光合成における光エネルギー変換と酸素発生の分子機作

Ｇ研 野口 巧

地球 「水と酸素の惑星」• 海：地表の７割• 大気：21%酸素• 生命

太陽光1.7 x106 GＷ

植物・藻類 光合成

6CO2 + 6H2O C6H12O6 + 6O2

光エネルギー

動物 呼吸人間 産業

太陽光 光合成高量子効率

•光合成生物の利用•人工光合成系

光合成メカニズムの解明

エネルギー問題・環境問題

光合成細菌（３５億年前～）非酸素発生型光合成

アンテナ色素

反応中心

top view

side view

光化学系Ⅱ 光化学系Ⅰシトクロムb/f

NADPH

H2O

e-

e-

e-

シアノバクテリア（２５億年前～）≈ 植物 酸素発生型光合成

光化学系Ⅱ

光化学系Ⅱ：色素系

top view

side view

反応中心

QAQB

Pheo

P680

Mn cluster

Cytb559

YZ

e-

YD

ChlZ

caro

O2

H+

H+

H+

H+H2O H2O

H+

PQH2

H+

PQ

+ChlD1

光化学系Ⅱ

光駆動水分解酵素

光化学系Ⅱ光合成細菌型反応中心

~25 億年前

O2+ 4H+2H2O

H2S

有機酸

Mnクラスター

P680P870

光化学系Ⅱの進化

e- e-

50億年前

地球の誕生

シア

ノバ

クテ

リア

O2発生

40 30 20 10 0

オゾン層

陸上進出

真核生物 人類

多細胞生物

生命誕生

光合成細菌

光化学系Ⅱと地球・生命の共進化

21%

葉緑体

光化学系Ⅱ

酸素発生系の構造と反応

Guskov et al., 2009

酸素発生系 X線結晶構造

Ferreira et al., 2004

3.5 Å 2.9 Å

酸素発生系の構造モデル

Yano et al., 2006 Barber and Murray, 2008

• Mnクラスターの構造の詳細は不明• 基質水分子の位置は不明

• X-ray diffraction (protein) + EXAFS (Mn core)

酸素発生Ｓ状態サイクル

S3 S

4

S0

S1

S2

e-e-

e-e-

O2

hn

hn

hn

hn

H+

H+

H+

H+

H2OH2O

? ?

?

?

?

2H2O → O2 + 4H+ + 4e-

光化学系ＩＩ

Mnクラスター

光化学系Ⅱ蛋白質中の酸素発生反応のメカニズムを調べたい！

巨大蛋白質中の１化学結合を検出

赤外光の利用

すべての生体物質が赤外光を吸収分子振動

分子振動の振動数を検出＝ 赤外吸収スペクトル

蛋白質、アミノ酸、色素、水……なんでも見える！

どうやって１化学結合の情報を取りだすのか？

トリガ（光 etc）

A

B

差スペクトル （B−A）

活性部位

•十万分の１の微小赤外吸収変化を測定可能

活性部位の個々の化学結合（基準振動）の変化を検出

反応誘起FTIR差スペクトル法

FTIR法

FTIR

Nd:YAG laser

PS II sampleMCT

IR beam

Michelson干渉計

移動鏡

固定鏡

半透鏡

B.反応後

差スペクトル（B−A）

A. 反応前

0.5A

bsorb

an

ce (

a.u

.)

1800 1600 1400 1200

Wavenumber/cm -1

A−B

1x10−5

蛋白質のFTIRスペクトル

アミノ酸の動きを見る

S状態サイクル FTIRスペクトル

Wavenumber /cm1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200

-1

ΔA

O2

1st flash

S1 → S2

2nd flash

S2 → S3

3rd flash

S3 → S0

4th flash

S0 → S1

蛋白質領域

10-4

Noguchi & Sugiura, 2001

S1

S0S2

S3 (S4)

• 水分解の反応サイクルにおける蛋白質、アミノ酸の動きを初めて観測

-1.0x10-4

-0.5

0.0

0.5

Rela

tive

in

ten

sity

12108642

Flash number

FTIRシグナル４周期振動

A

1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100

Wavenumber /cm-1

S状態サイクルFTIR 蛋白質領域

S1→ S2

S2→ S3

S3→ S0

S0→ S1

sym COO-asy COO-

main chain

His C-N

amide I amide II

Asp,Glu,C-term

A

3800 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200

Wavenumber/cm-1

H-bond networkamide NH

S状態サイクルFTIR：OH,NH領域

His N-Hwater OH

S1→ S2

S2→ S3

S3→ S0

S0→ S1

1450 1400 1350 1300

Wavenumber/cm-1

ΔA

10

-4

カルボキシル基COO−対称伸縮領域

S1→ S2

S2→ S3

S3→ S0

S0→ S1

C

O

O

-

Asp, Glu, C-terminus

• 約１２の対応するバンド

• 6つのカルボキシル基

1130 1120 1110 1100

Wavenumber/cm-1

1113 1106

11141107

2800 2700 2600 2500

Wavenumber/cm-1

2806

2692

2806

2698

2580

2754

2758

2613

2615

2584

酸素発生系 FTIR: ヒスチジン

spinach

Synecocystis

C-N stretchN-H stretch

15N

His-15N

unlabel

unlabel

Noguchi et al., Biochemistry 1999

６ carboxylate ligands

１ histidine ligand

C-term(Ala344), Asp170, Glu189,

Glu333, Asp342, CP43-Glu354

His332 His332

Loll et al., 2005

Gln165

Glu189

His332

Asp 342

His337

Glu 333Asp 61

Asp 170

D1-C末端

CP43-Arg 357

CP43-Glu354

Tyrz

Mn Mn Mn

Mn

Ca

X線結晶構造による配位子予想

Loll et al., 2005

CP43-Glu354 →Gln変異体

A

1750 1500 1250

Wavenumber (cm-1

)

5x1

0-5WT

E354Q

WT− E354Q

glutamine glutamic acid

C

ONH

H

C

OO

M

O

C

O

M1 M2

O

C

O

M

O

C

O

unidentate bridging bidentate chelating bidentate

>~200 cm-1

Glu354

S1 1525 1394 131 bridging

S2 1502 1431 71 chelating

~160 cm-1 <~100 cm-1

ν as ν s Δν

Δν

CP43-Glu354 →Gln S2/S1 & S3/S2 FTIR

A

1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100

Wavenumber (cm-1

)

WT E354Q

WT-E354Q

1st flash(S2/S1)

2nd flash(S3/S2)

Mn3+ Mn3+ Mn4+

Ca2+ Mn4+

Mn3+ Mn4+ Mn4+

Ca2+ Mn4+

Mn4+ Mn4+ Mn4+

Ca2+ Mn4+

CP43-Glu354

S1S2

S3Shimada et al., Biochemistry, 2009

水分子の反応を捉える

OOH stretch

(weak H-bond)OH stretch

(strong H-bond)

H H

Water vibrations

A

2750 2700 2650 2600

Wavenumber/cm-1

水 OH(D) bands

A

3700 3650 3600 3550 3500

Wavenumber/cm-1

5 x

10

-5

S1 S2

S2 S3

S3 S0

S0 S1

H2O & H

2

18O D

2O & D

2

18O

3588

3617

3634

3621

3612

2653

2682

2693

2677

2673

Noguchi & Sugiura, Biochemisty, 2002

water reaction : S1 → S2

O

H H

O

HH

S1→ S2

3588

3617

A

3700 3650 3600 3550

Wavenumber/cm -1

(M) (M)

H-bond asymmetry becomes larger

upshift

water reaction : S2S3 S0 S1

3634

3621

3612

A

3700 3650 3600 3550

Wavenumber/cm-1

S3 S0

S0 S1

S2 S3

O

H H

(M)

O

H H

(M)

(2)

O

H

(M)

O

H H

(M)

(1)

proton release or

strong H-bond formation

two OH groups react in S3→S0

OOH stretch

(weak H-bond)OH stretch

(strong H-bond)

HOH bendH H

Water vibrations

A

1800 1600 1400 1200

Wavenumber (cm-1

)

0.5

x 103

S2/S1 difference

PSII protein

water

HOH bend

Water HOH bending band

Amide I

A

1800 1600 1400 1200

Wavenumber (cm-1

)

in H2O

in D2O

DOD bending band

DOD bend

HOH bend

18O shift of DOD band

D216O

D218O

H2O

D2O

H216O

H218O

16O-18OH2O

D2O

A (

a.u

.)

1300 1250 1200 1150 1100

Wavenumber (cm-1

)

0.1

1208

1186

1225

1192

A

1300 1250 1200 1150 1100

Wavenumber (cm-1

)

5x10-5

A

1300 1250 1200 1150 1100

Wavenumber (cm-1

)

5x10-5

S-state cycle FTIR: DOD bending region

H2O D2O

S1→S2

S2→S3

S3→S0

S0→S1

noise

D216O

D218O

H216O

H218O

A

1300 1250 1200 1150 1100

Wavenumber (cm-1

)

16O-18O: pure S-state spectra

S1→S2

S2→S3

S3→S0

S0→S1

1 cycle

(S1→S1)

bulk water

• 少なくとも２つの水分子が常

にMnクラスターの近傍に存在

• 蛋白質内の水クラスターから

反応系に入る。

• S2→S3, S3→S0遷移におい

て基質水分子が挿入される。

• 酵素中で反応する水分子の変角振動を初めて検出

Suzuki et al. Biochemstry, 2008

Sadley, 2002

Water cluster

HOH bend

Cluster size

• HOH bend frequency

increase as the size of water

cluster

Murray & Barber, 2007

O2

S1

S0S2

S3 (S4)H2O

H2O

基質水分子の挿入過程

プロトンを検出する

H+

OEC

PS II 蛋白質

低濃度緩衝液

pH 変化

pH ガラス電極

pH指示薬の呈色反応

プロトン検出法: 従来の手法

H+

問題点：蛋白質による緩衝作用

bufferH+

OEC

PS II蛋白質

高濃度緩衝液

緩衝剤の反応

FTIRによるプロトン検出

buffer

buffer

bufferH+

buffer

緩衝剤によるプロトントラップ

FTIR検出

Suzuki et al.,

J. Am. Chem. Soc., 2009

• FTIRによる新規なプロトン検出法を開発

-3x10-4

-2

-1

0

1

1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000

Wavenumber / cm-1

T. elongatus (YD less) FTIR nth flash – before illu

protein bands

MesH+/Mes

1 flash

12 flashes

緩衝剤: 200 mM Mes (pH 6.0)

O

NSO3

-

O

NH+ SO3-

+ H+

- H+

N

O

SO3H

N

O

SO3D

D2

D2D2

D2

D2

D2

Mes

D13-Mes

-1.6x10-3

-1.5

-1.4

-1.3

-1.2

-1.1

1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000

Wavenumber / cm-1

S-state spectra in Mes and D13-Mes

Mes

D13-Mesprotein

MesH+/Mes

12 flashes

-3x10-4

-2

-1

0

1

1400 1300 1200 1100 1000

Wavenumber / cm-1

Mes – (D13-Mes)

1 flash

12 flashes

•緩衝剤によるプロトントラップ反応のみを検出

1.5

1.0

0.5

0.0

Pro

ton r

ele

ase

121086420

Flash number

Proton release pattern: Mes band intensity

Miss: 12%

Proton release:

S0S1: 0.94

S1S2: 0.28

S2S3: 1.20

S3S0: 1.57

exp.sim.

consistent with

1:0:1:2 pattern

S3 S

4

S0

S1

S2

O2

hn

hn

hn

hn

H+

H+

H+

プロトン放出数

H+

0

12

1

クロロフィルは如何にして酸化力を上げたか？

光化学系Ⅱ

QAQB

Pheo

P680

Mn cluster

Cytb559

YZ

e-

YD

ChlZ

caro

O2

H+

H+

H+

H+H2O H2O

H+

PQH2

H+

PQ

+ChlD1

クロロフィル二量体 P680

光化学系Ⅱ紅色細菌型反応中心

~25 億年前

O2+ 4H+2H2O

H2S

有機酸

Mnクラスター

P680P870

光化学系Ⅱの進化

Em(V

)-0.8

-0.4

0.0

0.4

0.8

1.2

P870*

QB

P680*

QB

紅色細菌型反応中心

光化学系 II

H2S e-

e-

H2O

e-

+0.88 V

(pH 6)

~+0.5 V

×~+1.2 V

e-

P870

P680

+0.7 V

クロロフィル二量体（P680）

•極めて高い酸化還元電位(~+1.2 V)

の獲得機構は？

Chl Eox: 誘電率依存性

Eo

x(V

)

e

?P680

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

403020100

inside proteins

Chla (有機溶媒中)

Chlaモデル

Mg

N

N N

N

OO

O

密度汎関数法：

構造最適化

エネルギー計算(Chla & Chla+)

Chla構造モデル

Chla+/Chl

酸化還元電位

溶媒効果:PCM

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

403020100

Eox (Chl+/Chl) : 誘電率依存性

Eº

(V)

誘電率 e

計算

Hasegwa and Noguchi, 2005

Eox (Chl+/Chl) : 疎水環境

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

1086420

Eº

(V)

e

e = 2

Eox = 1.37 V

P680+/ P680

Hasegawa & Noguchi,

Biochemistry, 2005

疎水環境

•疎水環境（低誘電率）ではクロロフィルの酸化電位は本来十分高い

• P680周りの疎水環境が高い酸化電位の一要因

P周りの極性残基

紅色細菌 P870 光化学系ⅡP680

P680カチオン上の電荷分布

電荷非局在化0.5+

+電荷局在化

酸化還元電位の低下

0.5+

N

N

N

N

CH3

CH2CH3

CH3

CH

H3C

O

H3C

HH

CH2

CO2CH3

H

Mg

CH2

CH2

CO O

Chlorophyll a

keto C=O stretch

ΔA

1740 1720 1700 1680

Wavenumber/cm-1

P680+/P680 FTIR：keto C=O

17

23

P680+

17

11

17

02

P680

ホウレンソウPSII

keto C=O

Okubo et al. 2007

• いずれのケトC=Oも水素結合なし

• P680+では2本のバンドが現れる

21 cm-1

9 cm-1

O O

完全局在

Chlモノマー

完全非局在

keto C=O frequency

部分局在

+

ChlChl+

~30 cm-1

upshift

二量体

ΔA

1740 1720 1700 1680

Wavenumber/cm-1

17

23

P680+

17

11

17

02

P680

21 cm-1

9 cm-1

+ δ+

70-80%

•電荷は片側に局在化して存在

Okubo et al., Biochemistry, 2007

電荷の局在

光化学系Ⅱコア複合体光化学系Ⅱ反応中心複合体

細菌型反応中心

ΔA

1740 1720 1700 1680

Wavenumber/cm-1

17

23

17

12

17

01

ＲＣ

17

02

+ δ+

0.5+0.5+

P680+/P680 FTIR：keto C=O

membranes

A

6000 5000 4000 3000 2000

Wavenumber (cm-1

)

P680+ intervalence band

RC

P1+P2

P1P2+

E

+PSII membrane

Okubo et al., Biochemistry, 2007

電荷非局在化効果：DFT計算

(e =2.2)

PD2

PD1

PD2

PD1

Eox = - ~140 mV

•エネルギー計算

B3LYP/6-311+G(d)P680

•P680座標←X線構造(3.0 Å)

•水素原子構造最適化B3LYP/6-31G(d)

電荷非局在化による酸化還元電位減少

Takahashi et al., Biochemisty, 2008

Eº’

YZ /YZ

P680+/P680

e-

RCmembranes, core

Change in Eox of P680

~0.1 V

電荷非局在化(~–0.14 V)

P680+/P680 e-

電荷局在化によりEox低下を抑制水を分解するのに十分な酸化力を獲得

クロロフィル酸化力獲得の進化過程

細菌型反応中心

L M D1 D2

光化学系Ⅱ反応中心

一次配列変化

誘電率降下

複合体化

電荷偏り D1 D2

光化学系Ⅱコア複合体

水分解能