日皮会誌:90 (14), 1373-1380, 1980 (昭55）

ラット皮膚におけるヒアルロン酸合成酵素の検討

山　本

　　　　　　　　　　　要　　旨

　Wistar系ラット背部の微景凍結乾燥皮膚組織を酵素

源としてヒアルロソ酸（以下ＨΛと略）合成酵素活性

を測定したUDP-N-acetyl-D-rU-"Cl-glucosamine (以

下UDP-GIcNAc-"Cと略）と　UDP-D-glucuronic acid

（以下UDP-GlcUAと略）を基質としてO.IM Tris-

HCl buffer pH 7.0 とMg°の存在下に37°Ｃ，3時間反

応させ，下降法ペーパークロマトグラフィーを行ない多

糖体ポリマーとヌクレオタイドに分離した．原点にとど

まる多糖体ポリマーの放射活性をオートラジオグラフｊ

－で確認後，その放射活性を液体シンチレーションで測

定し，以下の結果を得た.

　1）酵素源としての皮膚組織を含まない系および煮沸

した皮膚組織を用いた系では多糖体ポリマーの形成はみ

られない，

　2）多糖体ポリマーは反応時間３時間まで直線的に増

加する.

　3）多糖体ポリマベま皮膚組織lOmgまで直線的に

増加する．　　　　　　　　　　　　上

　4）本反応はPH依存性である.　　　　　　　　・

　5）本反応において，基質(UDP-GlcNAc-"C)に対

するみかけ上のＫｍ値は2.4×10’5Mである．

　以上より本反応は酵素的に進行していると考えられ

た．さらにヒアルロニダーゼ消化実験と二次元電気泳動

の結果より，多糖体ポリマーはＨＡを主とする物質で

あると考えられた．また，凍結乾燥皮膚組織に凍結融解

の操作を繰り返し加えた後の上清部分にも同様の多糖体

ポリマー合成活性がみられ，凍結乾燥皮膚組織そのまま

を用いた時の約60％の活性であった．

　加齢との関係では，凍結乾燥重量あたり，胎児で多糖

体ポリマー合成活性は最高値を示した．　　　　ｌ

岡山大学医学部皮膚科学教室（主任　野原　望教授）

Yasuo Yamamoto: Studies on hyaluronic acid syn-

　thetase in rat skin.

昭和55年５月６日受理

別刷請求先:（〒700）岡山市鹿田町2 ― 5―1

　岡山大学医学部皮膚科学教室　山本康生

康　生

　　　　　　　　　　緒　　言

　ムコ多糖(以下ＭＰＳと略)は生体の支持組繊を形づ

くる結合組織の１構成成分であり，皮膚においては，真

皮結合組織間基質として線維形成や水，電解質運搬を行

ない√表皮細胞間セタソト物質として大きな役割を果し

ている．そのＭＰＳは，生体内の種々の生理的，病的

状態によって影響を受けている．その動態は生成された

ＭＰＳを定量することにより検討されてきた．その結果，

皮膚とくに真皮におけるＭＰＳはＨＡとデルマタソ硫

酸とか主たる成分であり，加齢に伴いＨＡは減少し，

逆にデルマタソ硫酸は増加するといわれている!)~4≒　し

かし，部位別でみると一定のデータがみられない3) 5)-7)

そり一因として，定錨:するために比較的大量の材料を必

要とすることかあげられる．そのため，石川8)は比較的

少量の皮膚片より分離したＭＰＳをセルローズアセテー

ト膜電気泳動で分画し，デソシトノーターにかけ, MPS

を半定量的に測定した．結合組織の種々の病態を論ずる

際に，生成された物質の定量的検討は１つの方法である

が，その物質の合成に関与する酵素活性をみれば，ある

病態の動的側面をより適確につかめると考えられる．著

者は合成経路におけるＨＡ合成酵素に注目した．これ

までＨＡ合成に関する報告はいくつかみられる9)-16)

とりわけ，ストレプトコッカスにおけるHA 合成機構

に関して精力的に研究が行なわれている13) lC)しかし，

皮膚におけるＨＡ合成酵素活性測定はSchillerらの報

告9)10)以来みられない．その理由として，酵素活性の出

現が測定の際の試料調製に微妙に依存することがあげら

れる．著者は線維芽細胞におけるIshimotoらの方法11)

を一部改変しWistar系ラット背部の微量凍結乾燥皮膚

組織を用いて，皮膚におけるＨＡ合成酵素活性の測定法

の確立を試み，かつ加齢に伴う変動について検討した．

　　　　　　　　　　材料と方法

　I) HA合成酵素活性測定

　Wistar系ラット背部皮膚をエーテル麻酔下に剃毛後

鋏で採取し，あらかじめディープフリーザー内で冷却し

ておいた合成樹脂性のまな板上に脂肪織を下にして凍結

固定した. -15°Ｃの冷凍庫内で替刃のメスを用いて表皮

1374

0｡５Ｍ　　　Tris-HCl buffer pH 7.0　0.05 ml

0.2M　　　MgCI^　　　　　　　　　0.035ml

O.OIM　　UDP-GIcUA　　　　　　　0.02 ml

0.077mM　UDP-GlcNAc-"C*　　　　0.05 ml

　　　　　　　distilled water　　　　　　0.115ml

　　　　　　　　　　　　　　　　Total　　0.27 ml

(Penicillin lOOu/ml, Gentamicin 100μg/ml, ATP

3mM)

＊　specificactivity:　323mCi/inmol

　　図１　ＨＡ合成酵素活性測定における反応液

skin

　↓

凍結後タスで削る（－15旬冷凍庫内）

　↓

凍結乾燥

　↓

incubation at 37･Ｃ in reaction mixture

　↓

reaction stopped in boiling water

　↓

homogenize

　↓

凍結乾燥

　↓

descending paper chromatography

　↓

autoradiography

　↓

liquid scintillation

山本　康生

　　　図２　ＨＡ合成酵素活性測定の基本的操作

を荒削り除去した後，真皮を粉雪状の大きさに削り取り

凍結乾燥して試料（酵素源）とした．化学天秤で計量

後UDP-GlcNAc-"C (The Radiochemical Centre Am-

ersham England)とUDP-GlcUA (Sigma)とを基質と

して，図１に掲げる反応液中で37°Ｃ，3時間反応させた

後，３分間沸騰水で熱して反応を停止した．さらにI ml

用のガラスホモジェナイザー(Vitro)でポモジェナイ

スし凍結乾燥した．適量の蒸溜水で再懸濁させたものを

幅４ｃｍのWhatman 3MMの濾紙にスポッ斗し，イソ酪

酸：ＩＮアンモニア＝５：３の展開液で下降法ペーパー

クロマトグラフィーを48時間行ない，多糖体ポリマーと

ヌクレオタイドとを分離した．スポット原点にとどまる

多糖体ポリマー15）の放射活性を72時間のオートしラジオ

グラフ･f－（フジＸ線フィルムＲＸ）で確認後，濾紙を

4×ｌｃｍのたんざく形に切り取り, 0.5mlの蒸溜水と

5mlのアクアゾール２（ボクスイブラウｙ）を加えた

後，アロカLSC-653液体シンチレーションスペクトｐ

　　　　　skin　　　　　L

sohicationin 1ml disUlIed water ａtかC　　　　　L

　　　　　1ml ice-cold 10％ＴＣＡ

　｢__＿5tａt 2,000Xg, forlOmin,･ａt4℃

　Ｓｕp･　　prec.　　　　　｜

　　　　1.5ml ice-cold 95% ethanol

　→at 2,000Xg, tor10m in,ａt4℃

sup prec.

　t

heated in lm］5% TCA for lOmin, at90°Ｃ

　　　　　　　　at2,000Xg, forlOmin　よ

三二二〇min

　　heated

し

2ml O.IN NaOH for lOmin

　ｒ_＿jtａt 2,000Xg, for lOmin

plみc. sup, 一一f。ｒ[Protei司

　　　　　図３　ＤＮＡと蛋白抽出操作

at90°Ｃ

タークー（日本無線医理学）にて測定した（図２）．以

上を標準法とする.

　II) MPSの抽出

　I･）に記述した方法に従い作製した凍結乾燥皮膚組織

を4mg,反応液を各倍量とし37°Ｃ，3時間反応させた．

反応後0.2N NaOHを反応液に等量加え, 0 °C, 4時開

静置した後，24時間蒸溜水にて透析した．さらに■ O.IM

Tris-HCl buffer でpH 8.0 に調製し豚皮ＨＡ（生化学

工業) 2mgを加えた後プロナーゼＰ（和研化学）lmg/

10mlを0.1mlずつ12時間毎に加え，60°0, 48時間消化

した．消化終了後，終末濃度８％となるように50％トリ

クｐ－ル酢酸を加えた．０ °Ｃ，１時間静置した後，遠沈

除蛋白したものを蒸溜水に対し72時間透析し，凍結乾燥

後蒸溜水を加えてlm1とした．これを用いて，ヒアル

ロニダーゼ消化実験，二次元電気泳動を行なった.

　Ill) DNAと蛋白の抽出および定量

　Ｉ）で記述した方法に従い作製した凍結乾燥皮膚組織

2mgをlm1め蒸溜水に懸濁しMODEL W-225R ソ

ニケーター(Heat system)を用いoutput 3，0°Ｃ，

5分間ソニケーショソを行なった．その後の抽出は培養

表皮細胞におけるFlaxmanらの方法17）に従った（図

3). DNAはBurtonの変法18）により，蛋白はLowry

の方法19）により，200－20形日立ダブルビーム分光光度

計で比色定量した.

　IV）ラット皮膚におけるＨＡ合成酵素活性測定の基

礎的検討

　1）ホモジェナイズしたのみの皮膚を酵素源とした系

ヒアルロン酸合成酵素

　ラット背部皮膚をエーテル麻酔下に剃毛後鋏で採取

し，脂肪織を除いた後0.4gを鋏で細切した後1mlの

O.IM Tris･HCl bｕ汀erPH 7.0 を加え, 4°Cに冷やしな

がら，さらに鋏で細切しホモジェナイズした．皮膚100

mg湿重量相当を用いてその後の反応，測定は標準法に

よった.

　2）皮膚組織を含まない系は標準法で行なった.

　3）皮膚組織を煮沸した系は，反応前に皮膚組織を３

分間沸騰水で熱した他は標準法で行なった.

　4）反応後上清のみを測定した系は標準法で反応さ

せた後，遠沈後上清のみ下降法ペーパークロマトグラ

フィーを行ない多糖体ポリマー合成活性を測定した.

　5）可溶性画分を用いた系

　Ｉ）に記述した方法に従い作製した凍結乾燥皮膚組織

lOOmgを10mlのO.IM Tris-HCl buffer PH 7.0 に懸濁

後，３回凍結融解を繰り返し, 10,000 xgの上清0.1ml

を酵素源として標準法で反応，測定した.

　6）ヒアルロニダーゼ消化実験

　11）で抽出した粗ＭＰＳ画分0.4mlを，羊単丸ヒア

ルロニダーゼ0.2mg (Miles laboratories,1240u/mg)

を含むO.IM Sodium Acetate bufferpH 5.5 計lm1中で

37°C,24時間消化した後，蒸溜水に対し24時間透析後凍

結乾燥した．得られた非ＨＡ画分の放射活性を下降法

ペーパークロマトグラフィーを行なわず，直ちに0.5ml

の蒸溜水と5m1のアクアゾール２を加え，液体シソチ

レーショソスペクトロメーターで測定した.

　7）二次元電気泳動2o）

　II）で抽出した粗ＭＰＳ画分を用い，セルローズア

セテート膜(SepraphoreⅢ10×10cm)にスポットし，

一次元の電極液にO.IMピリジソー0.47Mギ酸緩衝液

を用い１ｍＡ/ｃｍで泳動を１時間行ない，二次元の電極

液にはO.IM酢酸バリウム溶液を用いlmA/cmで泳動

を4.5時間行なった．染色液には0.1％アルシアソブルー

溶液を用いた．二次元泳動後，セルローズアセテート膜

上の放射活性を２ヵ月間のオートラジオグラフィーで確

認した.

　8) time course,皮膚組織重量との相関は標準法で行

なった.

　9）PH依存性はpH 5.0～7.0にO.IM phosphate

buffer,pH 7.0～9.0にO.IM Tris-HCl bufferを使用し

標準法で検討した.

　10）基質との相関

　UDP-GlcNAc-''C濃度との相関, UDP-GlcUA濃度と

1375

の相関は標準法で行なった.

　11) UDP-GlcUA-"CとUDP-GlcNAcとを基質とした

系は標準法に準じて，基質にUDP-GlcUA-^C (specific

activity, 321mCi/mmol) (The Radiochemical Centre

Amersham England)を14μM, UDP-GlcNAc (Sigma)

を740.7μＭ使用しUDP-GlcNAcを含まないものを

対照として検討した．

　Ｖ）加齢に伴うＨＡ合成酵素活性の変動

　分娩直前のラット胎児（雌雄区別なし）10匹および

1, 2, 3, 4, 6, 9, 13週齢の雌雄各５匹ずつ（た

だし１週齢雌のみ４匹）を用いた．標準法に従い，皮膚

組織各2mgで検討した．さらに分娩直前の胎児２匹，

1, 2, 3, 4, 6, 9, 13週齢雌雄各１匹ずっを用い

て，Ⅲ）の方法により皮膚組織のＤＮＡと蛋白を定量し

た．

　　　　　　　　　　　結　　果

　1）ホモジェナイズしたのみの皮膚を酵素源とした系

　多糖体ポリマー合成活性は認められなかった.

　2）皮膚組織を含まない系

　皮膚組織の有無による多糖体ポリマー合成活性の比較

を行なったところ表１，図４の結果が得られ，皮膚組織

を含む系のみ多糖体ポリマー合成活性が認められた.

　3）皮膚組織を煮沸した系

　表２に示す如く，反応前に皮膚組織を煮沸した系で

は，多糖体ポリマー合成活性は認められなかった.

　4）反応後上清のみを測定した系

　表３に示す如く，反応後の上清には多糖体ポリマーは

認められなかった.

　5）可溶性画分を用いた系

　可溶性画分を酵素源とした場合，多糖体ポリマー合成

活性は標準法で認められる活性の約60％であった（表

4）.

　6）ヒアルロニダーゼ消化実験

　生成された多糖体ポリマーの約70％が羊皐丸ヒアルロ

ニダーゼにより消化された（表5）.

　7）二次元電気泳動

　標準ＨＡの部にスポットがあり，同部位に放射活性

が認められた（図5）.

　8) time course

　反応時間３時間まで多糖体ポリマー合成活性はほぽ直

線的に増加した（図6）.

　9）皮膚組織重量との相関

　皮膚組織lOmgまで多糖体ポリマー合成活性はほぼ直

1376

人Ｉ　皮膚糾織の町無による多柏体ポリ一一

　合成活性．皮唐組織を含打系では，成熟ム

　ラヴト服の皮膚組繊2.6 mgを使川した.

　　incorporated UDP-GlcNAc-"'C

　　㎜㎜㎜■㎜㎜　　･㎜㎜■･･■㎜　　　　　　■㎜■

皮膚組織を含まない系　　0.052 pmol/hr

　　　　　_..＿　　_＿‥‥

１　９少ｻﾔ.言　　　〇.517 pmo】/mg/hr

図４　下降法ベーパークロマトグラフィーの原点に

　おける多新体ポリマー放射活性のオートラジオダ

　ラフィー，Ａは皮膚組織を含まない系，Ｂは皮膚

　組織を含む系である．矢印で原点のスポットを示

　した，

表２　反応前に皮膚組織を煮沸した系での多糖

　体ポリマー合成活性．成熟ラット維２匹を用

　い，皮膚組織を実験１では2 rag,実験２では

　５ｍｇ使用した.

　　incorporated UDP-GlcNAc-"C pmol/mg/hr一 一

煮沸しない系

－－

実験１

-一実験２

表３　反応停止後2,000ｘgの上清を下降法ペー

　パークロマトダラフィーにかけ，その原点にと

　どまる多糖体ポリー・－の放射活性を測定した，

　成熟ラット雄の皮膚組織２ｍｇを使用した.

　　　incorporatedUDP-GlcNAc-"C pmol/mg/hr｜-一一

反応後上清のみ　　　　　_＿

標　　準　　法

山本　康上

　　　　一

－

Ａ

　　0.031　　　　1

／oし‾］　　８

線的に増加した（図7）.

　10) pH依存性

　図８に示す如く，多糖体ポリマー合成活性はpH依

人J　ll｣'溶什1111jjlflj酵素沁として川いた系での

　多鮪休ボレ。一削むI健に　成熟ラヴト顛の皮

　心組織１ｍｇ川ヽIりい検体として川いた。対!|が

　とトCは抑や法で皮膚組繊２ｍｇを使用した.

　　ilKO叩O iat<ヽdUDP-GlcNAcソ4C pmol/rag/hr

III･溶什Illlj ',]-

標　　叩　　よ

{). k;;!

(しぷ;I

,j.ム3　1.:ｙ･11』、　ｙ一一'･■il'ifiリ日丿皿に.1ノjち糖

　休小りごてり心卜け．ノ丿岫;いり･川ろ.’川ト

mcorp‘)tai('(l UDl'-Cli･＼A(･-「'C I･ｍ･｣l/>ng/li｢

ヒｙル1'にニゲー･りi"i (L 旺

ヒアルロニダーゼ木消化 !11:!

　　　．　　　　　　　　；

抽出粗MPS i由にyのづい白卜石水軸川町に、標

準ＨΛかll、ﾄ'、ﾉIﾐ端に冰!li川だ．

Ａのオートラジオグラフィーをトレースいたも

の．

　　　　　　　　図　５

存性であり，至適PHはphosphate bufferで6.5, Tris-

HCl bufferで7.0であった．

pmol/mg

０　　no

(ｒ>

１　　０　　０

　ｏ。-ｏｖＮ＝io-ｄａｎ

lo

ト

ヒアルｐｙ酸合成酵素

pmol/mg/hr

O.i-＝Ｖ

0.3

5 0.2

{

oT1

図６　多糖体ポリマー合成活性のtime course.成熟

　ラット雄の皮膚組織５聡を使用した．

　　　　　　　1　2　　　5　　　　　　10 mg

図７　皮膚組織重量と多糖体ポリマー合成活性との

　相関．成熟ラット雌を用いた.

　　　　　　　　　　　　　l/pmol/mg/hr

５．０

1377

９．０

　図･8　PHによる多糖体ポりマー合成活性の変動.14

　　週齢ラｙト雌,の皮膚組織３ｍｇを使用した. PH

　　5.0～7.0はO.lM phosphate buffer,pH 7.0～9.0

　　はO.IM Tris-HCl bufferを使用した.

　11）基質との相関

　i ) UDP-GlcNAc-"C濃度との相関

　UDP-GlcNAc-"C濃度が増加するにつれ，多糖体ポリ

マー合成活性も増加し，みかけ上のＫｍ値は2.4×10-=

Mであった（図9）。

　") UDP-GlcUA濃度との相関

　UDP-GlcUA濃度が変化しても，多糖体ポリマー合

成活性は1 .3pmol/mg/hr 前後でほぼ一定であった（図

10).

　12) UDP-GlcUA-"Cと　UDP-GlcNAc　とを基質とし

た系

　UDP-GlcNAcの有無による多糖体ポリヴー合成活性

を比較検討したが，その活性に差は認められなかった

　-I/Km　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1/1O-°M

図9. UDP-GIcNAc-"C濃度と多糖体ポリマー合成活性との相関．

　７週令ラット雄の皮膚組紐２ｍｇを使用した. Lineweaver-Burkの

　プロットで示した．挿入図にUDP-GlcNAc->'C濃度(0,1,2,

　5, 10, 14, 20, 30, 40μＭ）に対する多糖体ポリマー合成活性を

　示した．標準法でのUDP-GlcNAc-"C濃度は14μＭである．

1378

pmol/mg/hr

ジ1･5

1

１

作

.ﾖ

山本　康生

ＵＤＰこGloUAμＭ

図１０　UDP-GlcUA濃度と多糖体ポリマー合成活性との相関．

　３週齢ラット雌の皮膚組織２ｍｇを使用した．標準法での

　UDP-GlcUA濃度は740.7,μＭである．

表６　UDP-GlcUA-"Cと　UDP-GlcNACを基

　質とした系での多糖体ポリマー合成活性．６

　週齢ラット雌の皮膚組織２ｍｇを使用した.

　　incorporated UDP-GlcUA-≫C pmol/mg/h「

UDP-GlcNAcを含む 0.485

UDP-GlcNAcを含まない 0.489

pmol/mg/hr

ｙ

万

白

paj-ＢＪｏｄＪｏｏｕi

　　　０　１　２　３　４　　６　　　り　　　　　16 w

図ｎ　加齢に伴う多糖体ポいマー合成活性（単位凍

　結乾燥重量あたり）の変動，分娩直前のラット胎

　児10匹（雌雄区別なし），他はラット雌雄各５匹

　　（ただし１週齢雌のみ４匹）の平均値士標準偏差

　で示した。皮膚組織２ｍｇを使用した。

　（表6）.

　13）加齢に伴うＨＡ合成酵素活性の変動

　凍結乾燥重量あたりでみると図11に示すとおりで，多

糖体ポリマー合成活性は分娩直前のラット胎児で最も高

0｡-３ＶＮ０１０-ｄａｎ　ｐａt＾-iｏｄＪＯｏm

DNA/hr

２　３　４

-

ＮＮＳ｀●ｙｆ゛がｓ

－かφ″二“４

Ｗ

図１２　ＤＮＡ単位重量あたりに換算した多糖体ポリ

　マー合成活性の加齢に伴う変動．分娩直前のラッ

　ト胎児は２匹（雌雄区別なし）の平均値，他は１

　匹の測定値で示した．皮膚組織２ｍｇを使用した．

pmol/mg

10

　　　　　　　　　０

　　　　　　　　　ＬＯ

０ｎ-３ＶＮ＝10－ｄＣｉｎ　ｐ３?≪Ｊｏｄｊｏｏｕ!

Protein/hr

０ ２　３　４

■^-―'〆〆゛

　図13　蛋白単位重量あたりに換算した多糖体ポリマ

　　ー合成活性の加齢に伴う変動．分娩直前のラット

　　胎児は２匹（雌雄区別なし）の平均値，他は１匹

　　の測定値で示した．皮膚組織２ｍｇを使用した．

く，１週齢で落ち込み，２週齢より漸減した. DNAあ

たりのそれ（図12）は２～４週齢で高値を示し以後漸減

した．蛋白あたりのそれ（図13）は, DNAあたりのモ

れとほぼ同様の傾向で，４週齢で最高となり６週齢以後

ヒアルロソ酸合成酵素

はほぼ一定となった．

　　　　　　　　　　　考　　按

　皮膚におけるＨＡ合成酵素活性を検討するにあたり，

ラット皮膚をそのままポモジェナイスしたものを酵素源

とした場合には, UDP-GlcNAc-"Cと　UDP-GlcUA　と

から多糖体ポリマーは生成されなかった．種々検討した

結果，皮膚を凍結細片として凍結乾燥したものを酵素

源とすることにより　UDP-GIcNAc-"C (またはUDP-

ＧｌｃＵＡ-14C）が多糖体･ポリマーに取り込まれることが

判ったので上述したような酵素化学的検討を行なった．

　その結果，1）酵素源としての皮膚組織を含まない系

および煮沸した皮膚組織を用いた系では，ペーパークロ

マトグラフィーのスポット原点に放射活性が認められ

ず，多糖体ポリマーの形成がない; 2) time course で

反応時間３時間まで直線的に多糖体ポリマーが増加す

る；3）皮膚組織重量との関係でlOmgまで多糖体ポリ

マーが直線的に増加する；4）多糖体ポリマー合成活性

はPH依存性である；5）基質としてのUDP-GlcNAc-

14Cの量の増加とともに多糖体ポリマー量は増加し，み

かけ上のＫｍ値は2.4xlO-=Mであることが判った．

このことより凍結乾燥皮膚組織を酵素源とすることに

よってUDP-GlcNAc-"Cは酵素的に多糖体ポリマーに

取り込まれると考えられた．

　生体の組織中のＨＡ合成酵素を測定するための試料

調製には微妙な問題がある. Schillerら9）はラット胎児

皮膚のcell-free extractを用いて, UDP-GlcNAc-=Hと

UDP-GlcUAを基質としてＨＡ合成活性を検討してい

る．その際ホモジェネートをそのまま用いた場合に活性

は最も高く，その20,000 xg上清では活性が認められ

ず，沈位ではホモジェネートの約27％の活性が認められ

ている．さらにSchiller'°）はラット胎児皮膚ホモジェ

ネートをあらかじめパパイソ処理するとＨＡ合成活性

が３倍になること,パパイソ処理後では105,000 xg上清

に，パパイソ未処理ホモジェネートの約36～40％の活性

が認められ，皮膚のＨＡ合成活性がパパイソ処理する

ことにより可溶画分にもでてくることをみたIshimoto

ら11）は，線維芽細胞では強くフィットしたPotter-

Elvehjem homoge�ｚｅｒによるホモジェネートがHA

合成活性を検討するのに最も適しているとし，かつ

10,000 xgで遠沈するとその活性はほとんど全部沈澄に

くることをみた. Tomidaら14）は，培養細胞ではガラス

ホモジェナイザーによるホモジェネートよりも凍結融解

を繰り返した試料の方がより高いＨＡ合成活性を示す

1379

ことをみている.

　Schillerらの報告9)10)以来皮膚のＨＡ合成酵素を直接

に測定した報告はたい．著者の検討では，皮膚におい

て凍結乾燥皮膚組織のみがUDP-GlcNAc-"C (または

UDP-GlcUA-"C)より多糖体ポリマーを形成した．ま

た，凍結乾燥皮膚組織をbuffer中'で３回凍結融解を繰

り返した後のlOjOOOxgの上清に凍結乾燥皮膚組織全体

の約60％の活性が認められた. Schiller'"はパパイソ処

理により，酵素の隠されていた部分が露出されるのであ

ろうと述べているが，凍結乾燥あるいは凍結融解により

同様の可能性が推定される．

　今回の実験において，生成された多糖体ポリマーは，

二次元電気泳動でＨＡの泳動部位にほぼ一致して放射

活性を示し，羊率丸ヒアルロニダーゼにより70％消化さ

れた．羊率丸ヒアルロニダーゼはＨＡ特異的ではない

が電気泳動の所見とあわせて，この多糖体ポリマーは

ＨＡを主とする物質と考えられる. Hopwoodらls)は

ラット線維肉腫組織のＨＡ合成を検討し，生じた多糖

体ポリマーの放射活性はストレプトコッカルヒアル1=zニ

ダーゼ(バリダーゼ使用)により約80％減少することを

みた．

　本実験ではUDP-GIcNAc-"Cに対する　coldの基質

であるUDP-GlcUAの濃度変化により多糖体ポリマー

形成の活性に差がなくUDP-GlcUAがなくてもほとん

ど変わらぬ多糖体ポリマー形成がみられた. Schillerら9)

の実験ではUDP-GlcUAがない時ＵＤＰ･GIcNAc-=Hよ

りのＨＡ合成は約1/3になっている．ラット線維肉

腫(ＨＯＰｗｏｏｄら15))，ストンプトコッカス(Stoolmiller

ら13))における報告ではUDP-GlcNAcとUDP-GIcUA

のいずれが欠けてもＨＡ合成活性は認められないとい

う．ＨＡはN-acetyl-D-glucosamine　とD-glucuronic

acidとのβ－グルコシド結合からなる多糖体ポリマーで

あるが，著者の実験では凍結乾燥皮膚組織を用いている

ため内因性のD-glucuronic acid が基質として用いられ

ている可能性と単にUDP-GlcNAc-"Cから内因性のHA

鎖へGlcNAc-"Cの取り込みが行なわれている可能性と

が考えられるOsterlinら12)は子牛水晶体hyalocyteで

は内因性のＨＡがUDP-GlcNAc-≫Cの受容体となると

している．以上の点に関しては，生成多糖体ポリマーの

同定を含めてさらに検討中である．しかし，上記のいず

れの可能性が正しくても，著者の実験系で反応が酵素的

に進行していることは間違いなく　ＨＡ合成酵素活性の

動態の一面を知ることはできると考える．

1380 山本　康生

　ＨＡ合成酵素の至適PHはphosphate buffer で7.0～

7.5 (ラット線維肉腫"'), 7.1 (ストレプトコッカス13))

と報告されている．著者の0.5間隔で行なった成績では

phosphate buffer で6.5, Tris-HCl buffer で7.0であり，

やや酸性よりであるがほぼ近似する値である．

　加齢に一伴う多糖体ポリマー合成活性の変動の検討に応

用してみた成績は図11～13に示すとおりであった．主と

して，凍結乾燥重量あたりで検討したが，酵素反応の場

が細胞内もしくは細胞表面であることを考えればDNA

あたりで検討するのが妥当かもしれないパ

合成酵素活性と加齢との関係についての報告はみられな

い．本実験での加齢に伴う多糖体ポリマー合成活性の成

績を生成されたＨＡを定量的に検討した成績l)-tiと比

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文

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11) Ishimoto, N., Temin, H.M. & Stroininger,

較するとほぼ一致した結果である．このことは皮膚の分

化とＭＰＳの役割との関連を考える上で興味深く，今後

さらに検討を加える予定である．

　稿を終えるにあたり御指導，御校閲を賜りました野原

望教授ならびに終始直訴御指導をいただきました荒田次

郎助教授（現高知医科大学皮膚科教授）に深甚なる謝意

を表します．

　本論文の要旨は第78回日本皮膚科学会総会において発

表した．

　本研究は文部省科学研究費補助金昭和52年度奨励研究

A (277327,山本康生），昭和52, 54年度一般研究Ｃ

　(257280, 457273,荒田次郎）の援助を受けたことを附

記し深謝いたします．

献

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