Embed Size (px)
Citation preview
22 dansk kemi, 92, nr. 5, 2011
n DET KEMOMETRISKE RUM
Forbedret alginat-analyse med solid state NMR og Multivariate Curve ResolutionDet demonstreres, hvordan multivariate curve resolution af solid state NMR data kan føre til en forbedret kvalitetsanalyse af alginat.
Af Søren Balling Engelsen, Rasmus Bro, Institut for Fødevarevidenskab, Det Biovidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet og Lars Nørgaard, Foss Analytical
Vi har tidligere har vist, hvordan man kan prædiktere sam-mensætningen af alginat ved hjælp af infrarød spektroskopi og PLS-regression (Dansk Kemi, 4, 2009). Byggestenene i alginat-polysaccharidmolekylet er a-L-guluronsyre (G) og b-D-mannuronsyre (M), og forholdet mellem de to byg-gesten er bestemmende for funktionaliteten af alginatmo-lekylet. Det vigtige M/G-forhold måles traditionelt vha. NMR-spektroskopi via en relativ langsom analyse, der bygger på sur hydrolyse og efterfølgende væskefase-NMR-spektroskopi. NMR-spektroskopi er uovertruffen som refe-rencemetode, da man, ved at integrere nogle få baselinjese-parerede resonanser for de anomere protoner, kan bestemme M/G-forholdet for alginat. Men ud over at være langsom-melig, er ulempen ved denne metode, at hydrolysen af poly-saccharidet er destruktiv og kan påvirke analyseresultatet. Man kan imidlertid også vælge at måle alginat med fastfase NMR-spektroskopi. Det vil vi forsøge at demonstrere i den-ne klumme. Samtidig vil vi vise, at MCR er en glimrende metode til at resolvere de ikke helt velopløste kulstof-13 fast-fase NMR-spektre.
Alginat-prøverneFor at undersøge mulighederne for at bruge fastfase NMR til bestemmelse af M/G-forholdet i intakt alginat-pulver blev der sammensat et prøvesæt af 42 forskellige natrium-alginat-pulvere fra Danisco A/S (Brabrand, Denmark) [1]. M/G-forholdet af alle prøverne blev bestemt ved 1H væskefase-NMR-spektroskopi (referencemetode) og ligger med M/G-forhold i området fra 0,4 til 1,7. Der blev derefter målt 13C CP-MAS NMR-spektre (125.77 MHz for 13C) af samtlige prøver. Spektrene af alle 42 alginat-prøver er vist i figur 1 inkl. deres tilordninger til a-L-guluronsyre (G) og b-D-mannuronsyre (M). Kulstofspektrene kan opdeles i tre hovedområder med signaler fra pyranosering-kulstof (60-90 ppm), det anomere kulstof (90-110 ppm) og carboxyl-kulstof (172-180 ppm). Vi fokuserer her på regionen fra 60-110 ppm, der indeholder resonanserne fra pyranose og de ano-mere kulstofatomer. Estimation af M/G-forholdet ved kurvefitningUmiddelbart ser det ud til at være en overkommelig opgave at
Figur 1. 13C CP-MAS NMR-spektre
(500 MHz for 1H) af de 42 alginat-
prøver. Spektrene er farvetonet efter
deres M/G-forhold. (M) mannuronsyre
og (G) guluronsyre.
23dansk kemi, 92, nr. 5, 2011
DET KEMOMETRISKE RUM n
resolvere de overlappende NMR-spektre og benytte resulta-tet til at beregne M/G-forholdet i alginat-prøverne. Som ved væskefase-NMR kan man prøve med simpel kurvefitting med Gaussiske og/eller Lorentziske funktioner. Figur 2A viser re-
A B
sultatet af en kurvefitting med Gaussiske funktioner, og som det ses, opnås der et glimrende fit mellem model og det målte spektrum. Imidlertid er denne slags kurvefitting meget følsom over for antallet af valgte komponenter, interferenser, støj og
Figur 2. Kurvetilpasning med gaussiske funktioner af de fem pyranoseresonanser mellem 60 og 90 ppm. (A) Eksempel med kurvetilpasning. (B) Korrelation mellem forholdet af F-resonansen og G-resonansen og M/G-forholdet beregnet fra referencemetoden. Punkterne er farvetonet efter deres kalciumindhold.
t
24 dansk kemi, 92, nr. 5, 2011
lignende. Som et alternativ kan man anvende MCR på de målte spektre. I dette tilfælde vides det på forhånd, at 13C CP-MAS NMR-spektret indeholder mindst ti forskellige kulstofatomer (fem fra hver monomer), og at deres kemiske skift afhænger af den tilstødende nabomonomer. Imidlertid er disse signaler ikke veldefinerede, og forsøg på at resolvere spektrene i otte forskel-lige funktioner førte til tvetydige resultater. Imidlertid lykkedes det at resolvere de fem relativt velopløste resonanser i pyrano-seregionen fra 60 til 90 ppm (figur 2A). De bedste modeller med bedst korrelation til M/G-forholdet blev opnået ved brug af Gaussiske funktioner uden restriktioner mht. centerposition, bredde og intensitet. Figur 2B viser, som det bedste resultat,
korrelationen mellem M/G-forholdet bestemt ved forholdet mellem F- og G-resonanserne og M/G-forholdet bestemt ved referencemetoden (r2 = 0,98). Der ses imidlertid også systema-tiske afvigelser, bl.a. en overestimering af de lave M/G-forhold og en underestimering af prøver med et højt calciumindhold. Vi vil ikke diskutere dette i yderligere detaljer, men blot konstate-re, at der kan opnås en god kurvefitting-model for bestemmelse af alginatsammensætning. Der ses dog systematiske afvigelser, og metoden ikke er overvældende robust. Estimering af M/G-forholdet ved MCREn alternativ metode til at bestemme alginaternes M/G-forhold fra de stærkt overlappende 13C CP-MAS NMR-spektre er med Multivariate Curve Resolution: MCR. Målet med MCR er at modellere NMR-spektrene med et sæt loadings, der repræsenterer spektre af de rene komponenter og et sæt scores, som repræsenterer de estimerede relative koncentra-tioner af de kemiske komponenter. I dette tilfælde ønsker vi at modellere vores spektre i to komponenter: en svarende til ren mannuronat og en svarende til ren guluronat (i stedet for som ved kurvefittingen at dekomponere spektrene i individuelle kulstofsignaler) og derefter beregne M/G-forholdet ud fra de estimerede koncentrationer af de to monomere i hver prøve.
For at have en mulighed for at validere vores MCR-model blev syv prøver fjernet fra prøvesættet som derefter udgør et uafhængigt testsæt. Testsættet blev udvalgt ved at sortere de 42 alginat-prøver i forhold til deres M/G-ratio og derefter udtage hver sjette prøve. MCR blev derefter anvendt på de
Figur 3. MCR-model af de 35 alginat-spektre plus den rene mannuronat (sort). (A) 13C CP-MAS NMR-spektre farvet efter deres M/G-forhold. (B) MCR loadings: estimerede spektre af de rene komponenter. (C) Korrelation mellem forholdet af M- og G-scores og M/G-forholdet beregnet fra referencemetoden. Sorte cirkler viser prædiktionen af testsættet. Modellen forklarer 99,9% af variationen i datasættet.
Apparater 2011 Apparater 2011 Apparater 2011Nye!
n DET KEMOMETRISKE RUM
CA
B
25
UDSTYR n
dansk kemi, 92, nr. 5, 2011
resterende 35 alginat 13C CP-MAS NMR-spektre i området fra 60 til 110 ppm. Mens det ene af de estimerede spektre ligner et spektrum af ren guluronat, ligner det andet rene spektrum ikke et rent mannuronat-spektrum. Efter lidt yderligere analy-se må vi konkludere, at et rent mannuronat-spektrum ikke kan estimeres ud fra de 35 spektre med M/G-forhold i området 0,4-1,7. Et bedre resultat kan i nogle tilfælde opnås, hvis spek-tre af de rene kemiske komponenter inkluderes i modellerin-gen. Disse kan bidrage med at bryde forskellige korrelationer i data og dermed muliggøre en kemisk meningsfyldt model. Vi har derfor inkluderet et spektrum af en ren mannuronat i vores MCR-modellering. Figur 3A viser resultatet af en MCR-model for de 35 alginat-spektre plus den rene mannuronat. De estimerede rene spektre fra en tokomponent MCR-model er vist i figur 3B. Denne simple MCR-model forklarer 99,9% af variationen i datasættet. Det ses, at det estimerede og det eksperimentelle spektrum af den rene mannuronat er nærmest identisk (figur 3A og 3B). Man ser også, at de signaler, der relaterer til et højt indhold af guluronat (lavt M/G-forhold), ligner det estimerede spektrum af ren guluronat (figur 3B). Det er altså muligt at estimere spektret af ren guluronat.Den største ulempe ved MCR er, at den fundne model ikke al-tid er unik. Her har anvendelse af non-negativity-restriktioner på både scores og loadings vist sig at være nok til at give en robust løsning, når vi samtidig inddrager det rene spektrum af mannuronat i analysen. For at undersøge hvor veldefineret MCR-løsningen er, har vi gentaget MCR-beregningen 1000 gange med forskellige startgæt. Det viste sig, at 98,5% af alle modellerne var identiske, mens 1,5% af modellerne fandt et andet lokalt minimum som ydermere var spektralt urealistisk.
I en MCR-model har hver prøve en score (estimeret relativ koncentration af mannuronat eller guluronat) for hver loa-ding (estimerede spektre af rent mannuronat eller guluronat). M/G-forholdet kan derfor uden videre beregnes fra score-værdierne. I figur 3C ses korrelationen mellem de beregnede M/G-forhold fra MCR-scoreværdier og M/G-forholdet fra referenceanalysen. Figuren viser en meget høj korrelation mellem M/G-forholdet fundet ved de to forskellige metoder: r2 = 0,99 og prædiktionsfejlen, root mean square error of prediction (RMSEP), er kun 0,05. Vi ser endvidere, at denne model ikke har samme systematiske unøjagtigheder som vores kurvefittingsmodel.
OutroVi har vist, at man uden a priori viden om monomersammen-sætningen kan bestemme M/G-forholdet af alginat-prøver ud fra deres 13C CP-MAS NMR-spektre vha. Multivariate Curve Resolution. Hvis man kun har nogle få prøver til rådighed, kan M/G-forholdet bestemmes rimeligt nøjagtigt ved kurvetilpas-ning med gaussiske funktioner. Metoden er imidlertid ikke på højde med den multivariate metode. I næste klumme vil vi, for en foreløbig sidste gang, se på brugen af MCR; denne gang til billedanalyse.
E-mail-adresserSøren Balling Engelsen: [email protected] Bro: [email protected] Nørgaard: [email protected]
Referencer 1. T. Salomonsen, H.M. Jensen, F.H. Larsen, S. Steuernagel & S.B. Engel-
sen, Direct quantification of M/G ratio from 13C CP-MAS NMR spectra of alginate powders by multivariate curve resolution, Carbohydrate Re-search (2009), 344(15), 2014-2022.
AnalysevægtJesma-Davi er totalleverandør af vægte og vejesystemer, der dækker ethvert behov inkl. service, kalibrering og verifi-cering af alle vægttyper. Virk-somheden er bl.a. forhandler af udstyr fra OHAUS.
Discovery analysevægten fra OHAUS er designet til enkel betjening i et laborato-rium, hvor der kræves meget præcise målinger, og hvor de sporbare resultater skal overholde kravene i GLP/GMP.
Vægten har en automatisk temperaturregulering, så den påvirkes ikke af tempera-turændringer i laboratoriet. Vejehuset har adgang fra tre sider, intern kalibrering med to lodder, som sikrer vægtens linearitet til alle tider er kor-rekt, samt stort og tydeligt LCD display i to linjer.
Yderligere information:Jesma-DaviTlf. 75 72 11 00www.jesma.dk
