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MICROSCOPIA
Dr. José A. Gutiérrez Bustamante Area de Genética y Biología Molecular y Celular
Dpto. de Morfología HumanaFac. de Medicina UNT
GALILEO GALILEI
La “Accademia dei Linceii” publica un trabajo sobre la observación microscópica del aspecto de una abeja
MALPIGHI
En 1660 y 1665 Malpighi observa los capilares sanguíneos y Hooke publica su obra Micrographia
ANTONY VAN LEENWENHOEK
En el siglo XVII , utilizando microscopios simples de fabricación propia describió por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos
CARACTERÍSTICAS DEL MICROSCOPIO DE LEEUWENHOEK
Dos lupas
combinadas
260 aumentos,
Visualizó algunos
protozoos e infusorios
CALR ZEISS
Mejora la microscopía de inmersión
Sustituye el agua por aceite de cedro
Obtiene 2000 aumentos
FUNDAMENTO DE LA MICROSCOPÍA
Cuando el observador se acerca, el objeto se agranda
Si se aumenta el ángulo visual se ve con claridad
ESQUEMA DEL MICROSCOPIO
Un tubo cilíndrico aloja el sistema ópticoocular/objetivo. Una platina de original diseño permite observar las preparaciones, que son iluminadas por un espejo cóncavo que concentra la luz sobre el objeto a estudiar.
PODER DE RESOLUCIÓN
Distancia si dos puntos se distinguen
Mayor, cuando menor es la longitud de onda
Mayor, cuanto mas grande es la apertura numérica
Mayor, con aceite de cedro
PARTE MECÁNICA QUE SE PUEDE DESMONTAR
Estativo
Oculares
Objetivos
Condensador
Cabezal
Tornillos
de la
platina
SISTEMA DE AJUSTE (1)
Anillo de
ajuste de los
oculares
Tornillo que
permite
mover el
cabezal
Tornillos
reguladores
de la platina
Tornillos del
condensador
Palanca de
cierre del
diafragma
PARTE ÓPTICA
Sistema de iluminación: fuente de luz, condensador y diafragma
Lentes: objetivos y oculares
SISTEMA DE ILUMINACIÓN: FUENTE DE LUZ
Suele ser una lámpara halógena de intensidad graduable
Se enciende y apaga con un interruptor
En el exterior puede tener un filtro
Interruptor y
graduación de la luz
Lámpara
Filtro
CONDENSADOR Y DIAFRAGMA
• Condensador: concentra la luz de la lámpara en un punto de la preparación
• Diafragma o iris (está dentro del condensador):si se cierra mejora el contraste, pero empeora la resolución
LENTES: OBJETIVOS
Están colocados en el revolver
Tienen un sistema de amortiguación
Un anillo coloreado indica los aumentos
Son de 4, 10, 40 y 100 (inmersión) aumentos
ACEITE DE INMERSIÓN
De baja, media y alta viscosidad
Es imprescindible con el objetivo de inmersión (100x)
MANEJO DEL MICROSCOPIO
1. No poner la preparación al revés
2. Regular la luz a intensidad media
3. Ajustar condensador y diafragma al medio
4. Empezar por poco aumento
5. Mirando por fuera subir la platina
6. Enfocar y ajustar
7. Pasar al siguiente aumento y enfocar
8. Al acabar retirar la preparación
9. Apagar la luz
CONSERVACIÓN DEL MICROSCOPIO
Ponerle su funda al guardarlo
Limpieza de lentes con papel de gafas
El exceso de xilol al limpiar las lentes desgasta el cemento
Usar pincel y pera de aire
TIPOS DE MICROSCOPIOS
Tipos de
microscopios
Microscopio
óptico
Microscopio
electrónico
Microscopio
Óptico Simple
Microscopio
Óptico
Compuesto
M.O. Normal
Campo oscuro
Contraste de fases
Fluorescencia
Transmisión
Barrido
Digital
Efecto túnel o cuántico
Lupa
PODER DE OBSERVACIÓN DEL MICROSCOPIO
MICROSCOPÍA DE CONTRASTE DE FASES
Células epiteliales 20 x
VENTAJAS
Examina la estructura de los organelos
Observa el movimiento de los organelos, núcleo y mitocondrias
Observa células vivas en cultivo
DESVENTAJA
Observa células individuales
MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
Células epiteliales 200 x
Aplicaciones
Detecta proteínas específicas
Revela organelos dentro de la célula
Limitaciones
En cortes celulares finos
Utiliza fijadores que destruyen la antigenicidad de las proteínas
ERNST RUSKA
El microscopio electrónico de transmisión (T.E.M.) consiguió aumentos de 100.000 X. Fue desarrollado por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931
PRIMER MICROSCOPIO ELECTRONICO
Utilizó un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra.
Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido (SEM).
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO
Obtiene una imagen tridimensional
Tamaño pequeño y sencillo
Utiliza los e-dispersos a partir de la superficie de la muestra
M.E. DE TRANSMISIÓN
Bacilos en división
Similar al óptico pero de mayor tamaño
Complejo e invertido
Utiliza electrones que atravieza la muestra
Coloración: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teñido
por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es
lavado con el disolvente.
Ortocromáticas: los tejidos adquieren un color igual al colorante .
Metacromáticas: componente celular se tiñe con un color
diferente.
Métodos de coloración:
-Coloración directa: existe afinidad entre el colorante y el objeto.
- Coloración indirecta: requiere la intervención de mordientes.
- Coloración progresiva: se hace actuar el colorante hasta su
punto óptimo.
- Coloración regresiva: se realiza primero una sobrecoloración y
luego se elimina el resto del colorante por medio de
diferenciadores.
- Coloración simple: se colorean algunos elementos del preparado.
- Coloración combinada: colorea los elementos nucleares y
citoplasmáticos .
- Coloración panóptica: coloración combinada realizada
sucesivamente por colorantes neutros (May-Grünwald-Giemsa).
- Coloración pancrómica: en un solo baño colorante actúan todos
los colorantes neutros que se necesiten.
Clasificación de los colorantes:
Según su origen :
COLORANTES NATURALES:
- Animales carmín
- Vegetales hematoxilina, orceína, azafrán
COLORANTES ARTIFICIALES O SINTÉTICOS :
- Ácidos: eosina o eosinato de sodio. Son colorantes
citoplasmáticos.
- Básicos: azul de metileno. Son colorantes nucleares.
- Neutros: Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de
otro.
- Indiferentes: Sudán lll, rojo escarlata.
Colorantes: reciben esta denominación las
sustancias que pueden conferir color a
otros cuerpos.
FIJACION
La fijación tiene por objeto
matar las células y
conservarlas, en el estado
en que se encontraban
durante la vida.
Es un método histológico
destinado a obtener
preparados duraderos que
conservan la estructura
morfológica y química de
las células y tejidos al
estado vivo
1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células.
2. Poseer alto poder de penetración.
3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que
presentaban in vivo.
4. Permitir el empleo de los procedimientos necesarios
para su observación posterior .
5. Impedir la desaparición de los
6. elementos solubles durante la fijación o después de
ella.
7. No provocar la producción de estructuras artificiales.
8. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos
quebradizos.
CUALIDADES DE UN FIJADOR
TIPOS DE FIJADORES
Fijadores Químicos:
Fijadores simples: Constituido por una sola
sustancia quimica
FIJADORES SIMPLES:
a) Formol al 10%
b) Alcohol etílico absoluto o de 96%.
c) Alcohol metílico
d) Ácido ósmico al 1 ó 2%,
e) Bicromato de potasio al 3-5%.
Fijadores compuestos: Utiliza dos o mas fijadores
simples
a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética.
b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-
acética.
c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol.
d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética.
e) Liquido de Bouin alcohólico.
Fijadores Físicos:
1. Desecación.
2. Calor seco.
3. Calor húmedo.
4. Frío.