihova kompaktnost. Možno je, da so zaradi manjših oblik in mehkejše

strukture zrn, trki bili blažji, bilo jih je manj ali pa so se zrna preprosto sprijela v večjo kepo,

zaradi česar vrtilna frekvenca mešala ni imela močnega vpliva na prirast. Za bolj primerljive

in ponovljive rezultate bi se morali takšni eksperimenti izvesti s svežimi zrni.

5.6 Relativna prirast zrn v sirotki in mleku

Primarna in najbolj razširjena kultura za gojenje kefirnih zrn še je vedno mleko. V tabeli 5-5

vidimo relativne prirasti zrn v odvisnosti od temperature v primeru mleka (povzeto po

[26][26]) in sirotke. Fermentacije v mleku so potekale 48 h, v sirotki 24 h.

Relativno prirast zrn v % smo dobili po enačbi [26]:

100zz,

zz,kz,

rz,

(5.1)

kjer so:

Δγz,r masna koncentracija prirasti kefirnih zrn [%]

γz,k končna masna koncentracija kefirnih zrn [g/L]

γz,k začetna masna koncentracija kefirnih zrn [g/L]

Tabela 5-5: Začetne in končne masne koncentracije ter masne koncentracije prirasti kefirnih zrn v

odvisnosti od temperature [26].

Sirotka Mleko

T [°C] γz,z[g/L] γz,k[g/L] Δγz,r [%] T [°C] γz,z[g/L] γz,k[g/L] Δγz,r

24 40,00 47,64 19,10 22 40,16 52,54 30,827

28 40,00 49,5 23,75 24 40,06 53,84 34,398

32 40,00 48,46 21,15 26 40,08 53,1 32,485

Začetne in končne mase kefirnih zrn smo izmerili po 24 h v 0,5 L sirotke. Za boljšo

primerjavo z rezultati izmerjenimi v eksperimentih opravljenih v mleku, smo mase pretvorili

na 1 L sirotke. Relativne prirasti zrn v mleku in sirotki v odvisnosti od temperature so

prikazane na sliki 5-11.


41

Slika 5-11: Relativna prirast v odvisnosti od temperature za posamezno kulturo. [26]

Iz slike 5-11 sledi, da je relativna prirast kefirnih zrn višja v mleku, zrna dosežejo optimum

pri nižji temperaturi, kot pri sirotki. V obeh primerih je viden trend zmanjšanja aktivacije

kefirnih zrn, saj se pri najvišji temperaturi, uporabljeni v posameznem eksperimentu, prirast

zmanjša. Najvišja prirast zrn v sirotki je manjša, kot najnižja prirast zrn v mleku.

5.7 Gompertz-ova enačba

Za končni zapis Gompertz-ove enačbe z dobljenimi parametri, smo izbrali primer, pri

katerem sta bili maksimalna dosežena masa in proizvodnost najvišji, to je bilo pri

temperaturi T = 28 °C. Za izračun parametrov smo opravili serije meritev mas kefirnih zrn v

različnih časovnih intervalih, pri enaki temperaturi in enaki vrtilni frekvenci mešala. Z

uporabo programa Matlab in modela Gompertz-ove enačbe smo v omenjenem primeru dobili

sledeče vrednosti parametrov:

Δmmax (maksimalna dosežena prirast kefirnih zrn) – 4,723 g

rmax(dosežena maksimalna proizvodnost) – 0,7865 g/h

tl (trajanje lag faze) – 3,085 h

V enačbo 4.3 smo vstavili dobljene parametre. Enačba 5.2 predstavlja Gompertz-ovo enačbo

z vstavljenimi parametri za kefirna zrna v sirotki pri T = 28 °C.

1)085,3(

723,4

)1exp(7865,0expexp723,4 tm (5.2)

15

20

25

30

35

40

20 22 24 26 28 30 32 34

Δγz,r [%]

T [°C]

Sirotka

Mleko


42

kjer je:

Δm prirast kefirnih zrn v določenem času t [g]

t čas trajanja fermentacije [h]

Za t = 4 h, dobimo z enačbo (5.2) Δm = 0,7835 g, med tem ko je eksperimentalno izmerjena

vrednost Δm = 0,78 g.

Najboljša ujemanja eksperimentalno določenih in izračunanih vrednosti Δm dobimo pri

T = 28 °C, manjše in zanemarljivo odstopanje je opazno pri T = 24 °C. Pri T = 32 °C je

odstopanje med izmerjenimi in izračunanimi rezultati majhno, vendar je zaradi neujemanja

rastne krivulje pri takšni temperaturi model težko potrditi.

5.8 Kefirna zrna skozi proces eksperimentov

Za vse izvedene postopke fermentacije smo uporabljali izbrano prvotno kulturo (oziroma

njene subkulture) kefirnih zrn. Ker so bila zrna podvržena spremembam temperature

(spreminjanje temperature fermentacij, spreminjanje temperature okolice, temperature

sirotke pri aktivacijah) so zrna od začetka do konca nekoliko spremenila svojo obliko in

sprijemljivost oziroma gostoto. Po fermentacijah z višjo temperaturo so bila zrna manj

definirana, sprijeta ter manj elastična, kot po fermentacijah pri nižji temperaturi. Spremembe

v videzu zrn so vidne na sliki 5-12.

Slika 5-12: Kefirna zrna po 1 mesecu, slabih 3 mesecih in 6 mesecih uporabe.

Na sliki 5-12 je opazno, da so zrna nekoliko spremenila zunanji videz. Na začetku so bila

večja, v obliki cvetačnih cvetov, na koncu pa so zrna predstavljale v večini le še posamične

majhne kroglice, kot je razvidno na sliki 5-13. Zrna so bila elastična, lahko jih je bilo ločiti

med sabo, po izvedbi vseh eksperimentov, predvsem po tistih pri T = 32 °C so bila težje

definirana, sestavljena iz manjših kroglic, ki so se hitro sprijele in jih je bilo težko ločiti,

izgubile so elastičnost.


43

Slika 5-13: Kefirna zrna po polovici izvedenih eksperimentov. Med zrni že prevladujejo manjše

kroglice.


44

6 Zaključek

Ker sirotka v mlečni industriji nastaja v ogromnih količinah kot stranski produkt proizvodnje

sira in predelave mleka, je logično, da se je na temo uporabe in predelave sirotke izvedlo že

veliko raziskav in predstavilo veliko novih metod. Uporaba sirotke v fermentaciji za gojenje

starter kulture je nova, nekoliko manj raziskana tema, vsaj ne v obliki, predstavljeni v tej

raziskovalni nalogi. Glavni cilj naše naloge je bil, da ugotovimo primernost sirotke za

gojenje starter kulture. Želeli smo doseči ponovljive rezultate in na podlagi tega določiti

kinetični model rasti kefirnih zrn.

Rezultati so pokazali, da je optimalna temperatura za rast kefirnih zrn v sirotki T = 28 °C, pri

T = 32 °C so zrna spremenila svoj zunanji videz, izgubila so sprijemljivost in gostoto ter

elastičnost, obenem se je rast zmanjšala. Enako kot v mleku, velja tudi za sirotko, da z

naraščanjem temperature zrna hitreje rastejo, vendar imajo zgornjo temperaturno mejo.

Ugotovili smo, da je zgornja meja nekje med T = 28 °C, kjer so bili rezultati najboljši, in

T = 32 °C, kjer se je aktivnost zrn zmanjšala. Za spodnjo temperaturno mejo bi bilo potrebno

izvesti še dodatne eksperimente pri nižjih temperaturah kot je T = 24 °C, vendar je zgornja

temperaturna meja pomembnejša, saj visoka temperatura vpliva na mikrofloro, sestavo,

videz in gostoto zrn, pri nižjih temperaturah se po dobljenih rezultatih že opravljenih študij

zmanjša samo aktivnost zrn, zrna se kemijsko in fizično ne spremenijo. Zato se zrna med

neuporabo shranjujejo pri temperaturi okoli T = 4 °C (temperatura hladilnika), kjer mirujejo.

Ker smo dosegli ponovljivost rezultatov, smo s pomočjo računalniškega programa Matlab in

Gompertz-ovega modela izdelali kinetični model rasti kefirnih zrn v sirotki. Rastni krivulji

sta se pri T = 24 °C in T = 28 °C odlično prilegali S-obliki splošne krivulje rasti

mikroorganizmov, pri T = 32 °C nismo dosegli omenjene sigmuidne oblike krivulje. Z

izdelavo rastne krivulje smo določili parametre rasti (maksimalno prirast, ki jo zrna lahko

dosežejo, čas trajanja lag faze in proizvodnost v g/h), ki so se v primerih T = 24 °C in

T = 28 °C odlično skladali z opravljenimi meritvami, pri T = 32 °C so zaradi nepravilne

oblike rastne krivulje pričakovano odstopali, saj se parametri (razen proizvodnosti) računajo

glede na krivuljo.

Zanimal nas je tudi vpliv vrtilne frekvence mešala na spremembe pH vrednosti sirotke in

prirast zrn pri različnih temperaturah. Glede na opravljene raziskave vpliva vrtilne frekvence

mešala v mleku smo pričakovali podoben trend v sirotki. Rezultati so pri (100 in 150) min-1

sledili pričakovanim, da se prirast se hitrostjo nad 100 min-1

zmanjšuje. Pri 200 min-1

smo

dobili nepričakovane rezultate, prirast se je pri vseh treh temperaturah povečala. Opazili smo

tudi spremembe med končnimi in začetnimi pH vrednostmi sirotke pri (150 in 200) min-1

pri

fermentacijah pri T = 32 °C. Omenjeni eksperimenti so bili (razen tisti pri 100 min-1

)

izvedeni kot zadnji, po serijah izvedenih fermentacij od T = 24 °C do T = 32 °C. Čas gojenja

iste šarže kefirnih zrn, konstantne spremembe temperatur, predvsem visoke temperature so

vplivali na zrna in njihovo delovanje. Zaključimo lahko, da je take eksperimente potrebno

ponoviti s svežo šaržo, za zagotovitev realnih in pravilnih rezultatov.

S primerjavo rezultatov ugotovimo, da je mleko učinkovitejša izbira za gojenje kefirnih zrn,

glede na prirast zrn in optimalno temperaturo. Razlike v prirasti so majhne, okoli 10 % in


45

optimalna temperatura pri sirotki je samo 4 °C nad optimalno temperaturo v mleku, kar ne

predstavlja višjih stroškov za vzdrževanje konstantne temperature pri fermentaciji v

primerjavi s stroški pri fermentaciji z mlekom. Sirotka je med drugim cenovno ugoden

medij, saj je stranski produkt mlečne industrije pri proizvodnji sira in spada med odpadke.

Mleko je po drugi strani medij, ki je glavni vir proizvodov mlečne industrije in je njegova

uporaba že precej razširjena. Z nadaljnjo uporabo sirotke kot substrata za gojenje starter

kulture po odstranitvi iz proizvodnje sira se posledično zmanjša onesnaževanje okolja, tudi

stroški namenjeni obdelavi sirotke pred izpustom se zmanjšajo. Za uporabo sirotke kot

substrata v fermentaciji je ni potrebno dodatno obdelati (razne ultrafiltracije, kristalizacije,

sušenja in podobni dragi procesi niso potrebni), zato so stroški uporabe majhni. Zaključimo

lahko, da je sirotka primeren in učinkovit medij za gojenje starter kulture, v našem primeru

kefirnih zrn, s fermentacijo.

Po končani fermentaciji dobimo ostanek, kefirju podoben napitek na osnovi sirotke, za

katerega je že več raziskav dokazalo, da je primeren za proizvodnjo različnih, tudi

alkoholnih, pijač. Dokazano je, da je da ima sirotka po končani fermentaciji s kefirnimi zrni

dobre organoleptične lastnosti (videz, okus, barva, vonj, gostota) in je primerna osnova za

proizvodnjo novih napitkov. [6]


46

7 Literatura

[1] Bogataj J. Mleko, dediščina – hrana – simbol. Ljubljana: Založba Rokus d.o.o., 1999.

[2] Slanovec T. Sirarstvo. Ljubljana: Kmečki glas, 1982.

[3] Londero A., Hamet M. F., De Antoni G. L., Garrote G. L., Abraham A. G. Kefir grains

as a starter for whey fermentation at different temperatures: chemical and

microbiological characterisation. Journal of Dairy Research, 79, 262-271, 2012.

[4] Boekhout T., Robert V. Yeasts in food: Beneficial and detrimental aspects. Abington:

Woodhead Publishing Limiter, 2003.

[5] Teixeira Magalhães K., Pereira M. A., Ncolau A., Dragone G., Domingues L., Teixeira

J. A., de Almeida Silva J. B., Freitas Schwan R. Production of fermented cheese whey-

based beverage using kefir grains as starter culture: Evaluation of morphological and

microbial variations. Bioresource Technology 101, 8843-8850, 2010.

[6] Teixeira Magalhães K., Dias D. R., de Melo Pereira G. V., Oliveira J. M., Domingues

L., Teixeira J. A., de Almeida e Silva J. B., Freitas Schwan R. Chemical composition

and sensory analysis of cheese whey-based beverage susing kefir grains as starter

culture. International Journal of Food Science &Technology 46, 871-878, 2011.

[7] Londero A., Quinta R., Abraham A. G., Sereno R., De Antoni G., Garrote G. L.

Inhibitory Activity of Cheese Whey Fermented with Kefir Grains. Journal of Food

Protection, 74 (1), 94-100, 2011.

[8] Teixeira Magalhães K., Dragone G., de Melo Pereira G. V., Oliveira J. M., Domingues

L., Teixeira J. A., Almeida e Silva J. B., Schwan R. F. Comparative study of the

biochemical changes and volatile compound formations during the production of novel

whey-based kefir beverages and traditional milk kefir. Food Chemistry 126, 249-253,

2011

[9] Zajšek K. Optimiranje bioprocesnih parametrov proizvodnje etanola in kefirana z

mikrobioto kefirnih zrn, doktorska disertacija. Maribor: Univerza v Mariboru,

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2012.

[10] Leban J. Načini predelave sirotke kot reševanje okoljevarstvenih problemov v

mlekarstvu, diplomsko delo. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta,

Oddelek za zootehniko, 2006.

[11] Oreopoulou V., Russ W. Utilizationof By-Products and Treatment of Waste in the

Food Industry. New York: Springer Science + Business Media, LLC, 2007.

[12] Čanžek Majhenič A., Osojnik Črnivec I. G., Marinšek Logar R., Rogelj I. Ravnanje z

odpadki in uporaba stranskih proizvodov v mlekarstvu. Stranski proizvodi in odpadki v

živilstvu – uporabnost in ekologija, 25. Bitenčevi živilski dnevi. Ljubljana, 2008.

[13] https://sl.wikipedia.org/wiki/Bakteriocin (dostop dne 16.8.2016)

[14] Plessas S., Alexopoulos A., Voidarou C., Stavropoulou E., Bezirtzoglou E.

Microbialecology and quality assurance in food fermentation systems. The case of

kefir grain application. Anaerobe 17, 483-485, 2011.

[15] Farnworth E. F. Kefir – a complex probiotic. Food Science and Technology Bulletin:

Functional Foods 2 (1), 1-17, 2005.

[16] http://blogs.scientificamerican.com/oscillator/multicellularity (dostop dne 15.8.2016)

[17] Guzel-Seydim Z., Kok-Tas T., Ertekin-Filiz B., Seydim A. C. Effect of dirrefent

growth conditions on biomass increase in kefir grains. American Dairy Science

Association, 94, 1239-1242, 2011.

https://sl.wikipedia.org/wiki/Bakteriocin

http://blogs.scientificamerican.com/oscillator/multicellularity


47

[18] El-Mansi E. M. T., Bryce C. F. A., Allman A. R. Fermentation Microbiology and

Biotechnology, Second Edition. Boca Raton: CRC Press, 2007.

[19] Battcock M., Azam-Ali S. Fermented Fruits and Vegetables: A Global Perspective,

134 izdaja. Rim: Food and Agriculture Organization, 1998.

[20] http://michaelvertolli.blogspot.si/2013_01_01_archive.html (dostop dne 15.8.2016)

[21] http://www.scaconference.co.za/?attachment_id=133 (dostop dne 15.8.2016)

[22] http://www.gettyimages.com/license/128621740 (dostop dne 15.8.2016)

[23] Vehar N. Fermentacija koncentrirane sirotke z izbranimi laktobacili, osamljenimi iz

črevesne sluznice prašičev, diplomsko delo. Ljubljana: Univerza v Lljubljani,

Biotehniška fakulteta, Oddelek živilstvo, 2010.

[24] Petrišič J. Uvod v MATLAB: za inženirje. Ljubljana: Fakulteta za strojništvo, 2011.

[25] Jurčič-Zlobec B., Berkopec A. Matlab z uvodom v numerične metode. Ljubljana:

Fakulteta za strojništvo, 2005.

[26] Borinc N. Učinki pogojev gojenja naravne starter kulture v mleku na vsebnost

nastalega ogljikovega dioksida, diplomsko delo. Maribor: Univerza v Mariboru,

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2013.

http://michaelvertolli.blogspot.si/2013_01_01_archive.html

http://www.scaconference.co.za/?attachment_id=133

http://www.gettyimages.com/license/128621740


48

8 Življenjepis

Europass življenjepis

Osebni podatki

Priimek / Ime Koroša Monika

Naslov Križevci 50 A, 9242 Križevci pri Ljutomeru

Telefon 040 535 657

Telefaks /

E-pošta [email protected]

Državljanstvo slovensko

Datum rojstva 23.08.1990

Spol ženski

Zaželena zaposlitev /

zaželeno poklicno področje

Kemijski tehnik

Delovne izkušnje

Obdobje 01/10/2012 – 26/10/2012

Zaposlitev ali delovno mesto

Industrijski projekt

Naziv in naslov delodajalca

Krka d.d., Novo mesto, Obrat Ljutomer Ulica Rada Pušenjaka 10, 9240 Ljutomer (Slovenija)

Obdobje 18/07/2016 – 26/08/2016

Zaposlitev ali delovno mesto

Industrijski projekt, praksa

Naziv in naslov delodajalca

A&E Europe, sukanci d.o.o. Meljska cesta 74, 2000 Maribor


49

Izobraževanje in usposabljanje

Obdobje 01/09/2005 – 24/06/2009

Naziv izobrazbe in / ali nacionalne

poklicne kvalifikacije

Gimnazijski maturant

Naziv ali status ustanove, ki je

podelila diplomo, spričevalo ali certifikat

Gimnazija Franca Miklošiča Ljutomer Prešernova 34, 9240 Ljutomer (Slovenija)

Stopnja izobrazbe po EOK (Evropsko

ogrodje kvalifikacij)

Raven 4 EOK

Obdobje 01/10/2009 – 30/09/2013



Diplomirana inženirka kemijske tehnologije (UN)



Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerza v Mariboru Smetanova ulica 17, 2000 Maribor (Slovenija)



Raven 6 (EOK)

Obdobje 01/10/2013 – 30/09/2016



Magistrica inženirka kemijske tehnike



Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerza v Mariboru Smetanova ulica 17, 2000 Maribor (Slovenija)



Raven 7 (EOK)

Materni jezik(i) slovenščina

Drug(i) jezik(i) angleščina

Samovrednotenje Razumevanje Govorjenje Pisanje

Evropska raven (*) Slušno razumevanje Bralno razumevanje

Govorno sporazumevanje

Govorno sporočanje

Angleščina B2

Samostojni uporabnik

B2 Samostojni uporabnik




(*) Skupni evropski referenčni okvir za jezike

http://europass.cedefop.europa.eu/LanguageSelfAssessmentGrid/sl


50

Organizacijska znanja in

kompetence

- sposobnost dobre organizacije lastnega dela - natančnost - delo v ekipi

Računalniška znanja in

kompetence

- poznavanje programa Microsoft Office (Word in Excel) - uporaba spleta

Documents

FERMENTACIJA SIROTKE Z NARAVNO STARTER KULTURO · Fermentacija sirotke z naravno starter kulturo V Fermentacija sirotke z naravno starter kulturo Povzetek Sirotka je stranski produkt