G-CSF 介导的“ CXCR4 效应”和“非 CXCR4 效应”心肌缺血后心律失常发生中的作用

Cardiovascular Disease

G-CSFG-CSF 介导的“介导的“ CXCR4CXCR4 效应”和“非效应”和“非 CXCCXC

R4R4 效应”心肌缺血后心律失常发生中的作用效应”心肌缺血后心律失常发生中的作用

中国人民武装警察部队医学院附属平津医院武警部队心血管病研究所中国人民武装警察部队医学院附属平津医院武警部队心血管病研究所

罗涛李玉明罗涛李玉明周欣周欣刘红梅恽佶例刘红梅恽佶例

The role of G-CSF mediated “CXCR4 and non-CXCR4 effecThe role of G-CSF mediated “CXCR4 and non-CXCR4 effects” in post-ischemic arrhythmogenesis ts” in post-ischemic arrhythmogenesis


粒细胞集落刺激因子 Granulocyte Colony-Stimulating Factor, G-CSF

—— 血液病治疗

—— 无创、方便

有争议

动员骨髓中多种干细胞用于心肌梗死干细胞治疗


G-CSF 治疗心肌梗死作用机制

G-CSF 动员的骨髓干细胞直接转分化为心肌细胞及血管组织

G-CSF 动员的骨髓干细胞通过旁分泌机制发挥促血管再生、减少细胞凋亡

G-CSF 直接作用于靶细胞上的受体发挥细胞保护作用


Sham Operation MI control MI + G-CSF

0 30 60 900

25

50

75

100

Sham

MI Control

MI + G-CSF

MI + MSCs

Days after Myocardial Infarction

Per

cen

t su

rviv

al

Cardiovasc Res, 2008, 80(3): 425-34.


有创血流动力学检测


大鼠心肌梗死后非梗死区心肌细胞横截面积比较

采用 FITC 标记的 WGA 染色心肌组织切片，细胞轮廓清晰可见（绿色荧光） DAPI 标记细胞核（蓝色荧光）放大倍数为 ×200 倍。* 与 7 天同处理组比较 P<0.05 ，†与同时间点 sham 组比较 P<0.05 ，‡与同时间点saline 组比较 P<0.05 ，＃与同时间点 I-G 组比较 P<0.05 。

非梗死区心肌细胞病理学改变


G-CSF/SCF reduces inducible arrhythmiasin the infarcted heart potentially viaincreased connexin43 expression and arteriogenesis

Michael T. Kuhlmann et al.

The Journal of Experimental Medicine. 2006. 203: 87–97


究竟是何种原因引起究竟是何种原因引起 G-CSFG-CSF 对心脏结构和对心脏结构和血流动力学的作用效果和电生理效果出现血流动力学的作用效果和电生理效果出现差异，分离？差异，分离？


JAK-2

SDF-1

SDF-1

SDF-1

G-CSFR

G-CSF

Akt

eNOS

Stat-3

Bcl-2 Bcl-xl

G-CSF

nertrophils

Peripheral bloodCXCR4 AMD3100

AMD3100

RegenerationPancrine (VEGF, bFGF)

CXCR4 effects

Non-CXCR4 effects


探讨探讨 G-CSFG-CSF 对离体心肌细胞模型离子通道电流的影响；对离体心肌细胞模型离子通道电流的影响；

探讨探讨 G-CSFG-CSF 单独作用、单独作用、 G-CSFG-CSF 与骨髓干细胞表面受体与骨髓干细胞表面受体 CXCX

CR4CR4 的拮抗剂（的拮抗剂（ AMD3100AMD3100 ）联合作用对缺血心肌电生理）联合作用对缺血心肌电生理

特性的影响差异；特性的影响差异；

探讨探讨 G-CSFG-CSF 对早期（对早期（ 77 天）电生理特性的影响是否能够持天）电生理特性的影响是否能够持

续到心肌缺血后的慢性恢复期（续到心肌缺血后的慢性恢复期（ 33 月）月）

【研究目的】【研究目的】


Wistar Rats

250-300g正常Wistar Rats

断颈处死后，迅速完整取下心脏，在低温环境中适当修剪

将心脏固定于Langendorff灌流系统，主动脉逆向灌流

模拟缺血条件下分为两组

G-CSF干预组 Control组

膜片钳检测心肌细胞离子通道变化

7 Days 3 Months

建立缺血心脏模型（MI和I/R)

Sham

组

G-CSF-Instant 组

G-CSF-Delay 组

G-CSF+AMD3100-Instant 组

G-CSF+AMD3100-Delay 组

断颈处理，将心脏挂于Working Heart灌流系统，主动脉逆向灌流

复跳后稳定20min

测定心脏电生理参数：窦性心动周期，心室有效不应期，单相动作电位，室颤阈值

和室颤时程等


第一部分细胞电生理实验


不同浓度 G-CSF 干预条件下得到的电流

L 型钙离子通道（ ICa.L ）

激活曲线和失活曲线（激活曲线由 I-V 曲线计算获得，均可为 Boltzmann

方程（ y={1/1+exp[(Vm － V0.5)/s]} ）拟合）


I-V 曲线和激活曲线

钠离子通道（ INa ）

失活曲线和静态失活曲线


细胞电生理结果小结

急性急性 G-CSFG-CSF 干预下，模拟缺血条件下心室肌细胞干预下，模拟缺血条件下心室肌细胞 ICa.LICa.L 的的 I-VI-V 曲线发曲线发生了改变，呈剂量依赖性增加；失活曲线未发生变化，激活曲线在生了改变，呈剂量依赖性增加；失活曲线未发生变化，激活曲线在 3030

0μg/kg0μg/kg 的时候向右偏移，表明离子通道更容易激活；的时候向右偏移，表明离子通道更容易激活； 300μg/kg G-CSF300μg/kg G-CSF

同同 100μg/kg G-CSF100μg/kg G-CSF 相比，电流密度无明显统计学差异。相比，电流密度无明显统计学差异。

给予最大剂量（给予最大剂量（ 300μg/kg300μg/kg ）） G-CSFG-CSF 对缺氧条件下心室肌细胞急性干对缺氧条件下心室肌细胞急性干预，预， INaINa 的的 I-VI-V 曲线、激活曲线、失活曲线和静态失活曲线均无明曲线、激活曲线、失活曲线和静态失活曲线均无明显变化。显变化。


第二部分在体心肌缺血模型实验


saline

术后 7 天术后 3 个月

动物分组及技术路线

即刻治疗组（ I ）再灌注 1h 后开始治疗

延迟治疗组（ D ）再灌注 24h 后开始治疗

假手术（ n=18 ）缺血 60min/ 再灌注（ n=111 ）

Wistar rats (n=129)

G-CSF+AMD3100 （ GA ） G-CSF （ G ）

电生理检测病理学分析血流动力学检测


G-CSFG-CSF ：： 100μg/kg/d100μg/kg/d ，连续，连续 55 天；天；

即刻给药组：静脉注射（首次）静脉注射（首次） ++ 皮下注射（皮下注射（ ××4d4d ））

延迟给药组延迟给药组：：皮下注射（皮下注射（ ×5d ×5d ））

AMD3100AMD3100 ：： 1mg /kg/d1mg /kg/d ，腹腔注射，连续，腹腔注射，连续 66 天。天。


采用 Langendorff 灌流装置进行离体电生理实验


实验动物的一般情况及术后存活情况

Groups7 days 3 months

Total (n) Survival (n) Total (n) Survival (n)

sham 8 8 10 10

saline 16 14 10 9

I-G 11 8 10 8

D-G 14 10 10 9

I-GA 9 8 10 9

D-GA 11 8 10 8

本实验成功造模 129 只，在观察期间共死亡 20 只，最后纳入实验结果的为 109 只，其中 18 只为 sham 组（无一死亡）。各处理组均保证最后有 8 只以上大鼠纳入实

验。


大鼠心肌缺血 / 再灌注心肌梗死模型的建立

图大鼠心肌缺血 / 再灌注模型制作过程中心电图的动态演变


外周血细胞计数分析


主要离体电生理参数变化

窦性心动周期窦性心动周期有效不应期与有效不应期与 MAP90MAP90 离散度离散度


单相动作电位和有效不应期单相动作电位和有效不应期



室颤和室速记录图室颤和室速记录图



室颤阈值室颤阈值


室颤时程室颤时程


有创血流动力学检测


大鼠心肌梗死后非梗死区心肌细胞横截面积比较

采用 FITC 标记的 WGA 染色心肌组织切片，细胞轮廓清晰可见（绿色荧光） DAPI 标记细胞核（蓝色荧光）放大倍数为 ×200 倍。* 与 7 天同处理组比较 P<0.05 ，†与同时间点 sham 组比较 P<0.05 ，‡与同时间点saline 组比较 P<0.05 ，＃与同时间点 I-G 组比较 P<0.05 。

非梗死区心肌细胞病理学改变


心脏整体电生理结果小结即刻即刻 G-CSFG-CSF 干预组和延迟干预组和延迟 G-CSFG-CSF 干预组较干预组较 I/RI/R 对照组心对照组心

脏整体电生理指标均有改善，但上述两组电生理指标均未脏整体电生理指标均有改善，但上述两组电生理指标均未

恢复到恢复到 ShamSham 组水平组水平 ((PP<0.05)<0.05) ；；

即刻即刻 G-CSFG-CSF＋＋ AMD3100AMD3100 干预组和延迟干预组和延迟 G-CSFG-CSF＋＋ AMD31AMD31

0000 干预组电生理指标均基本恢复到干预组电生理指标均基本恢复到 ShamSham 组水平。组水平。

缺血再灌注缺血再灌注 77 天各干预组心脏整体电生理指标改善能够延天各干预组心脏整体电生理指标改善能够延

续到缺血再灌注后续到缺血再灌注后 33个月。个月。


讨论讨论

Cardiovascular Disease G-CSF

CXCR4 SDF-1α

disruption ofCXCR4/SDF-1α complexs

BMSCs mobilization

AMD3100

myocardiocytesrescued,

angiogenasis

BMSCs differentiation,pacrine effects

myocardiocytesregenaration,angiogenasis

Total Effects

peripheral blood

Bone marrow Heart

G-CSFR(neutrophils)

G-CSFR(myocardiocyte,EC)

enzymatic digestion(MMP-9,elastase,et al.)

Jak2

Stat3bcl-2,bcl-xl

Akt-eNOS

othermechanism ?

BMSCs

CXCR4+

SDF-1

AMD3100

CXCR4 effects

Non-CXCR4 effects


非梗死区心肌肥厚

负性肌力作用

募集

改善

SDF-1 CXCR4

AMD3100

AMD3100

Pflugers Arch, 2007, 455(2): 241-50.

改善

可能机制：即刻 G-CSF 治疗

动员 CXCR4+ 干细胞

损伤心肌

参与炎症反应

加重心肌损伤

被炎症反应损伤

削弱保护作用

LV 机械和电重塑

影响瘢痕形成即刻 G+A 治疗


00 ～～ 300μg/kg300μg/kg 范围内不同浓度范围内不同浓度 G-CSFG-CSF 急性干预条件下，随急性干预条件下，随 G-CG-CSFSF 剂量升高缺氧大鼠心室肌细胞剂量升高缺氧大鼠心室肌细胞 LL 型钙离子通道电流密度逐渐增大，型钙离子通道电流密度逐渐增大，300μg/kg G-CSF300μg/kg G-CSF 同同 100μg/kgG-CSF100μg/kgG-CSF 相比，电流密度无统计学差异，相比，电流密度无统计学差异，表明表明 100μg/kg100μg/kg 为为 G-CSFG-CSF 最佳干预剂量。最佳干预剂量。

结论结论

最大剂量（最大剂量（ 300μg/kg300μg/kg ）） G-CSFG-CSF 干预条件下，钠离子通道干预条件下，钠离子通道各项指标无明显改变，表明急性各项指标无明显改变，表明急性 G-CSFG-CSF 干预对钠通道无影响，即心干预对钠通道无影响，即心肌细胞动作电位上升支无改变。肌细胞动作电位上升支无改变。

即刻即刻 G-CSFG-CSF 干预优于延迟干预优于延迟 G-CSFG-CSF 干预；早期心脏整体电干预；早期心脏整体电生理学指标改善能够延续到缺血心肌慢性恢复期；联合生理学指标改善能够延续到缺血心肌慢性恢复期；联合 G-CSF+AMG-CSF+AM

D3100D3100 干预组有强于单独干预组有强于单独 G-CSFG-CSF 干预组的趋势。干预组的趋势。


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G-CSF 介导的“ CXCR4 效应”和“非 CXCR4 效应”心肌缺血后心律失常发生中的作用