F¡rocrocnnrÍn: Ot.¡rrrvos, r'rÉrouos y EJEtlILos

IILa fibgeografa se defne, en sentido estricto, como el anáisis espacjal delos linajes génicos (Avise et a/., 1987). Este análisis se aplica a nivelesinfraespecífco o de especies cercanarnente emparentadas y suryó hacepoco miás de diez años, en ürtud del progreso que han tenido dos aspectosde la biología evolutiva modema: uno tecnológico, gracias al cuat se comen-zó a disponerde datos de variabilidad intraespecfica en hforma de secuen-cias de ADN, y otro conceptual o teórico, que implicó la aplicación de lateoría de la coalescencia al estudio de procesos microevolutivos. Dadoque enfatiza los aspectos hitóricos de la actual ditribución de los linajesgénicos, la filogeografa puede considerarse como una subdisciplina dela biogeografa histórica, que integra conceptos y técnicas de genéticamolecular, genética de poblaciones, demografa, sistemática filogenética,etología y paleontología (Avise, 1994, 2000). Dos campos de efudiotradicionalmente separadostanto en sus enfoquesteóricos como meto-dológicos, como son la genética de poblaciones y la sistemática, hanencontrado puntos de coincidencia en el enfoque filogeognáfico (Aviseet.a/,, 1987).

La filogeografa aplica por irimera vez el análisis de genealogías géni-cas al estudio de Ia evolución de las poblaciones y permite sacar conclu-srones con respecto a las secuencias de colonización, diversificación yextinción de los linajes génicos en determinadas áreas. Además, el estu-dio comparado de los patrones filogeograficos de varias especiescodistribuidas contribuye a plantear hipótesis sobre posibles eventoscomunes de vicarianza o dispersión y a identificar las causas geológicas,ecológicas o etológicas que pudieran haber influido en ellos.

En un sentido amplio, la filogeografía comprende los estudiosfilogenéticos de la distribución espacial de cualquier caracterídca (mor fo-lógica, etológica, etc.); sin embargo, en la actualidad la disciplina se basaprincipalmente en el análisis de ADN mitocondrial (ADNmt). En espe-cies animales, el ADNmt se ha convertido en un instrumento funda-mental del análisis filogeográfico, pues adem¡ís de no recombinar, Dre-senta una tasa de mutación'elevada y herencia casi exclusivamente ma-terna (Gillespie, 1986; Harrison, 1989). Dado que los ,haplotipos'

ovariantes del ADNmt registran una historia matrilineal de eventosmutacionales, es posible conectarlos de un modo filogenéticamente in-teligible en un filograma, el cual se superpone con la distribución geo-grafica del grupo en efudio (Avise, 2000).

El crecimiento del número de trabajos sobre fibgeografa, desde susinicios en | 987, ha sido explosivo y abarca casitodos los grupos animalesincluido el Homo apiens(Avise, 1998, 2000). Entre las múftiples aplica-ciones del análisis filogeográfico c¿be señalar los estudios destinados adeterminar el lugar de origen y las vías de dispersión de especies conside_radas plagas agrícolas o que han colonizado archipiélagos volcánicos(Roderick y G il lespie, | 99 8 ; Confalonieri et a/., 2000; )uan et a/., 20OO); elgrado de estructuración poblacional de una especie (Osentoski y Lamb,l'995); las causas de la variación poblacional observada en caracerescromosómicos o genéticos y su correlación con gradientes geográfiasy/o ecológicos (Confalonieri et a/., 1998)t el üpo de especiación (simpátridao divergencia alopátrida múltiple) que explica la co-ocurrencja de distin-tos morfotipos de una especie (Bematchez y Dodson, 1990); el recono-cimiento de poblaciones en riesgo de extinción (Avise, | 989; | 996; MoriE,lr994 a,b, I995); y los estudios de filogeografa comparada, que permitenponderar la influencia de la dispersión y la vicarianza en la evolución deespecies codistribu¡das (Bermingham et a/., 1997; Cunningham y Collins,1998). Una mención especial merecen las investigaciones basadas en

A. Lanteriy Viviana A. Confalonieri

ADNmt, tendientes a reconstruir las relaciones fibgenétic¿s de la especieHomo sapiens, a corroborar la principal hipótesis sobre su ongen (,out ofPfrica') y a poner a prueba distintos modelos de evolución para las pobla-ciones humanas durante el pleistoceno (del candelabro, muhirre$onal ydel remplazo africano) (Ayala, | 995 a,b; Ayala et a/., | 994: Brown et al.,1982; Caralli-Sforza et al., 1994; Li y Sadler; 1992; Nei, t995). Estosestudios han sido pioneros y han permitido que la metodología de análisisempleada en humanos se extendiera al resto de los grupos animales.

El presente capítulo tiene por finalidad principal hacer una reseñade los objetivos, principios y métodos de análisis de la filogeografa, ydiscutir algunos ejemplos resultantes de nuestra labor de investigación ytomados de la literatura, con el fin de ilustr¿r el desarrollo crectenre y taimportancia de este nuevo campo de estudio.

Un requisito fundamental para poder establecer genealogías génicases el uso de marcadores genéticos o secuencias de ADN que norecombinen. Si se trabaja con muestras de genes nucleares provenien-tes de individuos entre los cuales existe o existió alguna vez flujo génico,es altamente probable que haya habido recombinación genética duran-te el apareamiento de cromosomas homólogos en la meiosis. Este pro-ceso puede llegar a desvirtuar profundamente las verdaderas genealo-gías de las secuencias, motivo por el cual la mayoría de ios trabajos defilogeografía utilizan marcadores de herencia citoplasmática nomendeliana, como el ADN de las mitocondrias (ADNmt) y de loscloroplalos (ADNcp), o marcadores nucleares en donde se naya cons-tatado que existe poca o ninguna recombinación genética.

En la actualidad la mayor parte de los estudios filogeográficos sebasan en el estudio de secuencias de ADN, sin embargo, los primerostrabajos sobre filogeografa llevados á cabo cuando las técnicas desecuenciación no eran tan accesibles, se realizaron sobre otro tioo deinformación, por ejemplo la que proveen los fragmentos de restricción.En tal sentido, una de las técnicas más utilizadas ha sido la de RFLp(polimorfismos para la longitud de fragmentos de restricción) sobreADNmttotal ffhorpe eta/., 1993; Confalonieri eta/., l99g).

Secuencias del ADN mitocondrial. El ADNmt de los ani_males es una molécula circular; que carece de histonas asociadas. Estaúltima característica sería uno de los factores que favorecen su afta tasade mutación y justifican su empleó a escala microevolutiva, a dferenciade los genes nucleares (Brown et a/., 1979;Wolfe et a/., l9gl. En lamayoría de los animales el ADNmt se hereda por vía materna, puestodas las mitocondrias las aporta la gameta femenina, habiéndose de_tectado transmisión de ADNmt a través del esperma solo en una pocasespecies (Anderson eta/,, 1995).

Las células somáticas típicas poseen cientos a miles de mitocondrias.cada una con varias copias de ADNmt, sin embargo, en general existeun haplotipo mitocondrial preponderante por cada individuo. Esta ca_racterística denominada homoplasmia, resutta fundamental para poderrealizar un análisis filogeográfico donde las unidades de estudio son losindividuos, y probablemente se debe a que dentro de cada poblaciónintracelular de ADNmt, las mutaciones se fijarían en forma rápida porun proceso análogo a la deriva génica.

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filogrupo A

filogrupo

Fig. 4. Filograma hipotético de una especie, en el que se observan dos flogruposclanmente separados por ocho pasos muhcionales. Dentro de cada uno de ellos, losdistintos haplotrpos (representados por círculo$ se sepnn por un solo paso mubcional.Los círculos negros representan los haplotipos más comunes de cada filogrupo.

metodología permite, en primer término, detectar y probar estadísti-camente los mecanismos evolutivos responsables de la distribución espa-cial de los patrones de variación genética observada, y en segundo lugar;detectar posibles deflciencias en los esquemas de muestreo.

El primer paso del análisis es convertir el árbol de haplotipos obteni-do mediante parsimonra, en una red de clados 'anidados', para lo cualdeben aplicarse ciertas reglas de anidación (Templeton y Sing, 1993). Unavez aplicadas estas reglas, el árbol de genes incluié clados anidados, don-de cada nivel sucesivo de la jerarquía se considera más antiguo que losclados subordinados (Fig. 5). El segundo paso consiste en analizar en for-ma conjunta el cladograma anidado y su distribución geogÉfica, tomandoen consideración las frecuencias de cada uno de los haplotipos en lasdistintas poblaciones. Pa.ra esto se calculan dos tipos de distancias: distan-cias de cada clado (Dc), que representan la dispenión geogÉfica de losmiembros de un clado (: haplotipos o dados subordinados) con respec-

to al centro geogÉfico de dicho clado, y distancias de los clados anidados(Dn), que representan el desplazamiento del centro geogáfico de cada

clado anidado, con respecto al centro geográfico del clado entero que los

contiene (Fig. 6) (Cruzan y Templeton, 2000). Por último, se calculan las

diferencias promedio entre las Dc y Dn, para los dados terminales versus

los clados internos, y se determina su significación estadística mediantepruebas de permutación al azar ftempleton y Sing, 1993).

La hipótesis nula del análisis estadístico es que todos los haplotipos

de los clados anidados se distribuyen geogÉficamente al azar. Si esta

hipótesis se rechaza, significa que existen asociaciones significativas en-

Fig. 5. Cladognnu no enraizado de crnco haplotips (A has,ta E). El clado anidado 2- |contiene a los clados subordinados l-l v l-2. Los miembros de c¿da clado e$án seoa-rados por un solo paso mubcional (e,g haplotipos A y B dentro del clado subordinados|-|; o dado subordinado l-I con respecto al |-2).

- - - - - - - - -

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Fig. 6. Elemplo hipotético de análisis de asociacrón geográfca del dado | - | de la fgura5. Los cuadrados blancos representan la ubicación geográlca de lu poblaciones quesolo incluyen haplotipo A, y los cuadndos mitad gns y mitad blanco, poblaciones conigual cantidad de haplotipos A y B. Los círculos delimitados con guiones, indican lasdistancias Dc (de cada clado) y Dn (de los clados anidado$, que representan niveles dedispersión con respecto al centro geogÉlco de cada haplotipo (Dc A y Dc B), y alcentro geográfico del dado | - | (Dn A y Dn B). Este último centro está indiodo con unpequeño rombo (Modifcado de Cruzan y Templeton, 2000).

tre los haplotipos y su distribución geogÉfica ftempleton et a/., 1995).Los procesos básicos que explicarían estas asociaciones son los siguien-tes: a) aislamiento por distancia, debido a flujo génico restringido; b)fragmentación histórica, y c) expansión del área de distribución de laspoblaciones, que incluye eventos de colonización a distancia. Cuandola hipótesis nula no se rechaza, se interpreta que el esquema de muestreoes inadecuado para detectar estructuración geogÉfica o que las pobla-ciones observadas son panmícticas a lo largo de toda el área muestreada.Recientemente, Templeton (200 l) propuso que su método de análisisanidado sea empleado además, para poner a prueba el concepto cohe-sivo de especie. De acuerdo con este lioncepto, una especie es unlinaje evolutivo cuyos límites eliín determi¡ados por fueaas genéticas

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-rluol le epsep seltsa)ns sauoDeztuolo) ap opnpo.rd ,sofa¡duor s-euoqtnu so:gp3oa8o¡g sauo.rled ueouaprrte es sosec soJlo uf .elueuq-uo) le epsep sepeztuolor Jes eled sa¡qruodsrp opqse upLl I ouegro ¡epopuo] le epsap opr&arue upLl splst seqtrp anb ua ¡elodutel pl)uan)esel uof euot)pleJ es lpnl pl ,splst sel ap err8g¡oe8 pepe alueJelp el uolatruaru8uot uoDezruolo) ep eDuen)es eun ua.lal8ns anb sorgg.r8oe8o¡ysauo:1ed oper¡spa.r ueq es sapultue sodruB soun8¡e en¿.(ggg7,7e 7euen[ :q'e OOO:',.F ja uoseLuf :g66 1

,erdsal¡gl¡ruapo¡:¿g6 l

,lunH,{ a¡¡e5 aq) so8edg¡e9 I rrervre¡ ,s€ueuel ep sol or.uo) ,solugolo so8-e¡grdrqtre ue qqeq anb eunel e¡ ep ugoeryrua p I ugrrezruo¡o: ep err-uen)es 'ua8uo

¡e Jetpnlse opts eq onrlelqo olnt so¡¡anoe teleues eqec'saluat)er soge u3 sopP)r¡qnd e¡el3oa8o¡g e.rqos sofeqe4 sosoJeujnusol alul 'spl!u9rlo^ sE¡s! ua sor¡¡gr8oa3ol!, solpnp¡

'u9po8¡e ¡ep onqnl lap ugtsueye el uo) opeuot)eler eluatfer ugDeztuol

-of ep olue^e un ep pt)uentasuo) oulo) ,vnl ep a$epns ¡ep sopnrrdsol uo) 'sprauopoS¡e seuoz ep sapeparo.rd seuelueulepns seuooelqoose¡ ep ue8r.ro ap peprunurol ep srselgdtr.¡ el elpu.lJguo) olsl .€l)ue¡stp euoDezruolo) rod elerr¡dxa e;.rpod anb e,ulergruBrs ergp8oa8 ugt)eDosepun uerlsenu.l efeur¡ alse ap sodrlo¡deq sol ,(966

l) uoleldurel ep ststlgu€¡a u¡3e5 'soprull sope5l ap elsapns ¡ep olauopo8¡e u-oJnlut) lap pu-eur8uo ',a1sepns

lep, eu-r.ro] epeutLuouep el e relttrlts eluauuerrBg¡o¡out'lmNCV ap afeur¡ un e uepapuodselo: (esou.uo1) eur¡ua8.ry l, ¡rsetg'len8e-re¿ ap se.rauopoS¡e spuoz ep sauot)elqod sel ,ou€rluot ol Jod'sorr8g¡oa8 sodr-uaq ua sepadsenL¡ se¡ue¡d sns ep ugt)nquFtp pl opuarn8ri

''lern1eu ugrs.tedsrp:od eare le oppquJp e¡qeq eoadse eqrrp anb opouuep 'seuorstti ap eournold el ua oreuopo8¡e ¡ap opn:rd lep sepjsa)uesauorre¡qod ap pDuolstxe el a.rqos ,(sq¿¡¿) soLutuou€ saope)eul Jeztl-eue le epeelupld srsa¡gdrq e¡ .re.roqorJo) uo.rar¡ulad (g55 ¡

,uo1a¡dua1)opeptue oltlsJpel) ststleue Jotrepod ¡a L salue¡¡nsar selelJpuo)oltLusodrlo¡deq ap seu.re.rSo¡4 so-1 .saluaDar seropeztuolor sauoDelqod ap otrd¡1sa pn) ol 'odr1o¡deq olos un uelnpur anb ,esou.tro3 I len8e.re¿ ep se¡uot ugrrrsodaluol ue ,seleqse)ue sauorre¡qod ep orrppapaec sa anbol 'sapupuololnL sodrlo¡deq ep orelrlfu loleu_r ¡a uau¡al sauorsr¡ ,(ofrxahl ep saFenLU se¡ anb onrlecgru8rs 91¡nsa.r

,oulsturrry.¡¡63 ua8 ¡ap:ryed e o,rnlqo es J€ltLUts u9-r1ed u¡ .o)lx?h ap I sauorsrl¡ ep sauooelq-od se¡ ua aluesne gse anb o-rad ,(esoul.ro¡) eurpa8_ry L len8erq ,¡¡se.rgap.lns '(y¡) sexel ep seJlsenut se¡ ua (orru¡ ¡e o) eluanra.rl seul le seanb y gururouap as anb F

¡Fupuo)olLu odrlo¡deq un g)l¡luapt as lolue8 ¡ap otypSoaSo¡4 srsr¡gue lep opqlnseJ outo3 .(¡pp¿ ,¡r,¡a rur¡Ae¡á5:000Z"ple uauo¡epo3) (¡l ¡esepxo oruo.reol¡r) ¡¡g3l ¡gl sepupuol-o1rr.u seua8 sol ep spt)uames ap ststpue le ue opeseq orggl8oe8o¡¡orpnlse un otfrur as eluapera.rd srselgdrq e¡ eqarud e .reuod erq¿

'aoadsa e¡ ap e:ygSoa8 €erg lep uotsuelxa ap le.rnleu osa)-oro un ap ope{nseJ ourot sepn¡}pl se¡se e ope8a¡¡ u4rqeq anb ,ecqgua8peprl¡qeue op salaruu so1l€ uo) sele.tlsafue sauorre¡qod ,ope¡ o-r1o .rod,( 'u9po8¡e ep soruIn) ap searg ue a¡ueul¡edouud seprnqu¡srp ,ec49ue8peprlrqeuen ep sale^ru sofeq uor ,solueDer seJopezuolof seuooe¡qodopel un rod uaeqsxa rns lep elueurv ua anb pepr¡rqrsoo el setuolua9a1ue¡d a5 'oqeuaS ppptltqeu€ epercla eun ueqefeua.¡ enb se¡euooe¡qodso:lauaed ue pnlltuJts .loleut eun uo) epeuoueleJlo) EqeFa .o)txgl¡ap el ̂ seuorsrl ap u9t)elqod el o4ua eDuelstp Jouaul slsf .(Og¡¡Z,.p

.¡a rur¡8epc5) saauopoS¡e seeJe ap sepruetqo ,kn8er¿ I ¡rsag ,(esouuo3

ap eounord) eurluaS"ry ap seluslsar se¡ uot enb o)x?hl ap sauooe¡qodse¡ uot e:rleuaB pDueptp -¡oueuJ ueqe¡Four ,(sauorsr¡ ap eourno:d ,eu-que3.ry) ¡zen3¡ ¡euooe¡ enb.re¿ ¡ep se¡ueparo.rd seuorrelqoa spl lprD¡e ua ,Sururol .roqq8rau, ep pqJg un JtruFuol ered uo.rez¡rp es seluel-lnsar sot€p sol .(t66

1 ,sure¡ll¡¡l,euual :955¡ ,¡a,ia sue¡¡¡¡¡) e&¡d

sar:adsa ap orgpSoe8 ua8uo ¡a.reuruu.ralep I se¡e.rrgeu sauoDelqoc eperqgua8 pep¡rqepe q reztpue EJed 066 | epsap olx? uo) opuecr¡de auer,ras anb '(.rc2e

¡e soper¡r¡dr.ue NCV lap soutsg.rourr¡od ap srsr¡gue) sg¿1¿ap e:rurfl el aluetpeur ,y¡3 ,( or¡x9¡ lns lep elu?ur\y' ep sauoDelq-od ap etrlgua8 ugtfezuepero el gztpeJ es ,edsle eJeulud eun u1

'

'e8e¡d eqrp ep seuorre¡qod se¡ ap ue8uo le repDnltp ep uU¡e uor o:g9.r3oa3o.oeu_¡ ,( o.llru_l ¡aruu e sauorre8rlselut uolet)tut as enb

ol rod'€66 | oge le ue ze¡ e¡autud .¡od gpepp as eur¡ua8-ry e¡ ul .ugp-o8¡e uor sepelqm spaJg ep ugrsueue ua oluaunp lap pr)uanfesuo)ouro) 'so)uglstq sodue¡ ue lns lap elugurv ep seuo8er selsen I sopru¡sopslsl ap rns la oppztuolo) epqeq anb I or¡x9¡ ap rns lep eueuguosa enb ee.¡l eS'(9g61 ,7e,ra e¡.rng) ery?urv ue orutln) asa ep eut!-ep sgLU ete¡d e¡ sa I (aepruor¡ntrn3 :aaldoe¡o3) ,o.rauopo8¡e lap oue)-xeur opn:d, ouror alueuueS¡n rt aoouco astpuet? snLuouoLlluv .orau-opogp ¡ap opnr¡d lf :E8Eld seltadse Á e;¡ergoa8o¡¡¡

'(955 ¡

'umo"rg I W*S) orru93 otng¡e oze¡d o&e¡ ap oluetuelse un ep opqlnsar ¡a uepas I ,sa.iee¡tnu seua8 lIUJNCIV F eluspeul aluauJeJpp uefouo)eJ as enb sefeur¡ uo) uopouto)sePePlun eFl '(886

| laut¡nu) edo.lnl ep a¡sapns l aluaug orpa¡ ¡ep I:oeu9.ua1peL.J ¡ap alsao ,{ etu;y ap alou ¡ap :¡mrdo,r¡ etr.4y I e.reqe5 ¡apJns lap seluapetord 'sa¡edouud ss)uleuropour sapeprun sár¡ o¡os rrn8u4-srp uoleryu.red souiapouJ s,eu.J sotpn¡se o.lad ,seflLuouoxe¡ sarmdseqns0Z ap ropeperp olursap uetqeq es aallleur srol elaqe q ep os€r le ue'o¡dueta rod '(9661 '566

| 'yatuq I ryeuro¡) sorgradsaalur sodruB

so.4o n ser>dseqns 'sarxdsa.rrn8uqsrp I srrru:guoxsl seuorsr)op JEoopeaed alueyodulr,(nu se (sot19rloyoLu elueLu¡edouud) sot8ololour sar-epe.rpo so¡ I ¡u¡gy ¡a.rod sopeyode solep sol elpa eouaruBuo) el epugoenp e q '(566

| ,'¡e 7a n>yeg) aluau:r:r8g¡o¡orl upDuereJp es ou

enb ap .resad e se¡ue8larup lnuJ uos ILuNCV ap sefeur¡ soun8¡e ,earsnpur:eluaJeJp U.TNCIV ep odrro¡deq un aasod ugr*¡qod epo anb ue erop-efon ou ene '@¡e4sne x'Qa1dy) epuelez e anN ap a1e: /v\t) p Jpuooueu.req€D eporerlr lnu ogpSoaSollj prnprulse uor seoadsa sel aJluf

'(000¿ 'esl$ ¡euor8a"r epledo¡y

eun e optqep sepeJnpruFs alue$pq ueJluan)ua es o)lrp€d lep sqsorsel ep souupLu seuoel ep sptuolo) se¡ I ,pepr¡r8en uer8 ns e ased sa1-ranl sergpSoaSol[ sernpru1se purr.r.]relep serqLuaq se¡ ap e1.r1edo¡g e¡ so8-plgr)rnu.l soun8p ul '¡u.INCV

¡a tod sope¡enal selpaurlu1euJ sa[eur¡ so¡ep u9DUnJ ue eluaul€t)pdsa gJpJnpnJlsa as al:edsa el et)uenfesuofue 'pleu orys ¡e opadsa.r uot sepr.4gdo¡g uos sel€Lutue selladse seq)nL!ep serqLueq sel '(t66

1 ,7e,¡a u¡pny) ¡er:os odruB le peprlapy o leteu

o$s F erJtedol$ oulo) ,oluatulsSrodu.rot lap se)t]straperef se¡ao ,o¡d

-uuale.¡od 'arradsa e¡ ap ugrvadsrp ap pepoedet ua8 e¡ e aseo a1.lenlPes Puot)plqod ejnpfuse e¡ enb ueuru:e1ap enb seropp] ualsrxe ,o3-requra urs '(955¡ 'esnyl,rel leM:566

I ,que1 L qsotueso :5661' le

¡a ra¡eg) se¡an; setgg-r3oa3o¡y se-rnpnlpa leluasa:d ua¡ens (se-rop-plo ou sene 'seJ5a.¡ral se8nyo] I'e) pepryBert Esose ep serredsa se¡'oue4uo) o1-to¿'Q551 './ste uupursspu :¡55 ¡

,rqLun¡e¿) or4p8oe8olyqsr^ ep olund le apsep elueLrjl¡qgp sepelnprulse ugpa I salueSle,r-rp orod aluaul¡elaue8 uos seuot)elqod se¡ (seur.rer.u seuen8l ,soulreLusoperqaye^ut 'sated ,soarg1ar ap seoadse ,E.a) pepr¡Ben ue.r8 ap se¡¡-9nbe u3 '(Lg6l 'Fla asrny) saoadse sel ap Fuor)plqod ugoernpn:1saap sope.r8 salueJalp sol et)uapr^a ue auod oty-e.r8oe8o¡g s¡srleue ll

'eltedsa ap e.¡-ro8a¡er el e as.rpnala ue.¡lpod saleut¡ soqtrpse)uolue 'seJapeJ?l soJJo ua er)uaptla as enb uooeltua:elp el uolelueplo)uo) se safeur¡ ep pDuaptxe el rS .salqeuen se anu splse pJedserfuslstp Jeln)ler ,( ¡enpe o:rug8 ofn¡¡ ap ptfuelsrxa e¡ es:erguen epandanb so¡ ua GA¿W : sorrrugue o se.real)nu saua8 ap o sotr8g¡o¡ouL)serepeJe) soJlo ep .rr¡-red e soptuelqo seloqle arqos ,sopeptuesodrlo¡deq ep pglg ¡a leuodladns epuatrlo)el es .serusoLto) seoaosauos sonnlola safeur¡ so¡ sopol ou o.red sorrp¡one safeui¡ solurprp e uar-aueyd seltseLlo) seltadsa sel sppo] enb opep ,o&equua uts .e tsaqo)a¡ledsa eun ap s,euJ ap pDuesa.rd e¡ lualur epend es ¡orulnlone afeur¡ unap s,eur ep eDue$txe e¡ asleqo.rdr.uor I e¡nu srsalgdrq el esJezeqfeJ aO'(errpluued peprun eun eu.¡Joluol enb.roep se) onrp¡one afeur¡ otru¡un e arauayad soppztpup sonpnput ap odruB la anb plnu srsalgdrq qeqerud e lauod a¡u"ued opolgru ¡a

,eluauernald ouoDuaw es ou.rol'¡epeuotseLlo), e pnpoldeJ peptunujo) eun ueeJ) anb sergorota I

.ugDezuop)al I ugour¡xa ap soprn8as seppuert solua euo.rafnpo.rd as anb e oprqap ,loueu se sodruBq$ a4ua ugoemdes el ap pjooual pep-rpuryotd e¡ '3 I g ua :olru,a3 ofng F pnStlue,hu erar.req eun.¡od uepdas as sodruBo¡¡1sol V aNetpen) le ul telrtltts or4,er3oa3o¡¡1 ug.r¡ed un upllsenul anb seprnquprporsaoedsa sa¿ erd 'sa¡uaLeyp so^qnlo^a soueuetse sa4 ap ugDsluaseJde¡ .¿ .t¡3

'(oooz'aqMse¡q¡ lnu uqlnsal 'sa¡euorsnotd anbune ,soptuelqo sopelnsa.r so¡ Ioduaq ¡ap o3lel ol p optpuaxe eq as (serr3g¡oa8 o sa¡rs91) seuooeulpaseJlo uo) sopqlnsal sope.rcteduror e.led I epua&erup ap seultuJur sep-epe reuiqse prPd sa.re¡nra¡out sefoler 3p oa¡dula ¡a

,o3.requ_ra uls .e)lpJl-ool)nu ugDnillsns ap sessl sel reuotsJolstp uepand enb (,qq a¡dri¡nLu,)sa¡dr¡1¡ru seuoDn¡gns upp es o.,(tgOl '.p ¡a a¡o¡¡) afeur¡ epm apo4uep elqpue ,(nut esel e ueuorrn¡one 1u¡6y ap seuaB I soqs salue.r-eJlp sol anb.lod o 'spyeDut se)en e salts-o, o sergg:Boe8orq set)uapr^eeluen) ue ueuol seuoDpJqr¡er seqtrp anb.rod opol a.rqos ,se)q!l sei.¡e^-rp oprqDeJ ueLl lulNCV ue sppeseq seuooplpp I sa.re¡nra¡ouu salo¡a.reP seuoDerqtlef sq {096 |

,anLury :6g6 | ,e}Llo I elnur;) p}srlpr}neu

pJJoal el ue sefj€J sns euetl saJplnleloul salo¡a.r so¡ ueseq as enbue sorugal solderuo) sol ouJor pt)uarsepof el ap eloal e¡ o1ue1 anbopep 'soryg.r8aSoly sotpnlsa sol uor epeDose eluaureq)erlso peptlpnpee¡ ue gse sotrugS safeur¡ ap er:uafueltp ap sapepe ap ugDeurpa el

' \L661 "/e la arlsrrql)sepr8leuns eluautlenpe selst ue oppzuau.lo) Jaqeq EJrpoo ugt)-elysre^tp ns anb oln¡ruol es ,(so¡e8el L so¡re8 ,seuen8r ou.ro) sat-eu.rue sodn.lS so:1o eled sepeztleeJ seieln)elolu seuotfelep uot ap-ouro: enbune) o8e¡ardrqr.re lep selst se¡ e"ied eLUtuJur etr8g¡oe8 pepeel ape)xe eouaS:errp el ap pepa elsnue&ede¡eg ap oso ¡e ua anbope6 '(t66

1 teiv\o-¡g) soue ap seuollrLu Z e S.l eluaurepeLurxordeereq oprBlarup uel.rqeq anb .sopuv sol ep apao I alsa ¡e soptnqrrlstpsodnrSo¡y sop te:edas alrr..ulad IuNCV ap leaurttrlpur eruaBo¡j elnr'oJere sntuo)UeH esodueuu el ap sauotfelqod ua sopezr¡ee; sorpnlsa epespq el erqos sopod.o.rpe e.red ope.rqr¡er reln)olou./ lo¡a.r un eluerp-oLU'(0002'Zple eJtenbes) soge ep seuoll tLrr ¿.¿ ua gurrpe as oB-e¡gtdrqr.re ¡ap sapadsa salupFeJ sel ,(,srsueo7ede¡e7 9 e.l1ua er:ua8-re^rp el ep pepe e-l .(elsl putstu pun ap slelqgq salua.ralp) e1.r1edo¡e-oJ)rLu o erJlpdLuts ue uotfe)Uts:eltp ep osa)oJd un arar8ns anbogtaq'snue&ede¡a9 ap aoadse eun ap sgLr.t e,(nqr:1srp as ,e:r8o¡oreuolreuoz elueseld enb ,¡eq91sr.r3 ue5 ue ,oLl lstultsV .uoDez-ruolol eun e.red opentape sgu ,oluelq, le oluel o¡ .rod Á ,alueutluo)

l€ euerJe) s9r! elst el se sgulepe anb ,(¡eqgpr.r3 ue5) o8e¡grdrqt.re ¡apen8rlue sgu.r plst el ue elnqr.rlsrp es,srsuao7ede¡e7 .9 'psegseut ar¡ad-sa e¡ anb errpur (¡63) lurNev ap set)uen)es ap .rrped p optualqoerue-r3ope¡r ¡3

'seurx-o.rd aluautery_el8oe8 se¡sr a:1ua seuor)ezruolofeJÁ tued ap auou le epsap elueJJn)eJ ugr)eztuolot ep uo.rled un.apelruelslxa e¡ ualarBns '(OOOZ "p 7a e.rrenba5) se.reln)eloLu ^ eeAl'ualuel) sorr89¡o¡or-u se:epeJel ap stsrlgue la elu€rpaur saroualuesorr¡9ue3o¡¡} sorpn¡s3 .seDadse pl ep u9r)e)Urs.renrp I o8e¡grdrqt.le ¡apselsr sel ap ugt)eztuolo) ap et)uan)es e¡ e opadse: uot sernald slsal-9drq eqenld e.reuod sa onrlafqo olnt lopenrl ,( ¡.re¿. ap euou lepsPlso) sel ue I so8edg¡e9 ep o8elgtdtLl)Je le ua optnq¡rlstp .(oeptuorl-nun3 'ere¡doap1) snueSede¡a9 o.reug8 ¡a ua orge.r8oe8o¡g orpnl-se un Jeztlee./ e oppzueulo) eq ugoe8rlsenur ep odn.r8 orpanN

,\100z''.F te saeu) alueul

-e^rpedser 'soge ep seuolltu g ,{ S.9 e)eq JP)utsre^rp e opezueLu--o) u€uqpq as (eeptuouqeuel :e.reldoe¡o3)e4aut¿ A -tala7a¡1 anboluPl u3 'soup ap sauollil.ll z 3p soueuJ a)pLl ugt)p)utsJe^rp ns op-ezuauor I se¡sr se¡ e opeqr.r-re ueltqe,4sanp,,ecetg Asnqtre¡e2 :ugD-ezruolol ep soluene so¡ oponpo.rd uelqeq es anb ua sodr-uerl so¡opeur$a ueLl es oLustutl$/ .( 100¿

,7e ,ia sae¡) sorr8g¡ote seluarq-ule solutlstp uo) soppt)ose sodr¡o¡ou.r uoJeoouo)al es ,etJpue3uerg ue qlqeq enb (eepruor.rgeual :e.re1doa¡o1.)se¡ose¡1 ap arradseeun ue I :(q 000¿

,7e le uosJeu¡j) se¡sr e.rtrue saluen)asqns seuors-radsrp uor 'seluarpuadeput uot)eztuolo) ap soluane sarl uole)Utluepras (aeprqe.re3 :e-reldoe¡o3) snt#eF) ep ose) le ue :(e OOO(.

,7e lauovau3) (¿¿5 ¡) utpurug ep optluas ¡e ua etgo¡o-ror ugrsel8o:d e¡ epe¡8e.r e¡ oprnBas eq (aepruol¡ntrn3 :e.ra¡doa¡o3) snso1nt sanp,lqtetgap e¡ed.rod ugoezruo¡ot ep et)uenfes pl ,seueue3 ap o8e¡ardlq>"re¡a ua 'o¡diuafa .ro¿ .(e¡sr pulsruJ pl ap setr8g¡ora seuoz salueralrpue) pr.¡1edu.rrs o (se¡sr selurprp ua) e.¡.r1edo¡e ap seuoopnlrs ," ,,rráB-rerup ,( seuotfulye ,seup)Jet SElst epsep seuot)eztuolo)eJ o alueu

'uot)ezluolo)ar ̂ ugDutye ap soprn8as salueueln solua^e epeoueJJn)o el e optqep ,eluar)eJ spr.ll se sop sorlo sol ua I ,en8que,(nu.rsa arradsa e¡ ep sodru3o¡¡1 sop sol e4ue ugne.redes e¡ ose>.raurud ¡a u3'se1ueru8uo: uos salen) sol 'septnquprpol sel¡adse se4 ep so)rl?lodtt¡sotyglSoaSo¡q sauo4ed ue¡uasalda,r as ¿ e.rn8¡¡ el uj .(g66

| ,sur¡¡o3 I

lueq8uruun3) eoua&enrp e¡ ap ¡aodr.ual peprpunlold e¡ ue et)uepJoruol,(eq ou ¡e.raue8 o¡ .rod ,oS.requue uts ,eluantel1 se s€ptnqulstpo) set)-adse seluqsrp ap sor¡g.r3oa8o¡y sauor¡ed e4ue eoueruEuo, .f .(OOOZ'asrny) e ueut¡euotftpeJl sopt)ouo)al sorgp8oa8orq soltJlstp o spt)-ur,ro.ld ap saILuJl sol uo: elueruBuor sa u9t)nqu5rp elnr (saoedseqnso sauorre¡god ap sodru3 ,sauooe¡qod) sodruBo¡y ue¡uasaJoar .lu.¡NCVep seua8 ep saloqrg sol ap se¡edrruud seuJel sel ¡sosel soq)nu uf

.(OOe I

,Sgg t

,qoor€) qooJg ep etuoursreo ep srsttgu€lo so sopezrltln elueuJelueuJo) s,eul soperL¡Jtpefo.rd so¡ ep oun .(566

|'osu3,( auo.t.ro¡ : g¿5 ¡,uos¡a¡ I )prulpld :5¿6 | uasgg) ezueuel^ el ep oeltlsJpep eraSoaSorq ua enb soFrolgLu soulstur so¡ uee¡du,¡a as epaedruore¡a8oe8o¡g uf .sereltults so:r8g¡ora o solqnlo e seJope;.rod sepepepoprs upr1 enb I ,ugruot euolstrl pun uepedulo) o uefa¡el anb.ru¡a.rd.ra1urapano as '.reltLuts opou ep a¡ueunggSoeSolu sepejnprulse uglse septnq-lrlslpo) ser)odse seue lS .0.66

| ,f¡nbuo¡ :g66 I

,4uor¡ I ueq8urut-rag) u¡r-uor ue seuorled ratelqqse ap o¡afqo la uo) ,septnqulstpo)saoadsa serre^ ep seleupuo)o¡Llr sodrlo¡deq "p ,"r,r9u"áo¡¡¡sauot)elar spl reztpup o¡efqo.rod auar¡ epe.redu.ror e¡efoa8o¡¡1 r¡

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ruesuo) uo4eruasuof ol eruerre¡e.r1o lqde.rSourep pue oqeueS uaar*pquorpeuuore pue ulstqorour4odVNC Fupuor1lolh

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'lro^ p^anN 'llpH pup uer"udeq3'uotnlo e pue Árolstq ¡ernleu

'ste4tetu relDeloN 'v661 2

-f ,esl^v' lg7.-6L(.ir'/o^J

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'8S06-tS06 :V8'VSn 'PS 'pnv UeN "o¿l 's\y'Nc rpapnu

pue 'pe¡do,ro¡qr 'leupuoq)olul lue¡d Suouue ,{pa.É l,re,r uoqnllsqnsaprloapnu Jo salpu'¿96 | .dreqg .W .d,{ .!.1 .H-.tn ..H .)l .ailoln'S€S9-

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