INTRODUCCIN
El presente trabajo de investigacin habla sobre fijadores,
detallo como se define, sus caractersticas, modo de accin, pero
principalmente cuales son los tipos de fijadores.
Partiremos por el concepto de fijacin, para continuar con los
tipos de fijadores como mencione anteriormente.
Para poder comprender se necesita saber a que llamamos fijacin,
pues es un proceso mediante el cual los elementos constitutivos de
las clulas, y por tanto de los tejidos, son fijados en su estado
fsico y parcialmente en su estado qumico, lo cual permite resistir
el tratamiento sucesivo con diversos reactivos sin que ocurra
prdida, distorsin o descomposicin significativas. Pues su objetivo
es detener el proceso autoltico de las clulas y conservarlas, en la
medida de lo posible, en el estado en que se encontraban durante la
vida. Por lo tanto, es un mtodo histolgico destinado a facilitar la
obtencin de preparaciones duraderas que conserven su estructura
morfolgica y qumica y que permita realizar posteriormente, los
procedimientos de coloracin, identificacin e interpretacin, que
contribuyen al conocimiento profundo de su morfologa, funcin y
alteraciones en los diversos procesos patolgicos.
A continuacin se pasa al marco teorico sobre los fijadores.
CAPITULO I: FIJACIN
1.1 FIJACIN
La fijacin tiene por objeto matar las clulas y conservarlas,
hasta donde sea posible, en el estado en que se encontraban durante
la vida. Por lo tanto es un mtodo histolgico destinado a obtener
preparados duraderos que conservan la estructura morfolgica y
qumica de las clulas y tejidos al estado vivo y que permite
realizar, posteriormente, los procedimientos de coloracin o de
identificacin que facilitan el completo conocimiento de su
constitucin ntima.
Una buena fijacin debe:- Inmovilizar la clula- Conservar
exactamente todas las partes constitutivas.- No hacer aparecer
artificialmente otros detalles en la estructura.
Los mejores fijadores son los que adems de actuar rpidamente
producen el menor numero posible de reacciones (modificaciones)
secundarias o artificios, capaces de darnos una idea muy falseada
de la morfologa interna de la clula.Un tejido bien fijado mostrar
clulas plenas, no vacuolizadas, ni hinchadas, ni arrugadas, sino
presentando muchos detalles de estructura fina.
1.1.1. En qu consiste esencialmente la fijacin?Es verdad que la
masa celular, formada de albuminoides, no puede ser conservada
exactamente, sino es por un proceso que la solidifique. Esta
solidificacin se obtiene por coagulacin o precipitacin.La
coagulacin es producida por agentes fsicos, la precipitacin,
siempre acompaada de modificaciones qumicas, es producida por
agentes qumicos.El verdadero papel de la fijacin es el de producir
una coagulacin o una precipitacin lo mscompleta posible de todos
los albuminoides celulares, conservando la configuracin
correspondiente a su naturaleza amorfa (citoplasma), granulosa
(grnulos de secrecin), filamentosa (condrioma), etc.
1.1.2. Conservacin morfolgica de los TejidosDebe endurecerlos
suficientemente para permitirles resistir sin deformarse, todas las
manipulaciones subsiguientes (deshidratacin, inclusin, cortes,
etc.).La fijacin debe producir al mismo tiempo la insolubilizacin
de los elementos constitutivos de la clula y de los tejidos. Es
pues necesario que los detalles de estructura, conservados por el
fijador no sean destruidos enseguida por la accin de los lquidos de
lavado o de las soluciones colorantes.Esta insolubilizacin puede
ser producida por la deshidratacin, coagulacin y principalmente por
la combinacin qumica del reactivo fijador con los albuminoides
celulares.
1.1.3. Preparacin para la coloracinCiertas combinaciones
formadas entre fijadores y tejidos tienen la propiedad de
combinarse con ciertas materias colorantes, estas as pueden
mordentar los tejidos y permitir coloraciones especficas.
1.1.4. Funcin del equilibrio fsico:Cuando hablamos de fijacin
debemos tener en cuenta las reglas del equilibrio fsico que se
relacionan con las membranas permeables. Desde el punto de vista
fsico, la fijacin es la penetracin de un producto extrao a travs de
una membrana permeable, es ante todo un fenmeno de smosis.La
rapidez de la difusin est en razn directa con la concentracin de la
sustancia que se difunde, conviene regular esta concentracin de
manera que la clula pueda conservar lo ms intacta posible su forma,
volumen y contenido, asegurando una penetracin rpida y completa.La
rapidez de la penetracin est en funcin directa a la concentracin y
en funcin inversa del peso molecular de las sales; esta es mayor
para los cuerpos minerales que para los cuerpos orgnicos.
Cuando una pieza es sumergida en un fijador, pueden suceder tres
cosas: La pieza cae al fondo, en este caso el fijador es hipotnico,
y la fijacin tiene bastantes probabilidades de ser incompleta e
irregular. La pieza permanece flotando en la superficie, el fijador
es hipertnico, muy denso y las clulas se contraern. La pieza se
sumerge, pero queda por encima del fondo del recipiente, hay
equilibrio fsico y la fijacin ser buena si los ingredientes del
fijador fueron bien elegidos.
1.1.5. Distintas fijaciones qumicas Fijacin por inmersin: este
mtodo consiste en tomar o extraer una muestra del tejido u rgano
que se vaya procesar y sumergirlo en una solucin fijadora.
Normalmente se introduce la pieza de tejido en un frasco que
contiene la cantidad adecuada de fijador. Fijacin por perfusin:
este mtodo consiste en realizar una perfusin de la solucin fijadora
utilizando el torrente vascular. Es el mtodo empleado normalmente
con animales de experimentacin.
1.1.6. Formas en la que se produce la fijacin Los fijadores se
pueden clasificar segn su mecanismo de accin en dos tipos:
Fijadores por mtodos fijos y Fijadores por mtodos qumicos.En el
primer caso se emplea el enfriamiento por congelacin. En el
segundo, los fijadores son generalmente lquidos y actan
desnaturalizando las protenas tisulares.Algunos fijadores aumentan
la afinidad del protoplasma por ciertos colorantes como el alumbre,
fenol y sales del cromo. Los fijadores aumentan por lo general la
diferenciacin ptica de las estructuras celulares y tisulares, al
mismo tiempo hacen que las clulas resistan la solucin hipo e
hipertnicas que son empleadas despus de los fijadores; reducen
tambin el riesgo de infeccin en las personas que manejan los
tejidos. Es preciso tener en cuenta que no hay un fijador ideal, y
la eleccin depende del tipo de clulas o tejido por estudiar.
1.1.7. Formas en la que se produce la fijacin De acuerdo a los
efectos que se desencadenan en el tejido, la fijacin se produce por
deshidrat acin, reticulizacin, formacin de sales o por cambio de
estado coloidal
a) Fijacin por Deshidratacin
Los reactivosfijadoresque se describen a continuacin, presentan
gran compatibilidad qumica con las molculas de agua, va puentes
hidrgeno. Los lpidos se disuelven rpidamente, a excepcin de los
fosfolpidos; mientras que los carbohidratos permanecen conservados
dependiendo de la precipitacin proteica. Los cidos nucleicos se
fijan correctamente.
Etanol Metanol Acetona
b) Fijacin por ReticulizacinLa accin de estosfijadoresaditivos
produce la liberacin de molculas de agua a partir las protenas que
constituyen los tejidos, originando grupos qumicos de carga
catinica y aninica en los aminocidos laterales para establecer, de
manera anrquica, estructuras fibrilares que promueven la formacin
de compuestos reticulados en estado de gel.
Formaldehdo Glioxal y Glutaraldehdo Tetrxido de osmio
c) Fijacin por formacin de SalesLas sustancias que fijan por
formacin de sales son aditivas y de penetracin lenta. El fenmeno de
fijacin se produce por el establecimiento del anin o catin salino
en lugares especficos de las molculas del tejido, a travs de
uniones inicas. Estas uniones entre sitios proteicos o lipdicos y
los iones metlicos producen liberacin de molculas de agua a partir
del tejido, el cual tiende a endurecerse y, por ello, se deben
utilizar mezclados con otras sustancias fijadoras.
Bicloruro de mercurio Dicromato de potasio Acido crmico Acido
pcrico Sulfato de zinc.
d) Fijacin por Cambio de Estado Coloidal
Todos los reactivos citados anteriormente provocan prdida de
agua a partir del tejido. Por tanto, mientras se produce la fijacin
de las estructuras tisulares, el agua tiende a salir del tejido
haciendo que los componentes moleculares pasen del estado de sol al
estado de gel. El cambio de estado coloidal hace referencia, ms
bien, al reestablecimiento del contenido de agua en el tejido,
asegurando imgenes microscpicas ms reales.
Acido actico
CAPITULO II: FIJADORES
1. FIJADOR
1.1.1 CONCEPTO
Es el proceso Fsico (Histoqumico) que logra una situacin estable
de los constituyentes tisulares, interrumpiendo las reacciones
enzimticas de autolisis.
Es el producto qumico ya diluido en agua que se usa para
eliminar las sales de plata, no reveladas, que son todava sensibles
a la luz.
1.1.2 CUALIDADES
Dentro de las cualidades de un buen fijador, tenemos:
1. Actuar con rapidez, fijando a las clulas antes de que se
inicien los fenmenos pre-mortem y post-mortem (autlisis,
fragmentacin, desintegracin, etc.).2. Poseer alto poder de
penetracin para asegurar la fijacin correcta hasta las porciones
profundas del espcimen, en funcin de sus dimensiones.3. Conservar,
en la medida de lo posible, los detalles estructurales en un patrn
morfolgico similar al que presentaban in vivo.4. Permitir o
favorecer la aplicacin de los procedimientos requeridos para su
observacin: procesamiento, inclusin en parafina, corte, tincin y
observacin, as como la realizacin de tcnicas histolgicas,
histoqumicas o inmuno-histoqumicas especficas. 5. Evitar la
desaparicin de los elementos solubles durante la fijacin o despus
de ella.6. Impedir la generacin de estructuras artificiales
(artificios y artefactos).7. No generar retraccin excesiva de los
tejidos ni volverlos friables o quebradizos.8. Ser econmico,
estable, con baja toxicidad y de fcil manejo..
1.1.3 MANERA DE ACTUAR DE LOS FIJADORESDe acuerdo a su
composicin o naturaleza: estabilizan las protenas sin combinarse
con ellas (alcohol, cido pcrico, yodo, calor), formando enlaces
qumicos con las molculas orgnicas (cido crmico y sus sales), o
reducindose en contacto con las mismas, lo que origina un
precipitado sumamente fino (cido smico, bicloruro de mercurio,
cloruro de oro).La mayora de los fijadores producen cierto
endurecimiento tisular, lo cual facilita el corte, sin embargo,
este efecto es complementado por el uso de alcoholes en
concentraciones progresivamente crecientes, que son empleados en el
proceso de la deshidratacin.La mayor parte de los fijadores actan
como oxidantes, favoreciendo as la coloracin y tincin de los
tejidos, adems de incrementar la diferenciacin ptica de las
estructuras celulares y tisulares. Asimismo, favorecen la
resistencia celular a las soluciones hipo e hipertnicas que son
empleadas despus de la fijacin, lo cual reduce el riesgo de
infeccin en las personas que manejan los especmenes.
1.1.4 MECANISMO DE ACCIN DE LOS FIJADORES Por coagulacin de las
protenas, sin combinarse con ellas: alcohol, formol, cido Pcrico,
etc. Formando combinaciones qumicas con las sustancias orgnicas:
cido crmico, bicromato de potasio, de amoniaco, etc. Por reduccin,
al contacto con las sustancias orgnicas formando un precipitado
fino: cido smico, bicloruro de mercurio. Por oxidacin: bicromato de
potasio.
1.1.5 CLASIFICACIN DE FIJADORES
Son los ms utilizados; pueden ser fijadores simples,
constituidos por una sola sustancia qumica, y fijadores compuestos
o mezclas fijadoras cuando varias sustancias intervienen en su
constitucin .
1.1.5.1 FIJADORES QUMICOS: Los mtodos qumicos de fijacin ofrecen
los mejores resultados. Estos mtodos utilizan lquidos que difunden
hacia la profundidad de la muestra para alcanzar y desnaturalizar
las enzimas que provocan la autlisis tisular.
Losreactivosutilizados tienen capacidad de interactuar con los
componentes del tejido, tales como protenas, glicoprotenas,
proteoglicanos, lpidos, glicolpidos, lipoprotenas, pigmentos, cidos
pcticos y nucleicos; como as tambin, la capacidad de preservar la
composicin y localizacin de carbohidratos: celulosa y almidn en
vegetales, quitina en insectos o glucgeno en tejidos animales y
depsitos metlicos (Fe+2, Cu+2, Al+3, Cd+2, Pb+2, As-3, Cr+2). La
fijacin qumica involucra el uso de soluciones orgnicas e inorgnicas
que permiten la adecuada preservacin de la morfologa tisular
ypropiedades tintorialesde las macromoleculas del tejido.
1. CARACTERSTICAS FUNDAMENTALES DE UN LQUIDO FIJADOR:
Losfijadorespor mtodos qumicos son normalmente qumicos y deben
poseer unas caractersticas que son las siguientes: Deben tener la
capacidad de bloquear de inmediato la autolisis, paralizando la
actividad enzimtica del tejido. Poseer un efecto microbicida, que
impide la accin bacteriana responsable de la putrefaccin. Son capaz
de no provocar sobre el tejido retracciones o distorsiones que
generen anomalas en su estructura. Sea capaz de inducir cambios en
la textura y composicin tisular que favorezcan la inclusin, el
corte y la coloracin del material histolgico (favorecer la
coloracin posterior es decir tienen carcter mordiente)De todas
estas caractersticas la ms importante es la capacidad de bloquear
la autolisis de inmediato y se va a relacionar con dos cualidades
del agente fijador: Velocidad de penetracin: y se refiere a la
rapidez con lo que un fijador se difunde en el interior de un
tejido de manera que el tamao de una pieza que se pretende fijar ha
de ser proporcional a la velocidad de penetracin del agente fijador
que se va a utilizar. La velocidad de fijacin: se refiere al tiempo
que cada fijador tarda en estabilizar los componentes qumicos de
los tejidos. La velocidad de fijacin de un agente qumico no siempre
es proporcional a su velocidad de penetracin.
2. REGLAS GENERALES EN EL EMPLEO DEL LIQUIDO FIJADOR: Para
evitar la autolisis, las piezas deben tallarse lo antes posible y
no deben ser muy gruesas ya que en este caso el fijador tardara
mucho en penetrar en el centro de la pieza por lo que es preferible
que al tallarlo se hagan cortes con un grosor mximo de 5 mm.
0.5cm.Si se va a fijar un rgano en bloque para preservar la
arquitectura del rgano se deben realizar incisiones, cortes, sobre
su superficie y apertura de sus cavidades internas con el fin de
que el lquido fijador alcance lo ms rpidamente posible el interior
del tejido. Para conseguir una buena fijacin de rganos huecos stos
deben ser rellenados con lquido fijador y atados en sus extremos.
El volumen del fijador respecto al de la pieza, es un punto muy
importante para la fijacin, lo ideal es 1-20 como mnimo. En la
fijacin con lquido que pierden eficacia al utilizarlos hay que ser
mucho ms cuidadoso. Este es le caso del Formol que debe ser
renovado cada cierto tiempo en una misma fijacin, ya que pierde
eficacia tambin hay que ser precavidos en el resto de
losfijadoresporque generalmente todos losfijadorescon voltiles, por
lo que nunca ser empleado el mismo fijador mas de una vez. Para
lograr una fijacin correcta el liquido tendr que estar en contacto
con todas las paredes del tejido, es por eso que no es conveniente
meter en un mismo frasco varias piezas porque podran pagarse unas a
otras y evitar la penetracin del fijador. Los tejidos que flotan
como por ejemplo grasa o tejido pulmonar no deben quedarse en la
superficie por lo que deben envolverse en papel de filtro o gasa
pesen vallan hacia el fondo y as estn rodeados del fijador. Cada
fijador tiene un tiempo de fijacin que va a depender de su
capacidad de penetracin y del tipo de tejido. Si este tiempo de
fijacin se prolonga se produce en endurecimientos en distintas
estructuras del tejido. Solo se permitir la permanencia de un
tejido: en un fijador, si adems al tener esta propiedad es un
liquido conservante porque sino se corre el peligro de que
bacterias aerobias descompongan el tejido. Durante la fijacin se
producen accidentes que modifican el estado de la pieza, los ms
importantes son la Hinchazn y la retraccin de los tejidos as como
la alteracin en el color. Si por ejemplo: el acido actico produce
hinchazn debido a que deshace los enlaces formando molculas de agua
que son absorbidas por la pieza. Otros como el acido crmico,
alcohol y acetona, realizan el efecto contrario porque el fijador
absorbe el agua del tejido por eso es importante que la presin
osmtica del liquido fijador sea equivalente a la del tejido y que
la de su pH se aproxime al pH fisiolgico salvo que nos interese que
su composicin sea acida. Este ltimo caso nos interesa para
descalcificar.
3. CLASIFICACIN
Son los ms empleados y pueden ser:
a) SIMPLES: CONSTITUIDO POR UNA SOLA SUSTANCIA:
Aldehdo glutrico o glutaraldehido Son dialdehdos que actan sobre
las protenas, asegurando su mxima preservacin qumica y espacial.
Sus potenciales de oxidacin estn prximos al formol. Son compuestos
miscibles en agua y el poder de penetracin es mayor, a pesar que
los pesos moleculares de estos son mayores que el correspondiente
al formol. Generalmente, se preparan en soluciones diluidas a pH
fisiolgicos. Fija correctamente protenas y estructuras celula res y
de matriz asociadas a ellas, tales como ADN y membranas. En el caso
del glutaraldehdo se empl ea, ms bien, en microscopa electrnica
diluido en buffer de cacodilato de sodio. El glioxal al 5% en
buffer de fosfatos a pH 7,4 tiene aplicacin reciente en microtcnica
de rutina.Glutaraldehdo.
Alcohol etlico absoluto al 96%, se us a generalmente en
microqumicaTambin llamado alcohol etlico (C2H5OH) es un fijador
coagulante, no aditivo y de bajo potencial de ionizacin (0.45
volt.), suele emplearse solo. Penetra lentamente el tejido
produciendo contraccin de la muestra y endurecindola. Es miscible
en agua en todas sus proporciones y compatible con todos
aquellosfijadoresque no tienen actividad oxidante fuerte. No
produce efectos de sobrecoloracin. Provoca la precipitacin de las
protenas por extraccin de la capa de agua que las solvata pero sin
desnaturalizarlas.La accin ms potente corresponde a las soluciones
ms concentradas (96 100). Para fijar fragmentos de 5 mm de espesor
es suficiente con 6 horas de accin. Si el tamao de la muestra es
mayor se corre el riesgo de que las capas superficiales se
endurezcan demasiado y ste no pueda penetrar an ms como para
alcanzar las capas ms profundas. Las soluciones etanlicas menos
concentradas tienen un efecto macerador de la muestra (70), por
tanto, no se utilizan como fijador. Precipita por coagulacin la
totalidad del citoplasma, las mitocondrias se distorsionan, los
glbulos lipdicos difunden o disuelven y provoca ligera contraccin
nucleolar.
Alcohol metlico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis
desecados (sangre, mdula sea, ganglio, bazo, lquidos de puncin,
etc.).Conocido como alcohol metlico (CH3OH) o metanol, es un fijad
or no aditivo que, generalmente, se utiliza solo y cuyo potencial
de oxidacin es inferior al del etanol. Esto hace que tenga mayor
poder reductor y, por tanto, se lo recomiende para la fijacin de
cido s nucleicos y en la impregnacin argntica de regiones
organizadoras del nucleolo. Es un excelente fijador para citologa
exfoliativa general. Al igual que el etanol es miscible en agua y
forma puentes hidrgeno con las molculas de agua del tejido, las que
extrae con rapidez coagulando protenas. Es muy adecuado para la
realizacin de mtodos enzimo e inmunohistoqumicos e hibridacin in
situ.
cido smico al 1 2%, es poco penetrante pero enrgico, conserva
muy bien estructuras celulares.
Acetona: es un agente no aditivo y muy oxidante (0.65 volt.),
debido a que el tomo de oxgeno puede compartir coordinadamente un
par de electrones. Su frmula es CH3COCH3 y deshidrata
violentamente. Es miscible en agua e incompatible
confijadoresmetlicos bivalentes. Generalmente se la emplea sola. Es
recomendada para cidos nu cleicos y en protocolos de
inmunofluorescencia directa para la deteccin de complejos
autoinmunes (biopsia renal, heptica, piel o mucosa). Tambin se la
puede emplear en determinados estudios con microscopio electrnico
de transmisin.Al igual que los anteriores, disuelve los lpidos y
los carbohidratos quedan conservados debido a la correcta
precipitacin de las protenas. Sin embargo, la rpida extraccin del
agua desde el tejido provoca una contraccin nuclear, que deja un
halo perinuclear, especialmente, en los epitelios.
Otros fijadores qumicos destacamos:
- cido actico:Incoloro, cristalizable por debajo de 17 C.
Aumenta el contraste entre ncleo y citoplasma. Retrae los tejidos,
Forma parte de la mayora de las mezclas fijadoras como fijador de
la cromatina.
cido actico: CH3COOH
Rara vez se lo utiliza solo, ya que se obtienen resultados
inadecuados. Por el contrario, este reactivo tiene excelentes
ventajas cuando es adicionado a otroslquidos fijadores, situacin
que se realiza frecuentemente. Su frmula es CH3-COOH y la
concentracin ptima es al 5%. Tiene un potencial de oxidacin
moderado (0,77 volt.); por lo tanto es un oxidante que se reduce a
acetaldehdo durante la fijacin. El pH es 2,32 y su constante de
disociacin (1,80 x 10-5), lo cual indica que tanto el cido
disociado como el no disociado se unen a nivel de los grupos aminos
y carboxilos vecinos de los aminocidos laterales de las protenas.
El grupo hidroflico resultante atrae molculas de agua provocando un
balance hdrico positivo que contrarresta la actividad deshidratante
de los demsfijadores. Durante la solvatacin del anin actico se
originan iones hidronio (H3O+) que tiene un efecto preservador de
las estructuras hsticas por inhibicin de la actividad enzimtica
proteoltica local. Produce separacin de agregados celulares. El
citoplasma se fija homogneamente, el ncleo se retrae ligeramente,
mientras que el ADN se preserva correctamente. Los grnulos
neutrfilos de los polimorfonucleares tienden a disolverse. Ciertos
lpidos son miscibles (colesterol, esfingomielinas y ricinolenas).
Sin embargo, si se lo utiliza a la concentracin indicada, no los
afecta demasiado. Los fosfolpidos forman soluciones coloidales. Los
hidratos de carbono no se fijan pero tampoco son disueltos. Las
mitocondrias se vuelven ligeramente granulares
- cido smico:Se presenta bajo la forma de cristales
amarillentos. Se obtiene comercialmente en pequeos tubitos de
vidrio sellados, contienen cantidades que varan de 0.1 a 1 g.El
manejo de este cuerpo presenta dificultades, es muy voltil y emite
sin cesar vapores extrema damente irritantes.Es un enrgico oxidante
por lo cual es reducido rpidamente por trazas de materia orgnica,
por lo que se debe tener especial precaucin para preparar las
soluciones. El ttulo habitual es de 1 a 2 %, puede prepararse en
agua destilada o en cido crmico.Desde el punto de vista morfolgico,
fija sin precipitar, impidiendo adems la precipitacin por el
alcohol durante la deshidratacin. Mata rpidamente las clulas y fija
bien el citoplasma y el condrioma pero no muy bien el ncleo. El
osmio es un buen fijador de sustancias grasas y de la mielina. Es
poco difusible y por consiguiente poco penetrante de manera que las
capas superficiales de las piezas estn superfijadas mucho antes que
el reactivo haya llegado al interior.
- cido pcrico:Pequeos cristales amarillentos que se emplean en
soluciones acuosas saturadas o en soluciones alcohlicas. Solubles
en fro en agua, mayor solubilidad con temperatura.Es un reactivo
muy penetrante que no se lo emplea solo, sino formando parte de
mezclas, como en el lquido de Bouin. El cido pcrico es un excelente
fijador, sobre todo desde el punto de vista tintorial. Se fija con
intensidad sobre los citoplasmas, facilita todas las coloraciones.
Contrae pero endurece poco.
cido pcrico: C6H2OH(NO2)3
- Bicloruro de Mercurio:Muy toxico, conformado por pequeos
cristales blancos muy venenosos, solubles en agua, en fro (7%) en
ebullicin (54%), muy soluble en alcohol (32%). En solucin acuosa
precipita enrgicamente los albuminoides, principalmente los del
ncleo. Estas propiedades se exaltan por la adicin de cido actico,
que vuelve ms penetrante el fijador. Una vez terminada la fijacin
es necesario eliminarlo de los tejidos para evitar la formacin de
cristales.Frmula qumica es Cl2Hg y se lo emplea, generalmente, en
solucin acuosa al 5%. Esta solucin tiene un pH aproximado a 3.0 y
su potencial de oxidacin es 0,75 volt. El Hg es un metal bivalente
que se adiciona a sitios insaturados de lpidos y a puentes
disulfuros en protenas con gran especificidad, provocando la
preservacin de estos componentes tisulares. Sin embargo, el
precipitado excesivo de este metal se observa en la preparacin
histolgica final como partculas negras y amorfas que se deben
redisolver en el corte de tejido antes de la coloracin, utilizando
una solucin dbil de Lugol y luego otra de tiosulfato de sodio
(S2O3Na2) para eliminar el iodo (se puede reemplazar por
hiposulfito de sodio: S2O4Na2). En el siguiente esquema se
representan 2 grupos laterales de Cistena unidos a un tomo de
Mercurio (Hg). Coagula fuertemente las protenas que contienen
principalmente metionina o cistena. Sin embargo, sobre el lado cido
del punto isoelctrico de la mayor parte de las protenas biol gicas
se une a los grupos aminos (-NH2) y, por el lado bsico, se liga a
los grupos carboxilos (-COOH). Precipita los cidos nucleicos. Los
triglicridos se fijan correctamente pero se colorean menos con
colorantes Sudn; los cidos grasos (palmtico y esterico) se
hidrolizan con facilidad a compuestos plasmales que se colorean
inespecficamente con el reactivo de Schiff (reaccin plasmal).
Provocan buena fijacin de citoplasmas y los componentes nucleares
adoptan una malla poco uniforme. Las inclusiones citoplasmticas no
presentan distorsin, aunque sufren difusin hacia la membrana
plasmtica.
- Bicromatos:Los bicromatos alcalinos, (Potasio, sodio,
Magnesio, Estroncio, Zinc) fijan bien los citoplasmas pero
destruyen los ncleos. Los bicromatos de Bario, Calcio, Cobre, fijan
bien las mitosis pero no los citoplasmas. El ms empleado de los
bicromatos es el de Potasio, gruesos cristales de color rojo
anaranjado, fcilmente solubles en agua (12.4%).
- Formaldehdo:Este cuerpo es un gas cuya solucin acuosa llev a
el nombre de formalina o de formol. Toda vez que hablemos de formol
puro tendremos en vista la solucin comercial al 40%. El formol es
el fijador ms utilizado, a causa de su bajo precio y la facilidad
de su empleo. Es un fijador importante a causa de su poder
coagulante y su notable capacidad de penetracin.El formol comercial
es un lquido incoloro, que emite vapores irritantes. A veces los
vapores del formol pueden producir accidentes febriles, bronquitis,
queratitis.Resulta muy desagradable manejar piezas embebidas en
formol a causa de las violentas punzadas que no se tarda en sentir
en los ojos, la accin sobre la mucosa olfatoria, es tal vez menos
sensible, pero ms durable y la olfacin puede terminar por quedar
notablemente disminuda.Conviene no poner los dedos en contacto con
las soluciones que contienen formol porque la epidermis se fija
rpidamente y endurece de manera poco agradable, adems de poder
ocasionar dermatitis alrgicas por contacto.Para manejar piezas que
han permanecido en formol sin sufrir los inconvenientes
mencionados, se las lava con agua y luego se las introduce en agua
ligeramente amoniacal, as se suprime todo olor.El formol de
comercio casi siempre contiene una cantidad ms o menos considerable
de cido frmico. Esta impureza daa muchas veces la fijacin, produce
precipitacin en los tejidos, destruye las clulas mucosas y daa
seriamente los citoplasmas por lo que es necesario emplear siempre
formol neutro.Es conveniente adoptar una convencin para formular el
ttulo de las diluciones:El porcentaje mirar siempre la soluci n
comercial de 40%, para preparar una solucin al 5% se mezcla 5 cc.
de formol con 95 cc. de agua. La solucin comercial presenta a veces
una alteracin particular que se manifiesta por un aspecto lechoso y
por la formacin deprecipitado blando ms o menos abundante, el fro
interviene mucho en este fenmeno.
Formol Al 10 % En Solucion SalinaFormaldehdo al 40 %
........................................................... 100
ml.Cloruro de
sodio......................................................................
9 gr.Agua
destilada.....................................................................900
ml.El llamado formol puro comercial, es gas formaldehdo al 40 % en
agua. Algunas de las alteraciones que produce, pueden amortiguarse
diluyndolo en suero fisiolgico en vez de agua, y entonces lo
llamamos formol salino. Para esto tambin puede utilizarse buffer
fosfato.
Ventajas: Es el fijador mas barato que existe por lo tanto es de
eleccin para los trabajos de rutina en Anatoma patolgica. Es un
buen fijador nico que determina una moderado conversacin de la
estructura tisular. Por ser buen desinfectante y no endurecer
excesivamente los tejidos, es un medio ptimo para conversar y
almacenar biopsias y piezas quirrgicas. Provoca escasa retraccin
tisular Posee una velocidad de penetracin intermedia entre la de
los alcoholes y la del sublimado Tiene aproximadamente una
velocidad de un milmetro por hora apenas altera la coloracin
tisular, por eso es el agente de eleccin para fijar grandes piezas
quirrgicas. Es excelente fijador para el tejido adiposo y para
lpidos en general y se emplea como agente de eleccin para fijar el
tejido nervioso y en general antes de cualquier impregnacin
argntica.
Formaldehdo: CH2=O.
ParaformaldehidoParaformaldehdo...................................................................
4
gr.PBS..................................................................................
100 ml.Para que se disuelva hay que ponerlo a bao mara a 60C en
agitadormagntico con calor. En lugar de PBS puede usarse Buffer
fosfato.
Soluciones fijadoras simples que contienen formol:hay 4
tipos:Formol salino:Se utiliza para prevenir el efecto osmtico que
provoca el empleo de disoluciones de formaldehdo en agua destilada
y se prepara disolviendo 9 gramos de cloruro sdico en 1000
mililitros de formalina al 10%.Formalina neutra:Se prepara aadiendo
a la solucin de formalina al 10% una pequea cantidad de carbonato
clcico insoluble que queda depositado en el fondo del recipiente
neutraliza esta sal el exceso de acido frmico que se produce y
aunque puede utilizarse todava para la formacin de tejidos en la
prctica ha sido desplazada por las soluciones tamponadas.Formol
tamponado:Es la solucin mas empleada hoy en da para prevenir el
choque osmtico que provoca la disolucin de formalina en agua
destilada y el depsito de pigmento formlico que ocurre a un pH
inferior a 6. Se preparada la siguiente manera, como amortiguador
se emplea el tampn fosfato calibrado con pH de 7.0 a 7.2 de la
siguiente frmula:1. FORMALINA PURA..100.0 ml.1. FOSFATO SDICO
MONOBSICO.4.0 gr.1. FOSFATO SDICO DIBSICO (ANHIDRO**)...6.5 gr.1.
AGUA DESTILADA....900.0 gr.
Se emplea fundamentalmente para fijar tejidos nerviosos en la
preparacin de algunas tcnicas de impregnacin argntica. Y se prepara
aadiendo una parte de cido actico glacial a 9 partes de formalina
al 10% con ello se consigue un pH en torno a 2.* 4gr: no tiene
agua, cogemos 3.5gramos si no pone nada en el bote cogemos 4
gramos.** Anhidro: hay que hidratarlo despus.
Tetrxido de osmio: sustancia txica, cuya frmula qumica es: O4Os,
se ioniza con dificultad y la solucin al 2% tiene un potencial de
oxidacin de 0,64 volt. Es un fijador aditivo que preserva,
preferentemente protenas y lpidos. En el primer caso, este xido se
une a los grupos aminos cercanos de la s protenas a modo de puente,
produciendo un reticulado estable de difcil disolucin. En el caso
de los lpidos se une en las dobles ligaduras, ta l como lo hacen
los metales bivalentes. Colorea de negro el cido oleico y las
olenas; mientras que el cido palmtico, esterico, sus steres y los
glicridos se tien de color marrn intenso (en realidad, estas
sustancias se encuentran mezcladas en el tejido, por tanto, se dice
que los lpidos se colorean de oscuro).
No presenta reaccin alguna con hexosas, pentosas o sus polmeros,
por tanto, no se emplea para fijar carbohidratos. Preserva muy bien
la estructura celular, a pesar de la prdida de homogeneidad
alrededor del ncleo, a menos que se realice una fijacin previa con
algn aldehdo, tal como se emplea en microscopa electrnica. Penetra
lentamente (K: 0,85 en 25 horas), o sea que a medida que el osmio
penetra su constante K se hace todava menor. La contraccin que se
produce es poco significativa, ms bien, ablanda el tejido a tal
punto que durante la obtencin de los cortes, el tejido se disgrega.
El tetrxido de osmio tiene 9 estados de oxidacin y, por los menos,
5 son reactivos con componentes celulares. El osmio es soluble en
medios polares y no polares, por tanto, puede fijar sitios polares
y apolares en lpidos y protenas, de acuerdo a lo mencionado con
anterioridad. El osmio al reaccionar con estos componentes es
reducido, originando un precipitado insoluble, difcil de extraer y
electrodenso, que lo hace muy adecuado para aumentar el contraste
de la ultraestructura del tejido.Tetrxido de osmio. OsO4.
Dicromato de potasio: se lo utiliza en solucin acuosa al 1,5% y
su frmula molecular es Cr2O7K2. A esa concentracin tiene un pH de
3,9 y su potencial de oxidacin en moderado (0,79 volt.). Durante su
disolucin origina los aniones dicromato y cromato hidrogenado, los
cuales permiten la correcta preservacin de lpidos y protenas
respectivamente. Penetra lentamente otorgando al tejido una rigidez
que favorece el seccionamiento con micrtomo. Las protenas se fijan
por coagulacin, los cidos nucleicos tienden a disolverse; mientras
que las histonas nucleares son fuertemente gelatinizadas. En el
caso de los lpidos son atacados por sus dobles ligaduras y los
vuelve ms resistentes a los solventes orgnicos. Los cidos grasos de
cadena corta que presentan una doble ligadura prxima al grupo
carboxilo terminal polimerizan tras oxidacin, lo que permite su
preservacin en el tejido. En el caso de los cidos grasos muy
insaturados, se producen dicetonas que luego se croman motivando su
estabilidad. Las triolenas se fijan si la accin del fijador es
prolongada. Las muestras fijadas con este reactivo presentan un
precipitado verdoso y, por ello, se deben lavar con agua comn a fin
de evitar coloraciones inadecuadas.
Acido crmico: se lo emplea en bajas concentracion es (0,5%). Su
frmula qumica es CrO3 y su potencial de oxidacin es 1,08 volt. Se
lo recomienda para preservar lpidos, ya que acta de la misma forma
que el dicromato de potasio. Sin embargo, no es buen fijador para
el resto de las estructuras histolgicas debido a su elevado poder
oxidante. Tras la fijacin, las muestras se deben lavar con agua
comn para eliminar el color amarillo verdoso que presentan.
cido pcrico: es soluble en agua, alcohol y benceno. Fija con
contraccin de la muestra, si bien el endurecimiento es escaso. La
solucin acuosa saturada tiene un pH de 1,6 y su potencial de
oxidacin es de 0,82 volt. Coagula las protenas originando picratos
salinos del aminocido al que se une. Fija bien los cidos nucleicos
y forma una malla homognea e n el ncleo, lo que permite gran
estabilidad espacial de sus componen tes. Los hemates se vuelven
esfricos. Si se desea realizar tinciones in toto o en bloque no se
recomienda el uso de soluciones acuosas (pironina), sino alcohlicas
(safranina). El tiempo de fijacin oscila segn el tamao de la
muestra entre 6 y 40 horas a temperatura ambiente. Por otra parte,
el cido pcrico tiene accin descalcificadora y, por ello, se debe
evitar el uso de este cido como fijador cuando se investiga la
presencia de calcio en la muestra (tcnica de von Kossa, Alizarina
S, etc.). Tras utilizar este reactivo, las muestras biolgicas se
deben lavar en varios baos de alcohol etlico de 70.
Sulfato de zinc: durante mucho tiempo se pens que esta sustancia
actuaba como un reactivo indiferente, tal como sucede con el
cloruro de sodio, sulfato de sodio o potasio. Sin embargo, en la
actualidad se lo emplea para la preservacin de lpidos de membranas
celulares y componentes de lmina basal y aqu es donde se observan
los beneficios que esta sustancia presenta. Asimismo, se lo utiliza
para fijacin de protenas tisulares en diferentes protocolos
inmunohistoqumicos. Se lo usa en bajas concentraciones (0,5%) y su
frmula es SO4Zn. El potencial de oxidacin es bajo (0,45 volt.) y,
por tanto, acta suavemente sobre membranas, aunque con ligera
contraccin de la muestra.
b) COMPUESTOS O MEZCLAS FIJADORAS: constituidas por varias
sustancias.
Las mezclas fijadoras se utilizan para tcnicas de rutina o para
tcnicas especiales. Las mezclas fijadoras son combinaciones de
agentes fijadores, cada uno de los cuales es por si solo
insuficiente para dar una fijacin que responda a todas las
exigencias.
Liquido de Flemming: (mezcla cromo-osmio-actica) para estudios
citolgicos. La solucin de Flemming es un buen fijador citolgico que
contiene el cromo como agente coagulante y el fijador aditivo
tetrxido de osmio. La fijacin con tetrxido de osmio se retrin ge a
las paredes celulares exteriores debito a su baja tasa de
penetracin en tejidos, mientras que el cido actico entra
concienzudamente en los tejidos. Por tanto, este es el mejor uso de
la solucin de Flemming sobre muestras de tejido de tamao pequeo.La
solucin "fuerte" fue uno de los fijadores ms tenidos en cuenta en
estos das. La solucin ms dbil est reservada generalmente para
tejidos delicados. Prueba para determinar qu frmula (o modificacin)
es la mejor para tu material particular.Prepara el fijador en dos
soluciones stock: la solucin A contendr los cidos crmicos y actico
y la B contendr slo cido smico (tetrxido de osmio). Aade la solucin
de osmio slo antes de su uso. Fija piezas de tamao muy pequeo
durante 24-48 horas, lavar concienzudamente, y preparar para
seccionar como es habitual. Los tejidos fijados con osmio necesitan
ser blanqueados con leja antes de su ticin.Precaucin: el cido smico
es un compuesto voltil extremadamente txico. Puede fijar crneas y
otros tejidos a travs de una fijacin con vapores. Emplear
preacuciones especiales y usar siempre en campana extractora de
gases.DbilFuerte
Acido crmico (1%)Acido actico (1%)Acido actico glacialAgua
destilada2510-5575-5-
Acido smico (2% acuoso)1020
Liquido de Bouin: (mezcla picro-formol-actica). El mejor fijador
para los trabajos corrientes. Muy penetr ante.Para hacer esta
mezcla es conveniente tener una solucin saturada de cido pcrico.
Componentes: solucin saturada de cido pcrico 15 cc, formol 40% 5
cc, cido actico 1 cc.Es uno de los mejores fijadores para el
estudio del glucgeno; penetra rpidamente a los tejidos, es un buen
fijador general, salvo para el rin. Es muy adecuado para las
coloraciones de Masson y Mallory. Produce poco encogimiento. Segn
el tamao de la pieza la fijacin requiere de 1 a 24 h. El lquido
completo es una solucin estable. Este fijador produce lisis de los
glbulos rojos y disminuye la cantidad de hierro frrico demostrable.
Los tejidos no deben permanecer por ms de 12 a 24 h. pues sino se
vuelven duros y quebradizos. Una vez terminada la fijacin se debe
pasar directamente a la deshidratacin con alcohol 80.Solucin acuosa
saturada de cido pcrico..................................... 75
ml.Formol...............................................................................
25 ml.Antes de usar, agregar 0.5 ml de cido actico por cada 10 ml
de solucin.
Se prepara de la siguiente manera:- SOLUCIN ACUOSA DE C.
PCRICO(C. PCRICO AL 1-2% EN AGUA DESTILADA)..750.0 ml.1. FORMALINA
CONCENTRADA250.0 ml.1. C. ACTICO GLACIAL.50.0 ml.1. PH. FINAL2.21.
TIEMPO DE FIJACIN..2 a 24 horas
Fijador de Bouin-Hollander:es una variante del liquido de Bouin
especialmente indicado para la fijacin de los cilindros de biopsia
de mdula sea cuando no es posible controlar el tiempo de fijaci n
de la muestra en ste lquido, la conservacin, puede incluso
conservar las 48 horas sin que se produzca excesivo
endurecimiento.Se prepara de la siguiente manera:1. ACETATO NEUTRO
DE COBRE.2.5 gr.1. C. PCRICO..4.0 gr.1. FORMALINA
CONCENTRADA....10.0 ml.1. C. ACTICO GLACIAL..1.5 ml.1. AGUA
DESTILADA..100.0 ml.Para preparar la solucin se disuelve primero la
sal de cobre en el agua destilada luego se aade el cido pcrico y
tras filtrarlos el formol y el cido actico glacial.Esta solucin se
conserva indefinidamente a temperatura ambiente el tiempo de
fijacin oscila entre 48-72 horas y sigue las mismas precauciones
que el lquido de Bouin
Bouin alcohlico (fijador de Dubosq-Brasil):Es una alternativa de
lquido de Bouin cuando la pieza que se debe fijar es relativamente
voluminosa porque posee una velocidad de penetracin mucho mas
elevada. Se utiliza tambin cuando se precisa una fijacin especfica
de sustancias hidrosolubles como el glucgeno ya que evita su
disolucin.Se prepara de la siguiente manera:1. ALCOHOL ETILICO
80%...............................................75.0 ml.1. C.
PCRICO0.5 gr.1. FORMALINA CONCENTRADA.....30.0 ml.1. C. ACTICO
GLACIAL...7.5 ml.Mezclar antes de usar el tiempo medio de fijacin
para fragmentos con un espesor en torno a 5 milmetros es de 2 a 3
horas.
Liquido de Gendre:Es una variacin que est especialmente diseada
para la fijacin del glucgeno y pigmentos derivados de la
hemoglobina. Se prepara por:1. SOLUCIN SATRUADA DE C. PCRICOEN
ALCOHOL ETLICO AL 70%.....................................80.0
ml.1. FORMALINA CONCENTRADA...15.0 ml.1. C. ACTICO GLACIAL.7.5
ml.El tiempo de fijacin oscila entre 1 y 4 horas. Tras acabar el
proceso debe realizarse sucesivamente 2 lavados cortos en etanol al
80, 95 y 100
Liquido de von Tellyesniczki:A base de bicromato de potasio cido
actico y agua destilada (3 g, 5 cc, 100cc). el bicromato conserva
bien el citoplasma. El cido actico conserva bien los ncleos. Las
muestras no deben ser mayores de 0.5 cm de dimetro. El tiempo de
fijacin no debe superar los dos das, al trmino del mismo debe
hacerse un lavado en agua corriente de 24 h.
De Carnoy:Los componentes de esta mezcla son los siguientes:
alcohol etlico, cloroformo, cido actico glacial (60 ml, 30 ml, 10
ml ).Este fijador es muy adecuado para pequeos fragmentos
tisulares, por ej. obtenidos por raspado, que se fijan bien en 30
min. a 2 h. Tambin inicia la deshidratacin, es un bu en fijador
para el glucgeno, los ncleos se tien bien. Como inconvenientes
podemos citar que produce lisis y encogimiento importante. Disuelve
los lpidos y la mielina. Fija bien el glucgeno.1. Est compuesta
por:1. ETANOL ABOSLUTO..60.0 ml.1. CLOROFORMO.30.0 ml.1. C. ACTICO
GLACIAL..10.0 ml.El tiempo de fijacin puede ser acortado hasta 3
horas. Las muestras deben cambiarse directamente a alcohol etlico
absoluto. El mayor endurecimiento se produce al prolongar demasiado
la deshidratacin en alcohol, para prevenirlo se puede sustituir el
etanol por metanol en la composicin de lquidofijador, que adems
provoca menor retraccin tisular, y para conservar la pieza se
deposita en alcohol etlico absoluto.
Fijador de Mller:Es la disolucin acuosa de un fijador simple de
dicromato potsico con la adicin de sulfato sdico su importancia
actual radica en que se emplea para fabricar losfijadoresde Orth y
de Zenker. Lo que llamamos solucin madre. Est compuesta de:1.
DICROMATO POTASICO2.5gr.1. SULFATO SDICO..1.0 gr.1. AGUA DESTILADA
100.0 ml.Tiempo de fijacin 4 y 8 horas. Tras la fijacin es
necesario lavar abundantemente en agua corriente durante unas
horas.
Fijador de Orth:Hoy da se emplea exclusivamente en ciertas
tcnicas de fijacin de tejido nervios. Se prepara de la siguiente
manera:1. Solucin stock de Orth: idntica a la composicin del
fijador de Mller.1. Solucin de trabajo: en el momento de su uso se
mezclan:1. SOLUCIN STOCK..90.0 ml.1. FORMULINA CONCENTRADA.10.0
ml.El tiempo de fijacin de tejido nervioso es de 48 horas y tras el
proceso de fijacin los tejidos han de ser lavados abundantemente en
agua y almacenados en alcohol etlico al 70%
Solucin de B-5 y Zenker-Formol (Liquido de Nelly):Ambas mezclas
son en esencia casi idnticas. La denominacin B5 corresponde en
realidad a una modificacin de la de Zenker.La solucin de
Zenker-formol contiene dicromato potsico y sulfato sdico. La mayor
utilidad de estosfijadoreses que mejoran considerablemente la
tincin nuclear, de hecho la fijacin en una mezcla que contenga
sublimado es hoy da prcticamente imprescindible para el diagnstico
morfolgico en las patologas del sistema linfoide y hematopoytico.
Es debido a la gran importancia que se da a la observacin de finos
detalles nucleares como es la presencia o no de hendiduras o
repliegues nucleares y del nucleolo para catalogar un tumor maligno
de ganglios linfticos, o de mdula sea (leucemias) como de alto o
bajo grado de malignidad y por tanto recomendar la teraputica ms
oportuna. Adems estas soluciones B5 zenker formol son
losfijadoresde eleccin para el rin, hgado, fibras de tejido
conectivo y para fibrina.Se prefiere la solucin de B5 porque al no
contener dicromato, esto permite una mejor conservacin de la
cromatina nuclear y de la estructura antignica tisular.1. Solucin
de 35:*Solucin stock de B5: Esta mezcla es estable durante bastante
tiempo pero concentrado en frasco opaco y oscuridad.0. CLORURO
MERCRICO... 12.0 gr.0. ACETATO SDICO....2.5 gr.0. AGUA DESTILADA
C.S.P.200 ml.
Mezclas con formaldehdo: El formaldehdo es quiz el fijador ms
usado hoy en da, tanto para tcnicas histolgicas rutinarias como
para otras como la inmunocitoqumica o la hibridacin de cidos
nucleicos. Lo ms frecuente es utilizarlo en solucin al 4 % junto
con otrosfijadores. Por ejemplo, el Bouin. Se suelen disolver en
soluciones tamponadas que tienen una osmolaridad similar a la del
tejido que se pretende fijar. Para fijaciones de tejidos destinados
a microscopa electrnica se suelen utilizar soluciones fijadoras que
contienen formaldehdo y glutaraldehdo. La funcin del formaldehdo es
iniciar una fijacin rpida, por su mayo capacidad de penetracin,
mientras que el glutaraldehdo realizar una fijacin ms poderosa,
pero ms lenta que afectar a la estructura tisular puesto que el
formaldehdo ya ha realizado una fijacin previa.
c) AGENTES CLARIFICANTES Se les conoce as porque los tejidos se
tornan transparentes cuando se exponen a los mismos Tiene que ser
afines tanto con el agente deshidratante (alcohol) como con el
agente infiltrante (parafina) Se les conoce como el agente
dealcoholizante Remueve el alcohol y prepara el tejido para la
infiltracin con parafina Si no hay una buena clarificacin no habr
una buena infiltracin Demasiada clarificacin tiene un efecto
parecido al de la deshidratacin
Xylene Mas utilizado Se pone opaco (lechoso) cuando esta
contaminado con aguaReemplazar inmediatamente Endurece el
tejido
Tolueno Endurece menos el tejido Tolera ms la presencia de agua
Las procesadoras automticas condensan agua en la tapa que con los
cambios de presin causan que le caiga agua al tejido durante los
ltimos pasos del procesamiento
Benceno Rpida evaporacin Difcil de mantener Txico,
carcingeno
Cloroformo Lenta penetracin al tejido Rpida evaporacin Difcil de
mantener Txico
Limonene (Sustituto de Xileno) Endurecen el tejido Contaminan la
parafina Alergias Dificultad respiratoria Dolor de cabeza
Hidrocarbonos Alifticos Alkanes Nueva clase de agentes
clarificantes Cadenas cortas Unas MARCAR mejores que otras
1.1.5.2 FIJADORES FSICOS:
Criodesecacin o filiacin: Consiste en someter al tejido a dos
procesos el primero es la fijacin instantnea por congelacin en
Nitrgeno liquido y el segundo desecacin por sublimacin directa del
agua confiada a vapor en una bomba de vaco es un proceso complicado
y costoso pero tiene una ventaja muy importante y es que al
eliminar totalmente el agua tisular, paraliza la autolisis y
produce una conservacin indefinida, adems evita que se produzcan
enlaces qumicos entre el tejido y el fijador, conservando asila
estructura antignica tisular. Calor: Ejerce una accin muy diferente
segn se aplique a objetos secos o hmedos. La fijacin por agua
hirviendo o por diversos fijadores en ebullicin presta servicios
para invertebrados y bsquedas histoqumicas
Fro: No puede ejercer ninguna accin fijadora a temperaturas que
no pasen de 0 C. Endurece los tejidos y suspende las alteraciones
celulares debidas a la necrosis y a la autodigestin. Este agente no
sera ms que una ayuda.La congelacin de los tejidos frescos parece
ser a priori, un detestable procedimiento histolgico. El aumento de
volumen de los lquidos que los llenan y la formacin de agujas de
cristales no puede evitar la produccin de verdaderos deterioros. Su
nica ventaja es la de no precipitar los albuminoides y de no
alterarlos.
Congelacin y desecacin: (Mtodo de Altmann-Gersh). detienen por
medio de la congelacin de la clula todos los procesos que la pueden
daar. Sin embargo, si quitamos la pieza del fro continuan los
procesos de autlisis. Se utiliza como mtodo para la fijacin el
enfriamiento por congelacin del tejido es el mtodo de eleccin para
realizar estudios morfolgicos o funcionales en los que se requiere
conservar intacta la estructura antgena del tejido o su contenido
enzimtico. La clave para una correcta fijacin por congelacin del
tejido es que su realizacin sea instantnea porque un enfriamiento
lento provoca la formacin de microcristales titulares de hielo que
pueden agregarse con el paso del tiempo produciendo roturas
titulares que dificulten el diagnostico-El procedimiento idneo para
fijar tejidos por congelacin consiste en utilizar ISOPENTANO a
menos de 50C como agente de congelacin y realizar una fragmentacin
suficiente de la muestra que se vaya a congelar.Normalmente se
preparan bloques de no ms de 3 cm. cuadrados de superficie y 3 mm
de espesor de modo que el proceso de congelacin instantnea no
requiera ms de 10 segundos. El mantenimiento continuo de isopentano
debe realizarse en un congelador programado a -70C para que quede
compensado la subida inmediata de la temperatura que se produce al
extraer el liquido del congelador.Al enfriar tanto no actan
bacterias ni enzimas y el tejido se endurece para cortar estos
tejidos utilizamos el microtomo de congelacin o un aparato mas
evolucionado o criostato el cual tiene como ventajas que la
temperatura se mantiene mas baja y se pueden realizar cortes mas
finos entre 2 y 15 micras.1.1.6 FIJADORES COAGULANTES Y NO
COAGULANTESLa fijacin qumica involucra el uso de soluciones
orgnicas e inorgnicas que permiten la adecuada preservacin de la
morfologa tisular y propiedades tintoriales de las macromoleculas
del tejido. Estas soluciones se dividen en dos grandes grupos:
1. Fijadores Coagulantes: son soluciones que pueden coagular
protenas, transformndolas en estructuras insolubles. Debido a que
la arquitectura del tejido se mantiene fundamentalmente por
lipoprotenas (uno de los principales componentes de membranas
plasmticas), por protenas fibrosas (colgeno) y globulares
(nucleoprotenas), la coagulacin de estas protenas mantiene la
morfologa del tejido a nivel de microscopa de luz, si bien la
fijacin por coagulacin produce floculacin citoplasmtica, como as
tambin, preservacin pobre de mitocondrias y grnulos de
secrecin.
2. Fijadores No Coagulantes: estas soluciones interaccionan con
diferentes sitios qumicos de las macromolculas tisulares para
establecer, a modo de puente, uniones que originan una malla que
las entrelaza. A diferencia de los fijadores coagulantes, la
eliminacin de las molculas de agua a partir del tejido es mucho
menor, haciendo que la mayora de los componentes tisulares se
conserve adecuadamente.
1.1.7 OTROS FIJADORES QUMICOS
G138
Fijador universal estndarEl fijador de dos componentes de Agfa,
G334, destaca por su menor emisin de olores. Esto se ha logrado
reduciendo tanto la emisin de cido actico como de dixido de azufre.
No ha disminuido la potencia y precisin del fijador y Ud. no
necesitar incrementar, por lo tanto, la tasa de regeneracin de la
procesadora.Flexible y universal G334 es adecuado para su
utilizacin en procesadoras automticas y le permitir procesar una
amplia variedad de pelculas radiogrficas, como las pelculas CURIX,
SCOPIX y MAMORAY.El fijador G334 ha sido diseado para ser utilizado
conjuntamente con revelador G138i o G139.Reducida emisin de
sustancias qumicas. La mayora de las sustancias qumicas utilizadas
en reveladores comunes yfijadoresno-endurecedores se disuelven
fcilmente en agua y no se evaporan excesivamente en el aire.El
fijador G334, sin embargo, contiene un regulador de pH con cido
actico y sulfito de sodio para evitar que se descomponga la sal
fijadora presente en el fijador.Al utilizar G334, se ha reducido en
gran medida la emisin tanto de cido actico como de dixido de
azufre.Compatible con la tecnologa E.O.S. G334 tambin es adecuado
para la recuperacin de plata "en lnea". En combinacin con el
Sistema de Optimizacin Ecolgica (E.O.S.) es posible utilizar una
tasa de regeneracin mnima.
G334 + ADITAN
Fijador universal estndarEl fijador de dos componentes de Agfa,
G334, destaca por su menor emisin de olores. Esto se ha logrado
reduciendo tanto la emisin de cido actico como de dixido de azufre.
No ha disminuido la potencia y precisin del fijador y Ud. no
necesitar incrementar, por lo tanto, la tasa de regeneracin de la
procesadora.Flexible y universal G334 es adecuado para su
utilizacin en procesadoras automticas y le permitir procesar una
amplia variedad de pelculas radiogrficas, como las pelculas CURIX,
SCOPIX y MAMORAY.El fijador G334(i) ha sido diseado para ser
utilizado conjuntamente con revelador G138i o G139.Reducida emisin
de sustancias qumicas. La mayora de las sustancias qumicas
utilizadas en reveladores comunes yfijadoresno-endurecedores se
disuelven fcilmente en agua y no se evaporan excesivamente en el
aire.El fijador G334, sin embargo, contiene un regulador de pH con
cido actico y sulfito de sodio para evitar que se descomponga la
sal fijadora presente en el fijador.Al utilizar G334, se ha
reducido en gran medida la emisin tanto de cido actico como de
dixido de azufre.Compatible con la tecnologa E.O.S. G334 tambin es
adecuado para la recuperacin de plata "en lnea". En combinacin con
el Sistema de Optimizacin Ecolgica (E.O.S.) es posible utilizar una
tasa de regeneracin mnima.
G150
Revelador de una sola parte, sin endurecedorG150 es un revelador
de una sola parte sin endurecedor especficamente diseado para
ofrecer una solucin flexible y ecolgica para el revelado manual. En
combinacin con el fijadorG354, el revelador G150 ofrece unos
excelentes resultados de revelado de pelcula radiogrfica
convencional, pelculas lser y pelculas de copia.Flexible para un
control perfectoG150 se adapta perfectamente a una gran variedad de
ciclos de revelado y temperaturas, desde temperatura ambiente hasta
35 C.El tiempo de revelado recomendad es de 5 minutos a 18 C y de 2
minutos a 25 C. Tambin es posible el revelado a otras temperaturas
ajustando los tiempos segn corresponda.
G153
G153 para procesado automtico:G153 es un revelador envasado en
12 unidades para preparar hasta 30 litros de solucin final.
G354
G354 es el fijador sin endurecedor y de una sola parte estndar
de Agfa para el revelado manual y el revelado automtico en
procesadoras de sobremesa. Fijador de bajo nivel de olor,
manteniendo su alta calidad.Uso universalEl fijador G354 ofrece
unos resultados de alta calidad en el procesado de una amplia
variedad de pelculas de rayos X, incluyendo pelculas radiogrficas
convencionales, pelculas lser y pelculas de copia.El fijador G354
se puede utilizar en una amplia variedad de ciclos de revelado y
temperaturas. Los mejores resultados se obtienen cuando se combina
con el revelador G150 para el revelado manual o con el revelador
G153 para el revelado automtico de sobremesa.
CONCLUSIONES
Existen multitud de fijadores en los manuales de tcnicas
histolgicas. Aqu slo trataremos aquellos que consideramos de uso ms
comn para la observacin de tejidos al microscopio, es decir,
aquellos que mejor preserven la estructura celular. Los fijadores
qumicos son los ms frecuentemente empleados, bien con un solo tipo
de sustancia fijadora o con mezclas de varias de ellas. Un fijador
conserva la forma, estructura, relacin y constituyentes qumicos de
los tejidos y clulas, postmortem. No existe un mtodo universal de
fijacin. Un fijador es adecuado para un tejido y puede no serlo
para otro.. No todos los fijadores conservan indefinidamente el
tejido, ya que la fijacin no es equivalente a conservacin. Tenemos
por ejemplo la formalina, y nos queda claro que ste fijador es el
mas utilizado y al mismo tiempo es buen conservador. Un defecto de
fijacin jams puede ser corregido. Es intil realizar un estudio
histopatolgico sobre material con defectos de fijacin graves.
ALGUNAS RECOMENDACIONES
Es importante recalcar que la mayora de las sustancias fijadoras
son txicas por inhalacin o por contacto, algunas de ellas
cancergenas. Hay que seguir las indicaciones de seguridad para su
manejo y utilizacin.
Controle cuidadosamente los tiempos establecidos para cada
tcnica. Es muy importante respetarlos para obtener resultados
satisfactorios.
Antes de iniciar cualquier tcnica, primero lala atentamente.
Prepare el material de vidrio necesario, rena los reactivos y
colorantes, haga las diluciones, determine los tiempos, y despus
comience el proceso.
Tenga mucha paciencia y voluntad. Sea perseverante, si durante
las primeras experiencias sus resultados no son lo que Ud.
esperaba, verifique cada paso y repita tantas veces como sea
necesario.
BIBLIOGRAFA
Jaulmes Ch., Jude A., Querangal J., Delga J. Prctica de
Laboratorio. Toray/Masson. 1970
Lynch M., Raphael S., Mellor L., Spare P., Inwood M. Metodos de
laboratorio. 2da. Ed. Interamericana. Mxico. 1972.
Martoja R., Tcnica de Histologa Animal. Toray-Masson S. A.
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