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GARANZIA DI QUALITA’ DEI DATI ANALITICI e DELLE PRESTAZIONI DEI MEZZI E DEGLI STRUMENTI
Quando i metodi analitici vengono applicati a probl emi del mondo reale, la qualità dei risultati , nonché la
qualità delle prestazioni dei mezzi e degli strumenti usati , deve essere valutata costantemente.
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Cosa vuol dire “qualità del dato analitico”?
Le misure analitiche, in qualsiasi ambito, devono essere affidabili e comparabili per poter essere di
aiuto nei processi decisionali
Il metodo di analisi applicato dal laboratorio deve avere
prestazioni stabili nel tempo in modo da garantire la
confrontabilità dei risultati, quindi la loro “qualità”.
Necessità di prendere decisioni in merito a sostanze vietate (es: additivi), dannose, rischiose per la
salute, non dichiarate in etichetta:
Importanza della qualità del dato analitico dal punto di vista legale
1) Indicazione della presenza o assenza di una certa sostanza in un campione di analisi
2) Confronto della quantità di sostanza presente con un riferimento: presenza della sostanza al di
sopra del limite di legge previsto
Il dato analitico prodotto deve essere corredato da opportuni parametri che ne indichino la QUALITA’
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La validazione può essere applicata ai:
campioni
metodi
strumenti
dati
La principale attività coinvolta è la:
VALIDAZIONE
VALIDAZIONE DEL METODO
Validare un metodo analitico significa mettere
in atto tutte le procedure necessarie per
dimostrare in modo oggettivo che il metodo è
adatto allo scopo per il quale si esegue l’analisi
ed è tale, quindi da eseguire le operazioni per le
quali è stato sviluppato, in modo affidabile e
riproducibile.
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Eurachem è una rete di organizzazioni, fondata nel 1989 con lo scopo di promuovere la qualità nella Chimica Analitica in Eu ropahttp://www.eurachem.org/
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Manuali ARPA –Accreditamento e Certificazione: “Linee guida per la validazione dei metodi analitici e per il calcolo dell’incertezza di misura” – Ed. settembre 2003
� Norma UNI CEI ENV 13005:2000 “Guida all’espressione dell’incertezza di misura”� “Quantifying uncertainty in analytical measurement” Eurachem, second Edition 2000.� Documento SINAL DT-0002 Rev.1 Febbraio 2000 “Guida per la valutazione e l’espressione dell’incertezza di misura”� Documento SINAL DT-0002/3 Rev.0 Aprile 2000 “Avvertenze per la valutazione dell’incertezza nel campo dell’analisi chimica”� Documento SINAL DT-0002/4 Rev.0 Aprile 2000 “Esempi applicativi di valutazione dell’incertezza nelle misurazioni chimica”� “The fitness of purpose of analytical methods” A laboratory guide to method validation and related topics Eurachem 1998.� Manuale UNICHIM 179/1 “Valutazione della precisione (ripetibilità stretta ) di un metodo analitico eseguito in un unico laboratorio da un solo operatore su di un unico strumento in un breve intervallo di tempo” Edizione 2001
�Manuale UNICHIM 179/2 “Valutazione della precisione (ripetibilità) di un metodo analitico eseguito in un unico laboratorio con più operatori/strumenti” Edizione 1995
� M. Thompson and P. Lowthian “The Horwitz Function revisited” J.A.O.A.C. 80 (1997) 676-679
� M. Thompson ”Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing” Analyst 125(2000) 385-387.
� AOAC/FAO/IAEA/IUPAC -“Guidelines for single laboratory validation of Analytical Methods for trace level concentrations of organic chemicals”
� Rapporti Istisan 97/23 “Metodi multiresiduo per l’analisi di residui di antiparassaitari in prodotti vegetali”
� Document Sanco/3103/2000: Quality control procedures for pesticide residues analisys. Guidelines for residues monitoring in the European Union second editino, 1999/2000
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La validazione determina quindi l’adeguatezza di
una analisi a fornire l’informazione desiderata.
E’ la conferma, sostenuta da evidenze oggettive, chei requisiti relativi ad una specifica utilizzazione oapplicazione prevista sono stati soddisfatti (UNI ENISO 9000:2000)
Il mezzo con cui ottenere una “oggettività” dei risultatiper la determinazione della prestazione di un metodoprevedono :
1) PROVE DI LABORATORIOdovrebbero essere una, o una combinazione dei seguenti processi:
� utilizzo di: a) materiali standard di riferimento , quando disponibili(i materiali di riferimento certificati (CRM) sono prodotti da entiinternazionali riconosciuti. Una importante sorgente di q uestistandard è l’Istituto Nazionale degli Standard e della Tecnologia(NIST) ma anche BCR, BAM ecc.) ; b) campioni sintetici campioni oche simulano la composizione chimica dei campioni da analiz zare;
� confronto dei risultati ottenuti con altri metodi;
� confronti interlaboratorio.
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2) DATI ANALIZZATI STATISTICAMENTE
- valutazione sistematica dei fattori che influenzano il
risultato;- stima dell’incertezza di misura
Tutti gli esperimenti di validazione utilizzati perdimostrare o trarre conclusioni sulla validità del metodo,devono essere documentati in una RELAZIONE(RAPPORTO DI VALIDAZIONE).
Quali metodi validare ?� i metodi non normalizzati (non standard methods)
� i metodi sviluppati e/o progettati dal laboratorio
� i metodi normalizzati ma utilizzati al di fuori del proprio scopo e campo di applicazione prefissato (metodi interni)
� estensioni e modifiche di metodi normalizzati
� i metodi normalizzati Ma attenzione!
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“ il laboratorio deve confermare che può
correttamente eseguire i metodi normalizzati prima
di metterli in opera”
Questo processo è anche chiamato
“Validazione secondaria “
In pratica un metodo si considera validato quando:� è adeguato per l’uso a cui è destinato� fornisce dati analitici utili in determinate situazioni� risponde alle richieste poste dal problema analitico considerato� assicura il livello di prestazioni prestabilito� permette di ottenere ciò che ci si aspetta di ottenere
La validazione viene spesso eseguita dall' analista ma può anche essere compiuta dal
personale supervisore.
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In linea generale quando un metodo viene sottoposto a
validazione è necessario porsi le seguenti domande :
quali parametri si devono scegliere e controllare?
quali procedimenti devono essere usati per valutare un particolare parametro?
quali sono i criteri con cui giudicare i valori di un parametro?
I requisiti che il metodo analitico deve
soddisfare si definiscono in base a:
� requisiti prescrittivi,
� raccomandazioni di organismi
nazionali o internazionali o di società
scientifiche,
� prestazioni analitiche di altri
laboratori,
� giudizio professionale.
In accordo a quanto previsto dalle linee guida internazionali(IUPAC Technical Report 2002, EURACHEM 1998) lecaratteristiche prestazionali da valutare durante la fase divalidazione di un metodo sono:
PARAMETRI PER LA VALIDAZIONE DI UN METODO
� specificità
� accuratezza (esattezza)
� precisione
� limite di rivelabilità
� limite di quantificabilità
� intervallo di linearità
� sensibilità
� robustezza
� incertezza di misura
BISOGNA VALUTARLI
TUTTI ?
NO
L’operatore sceglie e valuta quelli significativi per il metodo
La scelta sarà funzione della tipologia delmetodo in esame, allo scopo diminimizzare l’impegno necessario allavalidazione.
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QUAL I PARAMETRI ?
La Tabella suggerisce i parametri di validazione da prendere in considerazione in funzione dello scopo del metodo di prova da validare.
I parametri da stimare vanno scelti tra quelli previsti in tabella, in funzione anche delle modifiche eventualmente apportate al metodo.
La validazione viene indirizzata verso quei parametri che in base alla logica e all’esperienza potrebbero essere influenzati dalle modifiche.
Scopo della Prova
Parametro
QualitativaPresenza/assenza
Quantitativa
Analisi di tracce
Selettività/Specificità + + +
Limite di rivelabilità LOD + - +
Limite di quantificazione LOQ - - +
Linearità-intervallo - + +
Sensibilità - + +
Precisione:
Ripetibilità - + +
Precisione intermedia - + +
Esattezza - + +
Recupero - + +
Robustezza + + +
Definizione dei requisiti di accettabilità
Nella prima fase del processo di validazione, è indispensabile
che il laboratorio stabilisca i requisiti di accettabilità per ogni
parametro di validazione .
Tali requisiti possono essere :� espressamente riportati in specifiche norme di legge oppure in norme nazionali/internazionali;
� riportati come specifiche del metodo di prova oggetto di studio;
� fissati dalla direzione del laboratorio in base ad esigenze di carattere economico e di mercato o su richieste specifiche dei clienti.
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a) predisposizione del piano della validazione che definisce i requisiti dasoddisfare per l’applicazione prevista;
b) descrizione accurata del metodo da sottoporre a validazione;
c) studio dei parametri di validazione ;
d) accettabilità dei parametri di validazione;
e) redazione del programma operativo tenendo conto dei dati giàdisponibili, i parametri non applicabili e descrizione delle azioni daeseguire (esperimenti, elaborazioni di dati o altro) per verificare larispondenza delle caratteristiche del metodo ai requisiti previsti;
f) esecuzione del programma operativo, registrando ed elaborando i datianalitici e documentando le informazioni altrimenti acquisite;
g) redazione del rapporto di validazione a dimostrazione dell’evidenzaoggettiva del processo di validazione
La validazione di un metodo analitico deveprevedere le seguenti modalità operative:
Se i risultati soddisfano i requisiti, il metodo èdichiarato idoneo; in caso contrario se l’esito ènegativo, vengono discusse le azioni necessarie.
La validazione del metodo analitico si conclude con lastima dell’incertezza di misura da associare al risultatoanalitico.
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E’ definita come:
“ la capacità di determinare inequivocabilmente l’ana lita
con il livello di accuratezza prefissato in presenza di altri
componenti che prevedibilmente possono essere prese nti
nei campioni da esaminare ”.
E’ quindi la capacità di determinare un singolo ana lita o
una classe di analiti nella matrice di interesse se nza
interferenze.
SPECIFICITA’ (SELETTIVITA’)
In generale, la specificità riguarda l’abilità di un
procedimento di misurare soltanto ciò che si
vuol misurare anche in presenza di molti
composti affini dal punto di vista chimico-fisico
(OMOLOGHI serie di composti dove ogni membro differisce dal successivo di
un termine costante –CH2, ANALOGHI, METABOLITI).
Questo parametro è quasi sempre il primo che
l’analista deve controllare e solo una verifica
positiva consente di continuare il lavoro di
messa a punto o di validazione del metodo.
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Procedura:
I metodi più efficaci per la valutazione del grado dispecificità consistono nel:
1) Ricostruire le matrici dei campioni senza l’analita diinteresse e valutare la risposta del procedimento perscoprire interferenze o sovrapposizioni con quelladell’analita stesso;(ad es. in caso di una analisi cromatografica, si va averificare l’assenza di picchi con lo stesso tempo diritenzione nel profilo cromatografico della matrice privadell’analita);
2) Analizzare almeno una volta campioni reali o, sepossibile, materiali di riferimento (aventi una composizione ilpiù possibile simile a quella dei campioni reali) mediante ilmetodo in esame e mediante un metodo basato su di unprincipio fisico indipendente.
3) La selettività può essere valutata analizzando, con lostesso metodo di analisi, campioni reali prima e dopo“fortificazione” (aggiunta) di sospetti interferenti(possibilmente a diversi livelli di concentrazione): valutarese gli interferenti portano a risultati significativamentedifferenti.
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Un criterio ragionevole per la specificità (determinata
ad es. cromatograficamente) può essere considerato
quello che vi sia una separazione alla linea di base
dell’analita da tutti gli interferenti che possono essere
presenti.
Si controlla, quindi, la separazione dai picchi vicini
mediante il fattore di risoluzione Rs.
In genere Rs tra il picco di interesse e quello
interferente NON deve essere minore di 1,5.
BA
ARBR
BAS WW
tt
WW
ZR
+−=
+∆= ])()[(22 t
1 2 11 2
La risoluzione, dipende dalla distanza tra i massimi deipicchi (selettività al numeratore) e dall’ampiezza deipicchi (efficienza al denominatore)
La risoluzione permette di caratterizzare la bontà diseparazione tra due picchi
2 1
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CromatogrammaCromatogramma delledelle speciespecie AA ee BB registratoregistrato perper 33 colonnecolonnecaratterizzatecaratterizzate dada unauna diversadiversa risoluzionerisoluzione::
AA contiene contiene 4% di 4% di BB
0.3%0.3%
Il picco dell’impurezza (3) non è completamente risolto dal picco della cefatossima. In questo caso, un altro ragionevole criterio per la specificità può essere che i picchi associati alle impurezze, e non risolti, non influenzino le determinazioni della cefatossina per più dello 0,5% quando le impurezze sono alla concentrazione massima attesa.
Esempio:
Cefatossima (picco 4) addizionato con lo 0.2% (m/m) di impurezze note, presenti generalmente nel prodotto di sintesi.
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Fasi dell’analisi di un campione
Campionamento
Prelievo del campione di pesce
Analisi del campione:-Trattamenti preliminari
-Analisi strumentale
Identificazione del problema
Es: determinazione di Hg nel pesce
Determinazione della concentrazione
Ogni fase dà un suo contributo all’errore della misura finale,
cioè alla sua variabilità
Il termine “errore” non ha un’accezione negativa
Es: determinazione concentrazione di mercurio nel pesce
Conc Hg (ppm)
Aliquota 1 0.24
Aliquota 2 0.26
Aliquota 3 0.25
Aliquota 4 0.24
Aliquota 5 0.26
Repliche della stessa misura sono diverse a causa
dell’errore sperimentale (Sistematico)VARIABILITA’
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Sorgenti di errore
ATTENZIONE !!
Non confondere errore sperimentale con ERRORE “GROSSOLANO” che si può eliminare: disattenzione, reagente errato, virgola decimale posta nel punto sbagliato
Altre fonti di errore sperimentale CASUALE:
-temperatura dell’ambiente
-addestramento del personale
-purezza e freschezza dei reagenti
-efficienza e stato dell’apparecchiatura
Esemplificazione grafica dei concetti di accuratezza (esattezza) e precisione
a) b) c) d)
a)a) preciso ed esattopreciso ed esattob)b) preciso ed inesattopreciso ed inesattoc)c) impreciso ed esattoimpreciso ed esattod)d) impreciso ed inesattoimpreciso ed inesatto
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L’accuratezza di una procedura analitica,
esprime il grado di accordo tra il valore medio
ottenuto a partire da un grande insieme di
risultati di prova e un valore di riferimento
considerato “ vero” (es con CRM) o un valore di
riferimento accettato.
Il metodo è tanto più accurato quanto più ilvalore trovato si avvicina al “vero”.
ACCURATEZZA (Esattezza)
E’di solito espressa in termini di scostamento sistematico o
bias . È necessario verificare l’accuratezza del metodo,
ovvero l’assenza di errore sistematico . L'accuratezza viene
di solito espressa in termini di errore:
ERRORE ASSOLUTOERRORE ASSOLUTO: : è dato dalla differenza è dato dalla differenza tra il valore sperimentale tra il valore sperimentale (osservato) xi (osservato) xi e il valore “vero” (teorico) e il valore “vero” (teorico) xt.xt.
E = xi E = xi -- xt xt
cioè in termini di scostamento sistematico, distorsione o bias .
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PERCENTUALE DI RECUPERO (Recovery %):
Rapporto percentuale tra la quantità di analita
determinata sperimentalmente in campioni a
titolo noto per mezzo di soluzioni di
riferimento dell’analita puro (materiale di
riferimento certificato) ed il valore atteso.
X 100Recupero % =
l’esattezza del metodo può essere stimata, anche, determinando:
risultato trovato (sperimentale)
risultato teorico (valore atteso)
I criteri di accettabilità per la percentuale di recupero,
possono essere diversi in rapporto alla complessità
del metodo e alle concentrazioni di analita da
determinare.
Ad esempio:
1. nel caso della determinazione di componenti maggiori
(quandoquando ii costituenticostituenti sonosono presentipresenti inin unun intervallointervallo didi
pesopeso relativorelativo compresocompreso tratra l'l' 11%% ee ilil 100100%%) in matrici
non complesse la percentuale di recupero è ritenuta
accettabile se compresa tra il 95 ed il 105%.
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2. Nel caso invece di determinazioni di componenti intracce (1 ppb - 100 ppm) in matrici complesse, sonoconsiderati accettabili i seguenti valori che variano inrelazione alle concentrazioni dell’analita da determinare(valori accettati dalla Comunità Europea - ACCREDIA) :
Conc.(µg/Kg) Recupero medio %
<1 50-1201-10 70-110>10 80-110
1 microgrammo - 0.001 mg = 0.00000l grammi –1 mg per Kg = 1 parte su un milione (ppm )
La valutazione dell'accuratezza si effettua su un minimo di n° 6 campionipreparati a concentrazioni note in un intervallo simile a qu ello di lavoro(solitamente va da 0,5 a 1,5 volte quella attesa nel campione)
ACCURATEZZA
CampioneN.
Pesata in mg (valore atteso)
Trovato Recovery %
1 37.50 37.30 99.47
2 37.10 36.80 99.19
3 50.00 50.00 100.00
4 50.30 50.25 99.90
5 64.30 65.40 101.71
6 65.00 65.70 101.08
Il valore trovato per ciascun campione è il risultato di trerepliche a ciascuna concentrazione.
Esempio: analisi mediante HPLC con rivelatore a lunghezza d’onda fissa (Wavelength 216 nm )
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L’accuratezza del metodo analitico può essere valut ata analizzando materiali di riferimento certificati (CRM) prodotti da enti internazionali riconosciuti (BCR, NIST, BAM ecc.) e per i quali è nota la concentrazione dell’elemento di interesse.
Il risultato della verifica è tanto più affidabile quanto più la matrice del materiale certificato è simile a quella campione in esame .
In mancanza di CRM sono reperibili in commercio cam pioni sui quali sono state eseguite analisi in circuiti interlabora torio e per i quali sono disponibili valori di consenso (RM, materiali di riferimento ).
Se non si dispone né di CRM né di RM l’esattezza de l metodo può essere stimata determinando il recupero analitico d i quantità note dell’elemento aggiunte ai campioni in esame o a lor o miscele.
Con il metodo in esame si dovrebbe trovare il valore
certificato per l’analita nel materiale di riferimento,
all’interno della precisione del metodo.
La precisione di una procedura analitica esprime il grado
di accordo tra una serie di analisi ottenute da diverse
aliquote di un campione omogeneo e nelle medesime
condizioni sperimentali (replicati).
PRECISIONE
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Le considerazioni più importanti che scaturiscono daquesta definizione sono sinteticamente tre:
• la precisione non dipende dal valore di riferimentoaccettato (o valore “vero”) e può essere valutataripetendo più volte il procedimento analitico senzaconoscere il contenuto dell’analita in esame;
• i risultati devono essere indipendenti , intendendo chetutte le fasi di un procedimento analitico devono essereeseguite in modo indipendente dagli altri; ossia ognianalisi in replicato deve essere ripetuta in ogni suafase;
• le condizioni in cui i risultati sono ottenuti devonoessere ben specificate.
PRECISIONE
Ripetibilità (o Precisione intra-analisi)
Riproducibilità (o Precisione
Inter-laboratorio )
RIPETIBILITA’RISTRETTA
RIPETIBILITA’INTERMEDIA
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Ripetibilità ristretta (r)
Indica il grado di concordanza fra risultati di prov e indipendenti, identiche, effettuate sul medesimo campione:- applicando lo stesso metodo- nello stesso laboratorio- dallo stesso operatore- con la stessa apparecchiaturain un BREVE INTERVALLO DI TEMPO
(ISO 5725:1994; Manuale UNICHIM 179/0, 1999)
La ripetibilità stretta deve essere quindi intesa co me precisione ottenuta nelle condizioni in cui tutti i fattori sono mantenuti costanti.
Ripetibilità (o Precisione intra-analisi)
I campioni analizzati devono essere rappresentativi dei campioni per i quali si intende utilizzare il metodo.
Le misure sono ottenute analizzando lo stesso campione per un minimo di dieci volte.
Dato che la precisione può variare con la concentrazione è opportuno analizzare almeno tre campioni a concentrazione “bassa”, “media” e “alta” rispetto all’intervallo di concentrazioni di interesse.
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Ripetibilità intermedia
E’ così definita la ripetibilità valutata in condizioni in cui uno o più parametri variano nel corso delle misure, escluso il materiale su cui si effettuano le prove, il metodo ed il laboratorio. Tra i parametri variabili (quelli cioè che potrebbero influenzare i risultati delle misure) possono essere compresi, per esempio:- il tempo di misura, - la temperatura del laboratorio, - la serie di reagenti, - lo stato di taratura degli strumenti di misurazione impiegati,- gli operatori e gli strumenti, se il laboratorio ne possiede più di uno.
Esistono quindi diverse ripetibilità intermedie a s econda che sia un solo fattore a variare, o più di uno.
Indica la precisione valutata in “condizioni in cui i risultati delle prove sono ottenuti con lo stesso metodo su entità di pro va identiche, in laboratori differenti , da operatori diversi , usando apparecchiature diverse ” (ISO 5725:2004; Manuale UNICHIM 179/0, 1999).
Aliquote dello stesso campione vengono analizzate, quindi da diversi
analisti , in differenti laboratori , in tempi diversi , utilizzando reagenti e
strumenti propri di ciascun laboratorio.
Vengono cambiate cioè il maggior numero di condiz ioni quali: - Tempo- Operatore- Strumento- Laboratorio
La riproducibilità, quindi non può essere stimata n ell’ambito di un solo laboratorio ma viene determinata attraverso circuiti interlaboratorio.
Riproducibilità (R)
(o Precisione Inter-laboratorio)
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Ripetibilità
Deviazione media
Deviazione relativa
Deviazione standard
Varianza
Coefficiente di variazione
Range
Per stimare la RIPETIBILITA
Deviazione Media (o scarto medio) dm
dove: x = media delle misurexi = misura singolaN = numero delle misure
La deviazione media delle misure di una collezione è la media delle differenze tra le
misure singole e la media del set di dati senza riguardo al segno.
E’ espressa in valore assoluto
Nd i
m∑ −
=)( χχ
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Deviazione (o scarto) RelativaDeviazione (o scarto) Relativa % o ‰% o ‰(dalla media o dalla mediana) (dalla media o dalla mediana) ddrr
dr = dm x 100X
dove: X = media delle misuredm= deviazione media
dr = dm x 1000X
Come per l’accuratezza, le misure di precisione, del tipo della deviazione media, possono essere espresse oltre che come un numero assoluto anche come numero relativo (es. % o ‰‰).
L'intervallo di variazione si ottiene semplicemente calcolando si ottiene semplicemente calcolando la differenza fra il dato più alto e quello più basso, oppure la differenza fra il dato più alto e quello più basso, oppure
specificando il valore del dato più alto e quello del dato più basso.specificando il valore del dato più alto e quello del dato più basso.
ESEMPIO: ESEMPIO: Calcolare il range del seguente set di dati:Calcolare il range del seguente set di dati:
15,3 15,4 15,6 15,8 16,015,3 15,4 15,6 15,8 16,0
RANGE = 16,0RANGE = 16,0--15,3 = 15,3 = 0,70,7
Range
(o Campo o Intervallo di variazione o Estensione)
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Caratteristiche della curva normale degli erroriCaratteristiche della curva normale degli errori
Caratteristiche della curva Caratteristiche della curva normale degli errorinormale degli errori
-- La forma della curva è a La forma della curva è a “campana” ed “campana” ed è simmetrica, nel senso che si può dividere in due parti, specularmente uguali , tracciando una linea verticale in corrispondenza del valore di massima frequenza.
- Il risultato osservato con maggiore frequenza è quindi la media dell’insieme di dati.
-I risultati sono raggruppati simmetricamente attor no a questo valore medio, questo indica che gli errori positivi e quelli negativi hanno luogo con uguale frequenza.
Questa curva ha molte proprietà interessanti; I n particolare, è importante ricordare che nelle distribuzioni Normali la moda, la media e la mediana
assumono lo stesso valore.
µµµµ
- Piccoli spostamenti dal valore medio centrale sono più frequenti di quelli grossi, questo indica che gli errori casuali piccoli in un’analisi condotta bene, si osservano molto più frequentemente di quelli grandi.
Confronto tra distribuzioni normali con la stessa me dia e con la stessa media e diversa deviazione standarddiversa deviazione standard:
Metodo AMetodo AMetodo BMetodo B
Curve che mostrano i risultati dell’analisi di un c ampione ottenuti con due metodi di differente precisione. Il metodo A risulta meno preciso o affidabile.
Quanto più piccola è la deviazione standard tanto p iù sottile e alta è la curva a campana (metodo B); quanto più alta è la de viazione standard tanto più larga e bassa è la curva a campana (meto doA).
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La deviazione standard misura la larghezza della curva gaussiana, tanto maggiore sarà il valore di σσσσ, tanto più schiacciata sarà la curva, meno precisa sarà la misura.
� L’area (intervallo) definita mediante σ (µ±σ) contiene il 68%dei valori;
� quella definita da (µ ± 2σ) contiene il 95,5% dei valori;
� quella definita da (µ ± 3σ) contiene il 99,7% dei valori.
( )1
1
2
−
−=∑
=
N
xxN
ii
σ
Da un numero finito di misure non si può mai misurare µ e σσσσ, ma èpossibile misurare i valori x e s
x ed s si avvicinano a µ e σσσσ man mano che aumenta il numero dellemisure.
Per un numero finito di dati, la deviazione standar d, s, è calcolata con la seguente formula:
Dove: x = media del set finito di dati
x i – x = deviazione individuale dalla media
N = numero di misure effettuate
N - 1 = gradi di libertà ovvero il numero didi osservazioniosservazioni (( NN)) didi cuicui èè
compostocomposto ilil campione,campione, menomeno 11 (cioè(cioè:: gradigradi libertàlibertà == NN--11))..
s
Deviazione standard o scarto tipo di ripetibilità
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Per stimare l’errore sulla ripetibilità si devono effettua re almeno 6
analisi ripetute sulla stessa soluzione standard e calcola re:
� Il Coefficiente di Variazione (CV) che per un insieme di misure
è dato dalla deviazione standard (s) diviso la media delle mi sura (x):
CV = s/x
generalmente il Coefficiente di Variazione viene espresso come
percentuale della media:
(CV) % (o deviazione standard relativa % (RSD %):
CV(%) = (s/x) x 100
Le deviazioni standard relative spesso forniscono u na rappresentazione più chiara della qualità dei dati rispetto alle deviazioni standard assolute.
Ad esempio, supponiamo che un campione contenga circa 50 mg
di rame e che la deviazione standard di una determinazione
di rame sia 2 mg.
Il CV, per il campione di 50 mg con una deviazione standard
S = 2, sarà:
CV = (S/X) X100 = (2/50) x 100 = 4%Per un campione contenente solo 10 mg con una S sempre pari a2, il CV:
CV = (S/X) X100 = (2/10) x 100 = 20%
In qualsiasi caso, comunque, Il CRITERIO secondo cu i solitamente la precisione sarà considerata accettab ile è quello di avere un (CV)% compreso tra il 3% - 5%
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Per stimare invece la Riproducibilità (R)
di solito, a 5-10 laboratori diversi, vengono forni ti CAMPIONI IDENTICI E LA STESSA PROCEDURA SCRITTA.L’ analisi viene ripetuta più volte (6-10)
Ciascun laboratorio analizza i campioni con tale procedurae riporta i suoi risultati calcolando il valore della deviazi onestandard e del CV% delle misure ottenute in modo dastimare l’errore sulla riproducibilità.
Se tutti i risultati sono “simili” (test statistici ) e non vi sono errori sistematici gravi, allora il metodo viene co nsiderato “riproducibile”
La precisione interlaboratorio diminuisce al diminu ire del livello di analita nel campione.
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s
sFcalcolata =
Procedura:Questo test fa uso del rapporto delle varianze (S 2) delle due serie (1 e 2) di misure.Si calcola il valore di F mediante la seguente formula:
N.B. Ricordarsi sempre di porre la varianza maggiore al numeratore in modo da ottenere sempre:
1≥F
Il test verifica, ad un determinato livello di fiducia, se le deviazioni standard di due distinte serie di misurazioni sono significativamente diverse.
CONFRONTO DI DEVIAZIONI STANDARD (TEST F)
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Fcalc. > Ftab. (95%)(95%)
F così ottenuto viene confrontato con i valori critic i, calcolati assumendo che la probabilità di superarli sia solamente del 5%.
Quando il valore sperimentale di F (Fcalc ) è maggiore del valore di F tab, (presente in apposita Tabella) allora la differenza nella varianza o precisione viene conside rata statisticamente significativa, si può cioè affermar e che i due metodi forniscono risultati significativamente diversi.
Quando viene richiesto un confronto tra due distinte seriedi dati ripetuti (Test t appaiato) il primo passo consiste generalmente nelconfrontare le rispettive precisioni utilizzando l’F test.
(numeratore)(numeratore)
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Il test verifica, ad un determinato livello di fidu cia, se due serie di misurazioni replicate , che chiaramente forniscono dati leggermente diversi, siano da ritenersi in acc ordo tra loro all’interno degli errori casuali (ipotesi null a) oppure no.
CONFRONTO TRA LE MEDIE DI DUE SERIE DI DATICONFRONTO TRA LE MEDIE DI DUE SERIE DI DATI* * TEST t APPAIATOTEST t APPAIATO **
Esempio:si vuole verificare se due campioni analizzati (rispettivamente N1
ed N2 volte) con lo stesso metodo differiscono in modo significativo.
La differenza tra i due risultati è significativa: può essere indicativa di un errore in uno dei due metodi?
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IlIl testtest tt dettodetto appaiatoappaiato puòpuò essereessere impiegatoimpiegato perperdecideredecidere sese duedue serieserie didi misurazionimisurazioni ripetuteripetute dannodanno risultatirisultati“uguali“uguali ““ oo “differenti”“differenti” (cioè(cioè sese sonosono oo nonnon sonosono “in accordo”)all’internoall’interno didi unun determinatodeterminato livellolivello didi fiduciafiducia..
AA causacausa deglidegli inevitabiliinevitabili errorierrori casuali,casuali, infatti,infatti, nonnon cici sisi aspettaaspettacheche ii valorivalori medimedi ottenutiottenuti sianosiano esattamenteesattamente gligli stessi,stessi, ancheanchesese ciòciò cheche sisi stasta misurandomisurando èè lala stessastessa grandezzagrandezza fisicafisica..
La procedura per il test differisce a seconda delle deviazio ni standard delledue serie di misure.
Caso 1La deviazione standard della popolazione è essenzialmenteessenzialmente lala medesimamedesima perentrambe le serie di misure. Vale a dire che non c’è una differenzasignificativa di precisione per i due metodi.
Caso 2Le deviazioni standard delle due serie differiscono significativamente .
Per definire questa condizione, cioè se la precisione delle due Per definire questa condizione, cioè se la precisione delle due serie è da considerarsi simile, prima di applicare il “test t serie è da considerarsi simile, prima di applicare il “test t appaiato” sarà necessario applicare il “test F”che vedremo in appaiato” sarà necessario applicare il “test F”che vedremo in seguito.seguito.
Per l’applicazione di questo test, si dovrà quind i, disporre di Per l’applicazione di questo test, si dovrà quind i, disporre di due serie di due serie di misuremisure , che consistono di N, che consistono di N 11 ed Ned N22 misure (aventi le medie Xmisure (aventi le medie X 11 ed Xed X22) ) ciascuna con la propria incertezza e ciascuna con la propria incertezza e senza un valor e “noto”.senza un valore “noto”.
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21
2121
NN
NN
s
xxt
ccalcolata +
−=
Caso 1La deviazione standard della popolazione è essenzialmente la medesima per entrambe le serie di misure.
Procedura:Si calcola il valore di t mediante la seguente formula:
Dove Sc è la deviazione standard combinata (per due serie di misure).
2
)1()1(
2
)()(
21
2221
21
21
1
22
1
21
21
−+−+−=
−+
−−=
∑∑==
NN
NsNs
NN
xxxx
s
N
jj
N
ii
c
Il valore di t calcolato si confronta con quello tabulato per N1+ N2 - 2 gradi di libertà al livello di fiducia desiderato.
Se il valore di t calcolato è maggiore di quello di t tabulato i due risultati differiscono significativamente al livell o di fiducia
considerato.
Nell’applicazione del test t appaiato, si consideran o in generesignificative le differenze comprese in un intervall o
di fiducia tra il 90 e il 95%. Un livello di fiducia del 99%viene considerato molto significativo.
se tcalcolata > ttabulatala differenza è significativa, ovvero le differenze tra le due serie di misure non possono essere attribuite solo all’errore
casuale.
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E' la più bassa concentrazione di analita in un camp ione
che può essere rivelata nelle condizioni sperimentali del
metodo (con ragionevole affidabilità), ma non
necessariamente quantificata.
LIMITE DI RIVELABILITA’ (LDR) LOD (Limit of detection )
Durante la validazione di un metodo analitico è
necessario stabilire il limite di rivelabilità solo se devo no
essere analizzati campioni a bassa concentrazione,
vicina a questo limite.
Il calcolo del LOD può essere utile anche nella messa a punto di un nuovo metodo sperimentale
Journal of Chromatography B, 879 (2011) 231-233
Direct LC-ES-MS/MS determination of phthalates in physiological saline solution
Il limite di rivelabilità , quindi, sarà la minima concentrazione
di analita che produce un segnale significativamente diverso
da quello del bianco, ovvero la concentrazione
corrispondente al minimo segnale significativo Ss
Ss è un segnale vicino a quello del bianco (soluzione in cui l’analita è virtualmente assente), ma da esso significativamente differente, e quindi assegnabile all’analita sulla base di un criterio specifico.
La definizione del LOD dipenderà dal criterio usato per accertarsi che il segnale sia significativamente diverso da quello del bianco.
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Il LOD è la più piccola quantità di analita che fornisce un
segnale y “significativamente diverso” dal segnale di
fondo o dal “bianco”.
Poiché si può definire “significativamente diverso” in
molti modi, vi sono altrettanti modi per definire il limite d i
rivelabilità.
In modo più approssimativo il LOD viene spesso definito come la concentrazione di analita che fornisce un segnale pari a 2 o 3 volte il rumore di fondo
S/N = 3
dove:S = segnale campioneN = noise dove il noise viene calcolato come livello di rumore da picco a picco della linea di fondo
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Secondo la IUPAC:
LOD = 3 x Sb/m
Sb = deviazione standard del valore del bianco (almeno
5 campioni preparati preferibilmente in giorni diversi)m = coefficiente angolare (pendenza) della curva di taratura
Viene espresso nell’unità di misura della concentrazione dell’analitaricavata dall’applicazione del metodo (es mg/kg o g/kg) e si calcolamoltiplicando per tre il valore dello scarto tipo delle misure di almenocinque soluzioni di bianchi analitici preparati in differenti giorni di lavoro.
E' la più bassa concentrazione di analita in un campione
che può essere determinata quantitativamente con
accettabile livello di precisione ed accuratezza nelle
condizioni sperimentali del metodo.
La valutazione del limite di quantificabilità si effettua
utilizzando soluzioni a concentrazioni decrescente
dell’analita in esame e verificando il rispetto dei parametri di
precisione fissati da enti di riferimento (ad esempio FDA, EPA,
ecc.).
Normalmente si calcola come multiplo del valore di LOD:
LOQ = 3 x LOD
LIMlTE DI QUANTIFICABILITA' (LdQ) oLOQ (limit of quantification )
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LOQ = 10 x Sb/m
Sb = deviazione standard del valore del bianco (almeno 5 campioni)
m = coefficiente angolare (pendenza) della curva di taratura
Secondo la IUPAC:
Viene espresso nell’unità di misura della concentrazione dell’analitaricavata dall’applicazione del metodo (es mg/kg o g/kg) e si calcolamoltiplicando per dieci il valore dello scarto tipo delle misure di almenocinque soluzioni di bianchi analitici preparati in differenti giorni di lavoro.
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Una procedura per la valutazione sperimentale
del LOD e del LOQ è dettagliata qui di seguito:
• analizzare 10 campioni indipendenti di bianco;
• valutare le deviazioni standard dei campioni analizzati;
• se non è stata valutata, stimare la pendenza della curva di calibrazione analizzando almeno 4-6 soluzioni standard a diversi intervalli di concentrazione;
• calcolare il LOD e il LOQ
ESEMPIO. Determinazione del limite di rivelabilità per la quantificazione del nitrito nelle acque mediante spettrofotometria VIS (metodo di Griess ). Allo scopo viene misurata l’assorbanza a 534 nm di 10 campioni indipendenti del bianco.
I valori di assorbanza sono:A1 = 0.005 A2 = 0.004 A3 = 0.006 A4 = 0.011 A5 = 0.008A6 = 0.007 A7 = 0.013 A8 = 0.012 A9 = 0.005 A10 = 0.007
Retta di calibrazione: mediante regressione lineare dei minimi quadrati dei risultati dell’analisi di 10 soluzioni standard (intervallo di concentrazione: 7.7 x 10-7 M – 5.8 x 10-5 M) viene calcolata la pendenza che è risultata uguale a:
Pendenza (p o m) = 4.7923 x 104 L/mol
Valutare LOD e LOQ.
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Anche la presenza di nitriti costituisce un serio indizio diinquinamento, in quanto essi provengono generalmentedall'ossidazione dell'ammoniaca o dalla riduzione dei nitrati pereffetto di processi biologici oltre che naturalmente, da un aimmissione diretta da parte di scarichi industriali, ferti lizzanti, ecc..
I nitriti possono causare metaemoglobinemia soprattutto n ei bambinimolto piccoli.Inoltre, nello stomaco (ambiente acido) i nitriti possono r eagire conalcune ammine per dare origine a nitrosammine, cancerogene .
Determinazione dei Determinazione dei Nitriti (NO 2-)
peptidi aminoacidi NH4+ NO2
- NO3-
ox
red
I nitriti presenti nell' acqua vengono determinati per viaspettrofotometrica col metodo di Griess , basato unaad opera degli stessi nitriti che si ricercano, con acidosolfanilico e per successiva copulazione con αααα-naftilammina con formazione di un composto azoicorosso che assorbe a 420 nm.
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1) Calcolo dell’assorbanza media del bianco e della deviazione standard del bianco
2) Calcolo del LOD:
3) Calcolo del LOQ:
Il risultato analitico di un’analisi chimica è un’informazione costituita da:
� un numero
� un’incertezza
� un’unità di misura
Conversione del risultato in informazione utile.
E’ necessario fare alcune considerazioni sul metodo analitico utilizzato.
LINEARITA’
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I metodi in chimica analitica possono essere suddivisi in:
ASSOLUTI permettono di ricavare direttamente il dato senza dovereseguire operazioni di calibrazione. Tali metodi comportano una reazionechimica con equilibrio completamente (o quasi) spostato a destra.
I metodi assoluti sono relativamente pochi: metodi gravimetrici,volumetrici, elettrogravimetrici, coulombometrici.
COMPARATIVI che richiedono la calibrazione mediante soluzionistandard.
In genere la maggior parte dei metodi strumentali è di tipo comparativo.Viene misurata una proprietà fisica (es. assorbimento o emissione di luce,conducibilità) o chimica (ossidabilità o riducibilità) che dipende dallaNATURA (analisi qualitativa) e dalla CONCENTRAZIONE (analisiquantitativa).
I metodi comparativi si basano su una relazione matematica trail parametro misurato (RISPOSTA o SEGNALE) e laCONCENTRAZIONE dell’analita.
Una necessità fondamentale, quindi, è che sia nota la Una necessità fondamentale, quindi, è che sia nota la proporzionalità tra:proporzionalità tra:
-- la grandezza misuratala grandezza misurata X (risposta) X (risposta)
VARIABILE DIPENDENTEVARIABILE DIPENDENTE
Idealmente ci dovrebbe Idealmente ci dovrebbe essere una relazione lineare essere una relazione lineare tra le due variabilitra le due variabili
- ee lala quantitàquantità didi analitaanalita presentepresente(concentrazione)(concentrazione)
VARIABILEVARIABILE INDIPENDENTEINDIPENDENTE
Per verificare questo è necessario costruire un dia gramma di calibrazione ( o di dispersione) analizzando campio ni a concentrazione nota e riportando in grafico la risp osta analitica(segnale misurato: assorbanza, corrente, tensione, area di un picco, ecc.) in funzione delle quantità note di analita .
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I metodi per la calibrazione possono essere suddivisi in due gruppi: quelli in cui si usano STANDARD ESTERNI e quelli in cui si usano STANDARD AGGIUNTI.
Gli standard esterni vengono analizzati separatamente dal campione.
Una serie di standard di questo tipo è costituita da unità che contengono quantità note e differenti di analita.
Gli standard esterni vengono utilizzati per costruire le curve di calibrazione o di standardizzazione che si ottengono riportando in grafico la grandezza misurata (segnale strumentale) per una serie di soluzioni di standard a concentrazione nota.
Il metodo della curva di calibrazione con standard esternipuò essere utilizzato quando:
� i componenti della matrice del campione, inclusi tutti i reagenti necessari per la preparazione del campione, non causano interferenza,
� si conosce la composizione della matrice; in questo caso si possono preparare le soluzioni standard in matrici del tutto simili a quelle da analizzare.
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CURVA (o retta) DI TARATURA (O DI RIFERIMENTO)
Per costruire una retta di taratura relativa all’analita da determinareè innanzitutto necessario:
preparare una serie di campioni contenenti quantità note di
analita, (campioni standard) tali da coprire un opportuno i ntervallo
di concentrazioni. I campioni standard devono essere tratt ati nello
stesso modo in cui verrà trattata la soluzione campione.
Misurare per ciascun campione standard la risposta del
procedimento analitico prescelto.
Costruire un grafico riportando il segnale misurato in funz ione
della quantità del campione analizzato.
Tracciare una retta passante per i punti (METODO GRAFICO)
oppure calcolare la retta migliore attraverso i MINIMI QUAD RATI.
SegnaleSegnale
Concentraz. Concentraz. AnalitaAnalita
E’ inoltre possibile notare che in (a) c’è una asso ciazione forte
mentre in (c) l’associazione è debole
(a) (b) (c)
Il grado di dispersione dei valori ottenuti, rispetto ad una retta, può essere determinato dal coefficiente di correlazione r
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Per indicare la correlazione si usa di solito la lettera "Per indicare la correlazione si usa di solito la lettera " rr". ". rr viene dettoviene detto"coefficiente di correlazione" . "coefficiente di correlazione" . Nel caso della regressione, il coefficiente di
correlazione viene talvolta detto “coefficiente di regressionecoefficiente di regressione”
.
Il "coefficiente di correlazione“ si può calcolare:Il "coefficiente di correlazione“ si può calcolare:
1) manualmente applicando ad esempio il coeff. di 1) manualmente applicando ad esempio il coeff. di corr. di corr. di PearsonPearson::
nn ΣΣΣΣΣΣΣΣxx11yy11 –– ΣΣΣΣΣΣΣΣxx11yy11
[[ ΣΣΣΣΣΣΣΣnnxx1122 –– ((ΣΣΣΣΣΣΣΣxx11))22][][ nn ΣΣΣΣΣΣΣΣyy22
11 -- ((ΣΣΣΣΣΣΣΣ yy11))22]]
22) con l'aiuto di un software statistico.) con l'aiuto di un software statistico.
r =
dove: n = numero di puntix = variabile indipendente (concentrazione)y = variabile dipendente (es. assorbanza, area picco…)
Il coefficiente di correlazione r che misura il grado di dispersione dei valori ottenuti, rispetto ad una retta, può assumere valori compresi fra -1 e +1.
� I valori positivivalori positivi indicano l'esistenza di una correlaz ione lineare positiva; � i valori negativivalori negativi indicano una correlazione negativa;
� i valori prossimi a ± 1 si ottengono quando la correlazione (positiva o negativa) è massima, cioè perfettamente lineare (tu tti i punti cadono esattamente sulla retta);
� il coefficiente di correlazione tende a zero man man o che i valori si disperdono sempre più;
�il valore valore 00 indica assenza di correlazione.
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Non possono essere date regole fisse per l'interpretazionedel coefficiente di correlazione, che dipende da una seriedi considerazioni.
Possiamo dire, ad esempio che in genere:
� nel SETTORE BIOMEDICO ed in EPIDEMIOLOGIA(dove la variabilità biologica è piuttosto elevata) vengon oconsiderati "buoni""buoni" valorivalori attornoattorno aa ++ 00..77 (nel caso di unacorrelaz. positiva) oppure a -- 00..77 (per una correlaz.negativa).
� Per la VALIDAZIONE DI UN METODO ANALITICO,invece, il valore di r diventa molto più restrittivo. Lacorrelazione lineare sarà considerata accettabile se si av ràun coeff. di corr. r maggiore o uguale di + 0.99 (non sonochiaramente considerate le correlazioni negative)
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r è anche uno strumento diagnostico:
se ad esempio per un metodo consolidato esso diminuisce improvvisamente (o lentamente) dopo che il metodo è stato adottato, significa che si è verific ato un errore di procedura.
Quando le variabili in studio hanno fra loro una relazione lineare, i punti del diagramma a dispersione
tendono a disporsi secondo una linea retta.
Ad es., nel diagramma accanto qual è la retta "giusta "? Potremmo litigare a lungo senza venirne a capo. Ecco quindi
che serve un sistema obiettivo e ben serve un sistema obiettivo e ben codificato codificato che consenta di tracciare la che consenta di tracciare la
retta che meglio rappresenta l'andamento retta che meglio rappresenta l'andamento della nuvola di puntidella nuvola di punti. .
Come per la direzione e la forza, anche per la forma è possibile utilizzare l'occhio come strumento per individuare("ad occhio e croce") la retta
corrispondente (METODO GRAFICO). Tuttavia, come già detto, l'occhio non è un buono strumento a questo scopo; entrano in gioco fattori soggettivi, e
a partire dallo stesso diagramma ciascuno di noi potrebbe individuare rette diverse rappresentative della nuvola di punti.
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Per tracciare la retta migliore che rappresenta i r isultati
sperimentali i quali non sono mai allineati
perfettamente: è necessario usare metodi obiettivi
avvalendosi di opportuni test statistici .
Come è tipico (e desiderabile)il grafico approssima unaretta. Si noti, comunque, chenon tutti i dati cadonoesattamente sulla linea acausa degli errori random delprocesso di misura. Perciò,noi dobbiamo provare adottenere la “migliore retta”passante per quei punti.
Il metodo dei minimi quadratipermette di ottenereun’equazione per la retta.
Per dedurre la forma in modo oggettivo, si dovrà ricorre all’applicazione di un
metodo statistico:
Il MEODO dei MINIMI QUADRATI
Il metodo dei minimi quadrati è una tecnica statist icache permette di trovare la “migliore retta” che passa attraverso i punti corrispondenti ai dati speriment ali.
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Una volta ottenuto r, possiamo calcolare r 2 (r-quadrato), semplicemente elevando r al quadrato.
r2 viene detto anche coefficiente di determinazione ed è un indice ricco di significato, in quanto esprime la v ariabilità
nella variabile dipendente spiegata dalla variabile indipendente.
In parole più semplici, r 2
Perciò, ammettendo che il farmaco sia causalmente legato alla variazione di pressione (ammettendo che x sia causalmente legato a y), allora circa il 75% circa di tale variazione è giustificata dall'effetto del farmaco.
Coefficiente di determinazione
METODO DEI MINIMI QUADRATIMETODO DEI MINIMI QUADRATI
Il metodo dei minimi quadrati è una tecnica statist icache permette di trovare la “migliore retta” che passa attraverso i punti corrispondenti ai dati speriment ali.
11) Si assume che esiste una relazione lineare tra la Si assume che esiste una relazione lineare tra la risposta misurata y e la concentrazione dello standard x.risposta misurata y e la concentrazione dello standard x.
22) Si presuppone inoltre che l’errore associato ai valori di y ) Si presuppone inoltre che l’errore associato ai valori di y sia notevolmente superiore a quello dei valori di x.sia notevolmente superiore a quello dei valori di x.
Tale condizione si verifica spesso in una curva di taratura in Tale condizione si verifica spesso in una curva di taratura in cui la risposta sperimentale (i valori di y) è meno certa cui la risposta sperimentale (i valori di y) è meno certa rispetto alla quantità di analita (valori di x).rispetto alla quantità di analita (valori di x).
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La retta generata con il metodo dei minimi quadrati è quella c he:
minimizza la somma dei quadrati dei residui (o deviazioni) ,
dove per residuo (o deviazione) si intende la distanza di ogni
punto sperimentale dalla retta supposta ideale.
Y
X0 x 2
y 2
∆∆∆∆ y
((xx ii/y/y ii)) == concentrazione/segnaleconcentrazione/segnale
Il metodo è infatti chiamato metodo dei minimi quadratipoiché si minimizzano i quadrati delle deviazioni.
In un set di dati sperimentali alcune deviazioni son o positive, altre negative. Per minimizzare la grandezza delle deviazioniindipendentemente dal segno, si elevano al quadrato le deviazioni stesse per avere numeri positivi:di 2= (yi-y)2
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a
REGRESSIONELINEARE (metodo dei
minimi quadrati)
y = ax + bdove:y = variabile dipendente (segnale misurato)
x = variabile indipendente (concentrazione dell’analita)
a (m, p) = coefficiente angolare (pendenza della retta di calibrazione )
b = intercetta sull’asse y (segnale dello strumento per un bianco)
La maggior parte delle curve di calibrazione in chimica è lineare, ed è descritta dall’equazione:
Si ottiene la retta di regressione di y in funzione di x, calcolando il valore del coefficiente angolare (a) e dell’intercetta (b) secondo le equazioni:
a = nΣx1y1 - Σx1y1
nΣx12 - (Σx1)2
b = y -ax
Σy1
dove x = valore medio di tutti i valori di x1
y = valore medio di tutti i valori di y1
I calcoli sono normalmente eseguiti per mezzo di software I calcoli sono normalmente eseguiti per mezzo di software commerciali.commerciali.
Coefficiente angolare (pendenza)
Intercetta
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Una quantità correlata è l’intervallo dinamico . L’intervallo di concentrazione di analita nel quale vi è una risposta misurabile, anche se non lineare.
Non è affidabile effettuare estrapolazioni da qualunque tipo di curva di taratura, lineare o non lineare, al di fuori dell’intervallo di concentrazioni di standard misurato.
Si devono effettuare misurazioni di standard nell’intero intervallo di concentrazioni d’interesse.
La costruzione di una retta di taratura permette di definire l’intervallo di linearità (o intervallo dinamico lineare) di un metodo analitico che è dato dall’intervallo di concentrazione di analita nel quale la risposta è linearmente proporzionale alla variazione di concentrazione dell’analita.
L’intervallo dinamico di linearità di un metodo analitico,
si riferisce quindi all’intervallo di concentrazione che
può essere determinato con una curva di calibrazione
lineare.
A elevate concentrazioni, le deviazioni dalla linearità
sono comuni a causa delle risposte non ideali del
rivelatore o degli effetti chimici.
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L’INTERVALLO DI LAVORO (INTERVALLO DINAMICO LINEARE) È LIM ITATODA DUE VALORI CORRISPONDENTI ALLE CONCENTRAZIONI MINIMA EMASSIMA ENTRO LE QUALI È APPLICABILE IL METODO :
� Solitamente, si considera per limite superiore una deviazi one dallalinearità del 5%.
�ll limite inferiore può essere al minimo uguale al limite diquantificazione.
L’ampiezza dell’intervallo di lavoro è ≤ di quella dell’intervallo di linearità.
Questo parametro risulta particolarmente importante
per un rivelatore .
Alcuni tipi di rivelatori hanno una gamma dinamica
molto ampia, mentre altri funzionano solo in intervalli
ristretti prima di perdere la linearità.
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Principali rivelatori per GC e loro caratteristiche
Rivelatore Principio Selettività Gas ditrasporto
Distruttivo Sensibilitàg
Termocondu-cibilità(TCD)
Conducibilità termica Universale H2, He No 10-6 – 10-7
Ionizzazione a fiamma (FID)
Dissociazione termica e ionizzazione
Composti organici
H2, He, N2 Si 10-10
Cattura di elettroni
(ECD)
Riduzione corrente elettronica di fondo per
ionizzazione del composto
Composti con elementi
elettronegativi
N2, Ar, CH 4 No 10-12 – 10-13
Fotometria di fiamma (FPD)
Chemiluminescenza Composti con S e P
H2, He, N2 Si 10-11
Termoionico (NPD)
Ionizzazione da sorgente di
termoionizzazione
Composti con P e N
H2, He, N2 Si 10-12
Fotoionizza-zione (PID)
Composti aromatici,
olefine
H2, He, N2 No 10-12Ionizzazione per
irradiazione con raggi UV
Dal diagramma si osserva che il range dinamico di un rivelatore FID è molto ampio: circa 7 ordini di grandezza. Questo significa che si può far variare la massa del campione in un rivelatore FID di 10 milioni di volte continuando ad avere una risposta lineare. femto pico nano micro milli
I rivelatori in GC, inoltre operano con intervalli di linear ità molto variabilitra loro: per alcuni, infatti l’intervallo è grande (FID = 10 7), per altriinferiore (ECD = 10 4).
Per valori superiori a quelli compresi nell’interva llo lineare la linea tende ad incurvarsi ed i rivelatori non danno più u na risposta proporzionale.
55
In genere quindi si preferisce un ampio intervallo
dinamico di linearità poiché consente di
determinare un ampio intervallo di
concentrazioni senza dover effettuare diluizioni.
Esempio
Test di linearità per un nuovo Gas-
Cromatografo Mega 2.
Il test effettuato consiste nella
verifica della linearità delle risposte
del sistema analitico in esame, per
tutte le diverse configurazioni
possibili dello strumento, utilizzando
soluzioni standard di riferimento a
diverse concentrazioni note per più
prove consecutive.
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La linearità del gas-cromatografo Mega 2 sarà
considerata accettabile se, dallo studio di
regressione lineare, si avrà un coefficiente di
correlazione maggiore o uguale di 0.99 nella
determinazione dei valori di concentrazioni:
� di quattro soluzioni campione di Acetone con
concentrazioni teoriche comprese 1000 e 200 ppm.
� di quattro soluzioni campione di Alcol etilico con
concentrazioni teoriche comprese tra il 25% e il
100%
Procedura del test
� Prepariamo una soluzione standard concentrata a 1000 ppm di
Acetone, secondo le procedure correnti di laboratorio.
� prepariamo per diluizione successive almeno altre tre solu zioni
della soluzione di partenza 800, 400 e 200 ppm.
� prepariamo lo strumento secondo le procedure operative
standard ed eseguiamo le analisi;
� eseguiamo la serie di analisi per tre prove consecutive
indipendenti;
� riportiamo i risultati nel foglio di lavoro;
� calcoliamo il coefficiente di correlazione della retta di
regressione ottenuta;
� ripetiamo lo stesso test anche per l'alcol etilico.
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Tale test nella sua integrità viene ripetuto per altre due vo lte sempre sulla stessasostanza e per le stesse concentrazioni. Alla fine vengono r iportati in una schedafinale i risultati di tutte e tre serie di prove e verificato l a linearità dello strumento,mediante la valutazione del coefficiente di correlazione ( r), che deve risultareuguale o superiore a 0.99
Coefficiente di correlazione r
Alle schede così compilate vanno aggiunti tutti i cromatogrammi
effettuati. Di seguito ne riportiamo solo alcuni per dare un 'idea dellavoro svolto.
Coefficiente di correlazione r
58
59
Caratteristiche dello standard interno:
� deve essere assente nel campione da analizzare;
� dal punto di vista chimico deve essere sufficientem ente diverso dall’analita, in modo da poter essere determinato, nel medesimo esperimento, senza interferire nella misura dell’an alita;
� deve avere però un comportamento analogo all’analit a, in modo che il suo recupero rifletta quello dell’analita stesso (d eve ad esempio eluire, quanto più vicino possibile all’analita);
� deve essere chimicamente stabile nelle condizioni a nalitiche impiegate;
� non deve reagire con l'analita e neppure con gli al tri componenti del campione;
Quando la matrice solida o liquida del campione è i ncognita o molto complessa è utile ricorrere ai metodi che sfr uttano
standard aggiunti (Standard Interno)
Metodo dello Standard InternoMetodo dello Standard Interno(utilizzato prevalentemente in cromatografia):(utilizzato prevalentemente in cromatografia):
più elevata precisione (più elevata precisione (0,50,5--1%)1%)
Vengono minimizzate le incertezze dovute:
- all’introduzione del campione,
- alla velocità di flusso,
- alle variazioni delle condizioni presenti nella colonna.
Il metodo dello standard interno può compensare diversi tip i dierrori, se questi influenzano in modo eguale sia l'analita c he laspecie di riferimento.
Per esempio, se la temperatura influenza in modo eguale sia l' analitache la specie di riferimento, usando il rapporto dei segnali sipossono compensare le variazioni di temperatura.
60
Scelto opportunamente lo standard interno, una quantità fi ssa di unostandard interno accuratamente misurata viene introdotta:
� in ciascuno standard,
� in tutti i campioni in esame,
� nei bianchi.
Con questo metodo si analizza una serie di miscele standard contenenti la stessa quantità dello standard interno, ma quantità variabili del composto che interessa, e si determinano le aree dei picchi.
Il parametro analitico di risposta non sarà più quello del solo analita, ma il rapporto tra il segnale (aree o altezze del picco) dell'analita (Ai) e quello quello dello standard
interno (As).
I rapporti delle aree (Ai/As) sono correlati ai rapporti dei pesi rispettivi (o delle concentrazioni rispettive); fintanto che si lavora nel campo di linearità del rivelatore e non si sovraccarica la colonna, il grafico corrispondente sarà lineare.
La presenza dello Standard Interno garantisce lariproducibilità dell'analisi perché se si verifica unavariazione della risposta strumentale nei confrontidell'analita si deve verificare una variazione analoga neiconfronti dello Standard Interno: se il rapporto fra lequantità di analita e di Standard Interno non varia, ilrapporto fra i due segnali deve mantenersi costante.
Questo metodo, pertanto, non richiede iniezioni precise del campione e degli standard.
I metodi dello standard interno vengono generalmenteimpiegati quando l'analista è interessato solo allaconcentrazione di uno o pochi componenti del campione.
61
Illustrazione del metodo dello standard interno
Si costruisce il grafico riportando in ascissa la
concentrazione di analita e in ordinata il rapporto tra il
segnale misurato per l’analita rispetto a quello dello
standard interno (ad esempio nel caso della cromatografia
si fa il rapporto tra le aree dei picchi).
Quindi si aggiunge la stessa quantità di standard interno al
campione e si effettua la misura.
Dal rapporto segnale analita nel campione / segnale std interno ,
tramite l’equazione della curva di calibrazione, si
determina la concentrazione della specie in esame nel
campione stesso.
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ComeCome alal solito,solito, vieneviene preparatapreparata unauna curvacurva didi calibrazionecalibrazione nellanella qualequale ::
�� sull’sull’ delledelle xx sisi riportariporta lala concentrazioneconcentrazione dell'analitadell'analita neglinegli standardstandard..�� sull'sull' asseasse delledelle yy sisi riportariporta ilil rapportorapporto delledelle risposterisposte deidei picchipicchi analita/standardanalita/standard
internointerno
Questo grafico viene quindi utilizzato per determinare quantità (incognita) del composto che interessa presente nel campione effettivo.
Un egual volume dello standard interno (stessa quantità aggiunta nella serie degli standard) è stato addizionato a ciascun campione, le miscele sono analizzate in condizioni identiche, e si calcolano i rispettivi rapporti delle aree.
Mediante questi si possono leggere i corrispondenti rapporti in peso (o in concentrazione) nel diagramma di taratura. Conoscendo la quantità dello standard interno aggiunto, si può calcolare la quantità del composto che interessa.
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La sensibilità del metodo indica quanto esso è sensibile
ad una piccola variazione di concentrazione di un analita.
La definizione più semplice di sensibilità, accettata dalla
IUPAC, è la sensibilità di calibrazione, cioè la pendenza
della curva di calibrazione.
SENSIBILITA’
La maggior parte delle curve di calibrazione in chimica è lineare, ed è descritta dall’equazione:
y = ax + bdove:y = variabile dipendente (segnale misurato)x = variabile indipendente (concentrazione dell’analita)
a (m, p) = coefficiente angolare (pendenza della retta dicalibrazione )b = intercetta sull’asse y (segnale dello strumento per unbianco )
In questi casi la sensibilità risulta uguale a m, e d è indipendente dalla concentrazione c.
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La pendenza della curva di calibrazione è chiamata La pendenza della curva di calibrazione è chiamata sensibilità della calibrazione sensibilità della calibrazione m m
Variazione della risposta di uno strumento di misurazione diviso Variazione della risposta di uno strumento di misurazione diviso per la corrispondente variazione nello stimolo.per la corrispondente variazione nello stimolo.
Nella Figura 1.3, il metodo che ha una risposta lineare y = 2,5x è 5 volte più
sensibile del metodo che mostra una risposta y = 0,5x.
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“La robustezza è la capacità posseduta da un metodo di non essere influenzato significativamente, in termini di
precisione (ripetibilità e riproducibilità) e accuratezza, per effetto di piccole, ma deliberate variazioni di alcuni parametri del metodo introdotte nelle sue fasi di
realizzazione. La robustezza dà indicazione circa l’affidabilità durante
l’uso normale”
ROBUSTEZZA
PARAMETRI DA CONSIDERARE PER LA VALUTAZIONE DELLA ROBUSTEZZA
I parametri che dovrebbero essere valutati in fase di studio della robustezza sono essenzialmente di tre tipi:
1. parametri di base: es. stabilità delle soluzioni (standard, campione), condizione/usura dei materiali consumabili (es. colonne cromatografiche), ecc.
2. parametri interni: sono parametri direttamente legati alla procedura analitica (es. condizioni operative strumentali)
3. parametri esterni: sono parametri direttamente legati alle condizioni ambientali (es. laboratorio, analisti, strumenti, ecc.)
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In ogni metodo possono essere presenti passaggi critici nei quali, se non si opera con la cura necessaria, si verificano degli effetti importanti sulla performance.Ad esempio, per un metodo gascromatografico, valutare le variabili:
� temperatura,� flusso, � composizione del solvente,� concentrazione,� pH,� volume di inezione� lunghezza d’onda del rivelatore.� colonne fornite da diverse ditte fornitrici o appartenenti a lotti differenti).
Un metodo cromatografico, quindi, risulterà robust o se esso continua a fornire risultati accettabili quando vengono fatt e delle piccole variazioni dei parametri suddetti.
• Insensibilità a piccole variazioni dei parametri sperimentali
• Variazioni deliberate
� % solventi organici
� pH
� temperatura
� flusso
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E’ necessario verificare la "stabilità del metodo" nel tempo in condizioni di uso abituale, ovvero indagare quanto si deteriora la risposta in funzione del nume ro di analisi.
Preliminare alla definizione di robustezza è
l'individuazione delle variabili che più influenzano nel
tempo il deterioramento dei parametri di prestazione
del metodo.
Il modo meno efficiente per provare la robustezza è
quello di variare un fattore alla volta.
La Validazione del Metodo analitico si conclude con la stima dell’INCERTEZZA di
misura da associare al risultato analitico.
L’incertezza di misura è quindi il parametro associat o al risultato di una misura, che caratterizza la dispersi one
dei valori ragionevolmente attribuibili al misurand o (UNI CEI ENV 13005:2000)
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