タンパク質のX線結晶解析 (2)

Atsushi Shimada (嶋田睦)

Div. Struct. Biol., Med. Inst. Bioreg., Kyushu Univ. (九州大学生体防御医学研究所構造生物学分野)

生命医科学特論III (2019)

Topics in medical life sciences III (2019)July 23, 2019

Protein X-ray crystallography (2)

What we know from diffraction (回折から分かること)

Cell dimensions of the unit cellObtained from the positions of the diffraction spots

Information on the electron densities in the unit cell of the crystal lattice

Obtained by analyzing intensity distributions of the diffraction spots

We obtain the diffraction spots by irradiating a crystal by X-rays.

A cos(2πνt)

A cos(2πx/λ)

A cos[2π(νt - x/λ)]

Expression for waves (波の表現)

After 1/4 period in time

Position and time act in opposite senses on the wave.

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

3 cos(2π2t)

Time

Ampl

itude

0.5 1 1.5 2

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

2 4 6 8 2 4 6 8

Distance (x) Distance (x)

Ampl

itude

Ampl

itude

λ (wavelength)

3 cos(2πx/2)

オイラーの公式 (Euler’s formula):eiθ = cos θ + i sin θ

e: ネイピア数 (自然対数の底)

e = 2.7182818284…..

・ “eiθ”　is an expression for a wave. ・ Multiplying “eiθ” means the rotation in the complex plane.

Napier’s constant (the base of the natural logarithm)

Expression for waves (波の表現)

A cos(α+φ1) + B cos(α+φ2) = A cosα・cosφ1 – A sinα・sinφ1 + B cosα・cosφ2 – B sinα・sinφ2

同一波長を持ち、振幅や位相の異なるコサイン波の和は、やはり同一波長を持ち、振幅や位相が異なる コサイン波となる (上式および上図参照)。The addition of two cosine waves with the same wavelength and different amplitudes and phases result in a cosine wave with the same wavelength and different amplitudes and phases (see above).

= (A cosφ1 + B cosφ2)・cosα – (A sinφ1 + B sinφ2)・sinα

= C cosφ3・cosα – C sinφ3・sinα

= C cos(α+φ3) 　　　　　

A

BC

加法定理より (from the addition theorem)

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

A

B

C

Expression for waves (波の表現)

Aei(α+φ1) + Bei(α+φ2) = Aeiαeiφ1 + Beiαeiφ2

= (Aeiφ1 + Beiφ2) ・eiα

= Cei(α+φ3)　　　　　　

同一波長を持ち、振幅や位相の異なるコサイン波の和は、やはり同一波長を持ち、振幅や位相が異なる コサイン波となる (上式および上図参照)。The addition of two cosine waves with the same wavelength and different amplitudes and phases result in a cosine wave with the same wavelength and different amplitudes and phases (see above).

A

BC

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

A

B

C

Expression for waves (波の表現)

原点で散乱されたX線と原点からr離れた位置で散乱されたX線の行路差は、λk0・r - λk・r = λ (k0 - k)・r。したがってそれらのX線の位相差は、-2π(k0-k)・r = 2π(k-k0)・rとなる。Difference in path length between X-rays diffracted from an electron at the origin of the crystal and those diffracted from an electron at a position r relative to the origin of the crystal is λk0・r - λk・r = λ (k0 - k)・r. Thus, the phase difference between these X-rays is -2π(k0-k)・r = 2π(k-k0)・r.

Phase of diffraction from a single electron

λk0・r = λ|k0||r|cosθ = |r|cosθ

k0とkはそれぞれ、入射X線と散乱X線の波数ベクトル。 k0 and k are the wave vectors for the incident and scattered X-ray beams, respectively.

|k0| = 1/λ

原点で散乱されたX線と原点からr離れた位置で散乱されたX線の行路差は、λk0・r - λk・r = λ (k0 - k)・r。したがってそれらのX線の位相差は、-2π(k0-k)・r = 2π(k-k0)・rとなる。Difference in path length between X-rays diffracted from an electron at the origin of the crystal and those diffracted from an electron at a position r relative to the origin of the crystal is λk0・r - λk・r = λ (k0 - k)・r. Thus, the phase difference between these X-rays is -2π(k0-k)・r = 2π(k-k0)・r.

Phase of diffraction from a single electron

今、k - k0をs (散乱ベクトル) と定義する。すると、原点で散乱されたX線と原点からr離れた位置で散乱されたX線の位相差は、2πs・rとなる。 Now we define k - k0 as s. Then, the phase difference between X-rays diffracted from an electron at the origin of the crystal and those diffracted from an electron at a position r relative to the origin will be 2πs・r.

一つの電子からの構造因子 (Structure factor from a single electron)

多数の電子からの構造因子 (Structure factor from a number of electrons)

連続的な電子密度分布の構造因子(Structure factor from a continuous distribution of electrons)

Structure factor (構造因子)

exp(2πis・r) = e2πis・r

フーリエ変換 (Fourier transform)

フーリエ逆変換 (inverse Fourier transform)

F(s) = exp(2πis⋅r)

結晶の原点にある単位胞と、そこからta + ub + vc離れた位置 (t, u, vは整数, a, b, cは結晶格子の単位ベクトル) にある単位胞が位相を揃えて散乱するための条件は、 どのようなものだろうか?What is the condition for a unit cell at the origin of the crystal and another unit cell located in a position ta + ub + vc away from the origin scatter in phase?

Laue conditions (ラウエの条件)

単位胞の構造因子 (structure factor of a unit cell)

2c

3b

ラウエの条件 (Laue conditions)

F(s): 元の単位胞からta + ub + vc離れた位置にある単位胞の構造因子 Structure factor from the unit cell in a position ta + ub + vc　away from the origin.　　　

= ∫ρ (r) exp(2πis・r + 2πis・ta + 2πis・ub + 2πis・vc)dr

= ∫ρ (r) (exp(2πis・r) × exp(2πits・a) × exp(2πius・b) × exp(2πivs・c))dr

F(s) = ∫ρ (r) exp(2πis・r)dr

= ∫ρ (r) exp(2πis・(r + ta + ub + vc))dr

= exp(2πits・a) × exp(2πius・b) × exp(2πivs・c) × ∫ρ (r) exp(2πis・r)dr

s・a = h s・b = k s・c = l h, k, lは整数 (h, k, and l are integers)

unit cell

unit cell’

unit cell

= exp(2πits・a) × exp(2πius・b) × exp(2πivs・c) × F(s) unit cell

これらの乗数は、F(s) をそれぞれ2πts・a、2πus・b、2πvs・cだけ複素平面で回転する操作に対応。

These multipliers correspond to operations to rotate F(s) in the complex plane by 2πts・a, 2πus・b, and 2πvs・c radians.

unit cell

unit cell’

unit cell’

F(s)unit cell’

unit cell’

unit cell’

定数 (constant)

unit cell

Laue conditions (ラウエの条件)

s = ha* + kb* + lc*とすると、このような散乱ベクトルは、ラウエの条件を満たす。If s = ha* + kb* + lc*, then s satisfies Laue conditions.

s・a = (ha* + kb* + lc*)・a = ha*・a + kb*・a + lc*・a = h + 0 + 0 = h 証明 (proof):

同様に (similarly) s・b = k s・c = l

既に検討したように、このようなsはブラッグの法則も満たす。このことはラウエの条件とブラッグの条件が等価であることを示唆する。事実これらは等価である。As already examined, such s also satisfies Bragg condition, suggesting that Laue conditions and Bragg condition are equivalent. They are indeed equivalent.

ラウエの条件 (Laue conditions) s・a = h s・b = k s・c = lh, k, lは整数 (h, k, and l are integers)

r = xa + yb + zc

s・r = (ha* + kb* + lc*)・(xa + yb + zc) = hx + ky + lz = h・x

簡単になる (simplified)

Laue conditions (ラウエの条件)

F(h): 構造因子 (structure factor)ρ(x): 電子密度 (electron density)

(1) あるミラー指数“h”に対応する、単位胞の構造因子“F(h)”は、電子密度“ρ(x)”を上式にしたがって単位胞全体に渡りフーリエ変換することにより求められる。The structure factor F(h) of a unit cell for the Miller index h is obtained as the Fourier transform of ρ(x) over the unit cell.

(3) このことから、全てのミラー指数“h”に対応する構造因子“F(h)” を下式にしたがってフーリエ逆変換 (フーリエ合成) することにより、位置“x”の電子密度“ρ(x)”を求めることが出来る。Thus, we　obtain the electron density at the position x, ρ(x), by calculating the Fourier transform of the structure factor F(h) for all the Miller indices h according to the equation below.

(2) ここで、A(h)という関数がB(x)という関数のフーリエ変換であれば、B(x)という関数はA(h)という関数のフーリエ逆変換であるという関係が成り立つ。Here, if the function A(h) is the Fourier transform of B(x), B(x) is the inverse Fourier transform of A(h).

Fourier transforms (フーリエ変換)

h: ミラー指数 (Miller index)

構造因子 “F(h)” から下式にしたがって電子密度 “ρ(x)” を計算する際に、反射強度 “I” から構造因子の絶対値 “|F(h)|” は直接計算出来るが、位相 “φ(h)” は直接計算できない。したがって、何らかの方法で “φ(h)” を求める必要がある。When we calculate the electron density using the structure factor F(h), it is possible to directly obtain the amplitude |F(h)| from the intensity I. However, the phase of F(h), φ(h), cannot directly be obtained. Thus, we need to obtain φ(h) by some means.

F(h) = |F(h)|eiφ(h)

|F(h)|2 ∝ I

The phase problem (位相問題)

φ(h)

?

重原子同形置換法: multiple isomorphous replacement (MIR)

多波長異常分散法: multiwavelength anomalous dispersion (MAD)

single isomorphous replacement (SIR)

singlewavelength anomalous dispersion (SAD)

分子置換法: molecular replacement

直接法: direct method

類似構造の座標が利用できない新規構造の決定に使用される方法Methods used to determine novel structures with no available coordinates of homologous structures

類似構造の座標が利用できる時に使用される方法A method used to determine structures with available coordinates of homologous structures

低分子の構造決定に使用される方法

タンパク質中のメチオニン残基をセレノメチオニンに置換して行うSAD法が現在最も簡便で有効な方法である。The SAD method using proteins with methionine residues replaced by selenomethionine is currently the most convenient and effective method for this purpose.

Various methods for phase determination (様々な位相決定法)

A method used to determine structures of small molecules

Calculation of electron densities and model building

model building

explanation of functions

R = Σ |Fobs|

Σ ||Fobs| - |Fcalc||

R : R因子は、構造モデルから計算した構造因子の絶対値が、どれだけ反射強度から計算された構造因子の絶対値と一致しているかを評価する指標。この指標を下げるように構造モデルの座標を微調整する (構造精密化) ことで、より正確な構造モデルを得ることが出来る。より正確な構造モデルが構築出来ると、モデルから計算した位相が改良される。これにより、電

子密度も改良され、モデル構築をさらに進めることが出来るようになることが期待される。The R-factor is a measure of the agreement between the absolute values of the structure factors calculated from the crystallographic model and those experimentally obtained from the intensities of the X-ray diffraction data. It is possible to obtain more accurate model by fine-tuning the coordinates of the model (structure refinement). If we obtain a better model, the phases of the structure factors calculated from the model are improved, leading to the improvement of the electron density. This allows further model building.

R-factor

R = Σ |Fobs|

Σ ||Fobs| - |Fcalc||

Rfree : Rfree因子は、構造精密化計算から意図的に除かれた反射 (全体の約5-10%) について計算されたR-factorである。従来のR-factorよりも信頼できる、モデルと回折データの一致度を示す指標として使用されている。ランダムな位置に原子が置かれたモデルでは、この値は0.59程度になるが、構造精密化が進むと、0.3以下に低下し、良く精密化されたモデルでは0.2以下になることもある。The free R-factor (Rfree) is the R-factor calculated from reflections intentionally not used for structure refinement (~5-10% of the data). This value is used as a more reliable indicator of an agreement between the model and the reflection data than the conventional R-factor. This value is about 0.59 when computed using a model with atoms randomly distributed and becomes below 0.3 when structure refinement progresses. This value can be below 0.2 when computed using a very well refined model. 　　　　　　　　Brünger A. T. (1992) Nature, 472-475.

R-factor

非結晶学的対称性平均化：noncrystallographic symmetry averaging結晶格子中の非対称単位に同一分子が二分子以上存在している際に、これらの分子の電子密度が平均化されるように構造因子を操作することによって位相を改良する方法。In case there are more than two molecules in the asymmetric unit of the crystal, the phases can be improved by manipulating the structure factors so that the electron densities of these molecules are averaged.

溶媒平滑化：solvent flattening (Wang, Methods Enzymol., 1985) タンパク質結晶では、溶媒領域が約50%程度を占めることが多いが、電子密度から溶媒領域の平均電子密度を引いた後で、溶媒領域の電子密度が0になるように構造因子を操作することで、位相を改良する方法。Protein crystals typically contain solvents occupying around 50% of the volume of the crystals. The phases can be improved by manipulating the structure factors so that the electron densities of the solvent region becomes 0 after the subtraction of the average electron density of solvents from the electron density.

Density modification

ヒストグラムマッチング: histogram matching6.0 Åより良い分解能で溶媒領域を除くと、タンパク質結晶の電子密度の分布は、温度因子を固定すると、近似的に分解能のみに依存する。そのため、電子密度図における理論的な電子密度の分布に似るように構造因子を操作することで、位相を改良する方法。At resolutions of better than 6.0 Å and after exclusion of the solvent region, the frequency distribution of electron density values for protein density varies only with resolution when the overall temperature factor is artificially adjusted, to a good approximation. Thus, the phases can be improved by manipulating the structure factors so that the frequency distribution of electron density values for protein density matches well to the theoretical distribution (Cowtan and Zhang, Prog. Biophys. Mol. Biol., 1999).

X線結晶構造解析によるタンパク質などの高分子の構造決定に利用される主要プログラムPrograms used for the structure determination of macromolecules, such as proteins

Python-based Hierarchical Environment for Integrated Xtallography (Phenix): "Graphical tools for macromolecular crystallography in PHENIX” N. Echols, R.W. Grosse-Kunstleve, P.V. Afonine, G. Bunkóczi, V.B. Chen, J.J. Headd, A.J. McCoy, N.W. Moriarty, R.J. Read, D.C. Richardson, J.S. Richardson, T.C. Terwilliger, and P.D. Adams. J. Appl. Cryst. 45, 581-586 (2012).

Collaborative Computational Project No. 4 (CCP4): "Overview of the CCP4 suite and current developments” M. D. Winn et al. Acta. Cryst. D67 , 235-242 (2011)

Crystallography & NMR system (CNS): A.T. Brunger, P.D. Adams, G.M. Clore, P.Gros, R.W. Grosse-Kunstleve, J.-S. Jiang, J. Kuszewski, N. Nilges, N.S. Pannu, R.J. Read, L.M. Rice, T. Simonson, G.L. Warren,Crystallography & NMR System (CNS), A new software suite for macromolecular structure determination, Acta Cryst.D54, 905-921(1998).

Practice of X-ray crystallography

Phenix graphical user interface (GUI): ユーザーフレンドリーなGUIで、反射データ (回折データ) やサーチモデルから、分子置換法やMIR法、SIR法、MAD法、SAD法によるターゲット分子の結晶構造決定を半自動的に行うことができる。A user-friendly GUI, which can semiautomatically determine the crystal structure of the target macromolecules using molecular replacement, MIR, SIR, MAD, and SAD from the reflection data (diffraction data) and the search model.

Practice of X-ray crystallography　(Phenix)

AutoMR: 反射データとサーチモデルの座標から、分子置換法により、高分子の結晶構造を決定するプログラム。A program to determine crystal structures of macromolecules from the reflection data and the coordinates of the search model by molecular replacement.

Practice of X-ray crystallography　(Phenix)

AutoBuild: 反射データ、アミノ酸配列情報および初期位相から計算した電子密度図から、自動的にモデル構築と精密化を進めるプログラム。A program to automatically perform model building and refinement from the reflection data, amino acid sequence, and the electron density map calculated from the initial phases.

Practice of X-ray crystallography　(Phenix)

Coot: 高分子のモデル構築を行うためのプログラムA program for macromolecular model building

Practice of X-ray crystallography　(Coot)

双晶 (twinning): 二つの異なる結晶由来の回折点が重なり合っているものWhen reflections from more than one crystal overlap

低分解能結晶やモザイク性の高い結晶 (low resolution and/or high mosaicity crystals): データ処理や構造解析の際のパラメータの調整に経験を要する。Expertise is required to adjust parameters for data processing and structure determination.

分子置換法に用いるサーチモデルと目的の構造の一致度が低い場合 (in case the agreement between the search model used for molecular replacement and the target structure is low): サーチモデルの分子動力学計算による改良や分子置換に使用する領域の適切な選定などが必要。It is required to improve the search model by molecular dynamics simulation and/or the appropriate selection of the region of the macromolecule used as a search model for molecular replacement.

Practice of X-ray crystallography　(problems to make structure determination difficult)

Quiz (小テスト)

What is the key mathematical operation linking X-ray diffraction data and the electron density in X-ray crystallography? Hint: XXXXXXX transform.

X線結晶学において、X線回折データと電子密度をつなぐ鍵となる数学的操作を答えなさい。ヒント: XXXX変換。

1.

Send your answers to me (ashimada@bioreg.kyushu-u.ac.jp) via E-mail by today (July 23). In the E-mail, specify your full name and the student ID number.

今日中 (7月23日) に、私 (ashimada@bioreg.kyushu-u.ac.jp) 宛にE-mailで答えを送付してください。E-mailには、氏名と学籍番号を明記してください。

Announcement

Next lecture will be held on July 30 (７月30日).

http://www.sls.kyushu-u.ac.jp/lectures/materials/

Lecture slides can be found in the URL below.