Gıda Örneklerinde ğiştirilmiş - gmo-crl.jrc.ec.europa.eugmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual TR/bolum12.pdf · İmmunolojik yöntemlerin geliştirilmesi için

Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri

Bölüm 12

Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanması

F. Eyquem

WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION R E

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE

ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО

EGIONALBÜRO FÜR UROPA

Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanmsı 2

İçindekiler

Bölüm 12

Roundup Ready® Soyanın ELISA ile Nicel Saptanması

Giriş 3

ELISA Tekniği 7

Deneysel 11

Kaynaklar 21

Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 12


Giriş

Transformasyon sonrasında aktarılan gen tarafından sentezlenen yeni proteinin özel

immunolojik tayini, genetik olarak değiştirilmiş bitkilerin belirlenmesi için alternatif bir

yaklaşımdır. Ancak genetik modifikasyonun her zaman yeni bir proteinin

sentezlenmesini yönlendirmediği ve protein ifade seviyelerinin analiz metodları için

her zaman yeterli olmayacağı bilinmelidir. Buna ek olarak bazı proteinler bitkinin

sadece özel bölgelerinde (özel amaçlar için genellikle dokuya özel (doku hedefli)

promotörler kullanılır) ya da fizyolojik gelişimin farklı fazlarında veya belli bölgelerde

farklı seviyelerde ifade edilebilir.

En kuvvetli konstitütif promotörler kullanıldığında bile, transgenik ürünlerin ifade

seviyelerinin bitkilerde toplam çözünen proteinin yüzde 0 ile 2 arasında olduğu

belirtilmiştir (Longstaff, 1995). Birçok durumda, ifade seviyeleri (örneğin onaylanmış

GD tahıllar) üst sınır yüzde ikiden daha azdır (Hemmer 1997).

İmmunoanalizler, antikorları test maddesi olarak kullanan analitik ölçüm sistemleridir.

Antikorlar hayvanların serumundan izole edilen ve spesifik üretimlerine yol açan

(antijen) maddeye fiziksel olarak tutunan özel proteinlerdir. Antikorlar, tespiti gereken

maddeyi (örneğin CP4 EPSPS, herbisit Roundup®’a direnç sağlayan protein) fare,

tavşan gibi deney hayvanlarına enjekte ederek vücut hücrelerinin yabancı olarak

tanımladıkları bu proteine karşı antikor üretmesi ile elde edilir. Antikorlar saflaştırılır,

tespit edilebilir bir şaretleyici ile imlenir ve ilgi duyulan maddenin tayininde kullanılır.

İmmunolojik yöntemlerin geliştirilmesi için ilk koşul, tanımlanacak yeni protein için

yüksek hassasiyette antikorların bulunmasıdır. Buna ek olarak, numune ya da ilgi

duyulan proteinlerin önemli derecede parçalanmamış olması tayin için önemlidir.

Antikorlar bileşik karışımlardaki antijenlerin belirlenmesi ve nicel tespitinde biyologlar

için yüksek hassasiyetli araçlardır. Bütün immunoanalizler antikorun antijene özel

olarak bağlanması esasına dayanır.

Antikor-Antijen Etkileşimi

İmmunologlar antikorları çoklukla solüsyondaki antijenleri çöktürme özelliğine sahip

olan proteinler olarak tanımlasalar da bazı otoimmun hastalıklar hariç in vivo



koşullarda antikorlar antijenleri nadiren çöktürür. Antijenlerin belirlenmesi ve

izolasyonunda da ”çöktürme” artık nadiren kullanılmaktadır.

Antikor çöktürme reaksiyonlarının bilgilendirici değeri, Şekil 1’de gösterildiği gibi, bu

reaksiyonun antikor moleküllerinin temel ve evrensel özelliklerinin bir çoğunu

muntazam bir şekilde, bir bütün halinde ortaya koymasıdır.

Bu teknikle gösterilen bazı özellikler;

-serum IgG antikorları antijenle reaksiyonlarında bivalenttir ve farklı antijenlerle

çapraz bağlanma yapabilirler,

-antijenler antikorlarla olan reaksiyonlarında çok değerliklidir ( multivalent)

-serum antikorları doğada poliklonaldir

-antikorlar antijenleri moleküler düzeyde tanıyabilmek için çok özelleşmişlerdir.

Şekil 1. Bir antijen ve ona ait antikorun çökme grafiği

Çöken antikorun miktarının antijen derişimine karşı grafiği çizildiğinde üç bölge

görülür.

Yüksek antikor (Fazla antikor) bölgesi: çökelme önlenir ve fazla antikor

supernatantda tespit edilebilir.



Denge (Eşitlik) bölgesi: en fazla çökelmenin görüldüğü, antijen ve antikorun büyük

erimez yapılar (mavi ile gölgelendirilmiş) oluşturduğu ve ne antijen ne de antikorun

supernatantda tespit edilemediği bölgedir.

Yüksek Antijen bölgesi: çökelti engellenir ve fazla antijen supernatant içinde tespit

edilebilir.

Çökelme reaksiyonu poliklonal antikorlar ile çok değerlikli antijenler arasındaki

etkileşim karakterize etmek için uygundur.Antijenler aynı epitopu çoğul biçimde

taşımadıkları sürece (örneğin polisakkaritlerde bulunan tekrarlayan karbonhidrat

yapıları), monoklonal antikorlar ve antijenler arasındaki etkileşimi tanımlamak için

çökelme reaksiyonu pek yararlı değildir.Sadece bu koşullarda tek özellikli monoklonal

antikorlar bağlanarak antijeni çökertebilir. Monoklonal antikorlar, antikor-antijen

etkileşimi hakkında daha detaylı bilgi sağlayabilmek için denge sabiti, kinetik hız gibi

daha hassas ölçüm yöntemleri ile tanımlanırlar.

Yıllar boyunca geliştirilen çok hassas antikor uygulamaları göz önünde tutulduğunda,

antikorların antijenlerin izolasyonu ve belirlenmesi için ne denli yararlı bir yöntem

olduğu daha kolay analaşılır. Antikorların kullanımları antijenlere bağlanma

kapasitelerini etkilemeden, çeşitli kimyasal modifikasyon reaksiyonlarında

dayanıklılıkları ve yapısal dengelerini koruyabilme özellikle ile de yaygınlaşmıştır.

Çeşitli deneysel koşullar altında antikorlar, antijen tanımlaması ve izolasyonunu

artırmak amacı ile, kimyasal modifikasyon yöntemleri ile floresan, magnetik,

radyoaktif vb. işaretliyiciler ile antjiene bağlanma hassasiyetleri hiç etkilenmeden

imlenmiş ve kullanılmıştır.

Monoklonal antikorlar nasıl hazırlanır?

Vücuda yabancı olan maddeler örneğin hastalık yapan bakteriler, virüsler, ve diğer

enfeksiyon ajanları vücut bağışıklık sistemi tarafında istilacı olarak tanımlanır. Bu

yabancı ajanlara karşı doğal savunmamız, antijenleri tanımaya ve yok etmeye

yarayan antikorlardır.

Antikorlar iki yararlı özelliğe sahiptirler. Birinci olarak çok özelleşmişlerdir. Her antikor

özel olarak bir antijene bağlanır ve ona saldırır. İkinci olarak bazı antikorlar bir

hastalık sonucu aktive olduktan sonra bu hastalığa karşı direncin devamını sağlar.

Antikorların ikinci özelliği aşıların geliştirilmesine olanak sağlar. Aşı zayıflatılmış ya

da öldürülmüş bakteri ya da virüslerdir, vücuda verildiği zaman aşının içerdiği

antijenlere karşı antikorların üretilmesini tetikler.



Antikorların özelliği olan kendine özgülük monoklonal antikor teknolojisini değerli

yapar. Antikorlar yanlızca tedavi amaçlı hastalıktan korunmak için değil çeşitli

hastalıkların tanısına, viral ve bakteri ürünlerinin ve kandaki anormal maddelerin

teşhisine de yardımcı olur.

Hastalıklara karşı savaşan maddeler olarak çeşitli kullanımları, antikorların saf

miktarlarda üretimini bilimsel incelemelerin odağı yapmıştır. Geleneksel yöntem, bir

laboratuvar hayvanına antijen enjekte edilmesi ve antikorların oluşmasını takiben bu

antikorları kan serumundan toplamak şeklindedir (antikor içeren seruma anti-serum

adı verilir). Bu yöntem ile ilgili iki problem vardır: antiserum istenmeyen maddeleri de

içerir ve elde edilen kullanılabilir antikor miktarı çok azdır.

Monoklonal antikor teknolojisi, hücrelerden doğal olarak antikor eldesi yolu ile yüksek

miktarlarda saf antikor ve hücre kültüründe sürekli büyüyebilen hücrelerin üretimine

olanak verir. Hücre ölümsüzlüğü ve istenilen maddenin üretimini birleştiren bir hibrid

oluşturulduğunda zamana karşı antikor üreten bir fabrika sahibi olunur.

Monoklonal antikor teknolojisinde, sonsuz çoğalabilen tümor hücreleri, antikor

üretebilen memeli hücreleri birleştirilir. Bu hücre füzyonunun sonucu ”hibridoma”

oluşur ve sürekli olarak antikor üretebilir. Bu antikorlar monoklonal olarak adlandırılır

çünkü tek tip bir hibridoma hücresinden gelir. Diğer yandan geleneksel yöntemlerle

üretilen antikorlar birçok hücre tipinin bulunduğu ortamlardan üretildiği için poliklonal

olarak adlandırılır. Monoklonal antikorların nasıl oluştuğu aşağıda örneklenmiştir.

Monoklonal antikor üretimi

Myeloma, hücre kültüründe sürekli olarak büyümeye adapte edilebilen bir kemik iliği

tümörüdür. Myeloma hücreleri antikor-üreten memeli dalak hücreleri ile

birleştirildiğinde, oluşan hibrid hücrelerin veya hibridomaların, çok sayıda monoklonal

antikor ürettiği gözlenmiştir. Bu hücre füzyon ürünü iki farklı hücre tipinin istenilen tüm

özelliklerini birleştirir; sürekli olarak büyüme ve yüksek miktarlarda saf antikor üretimi.

Seçilen hibrid hücreler tek bir antikor ürettikleri için, geleneksel yöntemlerle üretilen

poliklonal antikorlardan daha saftır. Hastalıklarla savaşta geleneksel ilaçlardan daha

etkilidir. Çünkü ilaçlar yalnızca yabancı maddeye değil vücut hücrelerine de saldırırlar

ve bazen alerji gibi istenmeyen yan etkilere de neden olur. Monoklonal antikorlar ise

çok az ya da hiç bir yan etki olmadan sadece hedef moleküle saldırır.



ELISA Tekniği

Enzim Bağlı İmmunosorbent Analizi: Bir immunosorbent (katı bir desteğe bağlı

antijen veya antikor) ve enzim bağlı bir immunoreaktant (tepki veren) kullanılan bir

enzim immuno analizidir. Çeşitli yöntemler (örn işaretlenmemiş bilinmeyen ile işaretli

reaktant arasındaki yarışçı bağlanma) bilinmeyen derişimleri ölçmek için kullanılır.

ELISA (Clark ve Adams 1977) yönteminde antijen ve antikorlar arasındaki özel

etkileşim esastır. ELISA’daki anahtar ayraç moleküller, antijen adı verilen yabancı

maddelere karşı vücut bağışıklık sistemi tarafından üretilen anitkor adı verilen

çözünür proteinlerdir. GDO’ların belirlenmesi durumunda bu antijen, genetik

modifikasyon sonucu sentezlenen yeni protein olabilir.



ELISA deneysel safhada yeni aktarılan gen tarafından sentezlenen protein ifade

seviyesinin belirlenmesinde kullanılır. Bu nedenle, özel antikorların üretimi ve

kullanımı ile ilgili bilgiler transgenik bitkilerin geliştirilmesi ile ilgili pek çok makale de

bulunabilir (Mohapatra ve ark. 1999).

Onaylanan genetiği değiştirilmiş tahıllarda kullanılan transgenlerin ürünleri olan

proteinlere karşı kullanılabilecek özgün antikorlardan sadece bir kaçı ticari olarak

mevcuttur. Buna örnek olarak nptII gen ürününe (npt II ve APH(3’)II) ve gus gen

ürününe karşı olan antikorlar örnek verilebilir.

ELISA testi 3 farklı yöntemle gerçekleştirilebilir:

Roundup Ready® soya için özel bir belirleme yöntemi olarak ELISA’ya bağlı yeni bir

teknik geliştirilmiş, test edilmiş ve onaylanmıştır (Lipp ve ark. 2000).

Yöntem, Roundup Ready® soyada herbisite karşı direnci sağlayan protein CP4

EPSPS enzimine (5-enolşikimat-3-fosfat sentaz) (Agrobacterium sp. Suş CP4) karşı

özel antikorların kullanımına dayanır (Padgette ve ark. 1995). İlk sonuçlarda bu

yöntem (ticari ELISA kiti ile) kullanılarak ham soyada (işlenmemiş) GDO varlığı %0,3

ve %0,5 arasındaki derişimlerde belirlenebilmiştir.



Prensip

CP4 EPSPS proteinin belirlenmesi için direkt sandviç enzime-bağlı immunosorbent

analizi (ELISA) aşağıda gösterilen şekilde kullanılmıştır.

Bir mikrotitre plağının yüzeyi özel monoklonal antikor ile kaplanmıştır.

İlgilenilen numune uygulandığında, yüzeye tutunmuş olan antikor özel antijenine

bağlanır. Bağlanmayan moleküller yıkama ile ortamdan uzaklaştırılır.

Yıkamadan sonra, CP4 EPSPS proteinin ikinci bir antijenik bölgesine özelleşmiş olan

ve yaban turbu peroksidaz enzimini (HRP) kovalent bağlanmış olarak taşıyan

poliklonal antikor eklenir.



İkinci yıkamadan sonra, peroksidaz enzim aktivitesi için tetrametilbenzidin (TM)

kromojeni eklenir. Yaban turpu peroksidaz, antijen derişimiyle doğru orantılı olan bir

renk sinyali üretir. Renk sinyalini durdurmak için durdurma sıvısı eklenir. Elde edilen

renk 450 nm dalga boyunda ölçülür.




Deneysel

(GDO Gıda içeriği testi, soya kit kullanıcı rehberi (1999) Strategic Diagnostics Inc.,

Rev. 052099, vers, 1.8)11

Giriş

Aşağıdaki protokol soya unu veya soya protein izolatları ve ham (işlenmemiş)

tarımsal ürünlerde bulunan Roundup Ready® soyada ifade edilen CP4 EPSPS

proteinin belirlenmesi için kullanılan ELISA yöntemini açıklamaktadır.

Yöntem hiç işlenmemiş ya da çok az işlemden geçmiş CP4 EPSPS proteinin

bozulmadığı örneklerde çalışılabilir. Örneğin gıdaların işlendiği çok yüksek sıcaklıklar

yöntemin protein tayini becersini etkileyebilir. Elde edilen veriler, güvenilir protein

tespiti için işlem sıcaklıklarının 65°C’den yüksek ve sürelerinin 60 dakikadan fazla

olmaması gerektiğini belirtmektedir.

Bu yöntem, CP4 EPSPS proteinin tayini için onaylanmıştır ve özel referans materyali

kullanılarak numune içinde %0,3 – 0,5 aralığı içinde bulunan proteinlerin miktarının

(derişimlerinin) belirlenmesinde kullanılabilir. Değiştirilmiş bir protokol kullanılarak

%0,05’den %0,3’e kadar olan daha düşük seviyelerde de kullanılabilir.

Malzemeler

15ml polipropilen konikal santrfüj tüpleri

12x75 mm cam test tüpleri

Sera film veya aliminyum folyo

Plastik band (manuel yıkama için) ya da otomatik plak yıkayıcı

Yıkama şişeleri, örn. 500 ml

20µl- 500 µl aralığında hassas pipetler

Vorteks karıştırıcı

Ağırlık dengeleri

Spatulalar

0,01 g hassasiyette terazi

5000- 10000 rpm aralığına sahip santrifuj 1 Bu bölümde bahsi geçen kit, kurs düzenlediğinde ve bu kitap hazırlandığında ticari olarak erişilebilen bir kittir. JRC ve WHO herhangi bir ticari marka kiti tavsiye etmemektedir.


450 nm dalga boyunda absorbans okuma kapasitesine sahip mikrotitre plak

okuyucu

37°C de sabitlenebilen inkubatör

450µm aralıklı filtre veya eşdeğeri

150µm aralıklı(100 meş) filtre veya eşdeğeri

Çok kanallı pipet, örneğin 50µl ile 300µl aralığında (opsiyonel)

Çok kanallı dağıtım için sıvı reservuarları (opsiyonel)

Otomatik plak yıkayıcı (opsiyonel)

Tüp taşıyıcı raf (15 ml santrifüj tüpleri için) (opsiyonel)

Kimyasallar

Genel

Analiz esnasında aksi belirtilmedikçe, deiyonize veya saf su ve tanımlanmış analitik

derecedeki kimyasallar kullanılmalıdır.

Belirlenmiş performans ölçütlerinden sapmalar kimyasalların stabilitesindeki

eksiklikten kaynaklanabilir. Eğer substrat içeriği şeffaftan maviye dönüştüyse, bu

kimyasal atılmalıdır. Bulanık tampon solüsyonları kullanılmamalıdır.

Bütün kit maddeleri 2°C ile 8°C arasında saklanmalıdır. Kit içindeki maddelerin

kullanım süreleri “son kullanma tarihi” biçiminde belirtilmiştir. Hızlandırılmış stabilite

testleri 2°C ile 8°C arasında test kitinin kullanım süresi 9 ay olarak belirlemiştir.

Antikor konjugatı ”soya konjugat” stok solüsyonu ve antikor konjugat çalışma

solüsyonu kitin kullanım süresinin sonuna kadar 2°C ile 8°C arasında saklanmalıdır.

Seyreltilmiş çalışma yıkama tamponu yaklaşık 2°C ile 8°C arasında saklanmalıdır. Kit

son kullanım tarihinden sonra kullanılmamalıdır.

Test kitinde bulunan kimyasallar

Soya ekstrasyon tamponu, sodyum borat tamponu, pH 7.5

Soya Analiz Tamponu, PBS, Tween 20, Bovin Serum Albumin, pH:7.4

Kaplanmış şerit kuyucukları (12 şerit, her biri monoklonal antikorlarla kaplanmış 8

kuyucuğa sahip ve bir şerit tutucu)

Soya konjugatı, tavşan anti-CP4 EPSPS protein, liyofilize olmuş

Seyreltilmiş soya konjugat, %10 ısıyla inaktif olmuş fare serumu



Kromojenik madde, K-Blue TM, tetrametilbenzidin (TMB), hidrojen peroksit, temel

çözücü olarak %5 dimetilformamid

Durdurma solüsyonu, %0.5 sulfirik asit

10 kez konsantre yıkama tamponu, PBS, Tween 20, pH: 7.1

Negatif ve pozitif referans standartları

Deney

Prosedürün kısıtlamaları

Bu ELISA GDO testinin hassasiyeti CP4 EPSPS protein ifadesinin, kullanılan

referans standart içinde bulunan GDO materyalinin seviyesi ile ilişkili olduğu

numunelerle sınırlıdır.

ELISA test kiti 15°C ile 30°C arasındaki ortam sıcaklıklarında optimum performansı

vermek üzere tasarlanmıştır. En yüksek referans standartın absorbansı 0,8’den

büyük olmalı ve spektrofotometrenin lineer aralığı dışında olmamalıdır (üst sınır

spektrofotometre modeline göre değişebilir). OD değerlerinin 30°C den daha yüksek

sıcaklıklarda daha hızlı arttığını göz önünde bulundurmak gerekmektedir. Bu

nedenle, eğer sıcaklık yüksek ise substrat inkubasyon zamanını azaltmak

gerekmektedir. Düşük sıcaklıklarda (15°C’nin altında) substrat inkubasyon zamanı

arttırılmalıdır.

Numune hazırlama esnasında kontaminasyondan kaçınmak için alınması gereken

önlemler

Genel. ELISA GDO test sistemi çok düşük miktarlarda GDO kontaminasyonu

saptama kapasitesine sahip çok hassas bir tekniktir. Bu sebeple, numune serilerinin

değişimi sırasında soya numunelerini işlemek için kullanılan bütün ekipmanın

temizlenmesi zorunludur. Bu işlemlerde ilk basamak kalan materyal parçalarının

fiziksel temizlenmesidir. İkinci basamak ise alette kalabilecek GDO proteinin inaktif

hale getirmek için numuneyi alkol ile yıkamaktır.

Öğütücü temizliği. Yumuşak kıllı bir fırça ile fırçalayın. Periyodik olarak fırçayı

yıkayın ve alkol solüsyonuna batırın. Kullanmadan önce fırçayı kurulayın. Yumuşak

bir havlu ile silin. Alkolü üzerine püskürterek ya da alkol içinde bekleterek yıkayın. İki

yıkama ya da püskürtme yeterlidir. Ardından su ile yıkayın. Direk olarak kurumaya

bırakabilirsiniz ya da acil kullanmanız gerekiyorsa saç kurutucusu ile kurutun.



Filtre temizliği. Filtreler soya unu ile kalıplaşma eğilimi gösterirler. Kalıplaşan

materyali temizlemek için filtreyi hızlı bir şekilde sert bir yüzeye vurun. Temiz

yumuşak kıllı bir fırçayla fırçalayın. Düzenli olarak fırçayı yıkayın ve en az 1 dakika

alkol solüsyonunda bekletin. Kullanımdan önce fırçayı kurulayın. Yumuşak bir bez ile

silin.

5 dakika alkole batırın ve su ile yıkayın. Direk olarak kurumaya bırakabilirsiniz ya da

acil kullanmanız gerekiyorsa saç kurutucusu ile kurutun.

Alternatif bir yöntem olarak ultrasonik banyo ve takiben kurumaya bırakmak

kullanılabilir.

Çalışma alanının temizliği. Çalışma alanının temizliği çok önemlidir. Analiz çok

hassas olduğu için çok az miktarlarda bir GDO pozitif toz kontaminasyonu bile yanlış

pozitif sonuç verebilir. Çalışma alanında soya toz kontaminasyonundan

kaçınılmalıdır. Bir önceki işlemde kullanılan soya tozunun aleti kontamine ederek bir

sonraki işlemi etkilemesine izin vermeyiniz. Numunenin ezilip hazırlandığı odanın,

analizin yapıldığı oda ile aynı olmaması optimum performans için gereklidir.

Numune hazırlanması

Laboratuar örneğinden homojen artan bir alt örnek alınmalıdır. Eğer örnek

işlenmemiş soya ise en az 500 g uygun bir öğütücüde yaklaşık 3 dakika ya da

filtreden geçecek kadar ufak olana kadar ezin. Nicel analiz için 150 µm daha küçük

partikül boyutu, nitel analiz için 450 µm’den daha az partikül boyutu elde etmek

gerekir. Kontaminasyondan kaçınmak için filtreleme basamağına dikkat edilmelidir.

Buna ek olarak, fazla ısıtmaktan da kaçınılmalıdır. Blender (parçalayıcı), örneği hem

karıştıracak hem de parçalayacaktır. Ana materyalden yaklaşık 100 gr’lık bir örnek

alınıp 450 µm’lık filtreden geçirilmelidir. Bu örneğin en az %90’ı 450 µm’lik filtreden

geçirilmelidir. Nitel analiz için bu materyal direkt olarak kullanılabilir, nicel analiz için

filtrelenen materyal tekrar 150 µm’lik filtreden geçirilmelidir. 450 µm’lik filtreden geçen

materyalin homojen olduğu gözlenmiştir. Bu nedenle, 150 µm’lik filtreden yalnızca

son örneği sağlayacak kadar materyali geçirmek gereklidir. Son örnek için, prosedür

için gerekli olacak miktarda materyali filtrelemek yeterlidir.

Diğer tipteki örnekler daha küçük numune miktarları kullanılsa bile aynı biçimde işlem

görmelidir.



Analiz işlemi

Kullanımdan önce bütün sıvıları oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Kaplanmış şerit

ve şerit tutucuları folyo kutusundan çıkarın. Uygun sayıda şeriti çıkardıktan sonra

folyo kutusunu mutlaka kapatın. Referans standartları ve analiz körleri için 10

kuyucuk gereklidir. Her plak kendi standart ve kontrollerine sahip olmalıdır. Normal

yıkama kullanılıyorsa yıkama basamaklarında bütün şeritleri kenarlarından tutturmak

gereklidir.

Antikor konjugatın hazırlanması

Antikor konjugat stok solüsyonu: 1ml soya konjugat çözücü, soya konjugat

viyolünee alınır. Karıştırmak için 10 sn vortekslenir.

Antikor konjugat çalışma solüsyonu: Yeniden oluşturulmuş soya konjugatından

240 µl soya konjugat çözücü şişesine geri aktarılır ve tarih atılır. 20 kez çevirerek

karıştırılır.

Yıkama tamponunun hazırlanması

10x yıkama tamponunu oda sıcaklığına getiriniz.

Çalışma yıkama tamponu hazırlamak için bu tamponu deiyonize su ile seyreltin (örn

50 ml 10x yıkama tamponu 450 ml deiyonize su içine)

Yıkama şişesine koyun (ya da otomatik yıkayıcı)

Örnek ve referans standartlarının ekstrasyonu

Örnekler, pozitif ve negatif referans standartları, aynı koşullar altında, duplike olarak

aşağıda belirtildiği gibi esktrakte edilir.

Örnekleri tartarken, her referans standartı ve örnekler artan derişimlerde sıralanır.

Her referans standartı ve örnekden 0,5±0,01 g. tartarak polipropilen santrifuj tüplerine

koyun. Kontaminasyonu önlemek için her tartıda spatulayı temizleyin. 0,5 g numune

içeren her tüpe 4,5 ml soya ekstrasyon tamponu ekleyip 10 sn vorteksleyin.

Karışımları 5000 rpm de 15 dakika santrifüjleyin. Transfer pipeti kullanılarak çökeltiye

zarar vermeden supernatantı ayırınız. Supernatantı işaretlenmiş 15 ml lik temiz yeni

bir santrifuj tüpüne alınız. Analize başlamadan önce numuneler ve referans standart

ekstraktları soya tamponu ile Tablo 1’e göre seyreltilir. Protein ekstraktları bir çalışma

gününden uzun olmamak şartı ile 2°C ile 8°C arasında saklanmalıdır.

Tablo 1. Matrikse göre seyreltme oranları



Matriks Seyreltme

Soya fasülyesi

Soya unu

Yağı alınmış soya unu

Protein izolatı

1:300

1:300

1:300

1:10

Örnek ekstraktlarının seyreltilmesi

Ekstraksiyon yapılan negatif kontrol, ekstraksiyon yapılan pozitif referans ve her

örnek için seyreltme işlemi yapmak üzere iki adet 12x75 mm boyutlarında test tüpü

gereklidir.

280 µl soya analiz tamponunu bu tüplerden bir tanesine pipetleyin

380 µl soya analiz tamponunu diğer tüpe pipetleyin.

280 µl olan tüpü 1:15, 380 µl olan tüpü 1:300 olarak etiketleyin

Her örnekten 20 µl 1:15 olarak etiketlenmiş tüpe ekleyin ve vorteksleyin

Karıştırma sonrası 1:15 etiketli tüpten 20 µl alarak 1:300 etiketli tüpe ekleyerek

vorteksleyin

Bu basamakları her negatif kontrol, pozitif referans ve örnek ekstraktları için tekrar

edin

ELISA İmmunoanaliz prosedürü

Genel

ELISA analiz kiti 8 kuyucuklu şeritlerden herhangi biri kullanılarak çeşitli formatlarda

yürütülebilir. Rastgele yükleme şeması izlenmesi tavsiye edilmektedir.

Bütün reaksiyon kuyucukları eşli olarak yürütülmelidir. Her kuyucuk için ortalama

absorbans değerleri hesaplanmalıdır. Her yürütme tampon körü, negatif kontrol ve

pozitif referans standartlarının analizinden oluşur.

Analiz başlatıldığı zaman diğer basamaklar da ara vermeden tamamlanmalıdır.



Numune Eklenmesi

Seyreltilmiş ekstraktlar ve analiz tamponundan 100µl uygun kuyucuklara eklenir.

Kontaminasyonu önlemek için her pipetleme basamağında ayrı kullanılıp atılan pipet

uçları kullanılmalıdır.

Buharlaşma ve kontaminasyonu önlemek için kuyucukların üstü sera film veya

aliminyum folyo ile kapatılır.

Örnek inkubasyonu

Mikrotitre plağı 37°C de 1 saat bekletilir.

Yıkama

300 µl yıkama tamponu ile 3 kere yıkanır.

Elle yapılan yıkama: Kuyucuklar ters çevrilerek uygun bir atık kutusuna boşaltılır.

Yıkama solüsyonu ile dolu 500ml yıkama şişesi kullanılarak her kuyucuk tepesine

kadar doldurulur. 60 sn bekletilir, daha sonra ters çevrilerek boşaltılır. Yıkama adımı

3 kez tekrar edilir. Kalan sıvıyı ve hava kabarcıkları birkaç kağıt havlu üzerine ters

yüz ederek alınır. Uygun bir bant ile şeritlerin düşmesi engellenir.

Otomatik yıkama: İnkubasyon safhasının ardından bütün kuyucukların içi mikro

kuyucuk yıkayıcısı ile aspire edilerek boşaltılır. Ardından bütün kuyucuklar yıkama

tamponu ile doldurulur. Aspirasyon ve doldurma safhaları toplam 3 kez tekrar edilir.

Son olarak mikro kuyucuk yıkayıcı bütün kuyucuklardaki sıvının buharlaşması için

kullanılır. Kalan yıkama tamponu veya hava kabarcıkları birkaç kat kağıt havlu

üzerine ters yüze ederk alınır.

Kuyucukların tamamen kurumasına izin vermeyiniz. Bu analiz performansını

etkileyebilir.

Yetersiz yıkama hatalı sonuç verebilir. Her iki yıkama yönteminde de kuyucukların

eşit miktarlarda sıvı ile yıkanması gerekmektedir.

Antikor konjugatın eklenmesi

Her kuyucuğa 100µl antikor konjugat çalışma solüsyonundan eklenir.

Buharlaşma ve kontaminasyonu önlemek için plak örtülür.

İnkubasyon

Mikrotitre plak 37°C de 1 saat inkube edilir.



Yıkama

İnkubasyon safhasının sonunda tüm yıkama safhaları yukarıda belirtildiği gibi tekrar

edilir

Substrat eklenmesi

Her kuyucuğa 100 µl renk solüsyonu eklenir.

Plak yavaşca karıştırılır ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletilir.

Kromojenik substratın eklenmesi hemen yapılmalıdır.

Pipetleme safhasında aynı sıra ve zaman aralığı korunmalıdır.

Mikrotitre plak renk yoğunluğunun etkilenmemesi için güneş ışığından korunur.

Stop solusyonu eklenmesi

İnkubasyon safhasının sonunda her kuyucuğa 100 µl stop solüsyonu eklenir.

Plak yavaşca karıştırılır ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletilir. Pipetleme

safhasında Kromojenik substratın eklenmesi ile aynı sıra ve zaman aralığı korunmalı,

ara verilmeden tamanlanmalıdır. Mikrotitre plak renk yoğunluğunun etkilenmemesi

için güneş ışığından korunur.

Absorbans okunması

450 nm’de ölçüm yapabilmek için uygun filtre takılmış mikroplak okuyabilen

spektrofotometre ile her analiz kuyucuğunun absorbansını ölçünüz.

Bütün ölçümler durdurma solüsyonu ekledikten sonra 30 dakika içinde yapılmalıdır.

Elde edilen sonuçlar kaydedilir ve ortalama absorbans değerleri hesaplanır ya da

bilgisayar programı kullanılır.

Değerlendirme

Standart eğrinin çizilebilmesi için standart değerler kullanılır. Körün değeri bütün

numune ve referans standartlarından çıkarılmalıdır. Her çiftli referans noktasından

ortalama değerler standart eğri çizmek için kullanılır. Her çiftli numuneden elde edilen

ortalama veri bu grafikten derişim hesabı için kullanılır.

Kabul/Red Kriterleri

Geçerli olabilmesi için her yürütmenin prosedürdeki kabul/red kriterlerine uyması

gereklidir. Yürütme aşağıdakilerden oluşur; analiz körü, her GDO pozitif referans

standart ekstraktı, negatif kontrol ve her bilinmeyen numune. Bütün protein



ekstraktları ve analiz körü çiftli olarak yürütülür. Eğer yürütme analiz kabul ölçütlerine

uymazsa bütün yürütme tekrarlanır.

Yürütme Ölçüt

Analiz Tampon kör A450<0,30

%0 GDO standart A450<0,30

%2,5 Referans A450>0,8

Bütün pozitif standartlar Çiftlerin CVsi≤%15

Test edilen numuneler Çiftlerin CVsi≤%20



AKIŞ ŞEMASI

Örnek ve referans ekstrasyonu için akış şeması

İşlem Hacim/Ağırlık Tanım

Tartım 0,5 g Örnekler, analiz körü ve referans standartları tartılır.

Ekleme 4,5 ml Ekstrasyon tamponu eklenir.

Karıştırma Homojen olana kadar örnek ekstrasyon tamponu ile

karıştırılır.

Santrifüj 5000 rpm Örnek 5000 rpm’de 15 dakika santrifüj edilir

Supernatant temiz bir tüpe alınır.

Seyreltme 1:300 veya 1:10

incelenen materyale göre

Örnek veya referans standartları seyreltilir.

ELISA Immunoanaliz için Akış Şeması

İşlem Hacim Tanım

Ekleme 100 µl Örnek, referans standart ve analiz tampon körü uygun analiz

kuyucuğuna pipetle konulur.

Inkubasyon 1 saat 37°C de inkubasyon yapılır.

Yıkama 3 kez yıkama tamponu ile yıkanır.

Ekleme 100 µl Antikor konjugatı her analiz kuyucuğuna dağıtılır.

Inkubasyon 1 saat 37 °C de inkubasyon yapılır.

Yıkama 3 kez yıkama tamponu ile yıkanır.

Ekleme 100 µl Her kuyucuğa renk solüsyonu eklenir.

İnkubasyon Ortam sıcaklığında 10 dakika bekletilir.

Ekleme 100 µl Her kuyucuğa durdurma reaksiyonu eklenir.

Absorbans Ölçümü Plak okuyucuda her kuyucuğun absorbansı 450 nm de

ölçülür.



Kaynaklar

Clark, M.F. and Adams, A.N. (1977). Characteristics of the microplate method of

enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of

General Virology 34, 475-483.

Hemmer, W. (1997). Foods Derived from Genetically Modified Organisms and

Detection Methods. Biosafety Research and Assesment of Tehnology Impacts of

the Swiss Priority Program Biotechnology- Report 2/97, 61 pages.

http://www.bats.ch/bats/publikationen/1997-2_gmo/index.php (accessed January

2010).

Lipp, M., Anklam, E. and Stave, J.W. (2000). Validation of an immunoassay for

detection and quantification of a genetically modified soybean in food and food

fractions usig reference materials. Journal of AOAC International 83, 919-927.

Longstaff, M., Edmonds, H.S. and Newell, C.A. (1995). An improved method for he

detection and quantification of recombinant protein in transgenic plants. Plant

Molecular Biology Reporter 13, 363-368.

Mohapatra, U., Mccabe, M.S., Power, J.B., Schepers, F Vanderrarend, A., and

Davey, M.R. (1999). Expression of the bar gene confers herbicide resistance in

transgenic lettuce. Transgenic Research 8, 33-44.

Padgette, S.R., Kolacz, K.H., Deannay, X., Re, D.B., LaVallee, B.J., Tinius, C.N.,

Rhodes, W.K., Otero, Y.I., Barry, G.F., Eicholtz, D.A., Peschke, V.M., Nida, D.L.,

Taylor, N.B. and Kishore, G.M. (1995). Development, identification, and

characterzation of a glyphosate-tolerant soybean line. Crop Science 35, 1451-

1161.


http://www.bats.ch/bats/publikationen/1997-2_gmo/index.php



Ek Kaynaklar

Brett, G.M., Chambers, S.J., Huang, L. and Morgan, M.R.A. (1999). Design and

development of immunoassays for detection of proteins. Food Control 10,

401-406.

Commision Directive 79/700/EEC of 24 July 1979 establishing Community methods

of sampling for the official control of pesticide residues in and on fruit and

vegetables. OJ L 239, 22.9.1979, p.24.

Rogan, G.J. Dudin, Y.A., Lee, T.C., Magin, K.M., Astwood, J.D., Bhakta, N.S., Leach,

J.N., Sanders, P.R. and Fuchs, R.L. (1999). Immunodiagnostic methods for

detection of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthetase in Roundup

Ready® soybeans. Food Control 10, 407-414.

Stave, J.W. (1999). Detection of new modified proteins in novel foods derived from

GMO-future needs. Food Control 10, 367-374.

Van der Hoeven, C., Dietz, A. and Landsmann, J. (1994). Variability of organ-specific

gene expression in transgenic tobacco plants. Transgenic Research 3, 159-

165.

Documents

Gıda Örneklerinde ğiştirilmiş - gmo-crl.jrc.ec.europa.eugmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual TR/bolum12.pdf · İmmunolojik yöntemlerin geliştirilmesi için