FISH 技术在肿瘤病理诊断及肿瘤分子靶点治疗中的应用

中山大学肿瘤防治中心分子病理诊断实验室

王芳 邵建永

细胞遗传学技术 原理：通过荧光标记的 DNA 探针与细胞核内的DNA

靶序列杂交 观察：荧光显微镜 原位观察（细胞、组织）细胞核 彩色探针信号 目的：获得细胞内多条染色体 ( 或染色体片段 ) 或多种 基因状态的信息。

Fluorescence in situ hybridization

（ FISH ）

用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于 DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位

荧光标记探针

探针变性

样本 DNA变性

杂交

原理

FISH 技术的特点

操作简便，探针标记后稳定，可与多种技术结合， 可成功地帮助细胞遗传学家做出回顾性分析

方法敏感，能迅速得到结果， 24小时就可以完成检测

标本来源丰富，间期细胞，分裂中期细胞、分化或未分化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测

centromere

telomere subtelomere

locusspecific

whole chromosome paint

CSP探针：染色体着丝粒探针

GLP探针：位点特异性探针

WPP探针：全染色体或染色体区域特异性探针

FISH 探针的种类

操作流程简图

制片 制片 预处理 预处理

FISHFISH结果分析 结果分析

• 破坏细胞膜利于探针 杂交。• 蛋白酶消化、 HCl 处理

• 变性• 杂交• 洗涤• 复染

FISH 技术在乳腺癌检测中的应用

乳腺癌 Her-2 基因

致癌基因： Her-2 基因； 位点： 17q11.2-q12 ； 编码蛋白：跨膜蛋白（与 表皮生长因子受体部分同源）； 25-30% 乳腺癌病人都有HER-2 的扩增； HER-2 基因扩增是决定Herceptin 治疗是否有效的关键性指标。

Her-2 基因的检测方法

检测方法 检测指标 优点 缺点

IHC Her-2 蛋白 费用低光镜即可观察结果

准确性差，主观性强，假阳性率高

CISH Her-2 DNA 光镜即可观察结果 对低度扩增及染色体非整倍扩增检测灵敏度下降

FISH Her-2 DNA 对于低倍、高倍染色体非整倍性扩增检测准确性高，灵敏度特异性好，结果判断客观

相对费用较高

疾病名称 检测探针 标记颜

色 探针定位 探针名称

乳腺癌

GLP Her2 / CSP17

红 / 绿

Her2 ： 17q11.2-q12CSP17:17p11.1q11.1

CSP17:17 号染色体着丝粒

正常 : 2红 /2绿异常 : 红信号大于 2为异常细胞 (绿色信号不少

于 2个的细胞 )

Her-2 基因 FISH 探针组

DAPI 染色后与 HE 切片对比图

观察浸润部分

导管内癌

结果判断

统计 Ratio 值（计数浸润性部分的 20 个细胞） Ratio 值＝ 20个细胞核中红信号总数 / 绿信号总数 Ratio＜ 1.8 为阴性结果 Ratio＞ 2.2或众多信号连接成簇时可不计算为阳性结果

比值 2～ 4 为低度扩增 4～ 10 为中度扩增 >10 为高度扩增

Ratio在 1.8-2.2 之间时，则需要再计数 20个细胞核中 的信号。如仍为临界值，则应在 FISH检测报告中注明。

A. 无须计数的大簇团信号（高度扩增）

B. 颗粒状信号（ R>10 ，高度扩增）C. 须计数的颗粒状信号（ R=3.5 ，低度扩增）

A

C

B

Her-2 基因扩增状况

Her-2 基因无扩增情况

红信号数 >2 ，同时绿信号非整倍体R<1.8 ，无扩增

红信号与绿信号均为两点， R=1

荧光原位杂交与免疫组化检测 Her-2 结果比较

我实验室已完成病例小结

IHC

0 1+ 2+ 3+FISH

无扩增 13 3 4 0 20

扩增 2 2 10 29 43

总数

(n=15) (n=5) (n=14) (n=29) （ n=63 ）

Her2 表达 IHC（ 2+ ）标本中，基因扩增率为71.41%

Her2 表达 IHC （ 3+ ）标本中，基因扩增率为 100%（文献报道： 90-95% ）

>30% 的肿瘤细胞全部的细胞膜高强度着色

免疫组化（ 3+ ）与 FISH 对比图

×40 ×100

住院号： 177319

浸润性导管癌Ⅱ级IHC： +++

FISH ：呈簇团状高度扩增

×100

免疫组化（ 2+ ）与 FISH 对比图 1.

>30% 的肿瘤细胞全部的细胞膜弱至中等着色

×40

住院号： 175465

浸润性导管癌Ⅱ级IHC： ++

FISH： Ratio>5 ，中度扩增

×100

免疫组化（ 2+ ）与 FISH 对比图 2.

>30% 的肿瘤细胞全部的细胞膜弱至中等着色

×40 ×100

住院号： 176921

浸润性导管癌Ⅱ级IHC： ++

FISH： Ratio＝ 1.45 ，无扩增

>30% 的肿瘤细胞弱的着色

免疫组化（ 1+ ）与 FISH 对比图 1

×40 ×100

住院号： 175689

浸润性导管癌Ⅱ级IHC： +

FISH ： Ratio＝ 1.62 ，无扩增

免疫组化（ 1+ ）与 FISH 对比图 2

×40 ×100

住院号： 175895

浸润性导管癌Ⅲ级IHC： +

FISH ：簇状扩增

>30% 的肿瘤细胞弱的着色

免疫组化（－）与 FISH 对比图1

×100×40

住院号： 176846

浸润性导管癌Ⅱ级IHC ：－FISH ： Ratio＝ 1.02 ， Her2 基因无扩增

<30% 的肿瘤细胞弱的着色或不着色

免疫组化（－）与 FISH 对比图2

住院号： 175472

浸润性导管癌Ⅱ级IHC ：－FISH ：呈簇状扩增

肿瘤细胞不着色

×40 ×100

评价 17 号染色体的意义

17 号染色体非整倍性：每个细胞中 17 号染色体多于或少于 2 个； 乳腺癌遗传学特征之一，可能预示预后不良； 17 号染色体多体性是导致 IHC 3+但 FISH 检测为阴性的主要原因； 我实验室完成病例中 17 号染色体非整倍性发生率为33.3% 。 评价 Her-2 基因状态的同时应考虑

17 号染色体数目的变化

IHC与 FISH 结果不一致原因分析

IHC 判断标准的主观性 内对照探针—— 17 号染色体着丝粒探针的建立，

排除 IHC 假阴性 IHC 2+及 3+的基因检测结果分离，无法控制

• 由于 17号染色体多体性造成假性扩增• IHC 自身无法克服的缺陷

基因扩增是 Herceptin使用的关键性指标

Her2 基因检测流程

石蜡组织标本

IHC 检测

再用 FISH方法检测

— 1+ 3+2+

— +

Herceptin 治疗

+

再用 FISH方法检测

Herceptin 治疗

FISH 检测

+ —

再用 FISH方法检测 +

乳腺癌H

ER

2 FIS

H

检测报告模板

FISH 技术检测染色体易位在淋巴瘤分型中的应用

淋巴瘤的诊断与分型

HE＋ IHC + cytogenesis = 解决 !

不同类型的淋巴瘤有各自不同的染色体易位

使控制细胞发育分化过程中的关键蛋白失活

与淋巴瘤的发生密切相关

• IGH/BCL2 t (14;18) (q32;q21) 染色体易位

• IGH/MYC t (8;14) (q24;q32) 染色体易位

• IGH/CCND1 t(11; 14)(q13; q32)  染色体易位

• API2/MALT1 t(11;18)(q21;q21) 染色体易位

• IGH/MALT1 t (14;18) (q32;q21) 染色体易位

• BCR/ABL t(9;22) 染色体易位【费城染色体】

目前开展的染色体易位检测（ 6 种）：

t (14;18) (q32;q21) 染色体易位

意义： t (14;18) 易位后形成的 IGH/BCL2 基因能编码完整 BCL2

蛋白， IGH 基因附近的增强子使 BCL2 过表达 t (14;18)为 FL 的标志（低级别更易出现） , 检出率达 93%～100%

DLBCL 20% ～ 30%出现易位

影响检出率的原因： 石蜡标本中 DNA 的降解 FL3b 接近 DLBCL ，其易位率低，影响总体检出率

53

C region V region

J regio

n

14q32 region

3

MCR MBR

18q21 region

IGH/BCL2 Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe

探针杂交示意图

肿瘤细胞核 IGH/BCL2 双色双融合易位探针杂交后显示 1O1G2F 信号

细胞核 IGH/BCL2 双色双融合易位探针杂交后显示 2O2G 信号

检测探针 标记颜色 探针定位 IGH / BCL2 green/orange IGH: 14q32

BCL2: 18q21  正常 : 2O/2G 异常 : 1O/1G/1F阳性标准 : >7% 的细胞出现黄色融合信号

病例 1 ：会诊 84363 ，男， 74y

腹腔肿物；FISH： 54% 的细胞可见融合信号； 诊断： FL ~Ⅱ Ⅲ 。

4× 40×

100×

病例 2 ：会诊 84362 ，女、 36 颈部肿物 抗炎治疗后（出现变性坏死） 诊断： DLBCL FISH ：阳性， 10% 的细胞可见融合信号

40× IHC:BCL2

100×

t (8;14) (q24;q32) 染色体易位

意义： t (8;14) 易位后形成的 IGH/MYC 基因能编码完整 MYC蛋 白， IGH 基因附近的增强子使MYC 过表达应用范围： 所有 Burkitt淋巴瘤都有 t (8;14) 易位

诊断不典型 Burkitt淋巴瘤须有 t (8;14) 易位的 MYC异常

可见于继发于滤泡性淋巴瘤的前驱 B 淋巴母细胞白血病 /

淋巴瘤

MYC

8q24 region

14q32 region

C region V regionV regionC region

IGH/MYC, CEP8 Tri Color, Dual Fusion Translocation Probe

探针杂交示意图

正常细胞核 IGH/MYC, CEP8 三色双融合易位探针杂交后显示 2R2G2A 信号

检测探针 标记颜色 探针定位

LSI IGH  green 14q32 

LSI MYC  orange 8q24

CEP 8  aqua 8p11.1-q11.1

正常 :2G/2O/2A异常 :1G/1R/2F/1A或 >2A

肿瘤细胞核 IGH/MYC 双色双融合易位探针杂交后显示 1O1G2F 信号

10× 40×

病例 3: 399318 ，女、 5y

颈淋巴结活检； ISH: EBERs（ + ）； FISH:45% 的细胞可见融合信号； 诊断：散发性经典型 BL 。

病例 4: 405618 ，女， 21y盆腔肿物穿刺； ISH: EBERs（ + ）； FISH: 23% 的细胞可见融合信号； 诊断：考虑为散发性经典型BL 。

4× 40×

活检穿刺标本

病例 5:399625 ，男、 42y

ISH:EBERs（ - ）； 经多学科大会诊； 诊断：较符合散发性非典型 BL ； FISH: 25% 的细胞可见融合信号；

4× 40×

活检穿刺标本

t (11; 14)(q13; q32) 染色体易位

意义 t (11;14) 易位后形成 IGH/CCND1 基因， IgH 基因附近的增 强子使 Cyclin D1 过表达

应用范围 套细胞淋巴瘤的诊断性指标 也出现过零星其它淋巴瘤 t (11;14) 易位的检出

IGH/CCND1Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe

11q13 region

14q32 region

C region V region

J chain

简洁示意图

探针杂交示意图

肿瘤细胞核 IGH/CCND1 双色双融合易位探针杂交后显示 1R1G2F 信号

细胞核 IGH/CCND1 双色双融合易位探针杂交后显示 2R2G 信号

检测探针 标记颜色 探针定位

IGH/CCND1 green/orange IGH: 14q32 CCND1: 11q13   

正常 : 2O/2G异常 : 1O/1G/2F

10× 40×

IHC:CyclinD1

病例 6: 393301 ，男， 40y； 肘部肿物； IHC： CyclinD1弱阳性； 经科内会诊； FISH:21% 的细胞可见融合信号；诊断：MCL

所示箭头为染色体易位产生的融合信号（ ×100 ）

10×

CyclinD1

40×

病例 7: 386766 ，女， 67y

扁桃体活检 2块，直径 0.3CM

IHC： CyclinD1弱阳性； FISH:45% 的细胞可见融合信号；诊断：不排除MCL 的可能，重取活检；

形态不典型 +IHC 不理想

所示箭头为染色体易位产生的融合信号（ ×100 ）

FISH 检测标本要求

• 新鲜活检或手术切除标本；• 石蜡包埋组织或石蜡切片（ 3 － 5um ）；• 肿瘤穿刺活检组织或细胞涂片；• 骨髓穿刺组织尽量送涂片，不用活检组织（因为

脱钙需要使用盐酸，破坏 DNA ）；• 肿瘤细胞阳性的胸腹水涂片；• 一般在 3 个工作日后可以发出检测报告；

EBV-DNA 定量 PCR 结果的稳定性分析

EBV-DNA 定量 PCR 标准样品扩增曲线

107 106 105 104

鼻咽癌检测结果比较• 5 个不同样品重复检测；• 扩增可靠性 99.4% ；• 每个样品同时进行 5

次重复，结果重复性很好；

• 同时扩增，结果存在显著差异的为 8 ％；

• 不同时间扩增，结果存在显著差异的为 6.7％。

5 个样品，每个样品分 5管抽提 DNA 后，同时进行定量 PCR 检测结果

86987 ± 21134 (24%)

62902.67 786.2834080716EB07

82113.15 1026.4144080716EB07

88629.72 1107.8715080716EB07

80556.48 1006.95605080716EB07

120732.72 1509.159080716EB07

6579 ± 2729 (41%)

7632.05 95.40062080716EB06

1822.53 22.78165080716EB06

8748.75 109.359375080716EB06

7055.78 88.19726080716EB06

7633.76 95.42204080716EB06

138 ± 370 (268%)

0.00 0080716EB05

0.00 0080716EB05

0.00 0080716EB05

827.34 10.341734080716EB05

0.00 0080716EB05

Final resultsQuantitySample Name

3335827 ± 485146 (14%)

3038537.20 37981.715080716EB09

3244077.60 40550.97080716EB09

3300465.28 41255.816080716EB09

4161768.80 52022.11080716EB09

2934283.76 36678.547080716EB09

489681 ± 47968 (10%)

497186.24 6214.828080716EB08

498939.18 6236.7397080716EB08

458680.94 5733.5117080716EB08

433556.40 5419.455080716EB08

560041.80 7000.5225080716EB08

0

2

4

6

8

10

12

14

A B C D E

DNA

拷贝

数

× 10² × 103 × 104 × 105 × 106

Sample Name Quantity Final results080716EB05 45.632095 3650.57080716EB06 78.58184 6286.55080716EB07 1104.825 88386.00080716EB08 6099.1826 487934.61080716EB09 34647.082 2771766.56

080716EB05 0 0.00080716EB06 38.885056 3110.80080716EB07 1163.3236 93065.89080716EB08 5720.7812 457662.50080716EB09 46489.215 3719137.20

080716EB05 7.594282 607.54080716EB06 78.94603 6315.68080716EB07 665.7312 53258.50080716EB08 3822.3396 305787.17080716EB09 29358.242 2348659.36

5 个样品，每个样品分 3 管，在不同时间（相隔一个星期）分别抽提 DNA 后，进行定量 PCR检测结果

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

A B C D E

第一次第二次第三次

× 103 × 103 × 104 × 105 × 106

5 个样品，每个样品分 3 管，在不同时间（相隔一个星期）分别抽提 DNA 后，进行定量 PCR 检测结果

Thank you for your attention!!