İMMUNOLOJİK İMMUNOLOJİK TANI TANI

YÖNTEMLERİYÖNTEMLERİ

Prof. Dr. Bekir Prof. Dr. Bekir KOCAZEYBEKKOCAZEYBEK

I- GENEL BAKIŞ;I- GENEL BAKIŞ;

KLİNİK İMMUNOLOJİDE KLİNİK İMMUNOLOJİDE HASTALIĞIN TANISI İÇİNHASTALIĞIN TANISI İÇİN

a)a) Çok iyi bir Çok iyi bir ÖYKÜ ÖYKÜ alınmasıalınması

b)b) FİZİKİ İNCELEMEFİZİKİ İNCELEME yapılması yapılması

c)c) Uygun Uygun TANI TESTİNİNTANI TESTİNİN yapılmasıyapılması

ZORUNLUDURZORUNLUDUR

a)ÖYKÜ:a)ÖYKÜ:

KLİNİK İMMUNOLOJİ UZMANINA BAŞVURU KLİNİK İMMUNOLOJİ UZMANINA BAŞVURU NEDENLERİ(NEDENLERİ(sıklık sırasıylasıklık sırasıyla););

ENFEKSİYONLAR (en sık)ENFEKSİYONLAR (en sık) Yineleyen enfeksiyonYineleyen enfeksiyon

Çocuklarda bulaşıcıÇocuklarda bulaşıcı ÜSYE ÜSYE çok sıktır çok sıktır Bu çocuklarda sekonder olarak Bu çocuklarda sekonder olarak

♣♣ Otit, sinüzit, bronşit gelişebilirOtit, sinüzit, bronşit gelişebilir Bu hastalıklar diğer çocuklara görülmesine göre Bu hastalıklar diğer çocuklara görülmesine göre daha daha

sıksasıksa ♣♣ AntibiyotikAntibiyotik almayı almayı gerektiriyorsagerektiriyorsa

Ig G alt sınıf yetersizliği Ig G alt sınıf yetersizliği vardırvardır Deri veDeri ve ÜSYE’ ÜSYE’nin;nin;

♣♣ 6-12 aydan6-12 aydan sonra başlaması sonra başlaması ♣♣ Sık Sık ve ve birincilbirincil olması olması

Ig yetersizliğiniIg yetersizliğini gösterir gösterir

Çok ağır enfeksiyonlarÇok ağır enfeksiyonlar Ağır Ağır viralviral enfeksiyonlar enfeksiyonlar

T hücre yetersizliğiT hücre yetersizliği

AğırAğır bakteribakteri enfeksiyonlar enfeksiyonlar

B hücre yetersizliğiniB hücre yetersizliğini gösterirgösterir

Fırsatçı mikroorganizmalarla Fırsatçı mikroorganizmalarla enfeksiyonenfeksiyon

Hastane enfeksiyon etkenleriHastane enfeksiyon etkenleri

KİT’ de KİT’ de CMVCMV enfeksiyonuenfeksiyonu

Doğal ve özgül immunitede Doğal ve özgül immunitede ♣♣ Özellikle T hücre Özellikle T hücre

bozukluğubozukluğu

Kendine özgü mikroorganizmlarla Kendine özgü mikroorganizmlarla enfeksiyonenfeksiyon

Aspleniklerde Aspleniklerde

PnömokokPnömokok enfeksiyonuenfeksiyonu

Enflamasyonsuz enfeksiyonEnflamasyonsuz enfeksiyon

Aplastik anemi, nötropenik ve Aplastik anemi, nötropenik ve disfonksiyonel nötrofiliklerdedisfonksiyonel nötrofiliklerde

Pyojenik bakterilerePyojenik bakterilere dirençsizlik dirençsizlik

Kronik enfeksiyonKronik enfeksiyon

Kronik ishal yada büyüme bozukluğu Kronik ishal yada büyüme bozukluğu olanlardaolanlarda

sIgA yada T hücre yetersizliğisIgA yada T hücre yetersizliği

♣♣ Rotavirus, G. Rotavirus, G. lamblialamblia enfeksiyonu enfeksiyonu

İMMUN YETERSİZLİĞE BAĞLI;İMMUN YETERSİZLİĞE BAĞLI;

HASTALIK BELİRTİLERİ HASTALIK BELİRTİLERİ

Allerjik Allerjik

ArtritArtrit

Deri değişiklikleriDeri değişiklikleri

MALİGN HASTALIKLARLA İLGİLİ MALİGN HASTALIKLARLA İLGİLİ BELİRTİLERBELİRTİLER

b)FİZİKİ İNCELEME:b)FİZİKİ İNCELEME: Hastada enfeksiyon bulunup bulunmadığı;Hastada enfeksiyon bulunup bulunmadığı;

VARSA;VARSA; Hastanın genel yanıtı, sağlık durumunun gözlenmesiHastanın genel yanıtı, sağlık durumunun gözlenmesi

Hastalarda;Hastalarda; SolgunlukSolgunluk Kanama odaklarıKanama odakları Deride kolay morarmaDeride kolay morarma Döküntü Döküntü

Hastanın;Hastanın; Lenf bezleri ve bademcikleri var olup olmadığı Lenf bezleri ve bademcikleri var olup olmadığı Büyüklüğü saptanmalıdırBüyüklüğü saptanmalıdır

Ağır T hücre yetmezliğinde lenf bezi ele gelmezAğır T hücre yetmezliğinde lenf bezi ele gelmez Bademcikler görünmezBademcikler görünmez

Normal bebeklerde dalağın alt ucu Normal bebeklerde dalağın alt ucu ele gelirele gelir Ancak dalak yokluğu (aspleni ile)Ancak dalak yokluğu (aspleni ile)

BakteriyelBakteriyel ( (kapsüllükapsüllü) enfeksiyonlar sıktır) enfeksiyonlar sıktır Ağızda pamukçukların olmasıAğızda pamukçukların olması

T hücre yetersizliğiT hücre yetersizliği Candida spCandida sp

Bazı özel sendromlara spesifik;Bazı özel sendromlara spesifik; Hastalık ve/veya bulguların olmasıHastalık ve/veya bulguların olması

Di George sendromundaDi George sendromunda Neonatal tetanoz ve KKHNeonatal tetanoz ve KKH

Wiskott-Aldrich sendromuWiskott-Aldrich sendromu EgzamaEgzama

Kolay kanama eğilimiKolay kanama eğilimi

PeteşiPeteşi

c)TANI TESTLERİ:c)TANI TESTLERİ: UYGUN TANI TESTİ NE DEMEK?UYGUN TANI TESTİ NE DEMEK?

Hastanın kliniğine paralel Hastanın kliniğine paralel doğru doğru seçilmiş seçilmiş

Laboratuvar da Laboratuvar da özenle özenle yapılmışyapılmış

Sonucu Sonucu titizlikle titizlikle açıklanmış açıklanmış testtirtesttir

UYGUN TANI TESTİ İSTEMENİN UYGUN TANI TESTİ İSTEMENİN NEDENLERİNEDENLERİ

İmmun sistem çevre ile dinamik bir İmmun sistem çevre ile dinamik bir dengede olduğu için;dengede olduğu için;

Çoğu testin spektrumu geniştirÇoğu testin spektrumu geniştir

İmmunolojik testlerin İmmunolojik testlerin BAZILARI;BAZILARI;

BİOASSAYBİOASSAY (yaşam sürecinde (yaşam sürecinde inceleme) inceleme) olduğundanolduğundan

Test sırasında kontrol edilemeyen Test sırasında kontrol edilemeyen değişken değişken faktörlerden faktörlerden etkilenirleretkilenirler

Bundan dolayıBundan dolayı testler testler

♣♣ AynıAynı yaş ve zamanda yaş ve zamanda

Hasta ve kontrol gruplarındaHasta ve kontrol gruplarında yapılmalıdıryapılmalıdır

Bazı testler ilgili laboratuvarda az yapılırBazı testler ilgili laboratuvarda az yapılır Bundan dolayı Bundan dolayı

Bu birim sürekli Bu birim sürekli nitelik kontrolünitelik kontrolü yapması gerekir yapması gerekir

Test sonuçlarıTest sonuçları Klinik durumla paralel açıklanması gerekirKlinik durumla paralel açıklanması gerekir

ÇÜNKÜ;ÇÜNKÜ;

Başka Başka ikincil hastalıklarikincil hastalıklar

VeyaVeya metabolik bozukluklarmetabolik bozukluklar sonuçları etkiler sonuçları etkiler

İmmunolojik testlerİmmunolojik testler Özel araç- gereç ve uzman ekipmanlı Özel araç- gereç ve uzman ekipmanlı

laboratuvarlar gerektirdiğinden laboratuvarlar gerektirdiğinden pahalıdırpahalıdır

İMMÜN SİSTEM İNCELEME ALGORİTMASI

ÖYKÜ

FİZİKİ İNCELEME

RUTİN İNCELEME TESTLERİ

İMMUNOLOJİK GÖZDEN GEÇİRME TESTLERİ

Total Kompleman Düzeyi Tam Kan Sayımı Gecikmiş Tip Aşırı T, B ve diğer Lenfosit İmmunglobulin Duyarlılık Deri Testi alt grup Sayımları Düzeyleri Düşük Normal Lökositoz Lökopeni Pozitif Negatif Düşük Normal Yüksek Normal Düşük Trombositopeni T Hücre Yetersizliği T Hücre Fonksiyon B Hücre Fonksiyon Testleri Testleri

B Hücre Yetersizliği

İMMUNOLOJİK ÖZEL TANI VE ARAŞTIRMA TESTLERİ

I O

IMMUNOLOJİK TESTLERDE KLİNİK IMMUNOLOJİK TESTLERDE KLİNİK ÖRNEKLERÖRNEKLER

Venöz damardan kan alınabilirVenöz damardan kan alınabilir Mikrobiyal antijen tayini ile ilgiliMikrobiyal antijen tayini ile ilgili

Serum, dışkı, balgam, idrar, Serum, dışkı, balgam, idrar, Boğaz salgısı, BOS, PMNLBoğaz salgısı, BOS, PMNL Diğer enfekte doku, salgı ve sekresyonlar Diğer enfekte doku, salgı ve sekresyonlar

Humoral immuniteyle Humoral immuniteyle (antikor tayini)(antikor tayini) ilgili ilgili Serum (antikoagulansız kan)Serum (antikoagulansız kan)

Hücresel immuniteyle ilgiliHücresel immuniteyle ilgili Heparinlenmiş taze kan ve eriyik maddelerHeparinlenmiş taze kan ve eriyik maddeler İnvivo uygulamalar (cilt testleri)İnvivo uygulamalar (cilt testleri)

İmmuno genetik çalışmalarla ilgiliİmmuno genetik çalışmalarla ilgili Kan örnekleriKan örnekleri Taze veya fikse edilmiş dokularTaze veya fikse edilmiş dokular

ENFEKSİYON HASTALIKLARININ ENFEKSİYON HASTALIKLARININ TANISINDATANISINDA

İmmunolojik (Serolojik) Testlerİmmunolojik (Serolojik) Testler♦♦ Enfeksiyon hastalığının tanısına sıklıkla Enfeksiyon hastalığının tanısına sıklıkla

indirekt, (bazende direkt) yardımcı olurlarindirekt, (bazende direkt) yardımcı olurlar♦♦ Çeşitli klinik örneklerde mikroorganizmalara Çeşitli klinik örneklerde mikroorganizmalara

özgül özgül antijen (Ag)antijen (Ag) veya veya antikorları (Ab)antikorları (Ab) arama testleridirarama testleridir

♦♦ Ag araştıran testlerde duyarlılık erken ve Ag araştıran testlerde duyarlılık erken ve tedavi edilmeyen durumlarda yüksektirtedavi edilmeyen durumlarda yüksektir

♦♦ Ab araştıran testlerde primer immun yanıt Ab araştıran testlerde primer immun yanıt 7-21 gün içinde geliştiğinden çok erken 7-21 gün içinde geliştiğinden çok erken evrede yalancı negatif olabilirevrede yalancı negatif olabilir

♦ ♦ Erken tedavi edilen ve bağışıklık yetmezliği Erken tedavi edilen ve bağışıklık yetmezliği olan olgularda antikor yanıtı gelişmemektedirolan olgularda antikor yanıtı gelişmemektedir

♦♦ Bu testler Bu testler Ag-Ab birleşme temelliAg-Ab birleşme temelli testlerdir testlerdir ♦♦ Bu testler duyarlılığı ve özgüllüğü farklı Bu testler duyarlılığı ve özgüllüğü farklı YÖNTEMLERLEYÖNTEMLERLE invitro olarak invitro olarak yapılmaktadıryapılmaktadır ♦ ♦ Bu yöntemlerin Bu yöntemlerin ANALİTİKANALİTİK duyarlılığı duyarlılığı farklıdırfarklıdır

Hücresel İmmun YanıtHücresel İmmun Yanıt (Fakültatif yada (Fakültatif yada zorunlu H.İ.B) zorunlu H.İ.B) gelişirgelişir

İnvivo deri testleri İnvivo deri testleri İnvitro sentezlenen Quanteferon miktarı ya da İnvitro sentezlenen Quanteferon miktarı ya da

Quanteferon sentezleyen hücre miktarı ölçülür. Quanteferon sentezleyen hücre miktarı ölçülür.

İmmunolojik yöntemlerin İmmunolojik yöntemlerin analitik duyarlılıkları analitik duyarlılıkları

(µg/ml- ng/ml)(µg/ml- ng/ml)Yöntemler Analitik duyarlılıklar

Protein elektroforezi 100 mg/dl

Immun elektroforez 5-10 mg/dl

Tek Yönlü Immundiffüzyon <1-2 mg/dl

Çift Yönlü Immundiffüzyon <1 mg/dl

Elektroimmundiffüzyon <0,5 mg/dl

Nefakometre? 0.1 mg/dl

Aglütinasyon/KBD 1 mikrog/dl

RIA-EIA-FIA- Kemilüminesans-IA <5pg/ml

PresipitasyonPresipitasyon

MİKROBİYAL ENFEKSİYONLARDA MİKROBİYAL ENFEKSİYONLARDA SEROLOJİK(İMMUNOLOJİK) SEROLOJİK(İMMUNOLOJİK)

YÖNTEMLERİN AMACI(I)YÖNTEMLERİN AMACI(I)

1- TANIDA;1- TANIDA;• ÖRNEĞİN; ÖRNEĞİN; VİRUSLARIN TANIMLANMASINDA;VİRUSLARIN TANIMLANMASINDA;

♦ ♦ Kültürle izolasyonu;Kültürle izolasyonu;• Olanaksız, güç veya uzun zaman aldığındanOlanaksız, güç veya uzun zaman aldığından

• örneğin örneğin HIV enf uygun hayvan yokHIV enf uygun hayvan yok• Tam donanımlı laboratuvarlar ve deneyimli elemanlar Tam donanımlı laboratuvarlar ve deneyimli elemanlar

gerektirdiğindengerektirdiğinden• Virus izolasyonu için uygun örnek almak, transport Virus izolasyonu için uygun örnek almak, transport

etmek, saklamak hususlarındaki sorunlardan dolayıetmek, saklamak hususlarındaki sorunlardan dolayı

• RUTİN TANIDA PRATİK DEĞİLDİRRUTİN TANIDA PRATİK DEĞİLDİR

VİRUS ENFEKSİYONLARINDA VİRUS ENFEKSİYONLARINDA SEROLOJİK(İMMUNOLOJİK) SEROLOJİK(İMMUNOLOJİK)

YÖNTEMLERİN AMACI(I)YÖNTEMLERİN AMACI(I)

*Viruslerin mikroskobisinde;*Viruslerin mikroskobisinde;

--EM ve inklüzyon cisimciğiEM ve inklüzyon cisimciği aranmasının aranmasının pratikte kullanımı pratikte kullanımı sınırlı, zahmetli ve pahalı sınırlı, zahmetli ve pahalı olmasıolması

-Subjektif değerlendirmelere -Subjektif değerlendirmelere (deneyimli (deneyimli eleman) açık olması, eleman) açık olması, yalancı pozitiflik yalancı pozitiflik ve ve negatiflikler olabilirnegatiflikler olabilir

VİRUS ENFEKSİYONLARINDA VİRUS ENFEKSİYONLARINDA SEROLOJİK(İMMUNOLOJİK) SEROLOJİK(İMMUNOLOJİK)

YÖNTEMLERİN AMACI(I)YÖNTEMLERİN AMACI(I)♦♦Viral nükleik asidin saptanmasında;Viral nükleik asidin saptanmasında;

-Moleküler Yöntemlerin-Moleküler Yöntemlerin **Her sağlık merkezinde Her sağlık merkezinde

uygulanamamasıuygulanamaması** Uygulandığı laboratuvarlara teknik Uygulandığı laboratuvarlara teknik

donanım donanım yetersizliği ve deneyimli ekipman yetersizliği ve deneyimli ekipman azlığıazlığı

** Her virus için deneysel olarak optimize Her virus için deneysel olarak optimize edilememesiedilememesi

-Yalancı pozitif ve negatiflik sorunu-Yalancı pozitif ve negatiflik sorunu

* * Her virus için uygulamasının olmamasıHer virus için uygulamasının olmaması- Özgül primer sorunu- Özgül primer sorunu

Mikrobiyal Enfeksiyonlarda Mikrobiyal Enfeksiyonlarda İmmunolojik (serolojik) Test İmmunolojik (serolojik) Test Yöntemlerinin amacı;Yöntemlerinin amacı; ÖRNEĞİN;ÖRNEĞİN;

BAKTERİYAL ETKENİN TBAKTERİYAL ETKENİN TANIMLANMASINDAANIMLANMASINDA İzolasyonun olanaksız, güç veya zaman gerektirdiği İzolasyonun olanaksız, güç veya zaman gerektirdiği

durumlar;durumlar; Lepra, Sifiliz, Brucelloz, TularemiLepra, Sifiliz, Brucelloz, Tularemi

Derin yerleşimli bir enfeksiyonda örneği elde etmek veya Derin yerleşimli bir enfeksiyonda örneği elde etmek veya üretmede zorluk;üretmede zorluk;

CoxiellaCoxiella endokarditinde endokard örneği almak endokarditinde endokard örneği almak veya kanda üretme zorluğuveya kanda üretme zorluğu

Legionella, ChlamydophilaLegionella, Chlamydophila, atipik pnömosinde , atipik pnömosinde BAL yada NFS almak veya üretme zorluğuBAL yada NFS almak veya üretme zorluğu

Geçirilmiş bir enfeksiyon veya taşıyıcılık durum belirlemede:Geçirilmiş bir enfeksiyon veya taşıyıcılık durum belirlemede: ARA veya AGN’ de ASO düzeyi ARA veya AGN’ de ASO düzeyi Tifo’da Anti-ViTifo’da Anti-Vi varlığı varlığı

MİKROBİYAL ENFEKSİYONLARDA MİKROBİYAL ENFEKSİYONLARDA ETKENİ TANIMLAMADA SEROLOJİK ETKENİ TANIMLAMADA SEROLOJİK (İMMUNOLOJİK) DEĞERLENDİRME (İMMUNOLOJİK) DEĞERLENDİRME

KRİTERLERİ (I)KRİTERLERİ (I) Antikor tayin temelliAntikor tayin temelli dört kriter vardır dört kriter vardır a)a) Tek bir serum örneğinde;Tek bir serum örneğinde;

Yüksek titrede spesifik IgMYüksek titrede spesifik IgM yanıtıyanıtı-Rubella IgM, -Rubella IgM, M.pneumoniaeM.pneumoniae IgM IgM

Veya Veya IgM negatif IgG pozitif ise;IgM negatif IgG pozitif ise; Akut-konvelasan dönem (2-3 hafta sonra) Akut-konvelasan dönem (2-3 hafta sonra)

serumdaserumda 4 kat titre artışı4 kat titre artışı

-EBV IgG, -EBV IgG, C. pneumophilaC. pneumophila IgG ≥512 IgG ≥512 b)b) Akut ve konvelasan dönem (2-3 hafta) serumda Akut ve konvelasan dönem (2-3 hafta) serumda

4 kat titre4 kat titre artışıartışı TTotal antikor yanıtındaotal antikor yanıtında Paul Bunnel testi Paul Bunnel testi (EBV)(EBV)

BrusellozBruselloz tanısında Wright Testi tanısında Wright Testi 1/20den > 1/1601/20den > 1/160

c)c) N Nadiradir görülen görülen enfeksiyonlarda; enfeksiyonlarda; Tek serum örneğinde Tek serum örneğinde

Özgül IgM antikor yanıtı Özgül IgM antikor yanıtı Kuduz, Kuduz, BotulismusBotulismus

d)d) IgG AVİDİTE TESTLERİIgG AVİDİTE TESTLERİAFİNİTE:AFİNİTE: Multivalan bir antikorun monovalan Multivalan bir antikorun monovalan

bir bir antijenle bağlanma kuvveti antijenle bağlanma kuvveti

AVİDİTE:AVİDİTE: Multivalan bir antikorun multivalan Multivalan bir antikorun multivalan bir antijenle bağlanma kuvveti bir antijenle bağlanma kuvveti

Olası Serolojik ProfillerOlası Serolojik ProfillerIgG (-)IgG (-) IgG (+)IgG (+) IgG (+)IgG (+)IgM (+)IgM (+) IgM (-)IgM (-) IgM (+)IgM (+) YeniYeni ÖncedenÖnceden Kazanılmış Geçirilmiş veKazanılmış Geçirilmiş ve enfeksiyonenfeksiyon Kazanılmış Kazanılmış

BağışıklıkBağışıklık

               

          

Primer ve sekonder enfeksiyon Primer ve sekonder enfeksiyon ayırımında kullanılırayırımında kullanılır

BU DURUM;BU DURUM;Re-enfeksiyonlarda Re-enfeksiyonlarda

Toplumda yaygın dolaşan viruslar;Toplumda yaygın dolaşan viruslar; CMV, HSV gibiCMV, HSV gibi

Re-aktivasyonlardaRe-aktivasyonlarda CMV, HSV, EBV, VZVCMV, HSV, EBV, VZV gibi latent gibi latent

viruslarviruslarAkut ve Subklinik Enfeksiyon Sonrası Akut ve Subklinik Enfeksiyon Sonrası

Uzamış SerokonversiyondaUzamış Serokonversiyonda

GÖRÜLEBİLİRGÖRÜLEBİLİR ToksoplazmozToksoplazmoz

IgG AVİDİTE TESTLERİNDE PRENSİP IgG AVİDİTE TESTLERİNDE PRENSİP (I)(I)

Primer enfeksiyonlarda viruse özgül Primer enfeksiyonlarda viruse özgül IgG aviditesi IgG aviditesi düşük;düşük; Sekonder enfeksiyonlarda YüksekSekonder enfeksiyonlarda Yüksek

Re-enfeksiyon/aktivasyonRe-enfeksiyon/aktivasyon Primer enfeksiyonlarda oluşan antikorlar zaman Primer enfeksiyonlarda oluşan antikorlar zaman

ilerledikçe(>4 ay), olgunlaşır ve antijenlere ilerledikçe(>4 ay), olgunlaşır ve antijenlere bağlanma gücü artarbağlanma gücü artar Bunun nedeni;Bunun nedeni;

Yüksek aviditeli B lenfositlerin seçilmesindendirYüksek aviditeli B lenfositlerin seçilmesindendir

İMMUNOKOMPETAN KİŞİLERDE AVİDİTE OLGUNLAŞMA İMMUNOKOMPETAN KİŞİLERDE AVİDİTE OLGUNLAŞMA SÜRELERİSÜRELERİ

CMV CMV 4 ay 4 ay RUBELLA RUBELLA 2 ay 2 ay TOXOPLASMA TOXOPLASMA 6 ay 6 ay EBV EBV 2.5 ay 2.5 ay HIV HIV 6 – 12 ay 6 – 12 ay

IgG AVİDİTE TESTLERİNDE PRENSİP IgG AVİDİTE TESTLERİNDE PRENSİP (II)(II)

Hamile kadınların;Hamile kadınların; CMV, RubellaCMV, Rubella konjenital konjenital

enfeksiyonlarında;enfeksiyonlarında; Primer ve sekonder enfeksiyon ayrımında Primer ve sekonder enfeksiyon ayrımında

önemlidirönemlidir Enfeksiyon Enfeksiyon primerseprimerse konjenital konjenital geçiş yüksektirgeçiş yüksektir SekonderSekonder ise virusun ise virusun geçişi düşüktürgeçişi düşüktür

Immunsuprese Olgularda Immunsuprese Olgularda CMV, EBV ve HHV-6CMV, EBV ve HHV-6 enfeksiyonların enfeksiyonların

primer yada sekonder ayrımında kullanılırprimer yada sekonder ayrımında kullanılır

ETKENİ TANIMLAMADA ETKENİ TANIMLAMADA ANTİJEN TAYİNİ:ANTİJEN TAYİNİ:Duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek tanı Duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek tanı

yöntemleriyle yöntemleriyle Doğru yerden ve uygun şekilde alınan Doğru yerden ve uygun şekilde alınan

örneklerde Ag tayiniörneklerde Ag tayini PMNH / pp65’in IF ile PMNH / pp65’in IF ile CMVCMV tanısı tanısı Serum örneklerinde HBsAg’nin EIA ile Serum örneklerinde HBsAg’nin EIA ile HBVHBV

tanısıtanısı C.trachomatisC.trachomatis Ag tayini ancak epitel hücre içeren Ag tayini ancak epitel hücre içeren

üretral yada endoservikal sürüntü yada akıntıüretral yada endoservikal sürüntü yada akıntı H.pyloriH.pylori HpsA tayininde fazla sulu yada katı HpsA tayininde fazla sulu yada katı

olmayan dışkıolmayan dışkı

Ag Tayininin Yapıldığı Durumlar;Ag Tayininin Yapıldığı Durumlar;

İzolasyonda(Kültür) sorunlar İzolasyonda(Kültür) sorunlar

Kültürde zor üreyen bakterilerin tanısında;Kültürde zor üreyen bakterilerin tanısında; Örn: - C. trachomatisÖrn: - C. trachomatis

- L. pneumophila- L. pneumophila

Kültürü geciken yada uzun süren mikroorganizmaların Kültürü geciken yada uzun süren mikroorganizmaların tanısında;tanısında;

BakterilerBakteriler

- H.pylori- H.pylori ViruslarViruslar

- CMV/pp65- CMV/pp65 ParazitlerParazitler

- E. granulosus- E. granulosus MantarlarMantarlar

-C. neoformans-C. neoformans

Kısa sürede, hızlı tanı konulması gereken ACİL-Kısa sürede, hızlı tanı konulması gereken ACİL-CİDDİ durumlarda;CİDDİ durumlarda;

Özellikle mikrobiyal menenjit tablosundaÖzellikle mikrobiyal menenjit tablosunda Örn: S.agalactiaÖrn: S.agalactia yenidoğan menenjiti yenidoğan menenjiti

TonsillofarenjitTonsillofarenjit S.pyogenesS.pyogenes

Toksijenik Ag’lerin tayini ile Bakteriyolojik Toksijenik Ag’lerin tayini ile Bakteriyolojik TanısındaTanısında

C. difficileC. difficile Karışık ortamlardaki bakterilerin hızlı tanısındaKarışık ortamlardaki bakterilerin hızlı tanısında

CampylobacterCampylobacter İndirekt bakteriyal tür tanısındaİndirekt bakteriyal tür tanısında

Shigella sppShigella spp

Immunolojik(Serolojik) tanı Immunolojik(Serolojik) tanı neleri amaçlar?neleri amaçlar?(II)(II)2. 2. Enfeksiyon hastalığını doğrulama Enfeksiyon hastalığını doğrulama

Direkt Aglutinasyon TestiDirekt Aglutinasyon Testi--Kültürde üreyen bakterinin antijenine karşı Kültürde üreyen bakterinin antijenine karşı

hasta serumundaki hasta serumundaki antikor yanıtının saptanmasıantikor yanıtının saptanması

M.tuberculosisM.tuberculosis enfeksiyonunda Quanteferon enfeksiyonunda Quanteferon testitesti

HIV’ de EIA ile Anti- HIV’ in WB ile doğrulanmasıHIV’ de EIA ile Anti- HIV’ in WB ile doğrulanması

3.3. Bir kişinin ya da toplumun bağışıklığını saptama Bir kişinin ya da toplumun bağışıklığını saptama

Anti-HAV IgG,Anti-HAV IgG, Anti-HBsAnti-HBs

4.4. EtkenEtkenlerinlerin serogrup, serotip veya immuno serogrup, serotip veya immuno tipletiplendirilmesindirilmesi

E. coli’de ETEC, EPECE. coli’de ETEC, EPEC gibigibi

5.5. Hastalığın prognozu Hastalığın prognozu HAV IgM HAV IgM yanıtı,yanıtı, HBV’de hepatitHBV’de hepatit belirteçleribelirteçleri

Serolojik(İmmunolojik) Tanıda Serolojik(İmmunolojik) Tanıda Klinik Örnek Klinik Örnek UygunluğuUygunluğu

Serum, plazma,Serum, plazma, plevra-periton-eklem sıvısı, BOS ve doku plevra-periton-eklem sıvısı, BOS ve doku kesitlerikesitleri

Ab Arama amaçlı sAb Arama amaçlı serumun erumun eldesi eldesi aseptikaseptik koşullarda koşullarda olmalı veolmalı ve

Hemolizli,Hemolizli, lipemik, fibrinlilipemik, fibrinli olmamalıolmamalı Ag Arama temelli klinik örnekler;Ag Arama temelli klinik örnekler;

CMV/ pp 65CMV/ pp 65 PMNH bakılabilir PMNH bakılabilir RSV/Ag RSV/Ag Nazofarengiyal yıkama suyu veya aspiratNazofarengiyal yıkama suyu veya aspirat

Serolojik testler test kuralına göre çalışılmalı Serolojik testler test kuralına göre çalışılmalı Örneğin:Örneğin: Soğuk aglütinasyonSoğuk aglütinasyon

TaTaze serumla çalışılmalıze serumla çalışılmalı, , Çalışılamıyorsa;Çalışılamıyorsa;

Testlerin özelliğine göre Testlerin özelliğine göre 4400C, -22, -40C, -22, -40, -, -707000CC’’ de saklanmalı de saklanmalı

Serumlarda dondurma ve çözme işlemi Serumlarda dondurma ve çözme işlemi bir kezbir kez yapılmalı yapılmalı Bazı hastalıklarda kan alım aralığı önemli Bazı hastalıklarda kan alım aralığı önemli Örneğin:Örneğin: HIV’de HIV’de ortalama 1.5 ay sonraortalama 1.5 ay sonra

Serolojik Tanıda İnvitro Test Serolojik Tanıda İnvitro Test PrensipleriPrensipleriIgG’nin moleküler yapısıIgG’nin moleküler yapısı

Antijen (Ag)- Antikor (Ab) Antijen (Ag)- Antikor (Ab) birleşmesinin özellikleribirleşmesinin özellikleri

Antijen-antikor birleşmesi Antijen-antikor birleşmesi kimyasal kimyasal bir bir reaksiyondurreaksiyondur Çünkü ısı açığa çıkarÇünkü ısı açığa çıkar

ÖÖzgülzgül bir reaksiyondur bir reaksiyondur S. flexneri‘ye karşı hazırlanan AbS. flexneri‘ye karşı hazırlanan Ab S. dysenteria ile birleşmezS. dysenteria ile birleşmez

GGeriye dönüşüreriye dönüşür bir reaksiyondur bir reaksiyondur Ag+AbAg+AbAgAbAgAb Ag ile Ab arasında meydana gelen denge K ile Ag ile Ab arasında meydana gelen denge K ile

gösterilen denge sabiti ile açıklanırgösterilen denge sabiti ile açıklanır K=(AgAb) / (Ag) (Ab)K=(AgAb) / (Ag) (Ab) K ne kadar yüksek olursa birleşme o kadar özgüldür.K ne kadar yüksek olursa birleşme o kadar özgüldür.

Antijen ve antikor Antijen ve antikor uygun oranlardauygun oranlarda birbir araya getirildiğinde araya getirildiğinde maksimum maksimum reaksiyonreaksiyon oluşur oluşur

İki safhalı reaksiyondur:İki safhalı reaksiyondur: 1. safha;1. safha;

-Çok kısadır, Gözle görülmez-Çok kısadır, Gözle görülmez -Elektrolitlere gereksinim yoktur-Elektrolitlere gereksinim yoktur

2. safha;2. safha;- Uzundur, gözle görülür.- Uzundur, gözle görülür.- - Elektrolitlere gereksinim vardır. Elektrolitlere gereksinim vardır. - Isı ve nötral pH reaksiyonu hızlandırır- Isı ve nötral pH reaksiyonu hızlandırır

AntijenAntijen-a-antikor birleşmesinde ntikor birleşmesinde rol oynarol oynayan yan kuvvetlerkuvvetler

1- 1-         Elektrostatik kuvvetlerElektrostatik kuvvetler- - AgAg ve ve AbAb moleküllerinin yüzeyinde birbirine zıt yüklü moleküllerinin yüzeyinde birbirine zıt yüklü yapıların birbirini çekmesidiryapıların birbirini çekmesidir-- Bu hücrelerdeki çekme gücü 2 molekül arasındaki Bu hücrelerdeki çekme gücü 2 molekül arasındaki uzaklığın uzaklığın karesi ile ters orantılıdır. karesi ile ters orantılıdır. F=(1/dF=(1/d22))--Bu kuvvetler Bu kuvvetler AgAg ve ve AbAb birbirine yaklaştıkça artar birbirine yaklaştıkça artar-- Örneğin NH Örneğin NH++ grubu ise iyonize COO grubu ise iyonize COO-- grupları grupları birbirine çeker.birbirine çeker.

2-     Hidrojen bağları2-     Hidrojen bağları--Hidrofilik gruplar arasında meydana gelen bağlardır Hidrofilik gruplar arasında meydana gelen bağlardır --Zayıf ve geriye dönüşümlü bağlardırZayıf ve geriye dönüşümlü bağlardır--Bu bağların oluşmasında iki molekülün birbirine Bu bağların oluşmasında iki molekülün birbirine yaklaşması yaklaşması gerekmektedir.gerekmektedir.

3-     Hidrofobik bağlar3-     Hidrofobik bağlar- Bu bağlar 2 molekülün birbirine yaklaşması - Bu bağlar 2 molekülün birbirine yaklaşması sırasında sırasında su moleküllerini iterek su moleküllerini iterek

birleşmesinde etkendirbirleşmesinde etkendir

4-     Van der Walls kuvvetleri4-     Van der Walls kuvvetleri- - Bu kuvvetler Bu kuvvetler Ag Ag ve ve AbAb molekülünü molekülünü

saran saran elektron elektron bulutları ile ilgili bulutları ile ilgili kuvvetlerdir.kuvvetlerdir.

- Bu kuvvetlerin etkinliği için - Bu kuvvetlerin etkinliği için AgAg ve ve AbAb moleküllerinin moleküllerinin birbirine çok yaklaşmaları gerekir.birbirine çok yaklaşmaları gerekir.

- Bu kuvvetlerin etkinliği - Bu kuvvetlerin etkinliği AgAg ve ve AbAb arasındaki arasındaki uzaklığı 7 uzaklığı 7 ile ters orantılıdırile ters orantılıdır

F=1/dF=1/d77

SEROLOJİK TEST SEROLOJİK TEST YÖNTEMLERİYÖNTEMLERİ 1)PRESİPİTASYON;1)PRESİPİTASYON;

Çözünür haldeki antijen ve özgül antikorlarınÇözünür haldeki antijen ve özgül antikorların

Optimum konsantrasyonda karıştırılması Optimum konsantrasyonda karıştırılması veve

Birleşmesine bağlı gelişen reaksiyona Birleşmesine bağlı gelişen reaksiyona denirdenir

Reaksiyon sonucuReaksiyon sonucu Kompleks (presipitat)gözle görülürKompleks (presipitat)gözle görülür Birkaç dakikadan,1-2 güne kadar Birkaç dakikadan,1-2 güne kadar

uzayabilir uzayabilir Reaksiyonda Reaksiyonda

Optimum Ag ve Ab miktarı önemlidirOptimum Ag ve Ab miktarı önemlidir AYRICA;AYRICA;

PH, elektrolit ve ısı da önemlidirPH, elektrolit ve ısı da önemlidir

Presipitasyon reaksiyonları;Presipitasyon reaksiyonları; Pasif difüzyon şeklindePasif difüzyon şeklinde

Sıvı ortamda difüzyonSıvı ortamda difüzyon Halka ve kapiller tüpHalka ve kapiller tüp

N. menengitidis, S. pneumoniae, N. menengitidis, S. pneumoniae, H.influenzaeH.influenzae Ag Ag

Jel (agar)ortamda difüzyonJel (agar)ortamda difüzyon Tek yönlü difüzyon Tek yönlü difüzyon

Quidin tüp dif.Quidin tüp dif.

ÇeşitliÇeşitli virus ve bakterivirus ve bakteri Ag Ag belirlenmesinde kullanılırbelirlenmesinde kullanılır

Radyal, Mancini plak dif.Radyal, Mancini plak dif.

CRP, serum Ig ve kompleman düzeyleriCRP, serum Ig ve kompleman düzeyleri

♣♣ TürbidimetrikTürbidimetrik ve ve nefolometrik nefolometrik

cihazlar cihazlar geliştirilmiştirgeliştirilmiştir

♣♣ Çok sayıda Çok sayıda kan kan

değerlendirilmesi içindeğerlendirilmesi için Çift yönlü (quchterlonoy plak) difüzyonÇift yönlü (quchterlonoy plak) difüzyon

Aspergilloz, histoplasmoz, blastomikoz Aspergilloz, histoplasmoz, blastomikoz Ag’lerin belirlenmesindeAg’lerin belirlenmesinde

Immuno-double diffusion

■ ■ ELEKTRO- İMMUN DİFÜZYONELEKTRO- İMMUN DİFÜZYON Elektrikli ortamda; Elektrikli ortamda;

Antijenler elektriksel alanda ayrılırlar (elektroforez)Antijenler elektriksel alanda ayrılırlar (elektroforez) Elektroforez için değişik matriksler;Elektroforez için değişik matriksler;

KağıtKağıt Sellüloz asetatSellüloz asetat AgarAgar Poliakrilamid kullanılırPoliakrilamid kullanılır

İmmun difüzyon ve elektroforezin birleştirilmiş tekniğineİmmun difüzyon ve elektroforezin birleştirilmiş tekniğineİMMUNELEKTROFOREZİMMUNELEKTROFOREZ denir denir Serum proteinlerinin tanımlanmasındaSerum proteinlerinin tanımlanmasında Ig sınıfları ve ağır, hafif zincirlerdeki anormalliklerin Ig sınıfları ve ağır, hafif zincirlerdeki anormalliklerin

saptanmasındasaptanmasında

Basit, tek yönlü (laurell)(roket elektroforezi)Basit, tek yönlü (laurell)(roket elektroforezi)

♣♣ Titresi bilinmeyen bir antijenin Titresi bilinmeyen bir antijenin titresini belirlertitresini belirler

Karşıt( zıt yönlü) Karşıt( zıt yönlü) IEFIEF

♣♣ HBVHBV Ag ve Ab saptanmasında Ag ve Ab saptanmasında

♣♣ Septik menenjit, pnömoni, septik artrit Septik menenjit, pnömoni, septik artrit vb etken Antijen vb etken Antijen saptanmasında saptanmasında

2) AGLUTİNASYON:2) AGLUTİNASYON: Doğal olarak antijen taşıyanDoğal olarak antijen taşıyan

Bakteriler,Bakteriler, Eritrositler, Lökositler Eritrositler, Lökositler Yüzeylerinde yapay olarak antijen bulunanYüzeylerinde yapay olarak antijen bulunan

Eritrosit, Latex, BentonitEritrosit, Latex, Bentonit Polistren gibi sentetik parçacıklarınPolistren gibi sentetik parçacıkların

Elektrolitli bir ortamdaElektrolitli bir ortamda Taşıdıkları antijenlerle,Taşıdıkları antijenlerle,

Spesifik antikorlarınSpesifik antikorların

♣♣ KümeleşmeKümeleşme yaparak yaparak çökmesine çökmesine denirdenir

Lamda, tüpte mikroplaklarda yapılırlarLamda, tüpte mikroplaklarda yapılırlar İkiye ayrılır İkiye ayrılır

Aktif aglutinasyonAktif aglutinasyon Pasif aglutinasyonPasif aglutinasyon

AKTİF AGLUTİNASYON;AKTİF AGLUTİNASYON;

DİREKTDİREKT Aglutinasyonda rol alan Aglutinasyonda rol alan antijen partikülün antijen partikülün

kendisidirkendisidir Bakterilerin antijenleriBakterilerin antijenleri

Gruber- Widal, Wright, WFGruber- Widal, Wright, WF Kan grubu antijenleriKan grubu antijenleri

Aktif hemaglutinasyonAktif hemaglutinasyon♣♣ ABO, Rh, VdABO, Rh, Vd

ForwardForward

ReverseReverse

♣♣ Cross-MatchingCross-Matching

MajorMajor

MinorMinor

♣♣ Soğuk aglutinasyon Soğuk aglutinasyon

M.pneumoniaeM.pneumoniae♣♣ Paul- Bunnel Paul- Bunnel

EBVEBV

AKTİF AGLUTİNASYON;AKTİF AGLUTİNASYON; İNDİREKTİNDİREKT Antijen ve antikorun Antijen ve antikorun

bağlanmasında ikincil bir bağlanmasında ikincil bir antikorun kullanılması antikorun kullanılması

Antiglobulin Ab Antiglobulin Ab (tavşan (tavşan kaynaklı kaynaklı - ticari)- ticari)

Direk Coombs Direk Coombs ♣♣ Eritroblostasis fetalisli Eritroblostasis fetalisli

çocukların eritrosit çocukların eritrosit yüzeyindeki Ab saptanıryüzeyindeki Ab saptanır

İndirekt Coombsİndirekt Coombs♣♣ Rh (-) annenin Rh (-) annenin

serumdaki Anti-Rh serumdaki Anti-Rh Ab’ler saptanır Ab’ler saptanır

ReaksiyonReaksiyon

güçlendiricilergüçlendiriciler

A H G

A H G

(Anti Human Globülin)

(Anti Human Globülin)

PASİF AGLUTİNASYONPASİF AGLUTİNASYON

ANTİKOR (Ab) ARANIYORSAANTİKOR (Ab) ARANIYORSA

Aglutinasyonda rol alan antijenler Aglutinasyonda rol alan antijenler

Polisakkarit veyaPolisakkarit veya

Proteinler Proteinler (tannik asitle)(tannik asitle)

Eritrosite bağlanırsa Eritrosite bağlanırsa

♣♣ HEMAGLUTİNASYONHEMAGLUTİNASYON VZV, Rubella, CMV, VZV, Rubella, CMV,

T.gondiiT.gondii

Latex partikülleri, bentonit, Latex partikülleri, bentonit, kömür vb kömür vb

PASİF AGLUTİNASYONPASİF AGLUTİNASYON ANTİJEN (Ag) (TERS PASİF) ARANIYORSA; ANTİJEN (Ag) (TERS PASİF) ARANIYORSA;

Eritrosit, latex, bentonit, kömürEritrosit, latex, bentonit, kömür

S.aureus S.aureus covan 1 covan 1

Antikorun Fc’sine bağlanırAntikorun Fc’sine bağlanır

Latex Agg Latex Agg (LA)(LA)

Ko AggKo Agg (CoA) (CoA)

♣♣ Serum, BOS, idrarda Serum, BOS, idrarda

Bakteriyal polisakkarit Ag’leriBakteriyal polisakkarit Ag’leri

N.menengitidisN.menengitidis

HibHib

S.pneumoniaeS.pneumoniae

C.neoformans C.neoformans StreptokokStreptokok

gruplandırılması, gruplandırılması,

S.aureusS.aureus koagulaz deneyi koagulaz deneyi

Çeşitli Çeşitli bakteri ve virustabakteri ve virusta ag ag tayinleri tayinleri

Hemaglutinasyon- inhibisyon (HI) Hemaglutinasyon- inhibisyon (HI) testitesti HemaglutinasyonuHemaglutinasyonu engelleyici engelleyici antikorlarınantikorların

saptandığı testtirsaptandığı testtir Hastanın serumu seri dilusyon edilirHastanın serumu seri dilusyon edilir Üzerine standardize sabit Üzerine standardize sabit virus antijenivirus antijeni

konulurkonulur EritrositlerEritrositler eklenir eklenir

Serumda Ab’ler Serumda Ab’ler varsavarsa Hemaglutinasyonun görülmediği Hemaglutinasyonun görülmediği son titreson titre pozitif sonuçturpozitif sonuçtur

İnfluenzae, Kabakulak, İnfluenzae, Kabakulak, Rubella Rubella enfeksiyonlarındaenfeksiyonlarında

3)KOMPLEMAN BAĞLAMA TESTİ3)KOMPLEMAN BAĞLAMA TESTİ AntijenAntijen ve ve antikorantikor birleşmesinin birleşmesinin

komplemanı komplemanı uyarmasına dayanarak uyarmasına dayanarak geliştirilen iki basamaklı testtirgeliştirilen iki basamaklı testtir

Antikor (Antikor (sıklıklasıklıkla) ve antijen saptayabilen ) ve antijen saptayabilen yarı kantitatif yarı kantitatif bir yöntemdirbir yöntemdir

Test birbirinden farklı üç komponent içerirTest birbirinden farklı üç komponent içerir Test sistemiTest sistemi

Hasta serumu (inaktif/aranan Ab)Hasta serumu (inaktif/aranan Ab) Antijen (bilinen)Antijen (bilinen)

KOMPLEMAN(kobay veya tavşan KOMPLEMAN(kobay veya tavşan serum)serum)

İndikatör sistemi (hemolitik sistem)İndikatör sistemi (hemolitik sistem) Koyun eritrositleriKoyun eritrositleri Koyun eritrositlerine karşı AbKoyun eritrositlerine karşı Ab

DEĞERLENDİRME;DEĞERLENDİRME; Hasta serumunda Ab varsaHasta serumunda Ab varsa

Ag ve Ab birleşecek (klasik yol)Ag ve Ab birleşecek (klasik yol)

C, Ag ve Ab’ye bağlanacakC, Ag ve Ab’ye bağlanacak

Ortamda C kalmayacağı içinOrtamda C kalmayacağı için Hemolitik sisteme bağlanamayacakHemolitik sisteme bağlanamayacak

Hemoliz olmayacakHemoliz olmayacak

Bazı Bazı viral, riketsiyal ve fungalviral, riketsiyal ve fungal hastalıkların hastalıkların tanısında tanısında

1990’lı yıllarda Sifiliz için 1990’lı yıllarda Sifiliz için KOLMERKOLMER

4)FLOKÜLASYON4)FLOKÜLASYON

KardiolipinKardiolipin antijenin sifilitik hasta serumlarındaki antijenin sifilitik hasta serumlarındaki reaginlerle birleşerek oluşturdukları,reaginlerle birleşerek oluşturdukları,

VE;VE; Toksin ile anti toksininToksin ile anti toksinin uygun miktarda uygun miktarda karşılaştıklarında meydana getirdiklerikarşılaştıklarında meydana getirdikleri

KÜMECİKLEREKÜMECİKLERE denir denir Bu kümecikler gözle yada küçük büyütmelerle Bu kümecikler gözle yada küçük büyütmelerle

görülebilir.görülebilir.

Toksoid aşıların miktar tayinindeToksoid aşıların miktar tayininde kullanılır kullanılır

AYRICA;AYRICA;

Sifilizin tarama testlerinde;Sifilizin tarama testlerinde; Rapid plazma reagin (Rapid plazma reagin (RPRRPR) direkt, ) direkt, VDRLVDRL kadar ise serum kadar ise serum inaktif edilerek çalışılır. inaktif edilerek çalışılır.

Bunlar tüplerde veya özel lambalarla Bunlar tüplerde veya özel lambalarla kalitatif (kalitatif (RPRRPR) ve kantitatif ) ve kantitatif ( (VDRLVDRL) olarak yapılabilirler.) olarak yapılabilirler.

RPRRPR, 4+’dan (-) kadar, , 4+’dan (-) kadar, VDRLVDRL de ise ½ den de ise ½ den başlayan ve yukarı başlayan ve yukarı titrelere kadar varan titrede titrelere kadar varan titrede sonuç verilir.sonuç verilir.

5)NÖTRALİZASYON5)NÖTRALİZASYON

Bir virusun enfektivitesini Bir virusun enfektivitesini Özgül antikoru ile etkileştikten sonraÖzgül antikoru ile etkileştikten sonra Kaybetmesine denir.Kaybetmesine denir.Enfektiviteyi nötrleyen antikorların ortaya çıkarılması testidir.Enfektiviteyi nötrleyen antikorların ortaya çıkarılması testidir.

BİRÇOK VİRAL ENFEKSİYON TANISIBİRÇOK VİRAL ENFEKSİYON TANISI Nötrolizan Ab’lerin saptanmasıNötrolizan Ab’lerin saptanması Çift serumda Çift serumda Ab titresinin artışıylaAb titresinin artışıyla sağlanır sağlanır

PoliovirusPoliovirus/Serum/SerumDoku KültürüneDoku Kültürüne

Kabakulak virusuKabakulak virusu/Serum/Serum Embriyonlu YumurtaEmbriyonlu Yumurta

Kuduz AşısıKuduz Aşısı/Serum/Serum FareyeFareye

Nötralizasyon Nötralizasyon İnvitro ve invivoİnvitro ve invivo yapılabilir yapılabilir İN VİVO 3 ŞEKİLDE YAPILABİLİR:İN VİVO 3 ŞEKİLDE YAPILABİLİR:

Deney HayvanlarındaDeney Hayvanlarında En sık Fare kullanılırEn sık Fare kullanılır Doku KültüründeDoku Kültüründe En sık bu yöntem kullanılırEn sık bu yöntem kullanılır Prensip CPE’nin yok edilmesidir.Prensip CPE’nin yok edilmesidir. CP’nin görülmediği titre nötr. titresidir.CP’nin görülmediği titre nötr. titresidir. Embriyonlu YumurtaEmbriyonlu Yumurta İnfluenzae- Kabakulak İnfluenzae- Kabakulak Allantoik keseye Allantoik keseye Çiçek-Herpesviruslar Çiçek-Herpesviruslar Karioallantoik zaraKarioallantoik zara

İN VİTRO OLARAKİN VİTRO OLARAK ASO deneyiASO deneyi

AGBHSAGBHS’ de Streptolysin O’ya karşı’ de Streptolysin O’ya karşı Anti- Streptolysin O oluşurAnti- Streptolysin O oluşur

Nötrolizasyon sonucuNötrolizasyon sonucu İndikatör olarak eritrositlerde erime olmazİndikatör olarak eritrositlerde erime olmaz

METABOLİK İNHİBİSYON METABOLİK İNHİBİSYON TESTİTESTİ

Nötralizasyon Testi gibidirNötralizasyon Testi gibidir Virus/Serum karışımıVirus/Serum karışımı Üzerine hücre süspansiyonu konurÜzerine hücre süspansiyonu konur Fenol kırmızısı(Fenol kırmızısı(İndikatörİndikatör))

Nötralizasyon varsa renk Nötralizasyon varsa renk SARISARI Nötralizasyon yoksa renk Nötralizasyon yoksa renk KIRMIZIKIRMIZI

Örneğin; Örneğin; Enteroviruslarda renk kırmızı Enteroviruslarda renk kırmızı kalır, Adenoviruslarda renk değişikliği olur.kalır, Adenoviruslarda renk değişikliği olur.

G)İMMUNOASSAY G)İMMUNOASSAY TESTLERTESTLER İşaretli antikorların kullanılmasıylaİşaretli antikorların kullanılmasıyla

1942’de; 1942’de; FAFA Fluoresan Antikor Fluoresan Antikor

(Fluorokromlar)(Fluorokromlar) 1954’de; 1954’de;

IFAIFA (İndirekt Fluoresan Antikor) (İndirekt Fluoresan Antikor) 1960’da; 1960’da;

RIARIA (Radyoizotopla- iyotla) (Radyoizotopla- iyotla) 1970’de; 1970’de;

EIAEIA (enzimle) kullanıma girmiştir (enzimle) kullanıma girmiştir Antikor yada antijen Antikor yada antijen

saptamak için saptamak için kullanılırlar kullanılırlar

I- İmmun Fluoresan (IF) I- İmmun Fluoresan (IF) testlertestler

FLUORESANSFLUORESANS

FluorokromFluorokrom veya veya floroforflorofor boyalarınboyaların

UltraviyoleUltraviyole ışık altında ışık altında

Işık enerjisini emerekIşık enerjisini emerek

Bu enerjiyi Bu enerjiyi farklı dalga farklı dalga boyuna boyuna çevirmesine denir çevirmesine denir

Antikorlar en sık fluoresin isotiyosiyanat Antikorlar en sık fluoresin isotiyosiyanat ((FITCFITC) ile işaretlenir. ) ile işaretlenir. BUNA GÖRE;BUNA GÖRE; Direk fluoresan antikor (DFA)Direk fluoresan antikor (DFA)

Katı fazda klinik örnek (Ag)Katı fazda klinik örnek (Ag) Üzerine FITC’li AbÜzerine FITC’li Ab Pozitif sonuç (Pozitif sonuç (fluoresan-yeşilfluoresan-yeşil görüntü) görüntü)

Bakteri ve viruslerinBakteri ve viruslerin hızlı tanıda hızlı tanıda ♣♣ KuduzdaKuduzda negri cisimciği negri cisimciği ♣♣ Kolera Kolera tanısındatanısında

İndirek fluoresan antikor (İFA)İndirek fluoresan antikor (İFA) Katı fazda hazır AgKatı fazda hazır Ag Hasta serumu(Hasta serumu(aranan Abaranan Ab)) FITC’li Anti-IgFITC’li Anti-Ig Pozitif sonuç (Pozitif sonuç (fluoresan görüntüfluoresan görüntü))

Birçok bakteri virus enf ve otoimmun hast.Birçok bakteri virus enf ve otoimmun hast. ♣♣ FTA- AbsFTA- Abs ( (T.pallidumT.pallidum)) ♣♣ ANA, AMAANA, AMA vb vb

IF yöntemiyle klinik örneklerden IF yöntemiyle klinik örneklerden hemhem AgAg hemhem AbAb aranır aranır

Fluoresan mikroskobu olması ve uzman kişi Fluoresan mikroskobu olması ve uzman kişi gereklidirgereklidir

II-Radioimmuno Assay (RIA)II-Radioimmuno Assay (RIA)

Yöntem aynı Yöntem aynı IFIF ve ve EIAEIA gibidir gibidir Antikorda Antikorda işaretliyici madde olarakişaretliyici madde olarak

Radyoaktif maddeRadyoaktif madde I. 125 ve I. 132I. 125 ve I. 132 kullanılır kullanılır

Gamma sayaçlarında değerlendirilirGamma sayaçlarında değerlendirilir

Radyoaktif madde kullanımından dolayı Radyoaktif madde kullanımından dolayı sınırlıdırsınırlıdır

Özellikle hormon testlerinde (Özellikle hormon testlerinde (TSH, T3, T4TSH, T3, T4) ) kullanılırkullanılır

Radyo allergo sorbent (Radyo allergo sorbent (RASTRAST) deneyi) deneyi Allerjene spesifik IgE tayininde kullanılırAllerjene spesifik IgE tayininde kullanılır

Radioimmunosorbent (Radioimmunosorbent (RISTRIST))

Serumda total IgE tayinindeSerumda total IgE tayininde

VI. VI. ELISA (Enzyme Linked ELISA (Enzyme Linked Immunosorbend Assay)Immunosorbend Assay)

Antikoru ENZİMLE İŞARETLEME yöntemidirAntikoru ENZİMLE İŞARETLEME yöntemidir Peroksidaz, alkalin fosfataz ve beta galaktozidaz Peroksidaz, alkalin fosfataz ve beta galaktozidaz

gibi enzimlergibi enzimler Spesifik substratları renkli ürünlere çevirirlerSpesifik substratları renkli ürünlere çevirirler

Peroksidaz/OrthofenilendiaminPeroksidaz/Orthofenilendiamin Alkali fosfataz/Nitrofenil fosfatAlkali fosfataz/Nitrofenil fosfat

Renkli ürünler spektrofotometrede belirli dalga Renkli ürünler spektrofotometrede belirli dalga boylarında olurlarboylarında olurlar

Yöntemin;Yöntemin; Kullanılan reaktifler uzun ömürlü olmasıKullanılan reaktifler uzun ömürlü olması Artık maddelerle ilgili radyasyon sorunu olmamasıArtık maddelerle ilgili radyasyon sorunu olmaması Uygulamasının basit ve otomatize edilebilmesi Uygulamasının basit ve otomatize edilebilmesi

yönleriyleyönleriyle Aynı prensipli (işaretleme) RIA ve IF’ye göre Aynı prensipli (işaretleme) RIA ve IF’ye göre

avantajlıdıravantajlıdır

Dezavantajları ise;Dezavantajları ise; Antijen saptamada klinik örneğin Antijen saptamada klinik örneğin

uygunluğunun değerlendirememesiuygunluğunun değerlendirememesi Bazı viral enfeksiyonlarda düşük Ag Bazı viral enfeksiyonlarda düşük Ag

yoğunluğu saptanmamasıyoğunluğu saptanmaması IgM saptanmasında RF-IgM ile çatışmanın IgM saptanmasında RF-IgM ile çatışmanın

olmasıolması Bunun için Absorblama işlemi olmasıBunun için Absorblama işlemi olması

AAntijen veya antikorun çeşitli vücut sntijen veya antikorun çeşitli vücut sııvılarında vılarında <5pg düzeyinde saptandığı için yüksek <5pg düzeyinde saptandığı için yüksek ANALİTİK DUYARLILIKTAANALİTİK DUYARLILIKTA olması olması

UYGULAMA PRENSİPLERİUYGULAMA PRENSİPLERİ Ag ve Ab (sınıfa özgül) saptayabilirAg ve Ab (sınıfa özgül) saptayabilir Katı faz olarak;Katı faz olarak;

Plastik tabanlı mikrotitrasyon plaklarıPlastik tabanlı mikrotitrasyon plakları Boncuk veya filtre kullanılırBoncuk veya filtre kullanılır

Bazı ELIZA uygulama Bazı ELIZA uygulama şekilleri:şekilleri: 1)İNDİREK ELIZA ile Ab 1)İNDİREK ELIZA ile Ab TayiniTayini AgAg kaplı kuyucuk kaplı kuyucuk Hasta serumu (Aranan Hasta serumu (Aranan AbAb)) YıkamaYıkama Enzim işaretli ikincil Enzim işaretli ikincil AbAb YıkamaYıkama SubstratSubstrat H2SO4H2SO4 (Reaksiyonu durdurur) (Reaksiyonu durdurur) Spektrofotometre Spektrofotometre

Yarışmasız İndirekt ELISA Yarışmasız İndirekt ELISA ileileAb saptamaAb saptama

2)Sandwich ELIZA ile Ag 2)Sandwich ELIZA ile Ag TayiniTayini

Katı yüzeyde capture monoklonal yada Katı yüzeyde capture monoklonal yada poliklonalpoliklonal

AgAg içeren hasta serum örneği içeren hasta serum örneği YıkamaYıkama Enzimle işaretli saptayıcı monoklonal yada Enzimle işaretli saptayıcı monoklonal yada

poliklonalpoliklonal YıkamaYıkama SubstratSubstrat H2SO4H2SO4 (Reaksiyonu durdurma) (Reaksiyonu durdurma) Spektrofotometrede okumaSpektrofotometrede okuma

3) İNDİREK SANDWİCH ELIZA ile 3) İNDİREK SANDWİCH ELIZA ile Ag TayiniAg Tayini

Katı yüzeyde capture Katı yüzeyde capture AbAb AgAg içeren hasta serum örneği içeren hasta serum örneği YıkamaYıkama Spesifik bir saptayıcı antikor ilave edilir antijene bağlanırSpesifik bir saptayıcı antikor ilave edilir antijene bağlanır

Ag Ag iki antikor arasında kalıriki antikor arasında kalır Enzimle işaretli ikincilEnzimle işaretli ikincil Ab Ab saptayıcı antikora Fc saptayıcı antikora Fc

bölgesinden bağlanırbölgesinden bağlanır HRP ile işaretliHRP ile işaretli

YıkamaYıkama SubstratSubstrat H2SO4 H2SO4 (Reaksiyonu durdurma) (Reaksiyonu durdurma) Spektrofotometrede okumaSpektrofotometrede okuma

4) YARIŞMACI (KOMPETATİF)ELISA:4) YARIŞMACI (KOMPETATİF)ELISA: Serumda Ag Arama (Sıklıkla kullanılır)Serumda Ag Arama (Sıklıkla kullanılır)

Katı yüzeyde AbKatı yüzeyde Ab ŞŞüpheli serum (Ag aranan klinik örnek) ve üpheli serum (Ag aranan klinik örnek) ve

enzimli işaretli antijenin beraber enzimli işaretli antijenin beraber konulduğu antijen konulduğu antijen rekabet (Competetirekabet (Competetiveve) ) yöntemidiyöntemidir.r.

İşaretli antijen katı yüzeye bağlanırsa, İşaretli antijen katı yüzeye bağlanırsa, substratla da birleşir substratla da birleşir RENK OLUŞUR.RENK OLUŞUR.

Bu sonuç klinik örnekteki Ag’nin olmadığı Bu sonuç klinik örnekteki Ag’nin olmadığı bir sonuçtur.bir sonuçtur.

Fakat klinik örnekteki antijen katı faza Fakat klinik örnekteki antijen katı faza bağlanırsa enzim olmadığından substratla bağlanırsa enzim olmadığından substratla reaksiyon olmaz. reaksiyon olmaz. RENK OLUŞMAZ.RENK OLUŞMAZ.

5) YAKALAMALI (CAPTURE)ELISA:5) YAKALAMALI (CAPTURE)ELISA:Sıklıkla;Sıklıkla;

Enfeksiyoz etkene yönelik,Enfeksiyoz etkene yönelik,

Spesifik IgM ve IgGSpesifik IgM ve IgG saptama testidir saptama testidir

1)Spesifik Ag saptama1)Spesifik Ag saptama Katı faza poliklonal veya M.ab’lar Katı faza poliklonal veya M.ab’lar konulur konulur Poli Ab’ler, Poli Ab’ler,

M Ab’lere göre M Ab’lere göre

Farklı Ag epitoplarını Farklı Ag epitoplarını

bağladığı için bağladığı için güvenilirdirgüvenilirdir

2)Spesifik Ab (IgM) saptama2)Spesifik Ab (IgM) saptama

Katı faz formuKatı faz formu IgM’in Fc bölgesine karşıt anti-IgM Ab katı IgM’in Fc bölgesine karşıt anti-IgM Ab katı

faza faza bağlanırbağlanır Üzerine hasta serumu (IgM?) konulurÜzerine hasta serumu (IgM?) konulur Üzerine viral antijenÜzerine viral antijen Enzimle işaretli antikorEnzimle işaretli antikor Substrat… Substrat…

Konjugat faz formuKonjugat faz formu Katı fazda viral AgKatı fazda viral Ag

Hasta serumu (IgM?)Hasta serumu (IgM?) ENZİMLE İŞARETLİ anti IgM Ab ENZİMLE İŞARETLİ anti IgM Ab

(KONJUGAT)(KONJUGAT) Substrat…Substrat…

UYGULAMA CİHAZ UYGULAMA CİHAZ SİSTEMLERİSİSTEMLERİ MİKROELİSA TEMELLİ AÇIK MİKROELİSA TEMELLİ AÇIK

SİSTEMLERSİSTEMLERKlasik CihazlarKlasik Cihazlar

İlk yıllarda kullanılan bağımsız yıkayıcı ve İlk yıllarda kullanılan bağımsız yıkayıcı ve okuma cihazlarından ibaret sistemokuma cihazlarından ibaret sistem

Yarı Otomatik veya Tam Otomatik Yarı Otomatik veya Tam Otomatik CihazlarCihazlar

Örnek yükleme, Yıkama ve okuma cihazları Örnek yükleme, Yıkama ve okuma cihazları entegre sistemlerentegre sistemler

MAKROELİSA TEMELLİ KAPALI MAKROELİSA TEMELLİ KAPALI SİSTEMLERSİSTEMLER Kan bankası rutin çalışmalarına son Kan bankası rutin çalışmalarına son

yıllarda giren sistemlerdir.yıllarda giren sistemlerdir. Çalışma sistemleri ve Prensipleri; Çalışma sistemleri ve Prensipleri;

Kapalı bir cihaz ve bu cihazda çalışmaya Kapalı bir cihaz ve bu cihazda çalışmaya uygun kitler ile cihaza bağlı bilgisayar ve uygun kitler ile cihaza bağlı bilgisayar ve yazıcı.yazıcı.

Piyasada en sık bulunan sistemlerde Piyasada en sık bulunan sistemlerde kullanılan kitler;kullanılan kitler;

Enzyme-linked flureskent assay Enzyme-linked flureskent assay (ELFA)(ELFA) Mikro partikül enzim immuno assay Mikro partikül enzim immuno assay (MPEIA)(MPEIA) Fluoresan polorizasyon immuno assay (FPIA)Fluoresan polorizasyon immuno assay (FPIA) Chemiluminescent Assay Chemiluminescent Assay (CA)(CA) yöntemleri ile yöntemleri ile

çalışmaktadır.çalışmaktadır.

MİNİ VİDAS-ELFA

Bu sistemlerin;Bu sistemlerin; BAŞLICA AVANTAJLARIBAŞLICA AVANTAJLARI

Duyarlılık ve özgüllükleriDuyarlılık ve özgüllükleri yüksektir.yüksektir. Tam otomatik (inkübasyon, yıkama, reaktif pipetleme Tam otomatik (inkübasyon, yıkama, reaktif pipetleme

işlemleri) işlemleri) 24 saat kesintisiz24 saat kesintisiz çalışmaktadırlar. Açık çalışmaktadırlar. Açık sistemlere göre kontaminasyon, teknisyen hataları son sistemlere göre kontaminasyon, teknisyen hataları son derece azalmaktadır.derece azalmaktadır.

Random accesRandom acces(Rastgele erişimli(Rastgele erişimli)) Çok sayıda farklı testi aynı anda ve aralıklı yapan sistemÇok sayıda farklı testi aynı anda ve aralıklı yapan sistem İstenilen bir test istenilen bir örnekten istenilen bir İstenilen bir test istenilen bir örnekten istenilen bir

durumda(durumda(acilacil)yapabilmeye uygun)yapabilmeye uygun

STAT girişliSTAT girişli (tek örnek ve bir örneklik reaktif (tek örnek ve bir örneklik reaktif kullanımı) olmalarıdır.kullanımı) olmalarıdır.

Reaktif kompartmanlarının 2-8 Reaktif kompartmanlarının 2-8 00C sahip C sahip olmalarıdır ve cihazlarda atık torbalarının olmalarıdır ve cihazlarda atık torbalarının olması.olması.

Bunların yanında gerek cihaz donanımı gerek kitlerin Bunların yanında gerek cihaz donanımı gerek kitlerin hazırlanma tekniklerine ilişkin olarak avantajları vardır.hazırlanma tekniklerine ilişkin olarak avantajları vardır.

DEZAVANTAJLARIDEZAVANTAJLARI Kurumu tek cihaza ve buna bağlı olarak tek Kurumu tek cihaza ve buna bağlı olarak tek

kite zorunlu kılmalarıkite zorunlu kılmaları Açık sistemlere göre pahalı olmalarıAçık sistemlere göre pahalı olmaları

IV-WESTERN- BLOTIV-WESTERN- BLOT Viral lizat veya rekombinant antijenler Sodyum Viral lizat veya rekombinant antijenler Sodyum

dodesilsulfat yardımıyla (SDS)dodesilsulfat yardımıyla (SDS) POLİACRYLAMİD JELPOLİACRYLAMİD JEL zemininde, molekül ağırlıklarına zemininde, molekül ağırlıklarına

göre göre elektroforetik elektroforetik olarak ayrılır.olarak ayrılır. Polipeptit antijenler, ikinci bir elektroforez ile Polipeptit antijenler, ikinci bir elektroforez ile

NİTROSELÜLOZ MEMRAN ŞERİTLER ÜZERİNE NİTROSELÜLOZ MEMRAN ŞERİTLER ÜZERİNE transfer transfer edilir.edilir.

Hasta serumu ile şerit üzerindeki antijenler özel bir testte Hasta serumu ile şerit üzerindeki antijenler özel bir testte temas ettirilir (elektroforetik yöntem)temas ettirilir (elektroforetik yöntem)

Hasta serumunda aranılan antikorlar varsa, şerit üzerindeki Hasta serumunda aranılan antikorlar varsa, şerit üzerindeki antijen bulunan antijen bulunan BANDLARDA RENK KOYULUĞU (KOYU-BANDLARDA RENK KOYULUĞU (KOYU-ZAYIF-RENKSİZ) ZAYIF-RENKSİZ) oluşur.oluşur.

Kitin internal Pozitif ve Negatif kontrollerindeki band Kitin internal Pozitif ve Negatif kontrollerindeki band renkleri değerlendirmede önemlidir.renkleri değerlendirmede önemlidir.

Ve band için,Ve band için, HANGİ ANTİJEN VARSA REAKTİF HANGİ ANTİJEN VARSA REAKTİF kabul edilir. kabul edilir. Şeritlerin üzerindeki bandların pozitifliğine göre o hasta Şeritlerin üzerindeki bandların pozitifliğine göre o hasta

için, etkenin sonuç virulansı patternlerine göre için, etkenin sonuç virulansı patternlerine göre POZİTİF-POZİTİF-NEGATİF VEYANEGATİF VEYA SAPTANMAYAN SAPTANMAYAN sonuç verilir.sonuç verilir.

Etkene özgü IgM, IgG, IgA antikorlarına göre test Etkene özgü IgM, IgG, IgA antikorlarına göre test yapılabilir.yapılabilir.

HIV, H.pylori ve T.pallidumHIV, H.pylori ve T.pallidum enfeksiyonlarının enfeksiyonlarının tanısında tanısında özgüllüğü yüksek olarak özgüllüğü yüksek olarak kullanılmaktadır.kullanılmaktadır.

Western blot (WB)

III-HÜCRESEL İMMUNİTE III-HÜCRESEL İMMUNİTE ÖLÇÜM YÖNTEMLERİÖLÇÜM YÖNTEMLERİ

HÜCRESEL İMMUNİTEYE HÜCRESEL İMMUNİTEYE YÖNELİK TEST YÖNTEMLERİYÖNELİK TEST YÖNTEMLERİ İKİ BAŞLIK ALTINDA İKİ BAŞLIK ALTINDA

İNCELENİRİNCELENİRA)A) İNVİTRO İNVİTRO TEST YÖNTEMLERİTEST YÖNTEMLERİ

B)B) İNVİVOİNVİVO TEST YÖNTEMLERİ TEST YÖNTEMLERİ

A)İNVİTRO TEST YÖNTEMLERİA)İNVİTRO TEST YÖNTEMLERİ

1)LÖKOSİT SAYIM VE 1)LÖKOSİT SAYIM VE FENOTİPLEMESİFENOTİPLEMESİ

LÖKOSİT SAYIMILÖKOSİT SAYIMI Mikroskopik yöntemlerleMikroskopik yöntemlerle

Hemositometrik hücre sayımıHemositometrik hücre sayımı Işık mikroskobu (40’lık)Işık mikroskobu (40’lık)

Thoma ve Neabaur lamlarıThoma ve Neabaur lamları

%0.4’lük tripan mavisi%0.4’lük tripan mavisi

♣♣ RutindeRutinde Pek kullanılmıyor Pek kullanılmıyor

Gelişmiş immuno hemotolojik cihazlarGelişmiş immuno hemotolojik cihazlar En uygun yöntemdirEn uygun yöntemdir

Piyasada farklı firma cihazları varPiyasada farklı firma cihazları var

LÖKOSİT FENOTİPLEMESİLÖKOSİT FENOTİPLEMESİ Vücudun değişik bölgelerindeVücudun değişik bölgelerinde

Kemik iliği, kan, dalak ve lenf nodüllerindeKemik iliği, kan, dalak ve lenf nodüllerinde Lökositlerin sayı ve tipleriLökositlerin sayı ve tipleri

♣♣ LenfositlerinLenfositlerin B lenfositleriB lenfositleri T lenfositleriT lenfositleri

T4 ve T8T4 ve T8♣♣ MonositlerinMonositlerin♣♣ GranülositlerinGranülositlerin

NötrofillerNötrofiller BazofillerBazofiller EozinofillerEozinofiller

İmmuno İmmuno hematolojik cihazlar, hematolojik cihazlar,

Flowsitometrik Flowsitometrik cihazlarlacihazlarla

Hücre yüzey moleküllerinin (Hücre yüzey moleküllerinin (MarkerMarker) ) fenotiplemesifenotiplemesi CDCD (cluster of differntiation – farklılaşma (cluster of differntiation – farklılaşma

kümeleri) kümeleri) antijenleriantijenleri Hematopoetik hücrelerin yüzeyinde yer alırlarHematopoetik hücrelerin yüzeyinde yer alırlar

250’ye yakın 250’ye yakın CDCD tanımlanmıştır tanımlanmıştır

♣♣ Örneğin Örneğin CD4 T, CD8 T, CD45 B lenfositCD4 T, CD8 T, CD45 B lenfosit gibi gibi

Lökositlerin yüzeyindeki Lökositlerin yüzeyindeki CDCD antijenik epitopları antijenik epitopları

♣♣ Monoklonal antikorların (MAbs)Monoklonal antikorların (MAbs)

Fluoresan boyalar Fluoresan boyalar

Enzimlerle konjuge edilerekEnzimlerle konjuge edilerek

Fluoresan mikroskobuylaFluoresan mikroskobuyla

Flow sitometri cihazlarıylaFlow sitometri cihazlarıyla( ( EN SIKEN SIK))

** Kantitatif analizi ve Kantitatif analizi ve

** Hücre ayrımı ve tanımlaması Hücre ayrımı ve tanımlaması yapılıryapılır

FLOWSİTOMETRİFLOWSİTOMETRİÇALIŞMA PRENSİBİ;ÇALIŞMA PRENSİBİ; Fluoresanlanmış (FITC ile) M Ab ile Fluoresanlanmış (FITC ile) M Ab ile

işaretlenmiş hücrelerişaretlenmiş hücreler Sıvı bir ortamda sıra halinde uyarıcı Sıvı bir ortamda sıra halinde uyarıcı

ışıktan (Argon lazer) 488nm’de geçirilirlerışıktan (Argon lazer) 488nm’de geçirilirler Uyarıcı ışığıUyarıcı ışığı

Hücreler kırarlar Hücreler kırarlar veyaveya

Florokromla işaretlenmiş m Ab’lerin bağlandığı Florokromla işaretlenmiş m Ab’lerin bağlandığı hücre tarafından emilir ve yayılırhücre tarafından emilir ve yayılır

Bu yayılan ışığın şiddetini ve niteliğini algılayan Bu yayılan ışığın şiddetini ve niteliğini algılayan dedektörler bilgisayara aktarırlardedektörler bilgisayara aktarırlar

Buna göre;Buna göre;

♣ ♣ Hücrenin tipi ve sayısı Hücrenin tipi ve sayısı belirlenirbelirlenir

11’den ’den 10 10’a’a kadar renk kadar renk eklenebilireklenebilir – – ve bu sayı ve bu sayı

artmaktadırartmaktadır

KLİNİK KULLANIMIKLİNİK KULLANIMI Lökosit fenotiplemesi (Lökosit fenotiplemesi (EN SIKEN SIK))

Konjenital veya kazanılmış immun yetersizlik Konjenital veya kazanılmış immun yetersizlik tanısı (tanısı (en sıken sık AIDSAIDS)) HIVHIV pozitifliğinde prognoz değerlendirilmesi pozitifliğinde prognoz değerlendirilmesi İmmun yetersiz hastalardaİmmun yetersiz hastalarda immuniteyi yada immuniteyi yada kemoterapi kemoterapi monitörizasyonumonitörizasyonu KİTKİT yapılan hastalarda yeni immun durumun yapılan hastalarda yeni immun durumun takibitakibi

Tümör hücre fenotiplemesi Tümör hücre fenotiplemesi Lösemi ve lenfoma tanı ve sınıflamasıLösemi ve lenfoma tanı ve sınıflaması B lenfositlerinde klonal tayini ve lenfoma ve lösemi B lenfositlerinde klonal tayini ve lenfoma ve lösemi

ayırımında ayırımında Hücre içi antijenlerin (Hücre içi antijenlerin (myeloperoksidaz miktarımyeloperoksidaz miktarı) ) tayinitayini

Hematopoetik hücrelerin (Hematopoetik hücrelerin (CD4CD4) )

Hematopoetik olmayan Hematopoetik olmayan Tümörler ve hücrelerden ayırt edilmesiTümörler ve hücrelerden ayırt edilmesi

DNA analizi DNA analizi Anöploidi tayiniAnöploidi tayini

Hücre siklüsu kinetiğinin belirlenmesi Hücre siklüsu kinetiğinin belirlenmesi ApoptozisApoptozis

Nötrofil fonksiyon analizleriNötrofil fonksiyon analizleri O2’nin oluşumunun tayini ile;O2’nin oluşumunun tayini ile;

GranulomatozGranulomatoz hastalık tayinihastalık tayini Diğer kullanım alanlarıDiğer kullanım alanları

Retikülosit sayımı Retikülosit sayımı

Transplant hastalarında Cross-MatchTransplant hastalarında Cross-Match

SitogenetikSitogenetik

ENFEKSİYON HASTALIKLARINDAENFEKSİYON HASTALIKLARINDA Mikroorganizma- hedef hücre ilişkisi;Mikroorganizma- hedef hücre ilişkisi;

Apoptozisin incelenmesiApoptozisin incelenmesi

HIVHIV ile enfekte kişilerde ile enfekte kişilerde♣♣ Monunükleer hücrelerinde apoptosis Monunükleer hücrelerinde apoptosis oranları oranları CD8 TCD8 T ve ve

CD19 BCD19 B hücrelerinde hücrelerinde en sıktıren sıktır

Konak hücreye ait proteinlerdeki değişimlerKonak hücreye ait proteinlerdeki değişimler EBV EBV ile enfekte B lenfositlerinde;ile enfekte B lenfositlerinde;

♣♣ BCR2BCR2 ekpresyonu ekpresyonu HIV HIV ile enfekte T lenfositlerinde; ile enfekte T lenfositlerinde;

♣♣ CD4CD4 ekpresyonu ekpresyonu CMV CMV ile fibroblastlarda; ile fibroblastlarda;

♣♣ MHC IMHC I ekpresyonu ekpresyonu

Mikroorganizmanın hücreye bağlanmasının Mikroorganizmanın hücreye bağlanmasının incelenebilmesiincelenebilmesi

EBV’ninEBV’nin♣♣ B lenfositlerineB lenfositlerine♣♣ Epitel hücrelerine Epitel hücrelerine

CR2CR2 reseptörüne reseptörüne

PoliovirusPoliovirus♣♣ MNH CD14MNH CD14 reseptörlerinde reseptörlerinde

Kızamık virusuKızamık virusu♣ ♣ Hedef hücrelerin CD46Hedef hücrelerin CD46 reseptöründe reseptöründe

Hücre içi ve yüzeyi mikroorganizma antijenlerini Hücre içi ve yüzeyi mikroorganizma antijenlerini incelemeinceleme

VZVVZV ile enfekte hücre yüzeyinde ile enfekte hücre yüzeyinde ♣♣ gp1gp1

HIVHIV ile enfekte ile enfekte CD4 T CD4 T lenfositlerinde lenfositlerinde ♣♣ gp 160/120gp 160/120

İnfluenzaeİnfluenzae ile enfekte hücrelerde ile enfekte hücrelerde ♣♣ HAHA antijenileri antijenileri

Klinik virolojide kullanılmaktadırKlinik virolojide kullanılmaktadır Enfekte kişilerin hücrelerinden Enfekte kişilerin hücrelerinden

Virusle enfekte olanları süratle belirlerVirusle enfekte olanları süratle belirler

♣ ♣ CMVCMV ile enfekte ile enfekte MNHMNH’ler kantitatif ’ler kantitatif olarakolarak

♣ ♣ HIVHIV seropozitif kişilerde seropozitif kişilerde

MNHMNH’ lerde kantitatif Ag ’ lerde kantitatif Ag tayini tayini Böylelikle; Böylelikle;

**Antiviral Antiviral tedavinin izlemi tedavinin izlemi

Spesifik antikor tayiniSpesifik antikor tayini CMV, HSV, HIVCMV, HSV, HIV gibi viruslaragibi viruslara

H. pyloriH. pylori gibi bakterileregibi bakterilere

T.gondiiT.gondii gibi parazitlere karşıgibi parazitlere karşı

Gelişen spesifik Gelişen spesifik Ab’Ab’ler ölçülebilirler ölçülebilir

2-LENFOSİT SAYIMI VE AKTİVASYON 2-LENFOSİT SAYIMI VE AKTİVASYON TESTLERİTESTLERİ

a) Lenfosit izolasyonua) Lenfosit izolasyonu Dansite- Gradient Santrifüj YöntemiDansite- Gradient Santrifüj Yöntemi

Kan hücre grupları birbirinden farklı Kan hücre grupları birbirinden farklı dansite özelliğine sahiptirdansite özelliğine sahiptir

3 ml ficol-isopak (Dansite 1077 gr/lt) konur3 ml ficol-isopak (Dansite 1077 gr/lt) konur 3 ml heparinli periferik kan konur3 ml heparinli periferik kan konur 1500 devirde, 45 dakika santrifüj edilir1500 devirde, 45 dakika santrifüj edilir Lenfositler orta tabakada yoğunlaşırlarLenfositler orta tabakada yoğunlaşırlar

En altta eritrosit ve granülositlerEn altta eritrosit ve granülositler

♣♣ Dansiteleri 1077 ‘den fazlaDansiteleri 1077 ‘den fazla

En üstte buff-coat toplanırEn üstte buff-coat toplanır

♣♣ Dansiteleri 1077’den düşük Dansiteleri 1077’den düşük

♣♣ Buff- Coat’danBuff- Coat’dan

Trombositler (santrifüj)Trombositler (santrifüj)

Monositler petri kabında Monositler petri kabında tutularak uzaklaştırılırtutularak uzaklaştırılır

b) Lenfosit ayırımıb) Lenfosit ayırımı T lenfosit ayırımıT lenfosit ayırımı

Rozet testiRozet testi

Koyun eritrositlerine karşı Koyun eritrositlerine karşı CD2CD2 reseptörü vardır reseptörü vardır

Periferik kanda E-Rozet yapanPeriferik kanda E-Rozet yapan

%65-70 T lenfosit vardır%65-70 T lenfosit vardır

B lenfositi E-B lenfositi E-Rozet yapmazRozet yapmaz

B lenfosit ayırımıB lenfosit ayırımı Direkt immun fluoresan yöntemiDirekt immun fluoresan yöntemi

Fluoresanlanmış (FITC) anti- Ig Ab ile yapılırFluoresanlanmış (FITC) anti- Ig Ab ile yapılır Toplam lenfositlerin %20-25’i B lenfositleridirToplam lenfositlerin %20-25’i B lenfositleridir

Periferik kandakiPeriferik kandaki T ve B lenfosit oranını saptamakT ve B lenfosit oranını saptamak

İmmun yetmezlik hastalıklarının tanısındaİmmun yetmezlik hastalıklarının tanısındaLenfosit lösemi ve lenfomadaki lenfosit Lenfosit lösemi ve lenfomadaki lenfosit tipinin tayininde tipinin tayinindeOtoimmun hastalıklar ve kanserli Otoimmun hastalıklar ve kanserli

olgularda olgularda hücresel immun yanıtın hücresel immun yanıtın değerlendirilmesinde değerlendirilmesinde kullanılır kullanılır

NK sitotoksisite ölçümüNK sitotoksisite ölçümü Antikora bağımlı hücresel sitotoksisite Antikora bağımlı hücresel sitotoksisite ölçümüölçümü

CR 51CR 51 ile işaretlenmiş ve yıkanmış ile işaretlenmiş ve yıkanmış hedef hedef hücrelere hücrelere

Anti- hedef hücre Ig G ileAnti- hedef hücre Ig G ile FcR bulunan effektör hücreler (NK, FcR bulunan effektör hücreler (NK, makrofajlar) makrofajlar) eklenir eklenir

Hedef hücrelerden Hedef hücrelerden CR 51CR 51 salınır salınır Gamma sayacında Gamma sayacında CR 51CR 51

ölçülürölçülür CR 51CR 51 miktarı, miktarı,

♣♣ NKNK hücre sayı ve aktivite hücre sayı ve aktivite düzeyi ile düzeyi ile doğru orantılıdır doğru orantılıdır

c) Lenfosit Aktivasyon c) Lenfosit Aktivasyon testleri(LAT)testleri(LAT)

Lenfosit uyarımıLenfosit uyarımı OtoimmuniteOtoimmunite Kanser patogenezinde Kanser patogenezinde İntraselüler enfeksiyonlarda İntraselüler enfeksiyonlarda

Hücresel immun yanıtın ölçümünde Hücresel immun yanıtın ölçümünde uygulanmaktadıruygulanmaktadır

Genelde Genelde T hücreT hücre bazen bazen B hücreB hücre yanıtı yanıtı değerlendirilirdeğerlendirilir

Aktive olan T hücreleri Aktive olan T hücreleri Morfolojik ve fenotipik değişikliğe uğrarlarMorfolojik ve fenotipik değişikliğe uğrarlar

Büyüklüğü değişirBüyüklüğü değişir Histolojik boyamada kromatik değişiklikHistolojik boyamada kromatik değişiklik Dinlenme halinde olmayan Dinlenme halinde olmayan Ancak;Ancak; aktive olduğunda ortaya çıkan aktive olduğunda ortaya çıkan

yüzey yüzey proteinleri meydana gelir proteinleri meydana gelir

LAT;LAT;

Hasta lenfositlerinin Hasta lenfositlerinin

Özgül antijenle Özgül antijenle

VeyaVeya özgül olmayan antijenlerle özgül olmayan antijenlerle

İnvitroİnvitro uyarılmasına dayanır uyarılmasına dayanır

İki tipi vardırİki tipi vardır

1)Yüzey fenotipi (1)Yüzey fenotipi (aktivasyon belirteçleriaktivasyon belirteçleri) ) değişikliklerini belirlemekdeğişikliklerini belirlemek

Aktivasyon belirteçleriAktivasyon belirteçleri

YaYa enflamasyon bölgesinden direkt enflamasyon bölgesinden direkt hücrelerdenhücrelerden

Ya daYa da invitro uyarılan lenfositlerden invitro uyarılan lenfositlerden aranıraranır

♣♣ FLOWSİTOMETRİ FLOWSİTOMETRİ ile ile belirlenirbelirlenir

2) Uyarı sonrası lenfositin proliferasyon 2) Uyarı sonrası lenfositin proliferasyon yeteneğini ölçmekyeteneğini ölçmek

Lenfoblast transformasyon testi (LTT)Lenfoblast transformasyon testi (LTT)

96 kuyucuklu plaklarda yapılır96 kuyucuklu plaklarda yapılır

T hücreT hücre uyaranları olarak uyaranları olarak

Fitohemaglutin (Fitohemaglutin (PHAPHA) )

Konkovalin A (Konkovalin A (ConAConA)gibi )gibi lektinlerlelektinlerle

Süperantijenler gibi Süperantijenler gibi bakteriyel toksinlerlebakteriyel toksinlerle

B hücreB hücre uyaranları olarak, uyaranları olarak,

SüperantijenlerSüperantijenler

LPS kullanılır LPS kullanılır

LTT LTT TESTİNDE;TESTİNDE;

AntijenAntijen ve ve lenfositlerinlenfositlerin 72 saat kültürü 72 saat kültürü yapılıryapılır

H timidin H timidin eklenireklenir

H timidin H timidin çoğalan çoğalan DNA DNA yapısına gireryapısına girer

Radyoaktif veya Radyoaktif veya fluoresanfluoresan boya ileboya ile

DNADNA sentez hızı ve miktarı ölçülür sentez hızı ve miktarı ölçülür

♣♣ Hasta ve kontrol Hasta ve kontrol karşılaştırmaları ile karşılaştırmaları ile yorumlanır yorumlanır

Karışık lenfosit kültürüKarışık lenfosit kültürü Alıcı ve verici kanından ayrılan lenfositlerAlıcı ve verici kanından ayrılan lenfositler

İnvitro besiyerinde karıştırılarakİnvitro besiyerinde karıştırılarak

Lenfosit kültürü yapılırLenfosit kültürü yapılır♣♣ Antijenik farklılık varsaAntijenik farklılık varsa

♣♣ Biri diğerini aktive ederBiri diğerini aktive eder

♣♣ Blastik dönüşümle DNA miktarı artarBlastik dönüşümle DNA miktarı artar

DNA sentezinin kantitatif ölçümü yapılırDNA sentezinin kantitatif ölçümü yapılır

Bazen verici lenfositleriBazen verici lenfositleri ♣♣ X ışınları ile işleme sokulurX ışınları ile işleme sokulur

♣♣ Blastik dönüşüm olmaz Blastik dönüşüm olmaz

♣♣ Alıcının lenfositleri uyarılırAlıcının lenfositleri uyarılır

♣♣ Alıcının verilecek Dokuya karşı reaksiyon ölçülürAlıcının verilecek Dokuya karşı reaksiyon ölçülür

Buna Buna tek yönlü karışık lenfosit kültürütek yönlü karışık lenfosit kültürü denir denir

Doku transplantasyonundaDoku transplantasyonunda* * HLA- D (LD antijenleri) HLA- D (LD antijenleri)

antijenleri saptanır antijenleri saptanır

Sitolitik T hücre yanıtının Sitolitik T hücre yanıtının değerlendirilmesinde değerlendirilmesinde

Lenfositotoksik testLenfositotoksik test Test prosedürüTest prosedürü

HLA antijeni saptanacak total lenfositler veya CD 19 B HLA antijeni saptanacak total lenfositler veya CD 19 B lenfositlenfosit

Hangi HLA’ya ait olduğu bilinen anti-serumHangi HLA’ya ait olduğu bilinen anti-serum

KomplemanKompleman

Tripan mavisi veya eozin boyasıTripan mavisi veya eozin boyası

♣♣ Antijen + antikor birleşirAntijen + antikor birleşir

♣♣ Kompleman bağlanırKompleman bağlanır

♣♣ Lenfosit zarı zedelenirLenfosit zarı zedelenir

♣♣ Boya lenfosit içine girerBoya lenfosit içine girer

♣♣ Mikroskopta %50’den fazla boyanan lenfosit miktarıMikroskopta %50’den fazla boyanan lenfosit miktarı

Denenen lenfositleri, bilinen anti- HLA tipine ait Denenen lenfositleri, bilinen anti- HLA tipine ait olduğunu olduğunu gösterirgösterir

Doku transplantasyonunda Doku transplantasyonunda

** HLA A,B,C antijenlerin HLA A,B,C antijenlerin göstermede kullanılırgöstermede kullanılır

Sitokin sentezini belirleme testleriSitokin sentezini belirleme testleri Aktive T hücrelerAktive T hücreler değişik değişik sitokinlersitokinler üretirler üretirler Enflamasyon bölgesinden elde edilen T Enflamasyon bölgesinden elde edilen T

lenfositlerlenfositler İnvitro kültürü İnvitro kültürü yapılıryapılır

Total sitokinTotal sitokin sentezini verir sentezini verir ELISPOTELISPOT (Enzimle işaretli immunspot) (Enzimle işaretli immunspot)

Gama- IFN Gama- IFN (Quantiferon)(Quantiferon) sentezleyen hücre sayısı sentezleyen hücre sayısı yüzde olarak belirlenir yüzde olarak belirlenir

ELISA ELISA ile TH1’lerce sentezlenen gama IFN ile TH1’lerce sentezlenen gama IFN (Quantiferon)(Quantiferon) miktarı kantitatif olarak saptanır miktarı kantitatif olarak saptanır

FlowsitometrikFlowsitometrik yöntemle yöntemle Tüm farklı sitokinTüm farklı sitokin sentezleri ölçülebilir sentezleri ölçülebilir

3- MONOSİT/MAKROFAJ TESTLERİ3- MONOSİT/MAKROFAJ TESTLERİM/M HücreleriM/M Hücreleri Doğal bağışıklıkta rol alırlar Doğal bağışıklıkta rol alırlar

Ve Ve özgül bağışıklığı sitokinlerle özgül bağışıklığı sitokinlerle koordine koordine ederlerederler

Spesifik patojenleri yok eden efektör Spesifik patojenleri yok eden efektör hücrelerdirhücrelerdir

Apoptosizde apoptotik hücreleri temizlerlerApoptosizde apoptotik hücreleri temizlerler Bu hücreler doku örnekleri yada hücre Bu hücreler doku örnekleri yada hücre

süspansiyonlarından MAbs ile saptanırlarsüspansiyonlarından MAbs ile saptanırlar Monositin en iyi belirlenmesi;Monositin en iyi belirlenmesi;

FLOWSİTOMETRİDEFLOWSİTOMETRİDE Anti, CD14 mAbs ile olurAnti, CD14 mAbs ile olur Ayrıca CD11b, CD11c, CD16, CD32, CD64 Ayrıca CD11b, CD11c, CD16, CD32, CD64

gibi taşıdıkları gibi taşıdıkları reseptörlerle reseptörlerle tanımlanmaları yapılırtanımlanmaları yapılır

Histokimyasal boyama olarakHistokimyasal boyama olarak Non spesifik esteraz BoyamasıNon spesifik esteraz Boyaması

Monositer lösemi tanısında kullanılırMonositer lösemi tanısında kullanılır

MAKROFAJ GÖÇÜNÜ ÖNLENİM MAKROFAJ GÖÇÜNÜ ÖNLENİM TESTİTESTİ

Duyarlı lenfositDuyarlı lenfosit ile ile antijenantijen teması sonucu teması sonucu SalgılananSalgılanan MIF MIF (Makrofaj göçünü önleyen (Makrofaj göçünü önleyen

faktör)faktör) Saptama testidirSaptama testidir

Kapiller tüpteKapiller tüpte LenfositLenfosit Özgün antijen varsa Özgün antijen varsa MIFMIF

pozitiftirpozitiftir

MIF TESTİNİN POZİTİFLİĞİMIF TESTİNİN POZİTİFLİĞİ ♣♣ O antijene karşı O antijene karşı hücresel hücresel immun yanıtı immun yanıtı gösterir gösterir

4-NÖTROFİL FONKSİYON TESTLERİ4-NÖTROFİL FONKSİYON TESTLERİ Polimorf nüveli nötrofiller (Polimorf nüveli nötrofiller (PMNPMN))

Doğal immunitenin efektör (fagositik) Doğal immunitenin efektör (fagositik) hücreleridirlerhücreleridirler

Enflamasyon bölgesine ilk gelen hücrelerdirEnflamasyon bölgesine ilk gelen hücrelerdir

PMN yetersizliğiPMN yetersizliği Ya Ya PMN sayısal azlığıPMN sayısal azlığı YadaYada PMN fonksiyon bozukluğu şeklinde olabilir PMN fonksiyon bozukluğu şeklinde olabilir

Bakteriyel enfeksiyonlara yatkınlık sağlarBakteriyel enfeksiyonlara yatkınlık sağlar

Yetersizlik ölçüm testleri;Yetersizlik ölçüm testleri;a)a) Nötrofil Nötrofil sayısalsayısal değerlendirmesi testleri değerlendirmesi testlerib)b) Nötrofil Nötrofil adhezyonadhezyon değerlendirme testleri değerlendirme testleric)c) KemotaksiKemotaksi değerlendirme testleri değerlendirme testlerid)d) Opsonizasyon Opsonizasyon değerlendirme testlerideğerlendirme testlerie)e) FagositozFagositoz yapmayı saptama testleri yapmayı saptama testlerif)f) Oksidatif patlamaOksidatif patlama ve degranülasyon ve degranülasyon

değerlendirmesideğerlendirmesig)g) Bakteriyel Bakteriyel öldürmeyiöldürmeyi değerlendirme testleri değerlendirme testleri

olarak sınıflandırılırolarak sınıflandırılır

a)Nötrofil sayısıa)Nötrofil sayısı

NötropeniNötropeni 500/ml kanda olması500/ml kanda olması

Kemik iliği, malignite, otoimmunite ve Kemik iliği, malignite, otoimmunite ve kemoterapiye bağlı gelişirkemoterapiye bağlı gelişir

Mikroskobik boyama yöntemleriMikroskobik boyama yöntemleri

Gelişmiş hematoloji ve immuno Gelişmiş hematoloji ve immuno hemotoloji cihazlarıyla hemotoloji cihazlarıyla

saptanırsaptanır FLOWSİTOMETRİFLOWSİTOMETRİ

b) Kemotaksi(KT) testlerib) Kemotaksi(KT) testleri NötrofillerinNötrofillerin

Enflamasyon bölgesine hareketine (migrasyonu) Enflamasyon bölgesine hareketine (migrasyonu) KTKT denir denir Bakteri ürünleri (Bakteri ürünleri (endotoksin, hücre duvar yapıları, bakteri endotoksin, hücre duvar yapıları, bakteri

enzimlerienzimleri)) Konak faktörleri (Konak faktörleri (C3a ve C5a, LTB4C3a ve C5a, LTB4) rol oynar) rol oynar

Bu kemotaktik moleküllere yanıtsızlık; Bu kemotaktik moleküllere yanıtsızlık;

Defektif migrasyon (göç)Defektif migrasyon (göç) yanıtı ile yanıtı ile sonuçlanır sonuçlanır

Defektif göçü saptamadaDefektif göçü saptamada BOYDEN BOYDEN odacık testi kullanılırodacık testi kullanılır

Filtre üzerinde;Filtre üzerinde;

♣♣ Kemotaktik maddeKemotaktik madde

♣♣ Nötrofillerle yapılırNötrofillerle yapılır

Petride agaroz jelde;Petride agaroz jelde; ♣♣ Kemotaktik maddelerKemotaktik maddeler

♣♣ Nötrofillerle yapılırNötrofillerle yapılır

Kemotaksi testleriKemotaksi testleri İdyopatik immun yetersizlik hastalıklarının tanısında İdyopatik immun yetersizlik hastalıklarının tanısında kullanılırkullanılır

c) Nötrofil adhezyonuc) Nötrofil adhezyonu

NÖTROFİLLERİN NÖTROFİLLERİN Endotele adhezyonu ve enflamasyon Endotele adhezyonu ve enflamasyon

bölgesine göçübölgesine göçü L-selectin ve İntegrinle sağlanırL-selectin ve İntegrinle sağlanır

Bu iki adezindeki yetersizliğeBu iki adezindeki yetersizliğe Lökosit adhezyonu yetersizliği (Lökosit adhezyonu yetersizliği (LAYLAY) denir) denir

Bu durumda;Bu durumda;

♣♣ Nötrofil enflamasyon bölgesine ulaşamazNötrofil enflamasyon bölgesine ulaşamaz

♣♣ Bakteriyel enfeksiyon yayılırBakteriyel enfeksiyon yayılır

♣♣ Abse oluşmazAbse oluşmaz

LAY hastalarındaLAY hastalarında CD11a/CD 18a LFA-1 (lenfosit fonksiyon CD11a/CD 18a LFA-1 (lenfosit fonksiyon

antijen-1) lökosit integrini yokturantijen-1) lökosit integrini yoktur

Mabs’lerle Mabs’lerle FLOWSİTOMETRİ FLOWSİTOMETRİ ile belirlenirile belirlenir

d) Opsonizasyon testlerid) Opsonizasyon testleri

OPSONİNOPSONİN Mikroorganizmaların fagositlere Mikroorganizmaların fagositlere

bağlanmasını sağlayarak fagositozu bağlanmasını sağlayarak fagositozu kolaylaştıran moleküllere denirkolaylaştıran moleküllere denir IgG1,3 ve IgM, C3b ve iC3b’dirIgG1,3 ve IgM, C3b ve iC3b’dir

Opsoninler için Opsoninler için NötrofillerdeNötrofillerde

FcFcγγR III (IgG ve IgM)R III (IgG ve IgM)

CR1 ve CR3 (C3b ve iC3b)CR1 ve CR3 (C3b ve iC3b)

MakrofajlardaMakrofajlarda FcFcγγR I,II,III (IgG ve IgM) reseptörleri bulunurR I,II,III (IgG ve IgM) reseptörleri bulunur

OPSONOSİTOFAJİK TESTOPSONOSİTOFAJİK TEST Amacı;Amacı;opsonizasyon-fagositoz sürecini opsonizasyon-fagositoz sürecini

göstermektir.göstermektir. I-tüpeI-tüpe

Norm serum + norm lök + kuşkulu bakteriNorm serum + norm lök + kuşkulu bakteri

II-tüpeII-tüpe İmmun (hasta) serum + norm lök + kuşkulu bakteriİmmun (hasta) serum + norm lök + kuşkulu bakteri

3737ººC’de 20 dakika inkübasyon .Her iki tüpden ayrı preparat C’de 20 dakika inkübasyon .Her iki tüpden ayrı preparat hazırlanırhazırlanır

May –Grunwald – Giemsa boyamaMay –Grunwald – Giemsa boyama

Lökositlerin içine girmiş bakteri sayılırLökositlerin içine girmiş bakteri sayılır

Normal serumda ve immun serumdaNormal serumda ve immun serumda

♣♣ Ayrı sayılan bakterilerin toplamı sayılan lökosit sayısına Ayrı sayılan bakterilerin toplamı sayılan lökosit sayısına bölünürbölünür

♣♣ Bir lökosite düşen bakteri sayısı bulunurBir lökosite düşen bakteri sayısı bulunur

Buna Buna fagositoz endeksifagositoz endeksi (FE) denir (FE) denir

İS/NS oranı OPSONİK ENDEKSİ’ni verirİS/NS oranı OPSONİK ENDEKSİ’ni verir Oranın büyüklüğü İS’deki Ab titresi ile orantılıdırOranın büyüklüğü İS’deki Ab titresi ile orantılıdır

ERİTROSİT –AMBOSEPTÖR-KOMPLEMAN(EAC) ERİTROSİT –AMBOSEPTÖR-KOMPLEMAN(EAC) TESTİTESTİ

Kompleman C3b parçasına karşıKompleman C3b parçasına karşı

Nötrofillerde bulunan reseptörlerin Nötrofillerde bulunan reseptörlerin belirlenme testine denirbelirlenme testine denir

Koyun eritrositleriKoyun eritrositleri

Özgül antikorlarıÖzgül antikorları ile birleşir ile birleşir

KomplemanKompleman bağlarlar bağlarlar

♣♣ Hemoliz oluşurHemoliz oluşur

Kompleman C5 parçası eksik olarak deneye Kompleman C5 parçası eksik olarak deneye sokulursasokulursa

♣♣ E+Ab/C kompleksiE+Ab/C kompleksi

C3b reseptörlü nötrofillerle rozet C3b reseptörlü nötrofillerle rozet yaparlaryaparlar

e) Fagositoze) Fagositoz Mikrobiyal öldürmenin Mikrobiyal öldürmenin ilkilk basamağıdır basamağıdır Antikor ve komplemanla opsonize Antikor ve komplemanla opsonize

mikroorganizmanınmikroorganizmanın PNL ve makrofajlarla temasından sonraPNL ve makrofajlarla temasından sonra

İçeriye alınma işlemidirİçeriye alınma işlemidir

Fagositoz testleriFagositoz testleri Opsonize partiküllerOpsonize partiküller ile ile

NötrofillerinNötrofillerin inkübasyonu sonucu inkübasyonu sonucu Mikroskopta partikülleri içine alanMikroskopta partikülleri içine alan

Nötrofiller görülürNötrofiller görülür

Opsonize olmuşOpsonize olmuş AncakAncak hücre içine hücre içine alınmamışalınmamış partiküller partiküller

Asit muamelesi ile uzaklaştırılırlarAsit muamelesi ile uzaklaştırılırlar

Fluoresan veya radyoaktif madde ile işaretlenirlerFluoresan veya radyoaktif madde ile işaretlenirler

♣♣ Direkt sayımları yapılırDirekt sayımları yapılır

f) Oksidatif patlama ve degranülasyonun f) Oksidatif patlama ve degranülasyonun değerlendirilmesideğerlendirilmesi

I- Oksidatif patlamaya yönelikI- Oksidatif patlamaya yönelik Nötrofillerin fonksiyonun Nötrofillerin fonksiyonun

değerlendirilmesindedeğerlendirilmesinde En sık uygulanan testEn sık uygulanan test

Süperoksit sentez yeteneğininSüperoksit sentez yeteneğinin değerlendirilmesidirdeğerlendirilmesidir

Kronik granülomatöz hastalığın Kronik granülomatöz hastalığın taramasındataramasında Bu değerlendirme kullanılırBu değerlendirme kullanılır

ÇÜNKÜ;ÇÜNKÜ;

Bu hastalık Bu hastalık fagositoz defektifagositoz defekti sonucu gelişir sonucu gelişir♣♣ Nötrofil içinde NADPH’ı (nikotin amid adenin di Nötrofil içinde NADPH’ı (nikotin amid adenin di

nükleotid fosfat de hidro genaz) etkileyen nükleotid fosfat de hidro genaz) etkileyen oksidaz oksidaz enzimdeki bozuklukturenzimdeki bozukluktur

Dört test yöntemi kullanılırDört test yöntemi kullanılır1)NBT (Nitroblue tetrazolium test) 1)NBT (Nitroblue tetrazolium test) Testin prensibiTestin prensibi

NBT’ in NBT’ in redüksiyonunaredüksiyonuna dayanan bir testtir dayanan bir testtir

Redükte olduğunda Redükte olduğunda sarı sarı renkten koyu renkten koyu mora mora dönüşürdönüşür

Nötrofiller;Nötrofiller;

NBT içinde 37 NBT içinde 37 ººC’ de 15 dakika tutulurC’ de 15 dakika tutulur

NBT, nötrofil içine alınırNBT, nötrofil içine alınır

Pyridine ile ekstrakte edilirPyridine ile ekstrakte edilir

515 nm dalga boyunda 515 nm dalga boyunda spektrofotometrede spektrofotometrede okunurokunur

Veya Veya mikroskoptamikroskopta boyanarak görülebilir boyanarak görülebilir

Testin değerlendirilmesiTestin değerlendirilmesi Nötrofiller içinde Nötrofiller içinde süperoksitsüperoksit ve ve HH22OO22 oluşur oluşur

Bunların redüktan etkisiyleBunların redüktan etkisiyle

NBT redükte olur NBT redükte olur ((renk renk değişirdeğişir))

Öldürme işlemi olduğunu Öldürme işlemi olduğunu gösterir gösterir

Lökositlerin mikroorganizmaları Lökositlerin mikroorganizmaları öldürme işlemi bozuk olan öldürme işlemi bozuk olan hastalıklardahastalıklarda Kronik granülamatöz hastalıkKronik granülamatöz hastalık Chediak- Higashi sendromuChediak- Higashi sendromu Myeloperoksidaz yetmezliği olanlarMyeloperoksidaz yetmezliği olanlar Glukoz- 6 fosfat dehidrogenaz Glukoz- 6 fosfat dehidrogenaz

eksikliği olanlardaeksikliği olanlarda Akut lösemiAkut lösemi Down sendromuDown sendromu Akut enfeksiyonu olanlardaAkut enfeksiyonu olanlarda

NBT negatiftirNBT negatiftir

2)Sitokrom b ölçülmesi2)Sitokrom b ölçülmesi■■ Fagositlerde bulunan;Fagositlerde bulunan;

Oksidaz enziminin parçası olanOksidaz enziminin parçası olan sitokrom –b sitokrom –b’ ’ nin nin

İmmunolojik cihazlarİmmunolojik cihazlar VeVe biokimyasal yöntemlerle biokimyasal yöntemlerle ölçülmesidir ölçülmesidir

3) Flowsitometrik , DCF (dichlorofluoresan) yöntemi3) Flowsitometrik , DCF (dichlorofluoresan) yöntemi

■■ Bu test Bu test HH22OO22 oluşumunu ölçer oluşumunu ölçer

■■ Kronik granülomatoz hastalığın Kronik granülomatoz hastalığın tanısında kesin tanısında kesin sonuç verirsonuç verir

4)Kemülimunisans’a Dayalı immuno hematolojik cihazlar4)Kemülimunisans’a Dayalı immuno hematolojik cihazlar

■■ HH22OO22, O, O--, O, O22 radikallerini ölçmeye dayanır radikallerini ölçmeye dayanır

II- Degranülasyona dayalı testlerII- Degranülasyona dayalı testler DegranülasyonDegranülasyon

Fagozom ve lizozomların füzyonu sonucundaFagozom ve lizozomların füzyonu sonucunda

Fagolizozomun içine lizozom içeriğinin Fagolizozomun içine lizozom içeriğinin boşalmasıdırboşalmasıdır

ELISA yöntemiyleELISA yöntemiyle

Lizozom içeriğinin Lizozom içeriğinin

Asid hidrolozAsid hidroloz

LizozimLizozim

LaktoferrinLaktoferrin

Katyonik proteinlerin ölçümü yapılırKatyonik proteinlerin ölçümü yapılır

III- Mikrobik öldürmeIII- Mikrobik öldürme Mikrobisidal testMikrobisidal test

Hasta ve kontrol grubundan Hasta ve kontrol grubundan nötrofillernötrofiller alınır alınır

Hastalardan izole edilen Hastalardan izole edilen bakteribakteri ve ve mantarmantar ile kültürü yapılır ile kültürü yapılır

Bir gece beklenirBir gece beklenir

Ertesi gün yaşayan bakteri veya Ertesi gün yaşayan bakteri veya mantar mantar yoksa mikrobik yoksa mikrobik öldürme tamdıröldürme tamdır

B)İNVİVO TEST YÖNTEMLERİB)İNVİVO TEST YÖNTEMLERİDERİ TESTLERİ;DERİ TESTLERİ; Geç aşırı duyarlılık reaksiyonunu ölçerekGeç aşırı duyarlılık reaksiyonunu ölçerek

Hücresel bağışık yanıtın değerlendirmesiniHücresel bağışık yanıtın değerlendirmesini Belirli bir patojeni veya temas antijenini Belirli bir patojeni veya temas antijenini

tanıyan bellekli T lenf varlığını saptartanıyan bellekli T lenf varlığını saptar Test pozitifliği Test pozitifliği ancak ancak klinik öyküyle anlamlıdırklinik öyküyle anlamlıdır

En sık uygulanan model En sık uygulanan model İntraselüler bakteri enfeksiyonlarındaİntraselüler bakteri enfeksiyonlarında Tüberkülin deri testi Tüberkülin deri testi olarakolarak

Old tüberkülin(OT)Old tüberkülin(OT) 1890 yılında R.Koch buldu1890 yılında R.Koch buldu

PPD( purified protein derivide) uygulanırPPD( purified protein derivide) uygulanır Saybert ve Glen 1941 yılında tanımladılarSaybert ve Glen 1941 yılında tanımladılar

PPD-s olarak standardize edildiPPD-s olarak standardize edildi

1-TÜ : 0.00002 mgr PPD-s içerir1-TÜ : 0.00002 mgr PPD-s içerir

M.tuberculosisM.tuberculosis enfeksiyonlarının tanısında enfeksiyonlarının tanısında kullanılırkullanılır

AYRICA;AYRICA; Blastomisin (Blastomisin (blastomikozblastomikoz))

Histoplazmin (Histoplazmin (histoplazmozhistoplazmoz))

Brucellin (Brucellin (brusellozbruselloz))

Frei testi (Frei testi (LGVLGV))

Toksoplazmin (Toksoplazmin (toksoplazmoztoksoplazmoz))

Ekinokokkin(Ekinokokkin(ekinokokkozekinokokkoz)) Deri testleride kullanılır Deri testleride kullanılır

Bunların dışında;Bunların dışında; Kontak duyarlılığında Kontak duyarlılığında ilaç, metal, bitkisel ilaç, metal, bitkisel

maddeleremaddelere karşı karşı DermatitDermatit tanısında panel antijenler kullanılırtanısında panel antijenler kullanılır

Prausnitz-Küstner (PK) reaksiyonuPrausnitz-Küstner (PK) reaksiyonu Atopik allerjili bir serum ve spesifik antijeninAtopik allerjili bir serum ve spesifik antijenin

Diğer bir kişinin deri içine verilmesiyleDiğer bir kişinin deri içine verilmesiyle

♣♣ Anafilaksinin pasif transferi gösterilir Anafilaksinin pasif transferi gösterilir

TÜBERKÜLİN DERİ TESTİTÜBERKÜLİN DERİ TESTİPPD;PPD; Montoux deri içi uygulaması ile yapılırMontoux deri içi uygulaması ile yapılır

5 T U (0.1ml) ön kol iç yüzeyinin deri içine5 T U (0.1ml) ön kol iç yüzeyinin deri içine 48 -72 saat sonra endurasyon değerlendirilir48 -72 saat sonra endurasyon değerlendirilir

Endurasyonu (Sertliği);Endurasyonu (Sertliği); ≥ ≥10 mm olan,10 mm olan,

♣♣ BCG olmamış çocuk ve yetişkinlerdeBCG olmamış çocuk ve yetişkinlerde

♣♣ Pozitifliği gösterir Pozitifliği gösterir

≥ ≥ 15 mm olan15 mm olan

♣♣ BCG’li çocuklarda pozitifliği gösterirBCG’li çocuklarda pozitifliği gösterir

5-10 mm arası5-10 mm arası

♣♣ BCG aşılanmasınaBCG aşılanmasına

♣♣ Atipiklerle çapraz reaksiyonaAtipiklerle çapraz reaksiyona

♣♣ Anerjiye bağlı olarak görülürAnerjiye bağlı olarak görülür

Pozitif deri testinin anlamlı olması için;Pozitif deri testinin anlamlı olması için; Klinik belirtilerden önce Klinik belirtilerden önce negatifnegatif daha sonra daha sonra

pozitifpozitif olması gerekir olması gerekir

Tuberculin PPD 2 - 3 gün sonra

Cilt üzerinde şişlik ölçülür.

Deri testinde teknik hatalarDeri testinde teknik hatalar■■ Uygunsuz antijen konsantrasyonuUygunsuz antijen konsantrasyonu■■ Enjeksiyonun cildin derinine yapılmasıEnjeksiyonun cildin derinine yapılması■■ Subjektif değerlendirmeSubjektif değerlendirme■■ Test yerine dışsal müdahalelerTest yerine dışsal müdahaleler■■ Booster olayı gelişebilirBooster olayı gelişebilir

Yaşla Yaşla BCG aşılaması BCG aşılaması

M.tuberculosisM.tuberculosis ve atipiklere karşı ve atipiklere karşı oluşan aşırı duyarlılık oluşan aşırı duyarlılık

Booster’ı artırırBooster’ı artırır

IMMUNOGENETİK IMMUNOGENETİK TESTLER;TESTLER; İMMUN SİSTEMİN İMMUN SİSTEMİN

Bileşeni ve hücrelerin doğal ya da özgül fazlarındaki Bileşeni ve hücrelerin doğal ya da özgül fazlarındaki Naif yapılarınıNaif yapılarını Mutasyonel değişikliklerinMutasyonel değişikliklerin

Molekülleri genetik yöntemlerle ortaya koyan testlerdir.Molekülleri genetik yöntemlerle ortaya koyan testlerdir. ÖRNEĞİN;ÖRNEĞİN;

Antijen sunan hücrelerdeAntijen sunan hücrelerde(ASH) (ASH) MHC I MHC I ve ve II II moleküllerinin tayinimoleküllerinin tayini

Ig’lerin Ig’lerin Fab Fab kısmında kısmında variablevariable((vv))bölgesini,bölgesini,Fc Fc kısmındaki kısmındaki CH2CH2 gibi aktif bölgelerin genetik gibi aktif bölgelerin genetik yapıtaşlarının belirlenmesiyapıtaşlarının belirlenmesi

Fagositlerin sentezindeFagositlerin sentezinde enzim enzim ve ve sitokinlerin sitokinlerin genetik mutasyonlarını ortaya koyan testlergenetik mutasyonlarını ortaya koyan testler

Primer veya sekonder immün yetersizliklerin Primer veya sekonder immün yetersizliklerin genetik mutasyonlarının ortaya konulmasındagenetik mutasyonlarının ortaya konulmasında

İMMUNO GENETİK YÖNTEMLERİMMUNO GENETİK YÖNTEMLER

Nükleik asit teknolojisine (Nükleik asit teknolojisine (NATNAT) dayalı ) dayalı test yöntemleritest yöntemleri

Klinik immunoloji laboratuvarında Klinik immunoloji laboratuvarında tanısal amaçlı daha yenidirlertanısal amaçlı daha yenidirler

Rutin tanı amaçlı Rutin tanı amaçlı konvansiyonel konvansiyonel yöntemlerin yerini ne kadar yöntemlerin yerini ne kadar alacakları zamanla görülecektir alacakları zamanla görülecektir

ANCAK; ANCAK; Primer ya da seconder immun yetersizliğe bağlı Primer ya da seconder immun yetersizliğe bağlı

birçok sendrom ve hastalığın,birçok sendrom ve hastalığın, ÖrneğinÖrneğin X’e bağlı A-gammaglobulin X’e bağlı A-gammaglobulin hastalığı hastalığı

Artrit ve oto-immun hastalıklarla seyrederArtrit ve oto-immun hastalıklarla seyreder B hücre B hücre ve ve Ig izotiplerinde Ig izotiplerinde azalmaya nedeni azalmaya nedeni

olan olan B hücre tirozin kinaz B hücre tirozin kinaz genindeki genindeki mutasyonun belirlenmesi gibimutasyonun belirlenmesi gibi

Malign bazı hastalıkların;Malign bazı hastalıkların; Örneğin;Örneğin;Hodgkin ve Non-Hodgkin lenfoma Hodgkin ve Non-Hodgkin lenfoma

etiyolojisinde T lenfositlerinde moleküler etiyolojisinde T lenfositlerinde moleküler bozulmaların tayinibozulmaların tayini

MOLEKÜLER TANISINDA SIKLIKLA MOLEKÜLER TANISINDA SIKLIKLA KULLANILMAKTADIRLARKULLANILMAKTADIRLAR

NAT’a dayalı test NAT’a dayalı test yöntemleriyöntemleri

1)Hibridizasyon (1)Hibridizasyon (birleşmebirleşme))

2)Amplifikasyon 2)Amplifikasyon ((çoğaltmaçoğaltma))

başlıkları altında başlıkları altında incelenirincelenir

1)HİBRİDİZASYON1)HİBRİDİZASYON

Bir DNA molekülü Bir DNA molekülü Kompementerlik (Kompementerlik (birbirinin tamamlayıcısıbirbirinin tamamlayıcısı) )

özelliğindedir özelliğindedir Isı ya çeşitli kimyasal maddelerle Isı ya çeşitli kimyasal maddelerle ayrılabilenayrılabilen Uygun ısı, tuz konsantrasyonu, PH’da Uygun ısı, tuz konsantrasyonu, PH’da yeniden yeniden

birleşebilenbirleşebilen İki sarmal zincire sahiptirİki sarmal zincire sahiptir

İşte tanı amacıyla nükleik asitlerin araştırılmasıİşte tanı amacıyla nükleik asitlerin araştırılması Molekülün bu özelliklerine dayanmaktadırMolekülün bu özelliklerine dayanmaktadır

YÖNTEMİN PRENSİBİYÖNTEMİN PRENSİBİ Klinik örnekte varsayılan Klinik örnekte varsayılan etkeninetkenin nükleik nükleik

asidiasidi ısı ve kimyasal maddelerle iki zincire ısı ve kimyasal maddelerle iki zincire ayrılırayrılır

Bu zincirlerin varlığı Bu zincirlerin varlığı PROB PROB adı verilen adı verilen işaretli işaretli DNADNA ve ve RNA RNA parçasıyla gösterilmektedirparçasıyla gösterilmektedir

PROBPROB adı verilen reaktiflerin işaretlenmesinde adı verilen reaktiflerin işaretlenmesinde Flurokrom Flurokrom EnzimEnzim Kemülüminesan maddeKemülüminesan madde Radyoizotop kullanılmaktadırRadyoizotop kullanılmaktadır

PROBLARPROBLAR Hedef nükleik asitlerin belirli bölgelerine Hedef nükleik asitlerin belirli bölgelerine

komplementerdirkomplementerdir 50 bp’den küçüktürler50 bp’den küçüktürler

HİBRİDİZASYON TEKNİKLERİHİBRİDİZASYON TEKNİKLERİ

a)Sıvı faz hibridizasyonua)Sıvı faz hibridizasyonu Sıvı ortamda prob ve hedef nükleik asit Sıvı ortamda prob ve hedef nükleik asit

serbesttirserbesttir DNA/DNADNA/DNA

DNA/RNADNA/RNA

b)Katı faz hibridizasyonub)Katı faz hibridizasyonu

I-MAKROARRAY( makroskobik I-MAKROARRAY( makroskobik dizinleme) yöntemidizinleme) yöntemi

Nitro selüloz ve Naylon gibi porlu yüzeylerde yapılırNitro selüloz ve Naylon gibi porlu yüzeylerde yapılır

Southern blotSouthern blot DNA’lar; DNA’lar;

Agaroz jel elektroforezle, nitroselluloz ve Agaroz jel elektroforezle, nitroselluloz ve naylon membrannaylon membran kağıda aktarılırkağıda aktarılır Restriksiyon enzimleri ile klinik örnek temas ettirilirRestriksiyon enzimleri ile klinik örnek temas ettirilir

DNA/DNA (32p-Biotin/Avidin peroksidaz)DNA/DNA (32p-Biotin/Avidin peroksidaz) Nokta mutasyonları, delesyonlar ve translokasyon Nokta mutasyonları, delesyonlar ve translokasyon

sonucu farklılıkların saptanmasıyla hematolojik sonucu farklılıkların saptanmasıyla hematolojik malignitelerin özelliklerinin belirlenmesinde malignitelerin özelliklerinin belirlenmesinde kullanılırkullanılır Burkitt lenfoma, Foliküler lenfomaBurkitt lenfoma, Foliküler lenfoma Kronik myeloid lösemiKronik myeloid lösemi

Philadelphia kromozomuPhiladelphia kromozomu

AYRICA;AYRICA; B hücre B hücre lenfomalarında lenfomalarında

♣ ♣ B hücre klonizitesinin B hücre klonizitesinin incelenmesindeincelenmesinde

T hücre T hücre lenfomasındalenfomasında ♣ ♣ T hücre klonizitesinin T hücre klonizitesinin

incelenmesindeincelenmesinde Nükleik asit boyutları konusunda Nükleik asit boyutları konusunda

yardımcı oluryardımcı olur

Northern blotNorthern blot RNA’larRNA’lar,,

Nitroseluloz kağıtlara aktarılırNitroseluloz kağıtlara aktarılır mRNA /cDNA-cRNA mRNA /cDNA-cRNA

hibridlemesindehibridlemesinde 32p-Biotin/AP işaretlemesi 32p-Biotin/AP işaretlemesi

kullanılırkullanılırDot blotDot blot

DNA’lar,DNA’lar, Nitroselüloz kağıtlardaNitroselüloz kağıtlarda DNA/DNA DNA/DNA

32 p-Biotin/AP işaretlemesi 32 p-Biotin/AP işaretlemesi kullanılırkullanılır

II-MİKROARRAYII-MİKROARRAY Porsuz yüzeyleriyle Porsuz yüzeyleriyle plastik, cam plastik, cam ve ve silikon silikon

kullanılırkullanılır Klinik örnektenKlinik örnekten

Nükleik asidin pürifikasyonuNükleik asidin pürifikasyonu AmplifikasyonuAmplifikasyonu HibridizasyonuHibridizasyonu TespitiTespiti

25- 75 mm’lik slaytlarda yapılmaktadır25- 75 mm’lik slaytlarda yapılmaktadır Uygulama alanlarıUygulama alanları

Antimikrobiyal ilaç keşfi ve geliştirilmesi ile aşı Antimikrobiyal ilaç keşfi ve geliştirilmesi ile aşı çalışmalarıçalışmaları

Konak bağışıklık sistemindeki polimorfizmlerKonak bağışıklık sistemindeki polimorfizmler Gen up ve downregülasyonlarıGen up ve downregülasyonları Apoptozis mekanizmalarındaApoptozis mekanizmalarında

Kanserlerin sınıflandırması ve Kanserlerin sınıflandırması ve derecelendirmesindederecelendirmesinde

MicroarrayMicroarray

c) İn Situ Hibridizasyonc) İn Situ Hibridizasyon Doku Doku yada yada hücrelerdeki;hücrelerdeki;

Nükleik asitleri saptarNükleik asitleri saptar DNA/DNADNA/DNA hibridlemesinde;hibridlemesinde;

Biotin/AP işaretlemesi kullanılırBiotin/AP işaretlemesi kullanılır 16S/23S r-RNA’ları hedefleyen 16S/23S r-RNA’ları hedefleyen

Fluorokrom’la işaretleme olurFluorokrom’la işaretleme olur

FISH FISH ((flouresan inn situ flouresan inn situ hibridizasyon hibridizasyon yöntemi yöntemi))

FISH yöntemiyle;FISH yöntemiyle; Belirli genlerin; Belirli genlerin;

Kromosomal lokalizasyonunu Kromosomal lokalizasyonunu haritalamakharitalamak

VeyaVeya kromozomal bozukluklarının kromozomal bozukluklarının saptanmasında saptanmasında kullanılırkullanılır

T hücre fonksiyonlarının T hücre fonksiyonlarının belirlenmesindebelirlenmesinde

2)NÜKLEİK ASİT 2)NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYONU (ÇOĞALTMA)AMPLİFİKASYONU (ÇOĞALTMA)(NAA)(NAA)

NAA yöntemleriNAA yöntemleri

a)a) HedefHedef Amplifikasyon Sistemleri Amplifikasyon Sistemleri

b)b) Prob Prob Amplifikasyon SistemleriAmplifikasyon Sistemleri

c)c) Sinyal Sinyal Amplifikasyon SistemleriAmplifikasyon Sistemleri

adı altında incelenmektediradı altında incelenmektedir

a) Hedef Amplifikasyon a) Hedef Amplifikasyon SistemleriSistemleri

İncelenecek örnekteki az sayıda İncelenecek örnekteki az sayıda hedef molekülün (hedef molekülün (DNA, RNADNA, RNA))

İnvitro enzimatik replikasyon İnvitro enzimatik replikasyon yöntemleriyleyöntemleriyle

Saptanabilecek Saptanabilecek düzeylere düzeylere çıkarılmasıdırçıkarılmasıdır

YöntemlerYöntemler PCRPCR

Klinik örnekte DNA aranıyorsaKlinik örnekte DNA aranıyorsa 4 4 adet deoksinükleik trifosfat (adet deoksinükleik trifosfat (dATP, dGTP, dCTP, dATP, dGTP, dCTP,

dTTPdTTP))

Özgül oligonükleotik Özgül oligonükleotik primerleri primerleri (15-30 bazlık)(15-30 bazlık)

Isıya dayanıklı Isıya dayanıklı Tag polimeraz enzimiTag polimeraz enzimi

94 94 ººC’de (C’de (denatürasyon)denatürasyon)

54 54 ººC’de (C’de (bağlama)bağlama)

72 72 ººC’de (C’de (Genişleme)Genişleme)

♣♣ Bu işlem 25-30 kez yapılır Bu işlem 25-30 kez yapılır

Southern hibridizasyonla tanımlama Southern hibridizasyonla tanımlama yapılıryapılır

Klinik örnekte RNA aranıyorsaKlinik örnekte RNA aranıyorsa RNA’nın elde edilmesinden sonraRNA’nın elde edilmesinden sonra

Revers-TranskriptazRevers-Transkriptaz uygulanarak uygulanarak

cDNAcDNA’ya çevrilir’ya çevrilir

Daha sonraDaha sonra cDNAcDNA amplifiye edilir amplifiye edilir

Değişik PCR tipleri Değişik PCR tipleri Arbitrarily primer PCRArbitrarily primer PCR(APP)(APP)

Multiplex PCRMultiplex PCR(MP)(MP)

Nested PCRNested PCR(NP)(NP)

RT-PCRRT-PCR(RTP)(RTP)

KantitatifKantitatif PCR(KP) PCR(KP)

Real time Real time PCR(RTİP)PCR(RTİP)

Real-time PCRReal-time PCR

Eş zamanlıEş zamanlıNükleik asit amplifikasyonu Nükleik asit amplifikasyonu Amplifikasyon sırasında saptama yapılırAmplifikasyon sırasında saptama yapılır

Floresan sinyalin ölçülmesi (Floresan sinyalin ölçülmesi (Cyber green ICyber green I)) Kantitatif ve kalitatif sonuç Kantitatif ve kalitatif sonuç Kısa sürede (2-3 saat) alınırKısa sürede (2-3 saat) alınır

REAL TIME PCR

www.biorad.com

özel deteksiyon sistemli PCR cihazı

Real Time PCRReal Time PCR

DNA Bağlayıcı FlouroforlarDNA Bağlayıcı Flouroforlar Etidyum BromidEtidyum Bromid Syber GreenSyber Green Syber GoldSyber Gold

ProblarProblar Lineer Oligo problar Lineer Oligo problar

“HybProbes”“HybProbes” 5’ Nükleaz Oligo problar “Taq 5’ Nükleaz Oligo problar “Taq

Man” **Man” ** Molecular beconMolecular becon

Transkripsiyon temelli Transkripsiyon temelli Amplifikasyon teknikleriAmplifikasyon teknikleri

Hedef molekülleri RNAHedef molekülleri RNA’dır’dır

TASTAS( Transcription based Amp)( Transcription based Amp)

TMATMA(Transcription mediated Amp)(Transcription mediated Amp)

NASBANASBA (Nükleik Asid Sequence (Nükleik Asid Sequence based Amp)based Amp)

Northern blot Northern blot ile tanımlama ile tanımlama yapılıryapılır

Klinik immunoloji ve moleküler biyoloji labKlinik immunoloji ve moleküler biyoloji lab..

İnsan immun sistem bileşenleri İnsan immun sistem bileşenleri genomu ve kanser genotipi genomu ve kanser genotipi incelemelerinde incelemelerinde

DNA yapısındaki mutasyonlarDNA yapısındaki mutasyonlar

Gen tayini ve dizilimi saptamasıGen tayini ve dizilimi saptaması

Gen ve genetik polimorfizmi saptamaGen ve genetik polimorfizmi saptama

Transkriptlerin özellikleri ve miktarı Transkriptlerin özellikleri ve miktarı saptanmasısaptanması

Genetik manipülasyonun saptanması Genetik manipülasyonun saptanması

PCR’ IN İMMUNOGENETİK ÇALIŞMA ALANLARI

B) Prob Hibridizasyon Bazlı (NAA) B) Prob Hibridizasyon Bazlı (NAA) YöntemiYöntemi

Ligasyon yardımı ile prob Ligasyon yardımı ile prob çoğaltılmasına dayanırçoğaltılmasına dayanır

Hedef DNA + Prob Hibridizasyon / Hedef DNA + Prob Hibridizasyon / LigazLigaz

LCRLCR

C) Sinyal Amplifikasyon Bazlı NAA YöntemiC) Sinyal Amplifikasyon Bazlı NAA Yöntemi Aslında prob hibridizasyon çoğaltma Aslında prob hibridizasyon çoğaltma

yöntemidiryöntemidir İki prob kullanılırİki prob kullanılır Birinci prob hedef NA dizisini tanırBirinci prob hedef NA dizisini tanır

Üzerinde ikinci probu bağlama bölgesi vardırÜzerinde ikinci probu bağlama bölgesi vardır Çok sayıda sinyal taşıyan 2. prob 1. proba Çok sayıda sinyal taşıyan 2. prob 1. proba

bağlanırbağlanır SONUÇTA HEDEF DİZİ +1 Prob/2. Prob hibridi oluşurSONUÇTA HEDEF DİZİ +1 Prob/2. Prob hibridi oluşur Bağlama bölgesindeki bol miktardaki sinyalle Bağlama bölgesindeki bol miktardaki sinyalle HİBRİDHİBRİD oluşuroluşur

Örnek :Örnek : b-DNA (b-DNA (dallanmış DNAdallanmış DNA))

RCA RCA (Rolling Circle Amp)(Rolling Circle Amp) Tek nükleotid Tek nükleotid polymorfizmpolymorfizm AllellikAllellik ayrımında kullanılır ayrımında kullanılır

MAJOR HİSTOCOMPATIBILITY MAJOR HİSTOCOMPATIBILITY COMPLEX (MHC) GEN BÖLGESİNE COMPLEX (MHC) GEN BÖLGESİNE YÖNELİK TESTLERYÖNELİK TESTLER

MHC ve ÜRÜNLERİMHC ve ÜRÜNLERİ İnsan İnsan 6. kromozom 6. kromozom kısa kolunda yer kısa kolunda yer

alırlaralırlar

Üç gen bölgesine sahiptirlerÜç gen bölgesine sahiptirler

MHC Sınıf I gen bölgesiMHC Sınıf I gen bölgesi

HLA-A,B,C,E,F,GHLA-A,B,C,E,F,G antijenleriantijenleri

MHC Sınıf II gen bölgesiMHC Sınıf II gen bölgesi

HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DPHLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP antijenleriantijenleri

MHC Sınıf III gen bölgesiMHC Sınıf III gen bölgesi

Hsp, TNFHsp, TNFαα, C4A,C4B, C2, C4A,C4B, C2

HLA molekülleriHLA molekülleri Glikoprotein yapısındadırlarGlikoprotein yapısındadırlar Transmembranöz yapıda bulunurlarTransmembranöz yapıda bulunurlar Yüksek polimorfizm (Yüksek polimorfizm (bireyden bireyebireyden bireye) gösterirler) gösterirler

HLA-I;HLA-I; En fazla En fazla lenfosit, lökosit lenfosit, lökosit olmak üzere olmak üzere Tüm Tüm çekirdekli somatik hücrelerin çekirdekli somatik hücrelerin

çoğunda, çoğunda, Eritrositler Eritrositler hariçhariç

HLA-IIHLA-II ise;ise; Sınır olup Sınır olup APC APC ((dendritik hücre, dendritik hücre,

makrofajmakrofaj)) B lenfositleri, Aktive T4 lenfositleri, B lenfositleri, Aktive T4 lenfositleri, Endotel, böbrek glomerül hücrelerde Endotel, böbrek glomerül hücrelerde

bulunurbulunur

HLA Doku tipi tayinindeki HLA Doku tipi tayinindeki amaçlaramaçlar

Organ ve doku tipi nakillerinde, HLA Organ ve doku tipi nakillerinde, HLA uyumuuyumu

Adli tıptaAdli tıpta Babalık tayinindeBabalık tayininde Kimlik tanımlamasındaKimlik tanımlamasında

Bazı otoimmun hastalıkların tanısındaBazı otoimmun hastalıkların tanısında HLA-DR4HLA-DR4 ile ile RARA HLA-B 5HLA-B 5 ile ile Behçet hastalığıBehçet hastalığı

HLA Doku Tipi Tayin HLA Doku Tipi Tayin YöntemleriYöntemleri

Üç grup altında yapılmaktadırÜç grup altında yapılmaktadır

1) 1) MOLEKÜLER/DNA MOLEKÜLER/DNA TEMELLİ YÖNTEMLERTEMELLİ YÖNTEMLER

2) 2) Antikor Temelli YöntemlerAntikor Temelli Yöntemler

3) 3) Hücre Temelli YöntemlerHücre Temelli Yöntemler

Moleküler YöntemlerMoleküler Yöntemler

Özgün, esnek, yeni alleller yeni Özgün, esnek, yeni alleller yeni reaktiflerin geliştirilmesi, reaktiflerin geliştirilmesi,

Canlı hücre gerektirmemesi, Canlı hücre gerektirmemesi, Otomasyona uygun Otomasyona uygun olması(serolojik ve olması(serolojik ve

hücresel yöntemlere görehücresel yöntemlere göre), ), Eşzamanlı çok sayıda örnek ile çalışmaEşzamanlı çok sayıda örnek ile çalışma HLA genlerindeki HLA genlerindeki tüm çeşitliliklerin tüm çeşitliliklerin

gösterilmesi, serolojik olarak gösterilmesi, serolojik olarak tanımlanamayan alllellerin gösterilmesitanımlanamayan alllellerin gösterilmesi

DNA temelli yöntemler DNA temelli yöntemler

SSP cihazı

HLA-B27 için PCR-SSP ürünü (agaroz jelde)

HİBRİDİZASYON YÖNTEMİ İLE;HİBRİDİZASYON YÖNTEMİ İLE; Sekansa spesifik oligonükleotid Sekansa spesifik oligonükleotid ((SSOSSO) )

prob prob hibridizasyonuhibridizasyonu ileile HLA-I ve IIHLA-I ve II tayini tayini

AVANTAJLARI;AVANTAJLARI; Sekansa özgü Sekansa özgü oligonukleotitleroligonukleotitler

kullanılarak yapılırkullanılarak yapılır Tüm lokusu içine alacak şekilde Tüm lokusu içine alacak şekilde primer primer

seçilirseçilir Strip, tüpStrip, tüp, çip , çip (mikroarray)(mikroarray), boncuk , boncuk

((luminex teknoloji)luminex teknoloji) SolidSolid organ transp. da yeterli ( organ transp. da yeterli (böbrek, böbrek,

krc transpkrc transp)) Çok sayıda Çok sayıda örnekle çalışılabilirörnekle çalışılabilir

Histo spot SSO (full otomatik)

SSO hibridizasyon deneyi

Sekans (dizi analizi) Sekans (dizi analizi) HLAHLA TiplemesiTiplemesi

PCR ile çoğaltılan PCR ile çoğaltılan HLAHLA gen gen segmentininsegmentinin

SEKANS CİHAZINDA, SEKANS CİHAZINDA, nükleotid dizi nükleotid dizi analizi yapılmaktadır analizi yapılmaktadır

KULLANIM ALANLARI;KULLANIM ALANLARI; Böbrek alıcısı gibi hızlı sonuç gerektiren Böbrek alıcısı gibi hızlı sonuç gerektiren

örneklerdeörneklerde Denk olan vericilerin tespit edilebilmesi, Denk olan vericilerin tespit edilebilmesi,

diğer yöntemlerle elde edilen karmaşık diğer yöntemlerle elde edilen karmaşık sonuçların çözülmesi amacıyla sık sonuçların çözülmesi amacıyla sık kullanılmaktadır.kullanılmaktadır.

DNA Dizi AnaliziDNA Dizi Analizi

Aynı hastada Sekans Bazlı Tipleme(SBT) ile(HLA-B genotipi)

A lokusu SBT

Diğer Yöntemler

SSCP (Single stranded conformational polymorphism)(PAGE))

Pyrosequencing Ekzonükleazla released fluorescence

gibi

IMMUNOGENETİK IMMUNOGENETİK YÖNTEMLERİN SON YÖNTEMLERİN SON

YILLARDA KULLANIM YILLARDA KULLANIM ALANLARIALANLARI Immunolojide son yıllarda önem kazanan Immunolojide son yıllarda önem kazanan

Mikro RNA’lar(Mi RNA)Mikro RNA’lar(Mi RNA) Post transkripsiyon döneminin Post transkripsiyon döneminin regülatör proteinleri regülatör proteinleri

olarak ortaya çıkan çeşitli kanserlerin ve olarak ortaya çıkan çeşitli kanserlerin ve hastalıkların tanısında kullanılan hastalıkların tanısında kullanılan küçük RNA küçük RNA parçacıkparçacıklarıdır.larıdır.

A)Mikro-RNA bazlı çalışmalarA)Mikro-RNA bazlı çalışmalar Mikro-RNA’nın direkt kantitatif tayinidirMikro-RNA’nın direkt kantitatif tayinidir Mikro-RNA’nın klonlama tayinidirMikro-RNA’nın klonlama tayinidir Mikro-RNA ekspresyon ölçümüdürMikro-RNA ekspresyon ölçümüdür

B)Immunolojide bioinformatik gelişmelerB)Immunolojide bioinformatik gelişmeler Immun genomik sistemlerin moleküler genetik Immun genomik sistemlerin moleküler genetik

bazlı sayısal veri sunan analiz teknikleriyle bazlı sayısal veri sunan analiz teknikleriyle bilgisayar ortamında ortaya konmasıdırbilgisayar ortamında ortaya konmasıdır

MiRNA Bazlı Çalışmalarda MiRNA Bazlı Çalışmalarda Kullanılan yöntemlerKullanılan yöntemler

Mikro array ve genom dizilimiMikro array ve genom dizilimi Deep sequencingDeep sequencing Quantatif Real Time -PCRQuantatif Real Time -PCR Mikrodizi veri analiziMikrodizi veri analizi