Fitoquímica para Biología 2009-II

I.- Fitoquímica- Introducción

Fitoquímica Es la ciencia que estudia el aislamiento, estructura, química, metabolismo, distribución natural y función biológica de las sustancias orgánicas que elaboran y acumulan las plantas.

Farmacognosia “conocimiento de las drogas”. Estudia la ocurrencia y aislamiento de sustancias vegetales o animales que pueden utilizarse como medicamentos.

Etnofarmacognosia La farmacognosia de cada cultura o cada pueblo.En Perú existen varios centros geográficos con medicina tradicional propia,por ejemplo la medicina tradicional del sur andino del Perú, la del Perú septentrional ( sierra norte) , la del nororiente peruano. Por consiguiente existen varias etnofarmacognosias.

Figura 1.- Este hombre de Desaguadero (3843 msnm)-Puno está comercializando plantas medicinales. En la mano tiene Chuquiraga jussieui (Asteraceae) “Kiswara” que se utiliza en afecciones renales y prostáticas.

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Taxonomía vegetal Ciencia que delimita, describe y nombra cualquier grupo de plantas que considera representa una unidad distinta.

Una unidad taxonómica: taxón

Los rangos o categorías que deben siempre utilizarse para construir la clasificación jerárquica de las plantas es:

Rango Ejemplo

Reino Vegetal

División Espermatofita (plantas con semilla)

Subdivisión Angiosperma (semilla encapsulada)

Clase Rosales

Familia Rosaceae

Género Margyricarpus

Especie Margyricarpus pinnatus (Lam.)Kuntze

La posición de los productos secundarios en el metabolismo

Metabolismo: conjunto altamente integrado de reacciones químicas en los organismos vivos.

Catabolismo: degradación de moléculas grandes en pequeñas, generalmente para obtener energía.

Anabolismo: construcción de macrobiomoléculas (biosíntesis).

Metabolismo primario Estudia el agua, aminoácidos, azúcares,lípidos, polisacáridos, proteínas, enzimas , ácidos nucleicos. Son estructuras y reacciones comunes a todos los organismos. Los estudia la bioquímica.

Metabolismo secundario Estudia estructuras y reacciones que frecuentemente difieren de especie a especie y que pueden considerarse como una expresión de la individualidad química del organismo. Los principales metabolitos secundarios son:

Sustancias fenólicas

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Terpenos

Alcaloides

También los animales ejercen metabolismo secundario, por ejemplo:

Toxinas

Ferohormonas

Figura 2.- Los insectos tienen un lenguaje que se basa en la emisión y detección de sustancias químicas (ferohormonas).Coleóptero verde sobre Z innia peruviana (Asteraceae), en Huayllabamba-Cusco.

Motivos para estudiar químicamente las plantas

1.- Por su utilidad práctica:

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Tropaoelum majus “mastuerzo”, por su contenido de glucosinolatos/isotiocianatos sirve como insecticida, antibiotico, antiviral, antitumoral:

Figura 3.- El mastuerzo “texao” es oriundo del Perú, antiguamente sus flores y hojas se utilizaban para ensaladas. Se sabe contiene vitamina C ¿cuánto? : no esmuy dificil averiguralo

2.- Para conocer el curso de la evolución:

“las especies no evolucionan en aislamiento”

“los dinosaurios se extinguieron porque no pudieron detectar el sabor de los alcaloides tóxicos presentes en las primeras plantas con flores”

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Evolución de los compuestos fenólicos:

Edad (millones de años) Taxón Tipo de fenoles500 Algas verdes Ácidos

cinnámicos,chalconas,flavanonas,flavonas400 psilophyta Hidroxiflavonas, alcoholes cinnamílicos,

ligninas370 helechos Flavonoles, catequinas

(proantocianidinas)120 angiospermas Antocianidinas, auronas, isoflavonas

3.- Interacciones planta – animal:

Las sesquiterpenlactonas como la parthenina y la tenulina que se obtienen de ciertas asteráceas tienen fuerte actividad antinutritivas sobre insectos en concentraciones muy menores a las que existen en el tejido vegetal.

4.- Taxonomía vegetal:

En las asteráceas , la subtribu Barnadesiinae de la tribu Mutisieae no presentan 5-metilcoumarinas, mientras que las otras tribus de Mutisieae si las tienen, por consiguiente se excluye a Barnadesiinae de la tribu Mutisieae:

Antes la tribu Mutisieae tenía las siguientes subtribus:

Barnadesiinae

Gochnatiinae

Mutisiinae

Nassauviinae

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Ahora, Barnadesiinae a pasado a ser la tribu Barnadesieae.

Figura 4.- El “llaulli”-Barnadesia horrida(Asteraceae). Tiene su canción:

El amor es una planta llaullillay

Que crece dentro del pecho llaullillay

Luego,luego se marchita llaullillay

Bajo la sombra de un mal pago llaullillay

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Biosíntesis de metabolitos secundarios

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Figura 5.- Este es un esquema biosintético para el ácido rosmarínico , el ácido cafeoilshikimico y el ácido clorogénico, que son compuestos fenólicos antioxidantes presentes en muchas familias de plantas. El ácido rosmarínico es particularmente notable en la tribu Mentheae, subfamilia Nepetoideae de la familia Lamiaceae. (Phytochemistry 70,1663(2009)).

¿Para qué le sirven a la planta los metabolitos secundarios?

Como adaptación a los factores ambientales:

1) Factores climáticos: temperatura, intensidad luminosa, duración del día, la humedad.2) Factores edáficos: naturaleza del suelo, pueden existir metales pesados tóxicos o existir

deficiencia de nutrientes.3) Contaminantes artificiales. Gases industriales, pesticidas.4) Animales: contra herbívoros o simbiosis con insectos polinizantes.5) Competencia con otras plantas.

Veamos algunos ejemplos:

Adaptación a las heladas(<0°C), los insectos sintetizan glicerina (análogo al etilenglicol en los radiadores de auto). Para este efecto las plantas sintetizan alcoholes polihidroxilados como el sorbitol y el manitol.

Adaptación a la sequía, las plantas que crecen en sitios de baja pluviosidad (desiertos, altiplanos), a menudo resisten la sequía, se llaman xerofitas.Los cactus generan cutículas cereas y espinas en vez de hojas para minimizar la pérdida de agua por transpiración. Como ejemplo de una sustancia que hace que la planta conserve agua cerrando los estomas (orificios en las epidermis de hojas y tallos), tenemos al ácido abcísico:

Adaptación al selenio, el selenio es altamente tóxico para todos los organismos vivos. Sin embargo, hay plantas que se adaptan al selenio que si son comidas por animales, estos mueren.Una de estas plantas es Astragalus garbancillo (Fabaceae) “Juska”: asimilan incluso 5000 ppm de Se . El trebol con 5 ppm y los animales con 1ppm de Se muestran yá signos de toxicidad.¿Cómo es entonces que esta planta ha sido capaz de absorver tanto Se sin perjudicarse? La

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respuesta es por síntesis de aminoácidos seleniados:

Estos aminoácidos no hacen proteínas y pasan a las vacuolas

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Figura 5.- Astragalus garbancillo (Fabaceae). Planta muy tóxica para el ganado por su alto contenido de selenio.

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Para detoxificación:

Los fenoles son altamente tóxicos para plantas y microorganismos, de manera que se glucosilan y así van a las vacuolas o se metabolizan hasta CO2.

Como protección contra herbívoros: La defensa de la planta se basa en factores tanto físicos como químicos.

Factores físicos: espinas por ejemplo.

Factores químicos: existen 1180 plantas tóxicas para insectos (un solo autor). Entre las sustancias responsables de este efecto, tenemos:

Aminoácidos no proteicos.

Glicósidos cianogenéticos.

Alcaloides (senecionina por ejemplo).

Péptidos (amanitina).

Proteínas (fitohemaglutinina para escarabajos, mariposas).

“los herbívoros han fracasado en su ataque sobre las plantas, pues aun dominan el paisaje”.

Competencia entre plantas: Las plantas superiores compiten entre sí por agua, luz y nutrientes del ecosistema.En el curso de esta lucha han desarrollado varios medios de defensa contra sus vecinos, si esta es de naturaleza química, se llama alelopatía.

Alelopatía: interacciones bioquímicas entre todo tipo de plantas (beneficiosas y perjudiciales): por ejemplo, las raices del nogal (Juglans regia) ejercen la siguiente reacción química:

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De esta manera,no pueden crecer tomates hasta una distancia de 16 metros alrededor del árbol.

Métodos de separación y purificación de metabolitos secundarios

La purificación de metabolitos secundarios a partir de las plantas es de por sí todo un arte-ciencia.Es el primer paso para estudiar a estas sustancias.

Extracción

Los metabolitos secundarios se pueden extraer con disolventes de diferente polaridad :

Hexano

Benceno

Eter etílico

Cloroformo

Acetato de etilo polaridad creciente

Acetona

Etanol

Metanol

Agua

La extracción de un vegetal molido con un disolvente líquido se denomina lixiviación o extracción (l)-(l). De esta manera los solutos de una matriz orgánica sólida (la planta) son transferidos hacia el disolvente. Como “lo semejante disuelve lo semejante”, de acuerdo al solvente que se emplee, se extraerá un determinado tipo de sustancias en función a su polaridad.

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En la práctica esto se logra macerando la planta con disolvente frío o con disolvente caliente. Si el tejido vegetal es duro, como raices o cortezas puede decoccionarse (hervir) la planta en un determinado solvente.

Es práctica común extraer la planta secuencialmente con solventes de polaridad creciente, por ejemplo, primero con hexano o éter de petróleo, luego con cloroformo y finalmente con metanol.

Purificación de extractos

Reparto (l)-(l)

Cromatografía

Cristalización-recristalización

Reparto (l)-(l)

El reparto (l)-(l) o extracción (l)-(l) se puede definir como la transferencia de una sustancia X de una fase líquida A, a otra fase líquida inmiscible B.

Para una temperatura dada, está dada por la ecuación de Nerst:

KT = CaguaX/CsolventeX

Donde C significa concentración. En el laboratorio se realiza esta operación utilizando una pera de decantación:

La operación implica dispersar ambos líquidos inmiscibles para que suceda la transferencia de X. Esperar a que las fases se separen (coalescencia) por gravedad, y con la ayuda de la llave de paso, transferir el extracto, de la solución extraida. Generalmente la operación se repite varias veces sobre una misma solución.

Sistemas líquidos inmiscibles usuales:

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Agua-éter de petróleo o hexano

Agua-éter etílico

Agua-cloroformo

Agua-acetato de etilo

Agua-n-butanol

Solubilidad mutua:

Un litro de éter etílico disuelve 30 ml de agua

Un litro de agua disuelve 100 ml de éter etílico

Casi todos los pares inmiscibles presentan el fenómeno de solubilidad mutua.

Desecación de la fase orgánica: como el extracto orgánico está saturado de agua, antes de concentar el extracto por destilación, hay que privarle del agua solubilizada, esto se logra empleando un desecante inerte como el sulfato de sodio o el sulfato de magnesio.

Ejercicios:

1.-La solubilidad de un alcaloide a 25°C es de 0-16 g /100 mL de agua y 26.3 g 7100mL de dietil éter. Calcular el alcaloide extraido de un litro de solución acuosa que contenía 1.6 g de alcaloide al agitarla,

a) una vez con 20 ml de éter

b) dos veces con 10 mL de eter ,nuevos cada vez.

Solución:

Entonces KT = Cagua/Céter = 0.16/100/26.3/100= 6.08 x 10-3

Luego:

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a) 6.08 x 10-3 = 1.6-x/1000/x720, despejando X=1.23 g de alcaloide extraídos.

b) 6.08 x 10-3 = 1.6-x/1000/x/10, despejando x=0.995 g extraídos en la primera extracción.

En la segunda extracción:

6.08 x 10-3 = 0.605-y/y/10, despejando Y = 0.38 g extraídos en la segunda extracción.

Luego, las dos extracciones han extraído 1.38 g de alcaloide. Por consiguiente es mejor extraer con varias porciones de volúmenes pequeños que una sola extracción con un volumen grande.

2.-El coeficiente de distribución a 25°C del ácido láctico entre agua y cloroformo, CCHCl3/Cagua, expresado en mol/L , tiene por valor 0.0203. ¡Cuánto ácido láctico será extraído, al agitar con 100 mL de agua otros 100 mL de una disolución 0.8 M de dicho ácido en cloroformo?

KT = , CCHCl3/Cagua, = 0.0203; KT = 0.08-x/100/x/100 = 0.0203, despejando x= 0.072 moles

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Cromatografía

La cromatografía es un método para resolver mezclas de solutos que están disueltos en un solvente común por distribución entre dos fases: la fase estacionaria (sorbente) y la fase movil.

Equipo básico para cromatografía en columna:

Figura 6.- En la cromatografía de columna clásica el tamaño de las partículas de gel de sílice es de 200-700µm,el solvente eluye la columna simplemente por gravedad, mientras que en la cromatografía flash es de 40-63 µm y por eso se requiere aplicar presión de aire ,para eluir,usar una bomba de aceite o puede incluso ser una bombita de acuario.

Eluir: Obligar el paso de un líquido através de la columna cromatográfica, produciéndose la separación de los solutos que saldrán por el fondo de la columna.

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Figura 7.- En la cromatografía líquida por vacío el tamaño de las partículas de gel de sílice es de 40 µm. La elución se provoca ejerciendo vacío.

En la columna clásica, la longitud de la columna es 10 a 20 veces el diámtero de la columna.

Cumplir con:

1.- Llenado uniforme de la columna .

2.- Aplicación de la muestra.

3.- Se eluye con porciones de eluyente de polaridad creciente,luego como cada soluto de la mezcla tiene una particular tendencia a irse con el solvente / tendencia a retenerse el sorbente; se separan y salen por el fondo recogiéndose en los matraces.

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Formato de trabajo:

Muestra: extracto de acetato de etilo de Eclipta prostrata

Sorbente : 30 g de SiGel de 0.2 a 0.7 mm de diámetro de partícula

Dimensiones de la columna: 1.5 x 17 cm

Líquido adsorbido : CHCl3

N° fracción EluyenteCHCl3:Me2CO (mL)

Volumen (mL)

Peso matraz (g)

Peso matraz+residuo

Peso residuo(mg)

1 10 0 10 9.000 9.031 312 9 1 10 9.000 9.095 953 8 2 10 9.000 9.131 1314 7 3 10 9.000 9.222 2225 6 4 10 9.000 9.123 123

Análisis de las fracciones de cromatografía de columna por cromatografía en capa delgada

Figura 8.- En una cromatoplaca de SiGelG se aplica la muestra (la fracción) ha analizar y se desarrolla con el eluyente , el número de zonas observadas nos dice sobre la pureza o complejidad del material analizado.

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Principales tipos de metabolitos secundarios

Tipo N° estructuras (1980) Distribución Actividad fisiológica

Compuestos nitrogenados:

Alcaloides 5500 Amplia en Angiospermas Tóxicos y amargosAminas 100 Amplia en Angiospermas RepelentesAminoácidos no proteicos

400 Semillas de leguminosas Tóxicos

Glicósidos cianogenéticos

30 esporádicos Venenosos

glucosinolatos 75 Crucíferas y otras 10 familias

agrios

Terpenoides:

Monoterpenos 1000 Amplia Olor agradablesesquiterpenlactonas 600 En Asteráceas Tóxicos y amargosditerpenos 1000 Amplia en latex y

resinasAlgunos tóxicos

saponinas 500 Más de 70 familias Hemolizan las células de la sangre

limonoides 100 Rutáceas,meliáceas y simarubáceas

Amargos

cucurbitacinas 50 Cucurbitáceas Tóxicos y amargosCardenólidos 150 Asclepidáceas,

apocináceas y escrofuraliaceas

Tóxicos

carotenoides 350 universales color

Fenoles:

Simples 200 universales Antimicrobianosflavonoides 1000 universales Colorquinonas 500 Amplia en Rhmnaceae color

Otros:

poliacetilenos 650 Amplia en asteráceas y umbelíferas

Tóxicos.

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Figura 9.- El 2003 Michael Wink muestra el número de estructuras conocidas, fijarse por ejemplo, que en 1980 se reportan 5500 alcaloides mientras que para el 2003 ya se conocen 12000!. (Phytochemistry 64, 3-19(2003)).

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