fosfatasa alcalinaBIOQUIMICA[1]

8/8/2019 fosfatasa alcalinaBIOQUIMICA[1]

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Cintica de la fosfatasa alcalina

RESUMEN

Lafosfatasaalcalinaesunaenzimaquecatalizalahidrlisisdelenlace sterfosfrico entre un grupo orgnico y un grupo fosforiloa pHalcalino,loqueliberafosfatoalmedio.Enestaprcticasevanaestud iaralgunosaspectoscinticosdelafosfatasaalcalinacomercialdemucosaintestinalbovina.Paraellosevaaemplearunmtododeensa yodelaactividaddeestaenzimaqueempleacomosustratounsterdefosfatoartificial,elp-nitrofenilfosfato,cuyahidrlisisdalugarafosfatoya p-nitrofenol.steltimoadquierecoloramarillo apHalcalinoporloquesepuedecuantificarcolorimtricamentea405nm.Seobtendrlacurvadeprogresodelareaccincatalizadaysedeterminarlavelocidadinicialy laconcentracin de enzima. Se comprobar la dependencia de lavelocidaddereaccinconlaconcentracindeenzimaysecalcula r

grficamente la Km de la enzima.

Palabrasclave:EaddieHofstee,Lineweaver-Burk,UnidadesInternacionalesdeactividadenzimtica,velocidadmxima.

Abreviaturas empleadas. PNPP: p -nitrofenilfosfato; PNP: p -nitrofenol; UI:UnidadesInternacionalesdeactividaden zimtica.

1.INTRODUCCINYOBJETIVOS

1.1.Cinticaenzimtica

LacinticaenzimticaeslapartedelaEnzimologaqueseocupadel estudio dela velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas y lascausasdesuvariacin.Losensayosenzimticosseempleanrutinariamente en

muchos laboratorios clnicos para el diagnstico de numerosasenfermedades,bienobservandovelocidadesdereaccinanormalesobienobservando niveles enzimticos inadecuadosenelplasmauotrostejidos.

Unensayoenzimticosebasaenlaactuacindelaenzimasobreunasustancia,llamadasustrato, catalizando su conversin en otra especfica,conocidacomoproducto.Normalmentealgnelementodelosqueintervienenenlareaccinabsorbeluzaunalongituddeondadeterminada,conloquelareaccinpuedeseguirseporcolorimetra o espectrofotometra.


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1.2.Fosfatasaalcalina

Lafosfatasaalcalina(Ortofosfricomonosterfosfohidrolasa,(EC 3.1.3.1)esunaenzimaampliamentedistribuidaquehidroliza (3)elenlacester(1)fosfricoentreungrupofosfatoyunradicalorgnicoapHbsi co(pHptimoentre9y10)liberandofosfatoinorgnico.Estpresenteenrin,hgado,

intestinoyhueso.Lamedidadenivelesanormalesdefosfatasaalcalinaenelsueroindicanlaexistenciadeenfermedadesseasdegenerativas(raquitismo,osteomalacia,hiperparatiroidismosecundario,osteosarcoma)obienda oshepticos. El aumento fisiolgico de los niveles plasmticos de fosfatasaalcalinaseproduceenanimalesenfasedecrecimiento(seest formandotejidoseo)oenhembrasgestantes(fosfatasaalcalinadelapla centa).

Esta enzima, tambin se utiliza como control de la adecuadapasterizacindelalecheycrema,dadoquelafosfatasaalcalinaseinacti vaporcalentamiento.

1.3.Ensayoenzimtico

Como sustrato de la fosfatasa alcalina utilizaremos un compuestoartificial:p-Nitrofenil-fosfatoque,alposeerunrestoorgnicoconungrupofosfatounido,puedeser reconocidoporlaenzima.

El sustrato al ser hidrolizado origina un producto, el p-Nitrofenol,compuestocoloreadoqueensolucinalcalinaabsorbeaunalongituddeondade405nm,porloquesuaparicineneltranscursodelareaccin (Figura 1)puede seguirse colorimtricamente.

Paradetenerlareaccinseaadirfosfato,yaqueelexce sodeesteproductodelareaccininhibelaactividadenzimtica.

O

HO P

O

+

OH Fosfatasaalcalina

+ H2O

O

O

+ HO P OH + H+

OH+

N N- - -

O O O O

p-nitrofenil-fosfato p-nitrofenol

Figura 1.Reaccin enzimtica

1.4.Objetivos

ComprobarlaaplicacinprcticaenellaboratoriodelosprincipiostericosdelaEnzimologa,talescomo:

Efectodeltiempodereaccinenlaaparicindeproducto.

Representacindelacurvadeprogresodelareaccin.

Clculodelaactividadenzimticaapartirdelavelocidadinicialdelareaccin(vi).

Efectodelaconcentracindeenzimasobrelavelocidaddereaccin.


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Efectodelaconcentracindesustrato sobrelavelocidaddereaccin:

RepresentacindeEadie-Hofstee.

Representacin de Lineweaber-Burk.

ClculodelaconstantedeMichaelis-Menten(Km)ydelavelocidad mxima(Vm) a partir de las citadasrepresentaciones.

2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO

2.1.Equipamiento Baotermostatizadoa30C.Colormetro ajustado a405nm(fototubonormal).

2.2.MaterialPipetasdevidrio(5,0ml).PipetaautomticaP-1000(puntas).Propipeta.Rotulador para vidrio.Tubosdeensayodevidrio(1,5x16cm)16enunagradilla.

Cronmetro.Tubos especiales para medir en el colormetro.

2.3.ReactivosTampndeensayo.Solucin sustrato.Enzima:fosfatasaalcalinademucosaintestinalbovina.Solucinparadetenerlareaccin.

3.PROTOCOLOSAREALIZAR

3.1.Efectodeltiempodereaccinenla aparicindeproducto.

3.1.1.A5tubosdeensayoyseaadenlosreactivosquesedetallanenlaTabla1.Seagitansuavementeeincubanenbaotermostatizadoa30Clostiemposindicados.

abla 1: Efecto del tiempo de reaccin en la aparicin de producto.

Tubo (n) 1 2 3 4 5

Tampn (ml) 2 1 1 1 1Sustrato(ml) 1 1 1 1 1Enzima (ml) --- 1 1 1 1

AGITAR SUAVEMENTE E INCUBAR A 30 CTiempo (min) 5 5 10 15 20

3.1.2.A medida que se cumplen estos tiempos, se retira el tubocorrespondientedelbaoa30Cyseleaadeinmediatamente1mldefosfatomezclandolassolucionesparadetenerlareaccin.

3.1.3.Acontinuacinsemidelaabsorbanciaalosdistintostubosa405nm usandoel n 1 como blanco.

3.2. Efecto de la concentracin de enzimasobrelavelocidaddereaccin


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4

3.2.1.Aunaseriede5tubosdeensayoselesaadelosdistintosreactivos segn seindica en la Tabla 2, obtenindose as concentraciones crecientes deenzima en los mismos. Tras agitar suavemente se incubanenbaotermostatizadoeltiempoindicado:

abla 2. Efecto de la concentracin deenzima sobre lavelocidad de la reaccin.

Tubo (n) 1 2 3 4 5Tampn (ml) 2,5 2,3 2,1 1,9 1,7Sustrato(ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0Enzima (ml) --- 0,2 0,4 0,6 0,8

AGITAR SUAVEMENTE E INCUBAR A 30 C 10 minutos

3.2.2.Cuandosecumplanlos10minutosdereaccin,seretiranlostubosdelbaoyselesaadeinmediatamente0,5mldefo sfatoacadaunodeellosmezclandolassolucionesparadetenerla reaccin.

3.2.3.Semidelaabsorbancia alosdis tintostubosa405nmusandoeln1 como blanco

3.3. Efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de lareaccin.Determinacinde KmYVm

3.3.1.AunaseriedetubosdeensayoselesaadelosreactivosquesedetallanenlaTabla3yseagitansuavemente,obtenindosedeestamaneraconcentracionescrecientesdesustratoenlosmismos.Seintroducenlostubosenelbaot ermostatizadoa30Celtiempoindicadoparaquesedesarrollelareaccin.

abla 3. Efecto de la concentracin desustrato sobre lavelocidad de la reaccin.Tubo (n) 1 2 3 4 5 6Tampn (ml) 3,0 2,7 2,4 2,0 1,0 ---Sustrato(ml) 0,0 0,3 0,6 1,0 2,0 3,0Enzima (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

AGITAR SUAVEMENTE E INCUBAR A 30 C 10 minutos

3.3.2.Alfinalizarlos10minutosdereaccin,retirar lostubosdelbaoyaadirinmediatamente0,5mldelasolucindefosfatomezclandoparadetenerlareaccin.

3.3.3.Medirlaabsorbanciaalosdistintostubosa405nm;usandocomo blancoeln1.

4.RESULTADOSESPERADOS4.1.Efectodeltiempodereaccinenla aparicindeproducto.

Laactividaddeunaenzimasedeterminacono ciendolavelocidaddelareaccinquecatali za.Lavelocidaddereaccinsedefinecomolacantidaddesustratoconsumidoodeproduc toformadoporunidaddet iempo.Ennuestrocasorepresentaremoslaaparicindeproductofrentealtiempo(Figura2),obteniendolacurvadeprogresodelareaccin.Elclculodelaconcentracin


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ROFENO

L]

M)

deproducto(p-nitrofenol)sebasaenlaleydeLambert -Beer:A=.C.l;en estecasol=1cmy

(coeficientede extinci n milimolar) es 18,5 mM-1

cm-1

.

0,024

0,018

0,012 d [P]=

dtv=a

i b

0,006 b

a

0

0 5 10 15 20

TIEMPO (min)

Figura2.Representacindelefectodeltiempodereaccinenla aparicindeproducto.

Apartirdeestacurvasecalculalavelocidadinicial(v i)delareaccincomo lapendiente de la parte lineal de la curva de progreso.

Conociendo la v i se podr determinar la actividad enzimtica de lafosfatasaalcalinaenmU/ml,sabiendoque1UIdeactividadeslacantidaddeenzimaquecatalizalaaparicinde1micromol de producto por minuto.

4.1.1.Curvadeprogresodelareaccin. Clculodelaconcentracindeproducto

A = . C.I

AC=

.I

Aplicandoestaecuacinalasabsorbanciasobtenidasparacadaunode

lostubos,teniendoencuentaqueI=1cmy=18,5mM-1cm-1,seobtienela

concentracinproductoformado en cada uno de ellos.Para representar la curva de progreso de la reaccin (Figura 3), se

trasladanlosdatosobtenidosdelosclculos correspondientesdelaTabla4

Tabla 4. Curvade progreso de la reaccin

Tubo(n)

Tiempo(min)

Absorbancia(405 nm)

[Producto](mM)

1 5 0,00 0,00

2 5 0,644 0,035

3 10 0,943 0,051


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6

,2

,

65

5 2 , ,

Fi

.Represent

i ndelprogresodereacc i n:aparici ndeproducto frentealtiempodereacci

n

.1. . l l l l i i i i l.omosedescri eenelapartado4. .

Vi tg=

a

Fi

. Clculode ! elocidad inicial: tg

Aplicandolaecuaci n:

"

Vi =

a=

#,

#5 -0,035

=0 ,003mMmin- 110-5


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7

4.1.3. Determinacin de la concentracindeenzimaenmU/ml. Para determinar las mU/ml de fosfatasa alcalina utilizadas en lareaccinserealizanlosclculosapropiados(apartado 4.1).

Concentracindefosfatasaalcalina=12mUI/ml

4.2. Efecto de la concentracin de enzima sobre la velocidad de la

reaccin.

Enlamayoradelosexperimentoscinti coslaconcentracindeenzimaesmuchomenorqueladesustrato,puesstesueleencontrarseencondicionesdesaturacin,porloqueelfactorlimitantedelareaccineslacantidaddeenzimapresenteenelensayo.Aslavelocidaddereaccin serproporcionalalaconcentracintotaldeenzima.

4.2.1.Representacin de la velocidad de la reaccin frente a lacantidaddeenzimaaadida. Paraelloenprimerlugarsehaceunclculodelaconcentracinde producto

aparecido aplicando la misma expresin que en el apartado

anterior:(A= C I)

Acontinuacinsecalculalavelocidaddelareaccinencadaunodelostubos(mM/min)porelaumentodeproductoenfuncindeltiempodeincubacin:

V=[P]t

TrasladarlosdatosobtenidosdeloscorrespondientesclculosalaTabla 5:

abla 5. Velocidad de reaccin frentea concentracin de enzimaTubo

(n)

Enzima

(ml)

Absorbancia

(405 nm)

[producto]

(mM)

Velocidad

(mM/min)1 0,0 0,0 0,0 0,02 0,2 0,264 0,0143 0,001433 0,4 0,460 0,0240 0,002404 0,6 0,617 0,0330 0,003305 0,8 0,774 0,0410 0,00410

Representacin grfica los datos de la Tabla 5.


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Fi$ % &

'

(

.Efectodelaconcentraci)

ndeenzimasobrelavelocidaddelareacci)

n.

. . E l i l l i li . mi i m Vm.

Siserepresentalavelocidaddereacci nfrentealaconcentraci ndesustratoseobtieneunahiprbolarectangu larcuyaexpresi nmatemticaseconocecomoEcuaci ndeMichaelis-Menten.

Abajasconcentracionesdesustratola velocidadinicialesproporcionaladichaconcentraci n.Cuandolaconcentraci ndesustratoesmuyelevada,lavelocidad de reacci n se aproxima a un lmite superior conocido comovelocidad mxima Vm . El parmetro m se denomina constante deMichaelis-Mentenyes laconcentraci ndesustratoa lacual laenzima funcionaa lamitaddesuvelocidadmxima.

a representaci n de Eadie-Hofstee(Figura 6), como transformaci nlinealdelaecuaci ndeMichaelis -MentenyladeLineweaver-Burkodelosdoblesinversos(Figura7),tambincomotransformaci nlinealdelaecuaci n deMichaelis-Menten, permitenobtenerdemanera fiable la Vmyla m.

Fi$ % &

' 0

.Representaci)

nde Eadie-Hofstee


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9

Enlarepresentaci ndeEadie-Hofsteesesepresentanlosvaloresdelasvelocidadesenzimticasobtenidasfrentealoscocientesdelasvelocidadesentrelasrespectivasconcentracionesdesustratoyseobtieneunarectacuyo cortecon el eje de abscisas corresponde a la Vm/Km y con el eje deordenadasequivalealaVm, siendolapendiente -Km.

Fi1 2 3

4 7. Representaci5

ndeLineweaver-Burk

Enlarepresentaci ndeLineweaver-Burksepresentanlosinversosdelasvelocidadesenzimticasobtenidasfrentealosinversosdelasrespectivasconcentracionesdesustrato.Seobtieneasunarectacuyocorteconelejedeabcisasequivaleavale1Kmyconelejedeordenadasa1/Vm

. .1. i l l i l i /[S .i E i - )

Se trasladan los datos experimentales obtenidos y los clculoscorrespondientesefectuadosalaTabla6yserepresentagrficamentelosparmetrosadecuados(Figura8):

6

4

7l4

8.

9

@

A 3

@ B @

C

D

4

Ei

F C G

@ l4 H @ lI E

iG

4

G

P

3

@

C

D

@ 4 lE I E

i@C

D

@ V/[SQ

Tubo(n)

Sustrato(ml)

[Sustrato](m

R)

Absorbancia(405nm)

[Producto](m

S)

VT locidad(m

U/min)

VV locidad/[S]

(min-1)1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

2 0,1 0,0085 0,068 0,0038 0,00038 0,045

3 0,5 0,0489 0,328 0,0170 0,0017 0,039

4 1,0 0,0850 0,558 0,0300 0,003 0,035

5 2,0 0,1710 0,889 0,0480 0,0048 0,028

6 3,0 0,2570 1,124 0,0620 0,006 0,024


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FiWura8.Representaci

X

ndeEadie-Hofstee:Velocidadfrentealcociente V/[S]

4. . . resentaci n de 1/V rente a 1/[S] (Representaci n deLineweaver- urk).

Se trasladan los valores experimentales obtenidos y los clculoscorrespondientesefectuadosalaTabla7,representandosegrficamentelosparmetrosadecuados(Figura9).

Tabla 7. RepresentaciYnde la 1/V

rentea 1/[S]Tubo(n)

Sustrato(ml)

[Sustrato](m

a)

Absorbancia(405nm)

[Producto](m

b)

Velocidad(m

c/min)

!/V(min/m

d)

1/[S](m

d

-1)

1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

2 0,1 0,0085 0,068 0,0038 0,00038 2631,5 117,76

3 0,5 0,0489 0,328 0,0170 0,0017 588,2 23,314 1,0 0,0850 0,558 0,0300 0,003 333,3 11,76

5 2,0 0,1710 0,889 0,0480 0,0048 208,3 5,84

6 3,0 0,2570 1,124 0,0620 0,006 166,6 3,89

Fieura 9. Representaci

fn de Lineweaber-

gurk: Inversos de las

velocidadesenzimticasfrentealosinversosdelasconcentracih

nesdesustrato.


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3.3. . lculodeVm mmediantelasrepresentacionesde Eadie-ofsteeydeLineweaber- urk.

La Kmy Vmsedeterminanenambaspresentacionesporlospuntosdecortede larecta:

Eadie- ofstee(Figura10)o enabcisascorrespondealarelaci nVm/Km,

o enordenadasdirectamenteindica laVmdelareacci n.

Fiiura 10. Clculode Kmy Vm(Eadie-Hofstee)

Lineweaber- urk(Figura11)o enabcisascorrespondea1/Kmo enordenadascorrespondea1/Vm

Fipura 11. Clculode Kmy Vm(Lineweabery Burk)

5. IS SI Y E TARI S

Losresultadosobtenidos, se fijana losobjeti vosplanteadoseneldesarrollodelaprctica.


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Existe,enlascondicionesdetrabajoempleadas,unarelacin(Figuras3y4)entreeltiempoenquetranscurrelareaccin conlaaparicindeproducto,oloqueeslomismoconladesaparicindesustrato,queindicalav i delamisma,apartirdelacualsepuedede terminarlaconcentracindelaenzima(mU/mL)necesariaparaquetranscurra lareaccinenesascondiciones.

Cuandoseestudiaelprogresodelareaccinutilizandoconcentracionesvariablesdeenzima,sepuedecomprobar(Figura5)comostaesfactor limitante

de la velocidad, siendo dicha velocidad proporcional a laconcentracindeenzimasiemprequeelsustratoseencuentre en condiciones desaturacin tal y como ocurre en las condiciones de trabajo utilizadas.

Anteladisyuntivadeseleccionarunmtodofiablepa raladeterminacinapartirdeunagrficadelaKmyVmdela reaccinsehanutilizadodos,lade Eadie Hofsteecomo transformacin lineal de la ecuacin de MichaelisyMenten,yladeLineweaberyBurkodelosdoblesinversostambinco motransformacinlinealdelaecuacindeMichaelisyMenten.Comosepuedeobservar(Figuras10y11),enamboscasoslosvaloresobtenidosparalaKmyVmsonmuysimilaresyporlotantolosdosmtodosson vlidospara determinarestos parmetros.

6.BIBLIOGRAFACOMENTADA

Nelson DL, Cox MM (2001): Principios de Bioqumica, 3 ed. EditorialOmega(Barcelona,Espaa),pp304-305.

StryerL,BergJM,TymoczkoJL(2003):Bioqumica,5ed.EditorialRevert(Barcelona,Espaa),pp577-580.

ANEXO 1: MEDIOS, SOLUCIONES Y MATERIAL BIOLGICO EMPLEADO

Tampn glicina 100 mM pH 10,4

Tablaq. Tampn glicina 100 mM pH 10,4.

Glicina 7,507 gAgua destilada Hasta 1 litroAjustar el pH con HCla 10,4

Tampn de ensayo: glicina 100 mM pH 10,4; 1mM MgCl2; 1mM ZnCl2

Tabla 8. Tampn de ensayo.MgCl2 0,203 gZnCl2 0,136 gTampn glicina 100 mMpH 10,4 Hasta 1 litro

Solucin sustrato:p-nitrofenil-fosfato 0,3 mM

Tablar

. Sustrato.p-nitrofenilfosfato 0,026 gTampn de ensayo Hasta 200 ml

Solucinparadetenerlareaccin:K2HPO41M


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Tabla 10. Solucin de paroK2HPO4.x3H2O 228,2 gAgua destilada Hasta 1 litro

Solucin enzimtica: fosfatasa alcalina 10 g/200 ml

Tabla11

. Solucin enzimticaFosfatasa alcalina 10 gTampn de ensayo Hasta 200 ml

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