ニワトリの発生

熊本大学・発生医学研究所

嶋村 健児

なぜニワトリ？

• 卵生（観察、実験操作上の利点）

• 進化の観点（羊膜類：陸上生活に完全適応）

• 実験材料としての利便性、低コスト

• 極初期胚の体制がヒト胚に類似

ヒトの初期発生（円盤状の胚盤）

「ヒト発生の3次元アトラス」より

マウスの初期発生（円筒状の胚盤）

From “Manipulating the Moue Embryo”

ニワトリ卵（産卵時）

卵殻

胚盤胞

卵黄気室

カラザ

卵殻膜

卵白

ビテリン膜（卵黄膜）

From “The Atlas of Chick Development”

ニワトリの卵形成

From “The Atlas of Chick Development”

卵管漏斗

卵巣

卵子

卵白分泌部峡部（卵殻膜形成）

卵殻形成部

ニワトリ胚の盤状卵割

「カラーアトラス動物発生学」より

体軸（前後軸）決定と胚盤葉下層（hypoblast)の形成

「カラーアトラス動物発生学」より

体軸形成の基本原理～放射相称から左右相称へ～

円周上の一点を決めるSpecify a single point along the margin

ニワトリ胚の原腸陥入（三胚葉形成）

HH stage 2

HH stage 3

HH stage 4

HH stage 6

ニワトリ胚の原腸陥入（HH2～HH5）

「カラーアトラス動物発生学」より

ニワトリ胚の原腸陥入（体軸伸長と細胞のふるまい）

ニワトリ胚の原腸陥入（内胚葉形成）

From “The Atlas of Chick Development”

ニワトリ胚の原腸陥入体軸伸長とヘンセン結節（ノード）の後退

「カラーアトラス動物発生学」よりFrom “The Atlas of Chick Development”

ニワトリ胚の原腸陥入（HH2～HH11）

1日胚（HH5）

ヘンセン結節

原条

暗域

明域

・明域がひょうたん型になり、ヘンセン結節、原条がみとめられる。

・ヘンセン結節の前方に脊索、脊索前板が伸びている。

・原腸陥入を経て生じた中胚葉が胚盤葉上層、外胚葉の下に潜り込んでいる。

・前縁部の中胚葉が後の心臓原基となる。

・基本的に平たんではあるが、頭部神経版（脳原基）が形成されつつある。

・神経管が閉じ、先端部から前脳、中脳、後脳の脳胞が認められる。前脳の両側から眼胞が突出し、後脳には菱脳分節（ロンボメアー）が認められる。

・耳胞は外胚葉が肥厚した耳プラコードから形成される。

・心臓原基は対になって出現し、正中線で融合する。このステージではすでに拍動している。

・胴部神経管の両側に体節が規則正しく形成される。

2日胚（HH12）

前脳

中脳

後脳（菱脳）

耳胞

眼胞

体節神経管

心臓

胚を形成する。

・前脳は終脳と間脳に分かれる。

・鰓弓がみとめられる。

・肢芽の出現が認められる。

・体節が尾部に達している。体節からは、のちに椎骨、肋骨、真皮、筋肉が形成される。

3日胚（HH18）

鰓弓

心臓

耳胞 後脳・眼胞の近位側はくびれて眼

中脳

間脳

終脳

眼胞

前肢芽

後肢芽体節

脊髄

5日胚（HH25）

・終脳は左右に分かれて膨らみ、後の大脳半球の原基となる。

・後脳の蓋板はひし形に薄く広がり、後脳前部は小脳原基、後部は延髄原基となる。

・眼の色素上皮が分化し、黒化がみとめられる。

・体節から筋芽細胞が遊離し始める。

・両肢芽は遠位に伸長する共に、特有の形状を呈し始める。

・尿嚢が膨らんでくる。

鰓弓

眼胞

レンズ

小脳原基

終脳

尿嚢

心臓

前肢芽

7日胚（HH32）

・中脳の背側部は左右一対の視蓋に分化している。

・眼胞は大きく発達し、黒化が進む。

・手足のアポトーシスが進み、指の間の領域がわかるようになる。

・手足で軟骨がみとめられる。

・各器官で組織構築が進んでいる。

視蓋

前肢

後肢

眼胞

終脳

神経系、眼胞、耳胞

頭部の神経管は、複数の脳胞に分節されている眼胞は前脳の外側壁からふくれ出て、発生が進むと眼杯を形成する耳プラコードは外胚葉の肥厚として現れ、やがて耳胞を形成するようになる

3 日胚

眼杯

鯉弓

心臓

体節

後脳

間脳

耳胞

終脳

前肢芽

後肢芽

。

。

中脳

前脳

頭部の形成（in ovo観察、HH12～HH25）

神経板

眼胞

体節

神経管

前脳

中脳

後脳心臓

耳胞

神経管形成

2日胚

神経溝

神経摺

神経管

脊索

内臓板中胚葉からの心臓形成

Endocardium心内膜

1 2

34

Myocardium心筋

心臓の形成

心臓原基は両側性である

ニワトリ胚 ゼブラフィッシュ胚

二叉心臓（Cardia bifia）

野生型

milesapart

心臓はループを形成する

発生の途中で心房と心室の位置が逆転している

心房と心室の形成

R

ニワトリ胚 マウス胚

L心房

心室

胚体外膜~陸上生活への完全適応~

・胚は羊膜に包まれている。・尿嚢は窒素廃棄物をためるだけでなく、血管網を使ったガス交換を行う。・卵黄嚢の栄養は卵黄血管網に取り込まれて胚へと供給される。

（尿嚢）

胚体外膜の役割

2日胚 3日胚

胚膜の発生

Developmental Biologyより

5日胚 9日胚

胚膜の発生

Developmental Biologyより

漿膜と羊膜

漿膜と羊膜は外胚葉と中胚葉由来である

哺乳類では、漿膜（と尿嚢）が胎盤を作る

鳥類、爬虫類、哺乳類の胚は羊膜の中の羊水に保護される

羊膜

漿膜

卵黄嚢と尿嚢

尿嚢 と 卵黄嚢 は中胚葉と内胚葉由来である

尿嚢は排出物を蓄積する。哺乳類の尿嚢のサイズは種によって異なり、ヒトでは痕跡器官である。

鳥類と爬虫類の卵黄嚢 は胚に栄養を供給する。

尿嚢

卵黄嚢

ニワトリ胚の全胚培養New’s culture

胚盤

ガラスリング

New, DAT, 1955

ビテリン膜（卵黄膜）

卵白

ニワトリ胚の全胚培養ペーパーリングによる改良型Newカルチャー法

１．ディッシュに卵をあける。胚が卵黄の上部に来るように。

2．胚のサイズ穴のろ紙リングを貼り付け、ろ紙の輪郭に沿って切り出す。

3．ろ紙をもち、胚を裏返して卵白ゲル上に静置する。泡が入らないよう注意。

エレクトロポレーション（電気穿孔）法による生体への遺伝子導入

エレクトロポレーションの原理と要点

・細胞膜（脂質二重層）は絶縁体。

・一定の電気パルスがかかると細胞膜に無数の小さな穴が生じる。

・この穴を通って極性分子（DNA、RNA、ペプチド、タンパク質など）が電気泳動によって細胞内に流入する。

・この穴は一過的であり、ほどなく修復する。

・電気パルスは直流パルス（矩形波）で、角がシャープであるほど良い。

・標的に対して効率よく電圧をかけられる電極の形状、設置方法を検討する。

・パルスの電圧、長さ、間隔、回数を、対象によって最適化する必要がある。

電気パルス付加

⊖ ⊕

DNA,タンパクなど

電圧

時間

細胞膜（脂質二重層）

細胞シート

エレクトロポレーション法による脳胞への遺伝子導入（HH10~12)

Funahashi et al., 1999

脳の領域化と形態形成Regionalization and Morphogenesis of Brain

July 19, 2019

熊本大学・発生医学研究所脳発生分野嶋村 健児

simamura@kumamoto-u.ac.jp

Contents

・神経組織における領域化の意味

Significance of regionalization in the CNS

・脳の原基（神経板・神経管）の領域化のしくみ

Patterning of the CNS primordium

・領域性研究の現在と残された課題

Issues remained in the field

・我々の研究内容

Our research projects

脳には“地図”がある

大脳知覚、記憶、判断、運動の命令、感情など

小脳運動や姿勢の調節

脳幹呼吸、循環機能の調整など

視床下部ホルモンの調節

神経組織の領域性とは？What is the regionality of the CNS?

・場所による機能分担（機能のユニット化）Allocation of distinct functional units

・場所による組織形態の違い（神経核と皮質）Distinct histologenesis among the regions

・特定形質をもつニューロンの部位特異的な配置Site-specific generation of neurons with specific properties

・ニューロンの位置情報Positional information of individual neurons

視蓋（皮質）

被蓋（神経核）

脳は領域によってその内部構造が異なっている

ニワトリ中脳のニッスル染色

Case 1: 大脳新皮質における領野の構成The neocortical areas in mice and humans

視覚野Visual

体性感覚野Somatosensory

運動野Motor

Case 2: 「匂い地図」によって嗅覚は処理されるOlfaction is processed by the “oder maps”

Modifeid from Nagao et al., 2002

E10.5

apical

basal

神経上皮細胞：中枢神経系の幹細胞Neuroepithelium: embryonic CNS

stem cell

ventricle

pia

neuroepitelia

ニューロンに個性を与える二つのしくみGeneration of neuronal diversity by two distinct mechanisms

neuron

neural stem cell

neuron

neural stem cell

神経上皮細胞（神経幹細胞）の領域化Regional specification of neuroepithelium (embryonic neural

stem cell)

• 細胞系譜に基づく位置情報の確立

Cell lineage-dependent positional specification

•シグナル分子による二次元的パターン形成Two-dimensional pattern formation mediated by

diffusible factors

ニワトリ胚を用いた脳の領域化の研究

前脳

中脳

後脳

HH8 HH10 HH12

脳胞を部分移植して領域性の変化を調べる

?

?

Fujimori, T., Dev. Growth Differ. 52, 253-262, 2010

発生生物学における細胞の運命決定に関する概念Fate specification in Developmental Biology

調整プログラムRegulative programs

正常プログラムNormal programs

+

正常プログラムNormal programs

実験操作

正常発生（操作なし）

単離

異所移植

切り出し 完成

ニワトリ胚の脳組織片移植

ステージ11（孵卵２日目）

脳移植片の運命変化

Martinez et al., 1991

中脳後脳境界はオーガナイザーとして機能する

En2:中脳後脳境界と中脳後部のマーカー

Martinez et al., 1991

中脳後脳境界は間脳を中脳に運命転換する

ウズラ（ドナー）の中脳後脳境界がニワトリ（ホスト）の間脳を中脳にした。

領域性形成から投射地図の形成へ（網膜視蓋投射の場合）

Itasaki et al., 1991

中脳における極性形成

Crossley et al., 1996

Fgf8は中脳後脳境界からのシグナルである

ニワトリーウズラキメラ法による神経板予定運命地図の作製

Cobos et al., 2001

Lumsden and Keynes, 1989

神経上皮の区画化

Rhombomere（菱脳分節）

Fraser et al., 1990

ロンボメアーは“コンパートメント”である

脊髄における背腹軸パターン形成

神経板

脊索

移植された脊索

脊索

神経管

「脊髄の発生」脳科学辞典より

脊索の除去

遺伝子発現でみる脳原基の領域化

Shimamura et al., 1995

転写因子：ゲノム上の特定の遺伝子の発現を調節して、その細胞の性質を決める。

分泌因子：細胞の外部に放出されて、受け取った細胞の性質を決める。

領域性を決める主要なプレーヤー（遺伝子産物）

エレクトロポーレーションによるニワトリ胚への遺伝子導入

エレクトロポレーションによる脳の局所的な遺伝子導入

終脳

間脳

中脳

後脳

EP@HH8→HH20

頭部神経板におけるパターン形成Patterning of the head neural plate (brain primordium)

anterior neural ridge

isthmus

前脳forebrain

中脳midbrain

菱脳hindbrain

Fgf8

Shh

Nkx2.1

Foxg1

En2

dopaminergic neuron serotonergic neuron

competent region

Otx2

Gbx2

Six3

Fezf1,2

Irx1

Irx3

Pax6

Pax2

En1

anterior

posterior

初期神経板における領域性形成

Kobayashi et al., Development, 2002

脳の領域性研究の現在と残された課題

１．より詳細で網羅的な遺伝子発現マップの作成

２．Morphogenの濃度勾配がどう解読されるか？

３．転写因子の組合せのあと

４．神経上皮の領域性と異なる組織構築のリンク

視蓋（皮質）

被蓋（神経核）

脳は領域によってその内部構造が異なっている

ニワトリ中脳のニッスル染色

Irx3 EP, HH39

Kobayashi et al., Development 2002

領域性を変えると組織形態が変化する

脳組織構築の基本原理：増殖、自己複製、分化、移動

共通の基本原理からどうやって異なる組織形態がつくられるか？

基本原理を支えるしくみの量的・時間的な違いが、構造の大きな違いに至るのではないか？

P

NP

PP

N N

P

P

P P

P

P: progenitor

N: neuron

脳の形は動物によって大きく違う

胚の脳

ウサギ

ヒト

カメキンギョ

トリ

ハリモグラ

哺乳類における脳の多様性

DeFelipe J. 2011 Front. Neuroanat.,16

どうやって脳が拡大したか？

どうやって脳にシワができたか？

霊長類の脳はどうやって拡大したか?

Comparative Mammalian Brain Collection

The Multi-Dimensional Human Embryo (NICHD)

胚 成体

マウス

ヒト

E9.5

E28

1. ラジアルグリアが長期間にわたって増殖する。2. 中間前駆細胞（IP）が何度も分裂する。3. oRGが著しく増加している。

ラジアルグリア

中間前駆細胞 中間前駆細胞

outer Radial Glia

マウス ヒト

脳室 脳室

pia

ヒトとマウスの大脳皮質発生

ニューロン

pia

ニューロン

霊長類では脈絡叢が発達している

Human-Rat comparisons The Laboratory of Developmental Neurobiology, Inc

Rat Human

Rat E18 Human E63

脈絡叢・脳脊髄液の種間差が脳のサイズに関与するか？

Human GW11Mouse E13

Horizontal section

E55 E13

イメージ

種特異的な脈絡叢因子の探索

多くの哺乳類の脳にシワが見られる

humanchimpanzeelion

rabbit

cat

mouse

bat

脳のシワ（脳回・脳溝）はどうやってできるか?

Lui et al., Cell 146, 2011

OSVZ細胞の増加によって大脳皮質の表面積が拡大した

脳溝の多くは、ニューロン産生が終了後、グリアの分化や軸索の発達が起こっている妊娠後期に形成される

高等哺乳類における脳回・脳溝（シワ）の形成

E45 AdultP33P3

E75 (P3) AdultP33E59 P9

モルモット（Guinea pig）におけるシワ形成

E28

Hatakeyama, Sato, & Shimamura, Dev Growth Differ 2017

子宮内エレクトロポレーションによるモルモット胎児脳への遺伝子導入

Hatakeyama, Sato, & Shimamura, Dev Growth Diff, 2017

EP@E31 →E53

GFPBrn2DAPI

Hatakeyama, Sato, & Shimamura, Dev Growth Differ 2017

子宮内エレクトロポレーションによるモルモット胎児脳への遺伝子導入

・研究に大切なのは独創性。

・人とは違う視点で、人のやらない研究を。

・見て感じたことを大切に（出発点として）。

さいごに

天草イルカウォッチング

世界遺産 万田杭世界遺産 崎津天主堂

阿蘇山＆温泉

馬刺し熊本ラーメン

熊本へ、ぜひ！