Genetik Tan› Yöntemleri · hücreler, kistik higroma, fetus ya da yenido€an kan› gi-bi dokular›n hücreleridir. Genetik Tan› Yöntemleri Yrd. Doç. Dr. Ayﬂe Gül ZAMAN‹

143

Türk Toraks Derne¤i Okulu

TTDO 10. Y›ll›k Kongresi Kurslar›

Yak›n geçmiflte genetik hastal›klar Mendel kurallar›nagöre kal›t›lan ve do€umlarda anomalilerle seyreden kü-çük bir grup sendrom olarak nitelendirildi. Kanser, diya-bet, mental retardasyon ve kalp hastal›klar› gibi hasta-l›klar›n genetik temeli oldu€u düflünülürdü. DNA’n›n ya-p›s›n›n Watson ve Crick taraf›ndan keflfedilmesi ile ge-netik araflt›rmalar büyük ivme kazand› (1). Son y›llardagenlerin dizilimlerinin, yap›lar›n›n ve fonksiyonlar›n›nanlafl›lmas›yla da geneti€in t›ptaki yeri h›zla de€iflmeyebafllad›. ‹nsan Genom Projesi 1986 y›l›nda bafllad›€›ndabu noktaya gelinece€ini tahmin etmek mümkün de€ildi.Hatta 2005 y›l›nda tamamlanmas› öngörülen bu projeteknolojideki h›zl› geliflmeler sonucunda hedeflenendendört y›l önce tamamland› (2). Bu tarihsel süreç içeri-sinde uygulanan genetik tan› yöntemleri de giderek çe-flitlendi ve yeni geliflen tekniklerle çok say›da klinikbranfla tan› ve araflt›rma baz›nda hizmet verir hale gel-di. Genetik tan› yöntemlerini flöyle bir gözden geçirir-sek afla€›daki gibi s›n›fland›rabiliriz.

1. I. Sitogenetik Tan› Yöntemleri

1. Klasik sitogenetik tan› yöntemleri,

2. Özelleflmifl sitogenetik tan› yöntemleri,

a. Kardefl kromatid de€iflimi “Sister ChromatidExchange (SCE)”,

b. Mikronükleus (MN),

c. Frajil bölge tayini.

II. Moleküler Sitogenetik Tan› Yöntemleri

1. Ak›fl karyotiplemesi (Flow karyotyping),

2. Floresans in situ hibridizasyon (FISH),

3. Fiber FISH,

4. Multicolor-FISH,

a. Spectral karyotyping (SKY),

b. Multiplex-FISH (M-FISH),

c. R-FISH,

d. Cobra-FISH,

e. Komparatif genomik hibridizasyon (CGH).

2. Moleküler Genetik Tan› Yöntemleri

I. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR),

II. Allel-özgü oligonükleotid analizi “Allele-Specific Oli-gonucleotid (ASO)”,

III. DNA dizi analizi,

IV. Mikroarray analizi.

I. S‹TOGENET‹K TANI YÖNTEMLER‹

‹nsan kromozomlar› ilk kez 1857 y›l›nda Virchow tara-f›ndan görüldü, kromozom sözcü€ü ise 1988 y›l›nda Wal-deyer taraf›ndan kullan›ld› (3,4). Tjio ve Levan 1956 y›-l›nda, insan fetal akci€er fibroblastlar› ile yapt›klar› kül-türlerden elde ettikleri hücrelerde insan kromozomlar›-n›n say›s›n›n 46 oldu€unu ve cinsiyet kuruluflunun XX veXY oldu€unu kesin olarak saptad› (5).

Sitogenetik, kromozom ad› verilen hücre organellerininifllev ve morfolojilerini mitotik/mayotik metafaz süre-cinde inceleyen bilim dal›d›r. Sitoloji ve genetik bilim-lerinin birleflmesiyle ortaya ç›km›flt›r. Genetik materya-lin hücresel düzeyde incelenmesidir. Amaç, kromozomalevreye girmifl olan DNA’da meydana gelen yap›sal(translokasyon, delesyon, insersiyon, inversiyon, dupli-kasyon vs), say›sal (anöploidi, poliploidi vs.) de€ifliklik-leri ve köken farkl›l›klar›n› (kimerizm, mozaisizm, vs)saptamak, elde edilen sonuçla fenotip ile genotip ara-s›ndaki iliflkiyi de€erlendirmektir (6,7).

Sitogenetik tan› yöntemleri iki ana bafll›k alt›nda ince-lenebilir.

1. Klasik Sitogenetik Tan› Yöntemleri

Kromozom eldesi ve preparatlar›n haz›rlanmas› (har-vesting): Spontan bölünme h›z› yüksek olan hücrelerdendirekt olarak sitogenetik çal›flma yap›l›r; düflük olanhücreler ise önce kültüre edilerek yapay uyar›c›larla mi-toz bölünmeye sokulur, ço€alt›l›r ve daha sonra sitoge-netik çal›flmalar için kullan›l›r. Herhangi bir fiksatif so-lüsyon (örne€in; formol) içerisinde bulunan dokular kro-mozom elde etmek için uygun de€ildir (8).

Spontan olarak bölünen hücreler: kemik ili€i, lenf no-dülleri, solid tümörler, plevra ya da assit s›v›lar›ndakihücreler, kistik higroma, fetus ya da yenido€an kan› gi-bi dokular›n hücreleridir.

Genetik Tan› Yöntemleri

Yrd. Doç. Dr. Ayfle Gül ZAMAN‹

Selçuk Üniversitesi Meram T›p Fakültesi, T›bbi Genetik Anabilim Dal›, KONYAe-mail: [email protected]

Spontan olarak bölünme h›z› düflük olan hücreler isekan lenfositleri, amniyon s›v›s›, koryonik villus, deri vefibroblast içeren di€er dokulard›r.

Hücre kültürü: Spontan bölünme h›z› düflük olan hüc-reler kültüre edilerek ço€alt›l›r. Kültürler iki flekilde ku-rulabilir: k›sa süreli kültür (24-72, bazen 96 saat), uzunsüreli kültür (bir-üç hafta).

Kültür kurmak için haz›rlanan kültür ortam›nda afla -€›daki materyaller yer al›r:

1. Besi Yerleri (vasat): Dengelenmifl tuz solüsyonu ilehaz›rlan›rlar (Hanks ya da HBSS). Glukoz, esansiyel ami-noasitler, mineraller gibi hücre metabolizmas› için ge-rekli materyali içerirler. Hücre kültürlerinde TC Medium199, Minimal Essential Medium (MEM), McCoy’s 5A, Nut-rient Ham’s F-10, RPMI-1640 gibi besiyerleri s›kl›kla kul-lan›l›r (9). Tümörler ve özellikli dokular için üretilmiflspesifik besiyerleri de kullan›lmaktad›r (Leibovitz L15).

2. Serum: Dana serumu (FBS) ve s›€›r fetusu serumu(FCS) kullan›l›r. Serumlar içlerinde hücre büyüme fak-törleri, adezyon faktörleri, iz elementler, hormonlar vevitaminleri bulundurur.

3. Antibiyotik: Penisilin ve streptomisin bakteri infek-siyonu engellemek için en çok kullan›lan antibiyotikler-dir. Bunlara mantar infeksiyonlar›n› engellemek için am-foterisin ve nistatin eklenebilir.

4. L-Glutamin: Esansiyel bir aminoasittir.

5. Mitoz uyaran›: Fitohemaglutinin, EBV (Epstein-Barvirüs), Pokeweed mitojen (PWM), Forbol ester (TPA)kullan›l›r.

Direkt hücre materyalinden ve hücre kültürlerindenpreparatlar›n haz›rlanmas› (Harvesting): Kültürlereveya elde edilen direkt hücre materyaline çal›flmayabafllamadan iki saat önce mitozu durdurmak için kolfli-sin ya da demekolflin eklenir. S›v› faz santrifüjlenerekuzaklaflt›r›l›r. Tüpte kalan hücre faz› hipotonik solüsyo-nu (0.075 M KCl) ile 20 dakika muamele edilir. Kromo-zomlar›n birbirlerinden ayr›lmas› sa€lan›r. Süre sonundas›v› faz santrifüjlenerek uzaklaflt›r›l›r. Hücre faz› üç ke-re fiksatif (3 Metanol: 1 Asetik Asit) ile y›kan›r. Dahasonra elde edilen hücre faz› lamlara yay›larak boyan›r(fiekil 1).

S›kl›kla kullan›lan boyama yöntemleri: Normal kromo-zomlar›n tan›mlanmas› ve anormalliklerin tespiti için el-de edilen preparatlar›n boyanmas› gereklidir. Çeflitli bo-yalar kullan›larak yap›lan bandlama ifllemleri kullan›lanboyan›n, boyanan bölgenin veya yöntemin ismiyle adlan-d›r›l›r. Klasik bandlama yöntemleri oldukça basit ve fi-yat› uygun yöntemlerdir. Bu nedenle in situ hibridizas-yon yöntemleri uygulanmadan önce modern sitogenetikanalizlerin temel çal›flmas› olarak kullan›l›rlar.

1. Giemsa bandlama yöntemi (G-Banding): G bandla-man›n birçok yöntemle yap›labilmesine ra€men en çokkullan›lan teknik tripsinizasyonu takiben Giemsa kullan›-larak gerçeklefltirilen boyama yöntemidir. Enine aç›k vekoyu bandlar elde edilir. Koyu bandlar, adenin ve ti-minden zengin, transkripsiyon düzeyi düflük genleri, aç›krenk bandlar ise guanin sitozinden zengin, korunmuflgenleri içerir. Koyu bölgelerdeki paketlenmenin daha s›-k› olmas› sebebiyle, bu bölgede yer alan DNA ve pro-teinlerin tripsinizasyonla kaybolmad›€› düflünülmektedir.G bandlama ile 400-700 aras›nda band de€erlendirilir(Resim 1). Kromozomlar›n ilk defa Paris Kongresinde(1971) idiogramlar› belirlenmifl, en son flekli 2005ISCN’de yay›nlanm›flt›r (fiekil 2) (10,11). Bu yöntemlegenomu taranarak 10 Mb (1Mb= 1.000.000 baz çifti) bo-yutundaki de€ifliklikler tespit edilir. Hücreleri senkroni-ze ederek maksimum say›da mitoz biriktirmek ve uygunkonsantrasyonlarda kolflisin uygulayarak daha uzun band-lara sahip olan kromozomlar elde etmek amac›yla uy-gulanan yüksek rezolüsyonlu bandlama “High ResolutionBanding (HRB)” ile kromozomlar daha detayl› olarak de-€erlendirilir (Resim 2).

2. Floresans bandlama yöntemi (Q banding): Quinac-rine mustard/Quinacrine dihydrochloride gibi floresanveren boyalar kullan›larak yap›lan bandlamad›r. Parlakve soluk bandlar elde edilir. Parlak bandlar G bandla-madaki koyu renk bandlara, soluk bandlar aç›k renkbandlara karfl›l›k gelir. Bir, dokuz ve onalt› no’lu kro-mozomlar›n sentromer bölgelerinde ve Y kromozomun-da farkl›l›klar izlenir. Trizomilerde fazladan bulunankromozomun parental orijininin tespit edilmesinde kul-lan›l›r (9,10).

3. Reverse bandlama yöntemi (R-Banding): G bandla-madaki koyu renk bandlar aç›k, aç›k renk bandlar koyurenkte boyan›r. G bandlaman›n negatifi gibidir. Yüksek›s› ve kontrollü pH ile muamele edilen preparatlar Gi-emsa ile boyan›r. G ve Q bandlamada soluk olarak bo-yanan telomerik bölgelerin koyu olarak boyanmas›na im-kan tan›r. Kromozomlar›n uç k›s›mlar›n› kapsayan ano-malilerin de€erlendirilmesinde kullan›l›r (8-10).

4. C-Bandlama yöntemi (C-Banding): C-band bölge-sinde bulunan histon olmayan proteinlerin bölgeDNA’s›na çok s›k› ba€lanmas› ve tekrarlayan satellitDNA’n›n histonlarca s›k›ca paketlenmifl olmas› nedeniy-le, asit ve alkali muamelesi sonucunda C-band bölge-si d›fl›nda yer alan fragmentlere ayr›lm›fl DNA kaybo-lurken, C-band bölgesindeki DNA korunarak kal›r. Sen-tromere yak›n C-band bölgeleri koyu, di€er bölgeleraç›k boyan›r. Bir, dokuz ve onalt› no’lu kromozomla-r›n sentromer bölgelerinde ve Yq’da spesifik bandlarizlenir (Resim 3). Kromozom polimorfizmi bu yöntem-le de€erlendirilir.

144



145



fiekil 1. Kandan kromozom analizi basamaklar› (Passarge E. Renkli atlas. ‹stanbul: Nobel T›p Kitabevleri, 2000: 179.

5. NOR-bandlama yöntemi: Gümüfl nitrat ile akrosen-trik kromozomlar›n (13, 14, 15, 21 ve 22’nin k›sa kol-lar›) satellitlerinde yer alan nükleer organizer bölgelersiyah noktalar fleklinde boyan›r (Resim 4). Bu bölgede18S ve 28S ribozomal RNA genleri yer almaktad›r.

Bandlanan preparatlar›n mikroskobik analizi ve görüntü-leme: Bandlama sonras› mikroskopta 10 x 100 büyütmeile görüntü analiz sisteminde rutin analizler için en az25 metafaz de€erlendirilir.

Bu bandlamalar›n d›fl›nda daha özel amaçlarla kullan›-lan birçok boyama ve bandlama yöntemleri de vard›r:florokromlar ve z›t-boyama teknikleri, antikinetekor an-tikorlar› ile yap›lan boyamalar, restriksiyon endonükle-az-Giemsa bandlama vs. (9).

2. Özelleflmifl Sitogenetik Tan› Yöntemleri

Sitogenetik tan›da spesifik durumlar ve baz› kromozo-mal hastal›klar›n tan›s› için veya mutajenite testi ola-rak kullan›lan çok özelleflmifl teknikler de vard›r. Bun-lardan en çok kullan›lanlar› flunlard›r:

146



Resim 1. G-bandlama yöntemi uygulanm›fl bir olguda metafaz örne¤i (Dr. AG Zamani arflivi).

a. Kardefl kromatid de€iflimi “Sister Chromatid Exc-hange (SCE)”: Metafaz kromozomlar›nda morfoloji de-€iflmeksizin, özdefl segmentlerin simetrik de€iflimi sonu-cu kromatidlerin karfl›l›kl› farkl› boyanmas›d›r. Mutajenveya karsinojenlerin oluflturdu€u genetik harabiyetingösterilmesinde ve kromozom k›r›€› sendromlar›n› de€er-lendirmek amac›yla kullan›l›r (örne€in; Bloom Sendromu)(8-10). Genotoksik etmenler en baflta sigara olmak üze-re maruz kal›nan kimyasal ve fiziksel ajanlar olabilece-€i gibi tan› ve tedavi amac›yla kullan›lan ilaçlar da ola-bilir. Kültür ortam›na eklenen bromo-deoksi-uridin(BrdU) sentez faz› esnas›nda kendini eflleyen DNA’n›nyap›s›na girerek timin nükleotidinin yerini al›r. ‹kincikez mitoza giren hücrelerde, biri ana hücreden gelendi€eri de yeni sentezlenen iki kromatid aras›nda parçade€iflimleri meydana gelir (fiekil 3). Parça de€iflimlerinigörüntülemek için preparatlar Giemsa ile boyan›r. BrdU

ba€layan bölgeler boyay› tutmad›klar› için kromozomlarüzerinde aç›k renk ve koyu renk bölgeler oluflur. De€er-lendirme bu renk de€iflimlerinin say›s›na göre yap›l›r.Say› normal s›n›r›n üzerine ç›kt›€› zaman SCE pozitifli€isöz konusu olur. Kromozomal instabilite testi olarak daadland›r›l›r.

b. Mikronükleus tekni€i: Mikronükleuslar (MN) hücrebölünmesi s›ras›nda ortaya ç›kan, esas çekirde€e dahilolmayan kromozomlar veya asentrik kromozom parçala-r›ndan köken alan oluflumlard›r (Resim 5). MN say›s›n-daki art›fl anöploidiyi uyaran çeflitli mutajen veya kar-sinojenlerin hücrede yol açt›€› say›sal ve yap›sal kromo-zom anomalilerinin dolayl› olarak de€erlendirilmesinisa€lar. Genotoksisite de€erlendirme testidir. MN testikarsinojenlerin ya da farmasötik ajanlar›n yapt›€› sito-genetik harabiyetin tesbitinde kolay uygulanabilmesi,çok fazla say›da hücrenin de€erlendirilebilmesi ve ista-

147



fiekil 2. Normal insan kromozomlar›n›n Giemsa bant örneklerinin flemas›= ‹diyogram› (Nussbaum LR, Malnnes RR, Willard HF.Thompson ve Thompson T›bbi Genetik. Ankara: Günefl Kitabevi; 2005: 137).

148



Resim 2. HRB-bandlama yöntemi uygulanm›fl bir olgudan karyotip örne¤i (Dr. AG Zamani arflivi).

Resim 3. C-bandlama yöntemi uygulanm›fl bir olguda metefazörne¤i (Dr. AG Zamani arflivi).

Resim 4. NOR-bandlama yöntemi uygulanm›fl bir olguda mete-faz örne¤i (Dr. AG Zamani arflivi).

tistiksel yönden anlaml› sonuçlar elde edilmesi avanta-j› ile yayg›n kullan›lan bir tetkiktir (6,12).

c. Frajil bölge tespiti: Frajil bölgeler kromozomlar üze-rinde yer alan, özel kültür koflullar› alt›nda baz› faktör-ler taraf›ndan indüklenince gözlenen boyanmayan aral›k-lar (boflluklar), k›r›klar, yeniden düzenlenmeler veya tri-radiyal bölgelerdir (Resim 6) (13,14). Frajil bölgelerigösterebilmek için hücreleri de€iflik koflullar› olan ortam-larda ço€altmak ya da kimyasallarla karfl› karfl›ya b›rak-mak gerekir. Frajil bölgeler toplumda görülme s›kl›klar›ve indükleyici ajan tipi dikkate al›narak s›n›fland›r›l›rlar:

1. Nadir gözlenen frajil bölgeler: Toplumda %2.5’tendaha az s›kl›kla izlenirler. Folat stresi, BrdU veya dis-tamisin-A ile indüklenerek ortaya ç›karlar.

2. S›k gözlenen frajil bölgeler: Bütün bireylerde izle-nirler. Afidikolin, 5-azasitidin, kafein ve etanol taraf›n-dan indüklenince ortaya ç›karlar. Frajil bölgelerin kal›t-

lanabilir varyantlar› mevcuttur. Klinik olarak anlaml› ol-du€u aç›kça gösterilmifl olan Frajil X sendromundan so-rumlu olan fra Xq27.1 bölgesidir. Frajil bölgelerde kan-sere yol açan genlerin yerleflti€i gösterilmifltir. Bu gen-lerin kanser hücrelerinde s›kl›kla delesyona u€ramas›,frajil bölgelerin kanser gelifliminde genomik karars›zl›kaç›s›ndan önemini ortaya koymaktad›r (13,14). En s›kgörülen frajil bölge olan 3p14.1’de yer alan FHIT genimuhtemelen tümör süpressör gen olarak görev yapmak-tad›r (15).

II. MOLEKÜLER S‹TOGENET‹K TANI YÖNTEMLER‹

1. Ak›fl Karyotiplemesi (Flow Karyotyping)

Flow sitometri ile kromozomlar›n analizi için iki lazerlifloresan-aktive edici hücre sayac› “Fluorescent-Activa-ted Cell Sorter (FACS)” kullan›l›r. Birinci lazer 364 nmdalga boyunda ›fl›k dalgas› göndererek Hoechst 33258

149



fiekil 3. Kardefl kromatid de¤ifliminin mekanizmas›.Kal›n çizgiler do¤al DNA zincirini, ince çizgili zincir BrdU içeren DNA zincirinigöstermektedir (Verma SM, Babu A. Human chromosomes manual of basic techniques. New York: Pergamon Press, 1989: 130).

boyas›n›n, ikinci lazer 458 nm dalga boyunda ›fl›k dal-gas› göndererek Chromomycin A3 boyas›n›n floresan ›fl›-mas›n› sa€lar. Mitotik hücre popülasyonundan elde edi-len kromozom süspansiyonu Hoechst 33258 ve Chro-momycin A3 boyalar› içeren poliamin buffer içinde bo-yan›r. Hoechst 33258 → adenin ve timinden zengin,Chromomycin A3 → guanin ve sitozinden zengin DNAbölgelerini boyar. Daha sonra kromozomlar flow sito-metrinin ›fl›k demetinden tek tek geçirilmek suretiyleanaliz edilir. ‹ki lazerden iki farkl› dalga boyunda gön-derilen ›fl›n demetlerinden yans›yan floresan ›fl›n›m fo-tomultiplier taraf›ndan ölçülür ve FACS taraf›ndan de-polan›r (fiekil 4) (16,17). Daha sonra bilgisayar taraf›n-dan yap›lan analiz sonucunda birkaç yüz bin kromozom-dan elde edilen verilerin toplam› ile bir ak›fl karyotipioluflturulur. Her kromozomun kendi rezolüsyonuna göreayr› ayr› ya da ortak bir pik izlenir. Dokuz, 10, 11 ve12 numaral› kromozomlar›n genetik içeri€i birbirine ben-zer oldu€u için bu kromozomlara ait tek bir noktada bi-rikim saptan›r (fiekil 5) (16).

2. Floresans In Situ Hibridizasyon (FISH)

Sitogenetik ve moleküler genetik teknikleri biraraya ge-tiren bir tetkiktir. Genomda istenilen hedef DNA bölge-sinin floresan veren DNA veya RNA problar› ile boyana-rak “in situ” olarak gözlenmesine imkan tan›yan mole-küler sitogenetik bir yöntemdir. ‹nterfaz hücre çekirde-€inin ve metafaz kromozomlar›n›n de€erlendirilmesinisa€lar. Yöntemin temelinde, görüntülenmesi hedeflenenDNA bölgesine komplementer florokromlarla (floresansveren moleküller) iflaretlenmifl olan tek iplikçikli (oligo-nukleotid) DNA dizileri kullan›l›r. Bu florokromlarla ifla-retli DNA dizilerine Prob denir. Morfolojik olarak korun-mufl kromozom preparasyonlar›na, fikse edilmifl hücrele-re ya da doku kesitlerine uygulanabilmektedir.

Klinik sitogenetikte say›sal ve yap›sal anomalilerin, mik-rodelesyon sendromlar›n›n, kriptik translokasyonlar›n,marker kromozomlar›n tan›mlanmas›nda, tümör gelifli-

150



Resim 5. MN örne¤i (Dr. HG. Durakbafl›-Dursun’un izniyle).

fiekil 4. Floresan-aktive edici hücre sayac› ile ak›fl karyotipleme-si (Alberts B, Bray D, Hopkin K, et al. Essential Cell Biology. 2nd

ed. Spain: Garland Science; 2004: 326.)’dan modifiye edilerekal›nm›flt›r.

Resim 6. Fra15q içeren bir hasataya ait kromozom 15 örnekle-ri (Dr. AG Zamani arflivi).

minde ortaya ç›kan anomalilerin tan›mlanmas›nda, genharitalamada kullan›lan bir tekniktir (8,18,19).

FISH prosedürü genel olarak flu basamaklardan oluflur(fiekil 6):

• Hedef DNA (metafaz kromozomu ya da interfaz nuk-leusu) ve prob haz›rlan›r.

• Hedef DNA ve prob birlikte ya da ayr› ayr› yüksek›s›da denature edilir (72-75ºC). DNA’n›n çift zincirli ya-p›s› aç›larak tek zincirli hal al›r.

• Hedef DNA ve probun 37ºC’de hibridizasyonu sa€lan›r(süre probun tipine göre de€iflir: 1-16 saat). Bu aflama-da problar hedef kromozom üzerindeki komplementeriolduklar› bölgeye ya da bölgelere ba€lan›r.

• Hibridizasyon süresi bitince nonspesifik ba€lanmalar-dan ve artefaktlardan (kirliliklerden) kurtulmak için çe-flitli s›cakl›klarda ve çeflitli yo€unluklardaki tuz ve de-terjan türevi maddelerle y›kama ifllemi yap›l›r=Posthib-ridizasyon y›kama.

• Kromozomlar kontrast oluflturan bir renkle (örne€in;DAPI=4’-6-diamidino-2-phenylidole/Antifade) boyanarakgörünür hale getirilir.

• Floresans mikroskopta incelenir.

• Hedef kromozom ya da kromozom bölgesine ve ama-ca ba€l› olarak kullan›lan çeflitli problar vard›r:

a. Tüm kromozom boyama problar› (kromozom pain-ting prob): Kromozom ya da kromozom kollar›n›n iden-tifikasyonu için kullan›lan problard›r (Resim 7).

b. Sentromer spesifik problar: Sentromer yak›n›ndakialfa satellit bölgesine özgü problard›r (Resim 8). Sade-ce 13/21 ve 14/22 kromozomlar› sentromerik bölgele-rinde homolog dizilere sahiptirler. Ay›rt edilebilmeleriiçin ekstra bir prob ile kombine edilirler (8,18,19).

c. Lokus spesifik problar= Tek gen problar›: Delesyonya da duplikasyonlar› tespit etmek ve gen lokalizasyo-nunu belirlemek için kullan›lan bir gen/lokus bölgesineözgü problard›r (Resim 9). Tümör geneti€inde s›kl›klakullan›l›r (8,18,19).

d. Telomerik problar: Kromozomlar›n terminal bölgele-rini tan›mlayan problard›r. Hücre yafllanmas› (senescen-ce), kromozomal yeniden düzenlenmeler ve delesyonla-

151



fiekil 5. Ak›fl karyotiplemesi analiz sonucu (Thompson MW,McInnes RR,Willard HF. Thompson and Thompson Genetics in Medi-cine. 4th ed. Philadelphia: WB Saunders, 1999: 176).

fiekil 6. FISH analizi basamaklar›.

Hedefin haz›rlanmas›

Denaturasyon

Hibridizasyon

Hibridizasyon sonras›y›kama

Kromozomlar›nboyanmas›

Floresans mikroskobi

Probun haz›rlanmas›

r›n araflt›r›lmas›nda kullan›l›r. Her kromozoma özgü te-lomerik problar bulunmaktad›r.

3. FIBER-FISH

Kromozom fiberleri metafazda kondanse olurlar bu ne-denle ancak birbirinden 2-3 Mb (1 Mb= 10.000 bp) uzak-l›ktaki bölgelerde problarla elde edilen floresan tespitedilebilir. Daha yak›n mesafelerde prob ›fl›n›mlar› üstüste biner ve elde edilen sinyal kombine olarak alg›la-n›r. E€er interfazda bu hibridizasyon gerçeklefltirilir vefiberler aç›k olarak izlenebilirse iki probun sinyalinin iz-lenebilmesi için aradaki en az mesafe oran› 50 kb’ye(1 kb= 1000 bp) kadar düfler (20).

4. Multicolor-FISH

Daha sonraki y›llarda FISH metodunu temel alarak ge-lifltirilmifl uygulamalard›r.

a. Spektral karyotipleme (SKY): Tekni€in esas› her bi-ri 5 florokromun farkl› kombinasyonlar›yla haz›rlanm›fl24 farkl› kromozom boyama probu ile 24 kromozomunefl zamanl› hibridizasyonu ve tek bir filtreye sahip flo-resans mikroskopu ile analizine dayan›r. Befl farkl› flo-resan boyan›n kombine edilip kullan›lmas›yla 31 farkl›hedefi ay›rt edebilmek mümkündür. Efl zamanl› olarakbir metafaz pla€›nda yer alan tüm kromozomlar›n fark-l› renklerde görüntülenmesine imkan tan›r. Her bir kro-mozomun yayd›€› floresans›n tek bir optik filtre kulla-n›larak spektral görüntülenmesi ve emisyonlar›n›n ölçül-mesi hibridizasyonun de€erlendirilmesine olanak sa€lar.Her kromozom kendine ait farkl› karakteristik bir dalgaboyunda veya floresansta izlenir. SKY ile 1.5 Mb’nin al-t›ndaki parça de€iflimleri bile saptanabilir (19,21). Kan-sere neden olan genomik de€iflikliklerin standart bant-lama yöntemlerinden daha iyi anlafl›lmas›n› sa€lar. Ye-niden düzenlenmeler kolayl›kla tan›mlan›r. ‹liflkili kro-mozomlar saptan›r. Bandlama tekniklerine üstünlü€ü çokküçük boyutlardaki anomalilerin daha kolay tan›nabilme-sine olanak vermesidir (22).

b. M-FISH (Multiplex FISH): SKY gibi 5 florokromun çe-flitli kombinasyonlar›yla haz›rlanm›fl problar›n hibridizas-yonu ve farkl› floresan sinyaller ile analizine dayal› biryöntemdir. Befl florokromun her birinin ayr› ayr› ›fl›n›-m›n›n dar band-geçiflli bir ›fl›ma saptama filtresi ile tes-pit edilmesi ve elde edilen befl floresan ›fl›ma tabaka-s›n›n bilgisayarda üst üste çak›flt›r›larak de€erlendirilme-si esas›na dayan›r. Sadece sentromerler için uygulanan

152



Resim 7. Tüm kromozom boyama probu kullan›larak sekinizcikromozom boyanm›flt›r (Dr. AG. Zamani ve HG. Durakbafl›-Dur-sun’un arflivi).

Resim 8. ‹nterfaz FISH. 7 ve 8 no’lu kromozomlara ait sentro-merik problar (7. kromozom yeflil, 8. kromozom k›rm›z›) kullan›l-m›flt›r (Dr. AG. Zamani ve HG. Durakbafl›-Dursun’un arflivi).

Resim 9. SRY lokus spesifik prob kullan›larak yap›lm›fl FISH ör-ne¤i. SRY/X probu kullan›ld› (X kromozomu yeflil, SRY k›rm›z›)(Dr. AG. Zamani ve HG. Durakbafl›-Dursun’un arflivi).

CM-multiplex FISH ve telomerler için uygulanan TM-Mul-tiplex FISH tetkikleri mevcuttur (19,23).

c. COBRA-FISH= Combined binary ratio FISH: Di€er FISHyöntemlerine benzer. Ancak 4 florokrom kullan›l›r. Yirmi-dört kromozomun 12’si bir gruba di€er 12’si di€er bir gru-ba ayr›l›r. ‹lk grup üç ayr› florokromla hibridize olurken,i k i n c i grupta ek olarak dördüncü bir florokrom kullan›l›r.Bu metod, b e fl i n c i florokromla da yap›labilir. Kromozomkollar›na özgü boyama sa€lad›€› için kullan›l›r (24).

d. R x FISH=Cross-species colour FISH: Jibon kromo-zomlar› prob olarak kullan›l›r. Jibon ve insan kromozom-lar›n›n homolojisi yaklafl›k %98’dir. RxFISH ile yaln›zcakromozom aras› parça de€iflimleri de€il, ayn› zamandakromozom içi de€iflimler de belirlenebilmektedir (deles-yon, inversiyon). G-bantlama tekni€i ile birlikte kullan›l-d›€›nda 400 kat daha hassas sonuçlar vermektedir (25).

e. Karfl›laflt›rmal› genomik hibridizasyon=comparativegenomic hybridization (CGH): FISH’de dahil olmak üze-re klasik sitogenetik yöntemlerin, kanser sitogeneti€in-de karfl›lafl›lan yap›sal anomalileri do€ru olarak tan›mla-mada yetersiz kalmas› yeni yöntem aray›fllar›n› berabe-rinde getirdi. Sitogenetik ve moleküler genetik teknik-lerin birlikte kullan›ld›€› CGH bu sorunun çözümlenme-sini sa€lad›. Kallioniemi ve ark. taraf›ndan uygulamayasokulan bu teknikte amaç DNA kopya say›s›ndaki art›fl›veya eksilmeleri ortaya koymakt› (26,27).

Yöntem, kontrol ve test DNA’lar›n›n anomali içermeyennormal metafaz pla€› üzerinde hibridize edilmesi esas›-na dayan›r. Genomdaki dengesiz materyalin daha ayr›n-t›l› ve do€ru analizi ve özellikle dengeli görünen bir ge-nomda yer alan belirgin olmayan sapmalar› göstermekiçin kullan›l›r. Ayr›ca, gen amplifikasyonu bak›m›ndantümör genomunun taranmas› ve amplifikasyonun kromo-zomal lokalizasyonunun saptanmas› amac›yla da kullan›-l›r. Yöntem ile hasta DNA’s›ndaki kromozomal kay›p(loss) veya belli bir bölgenin amplifikasyonu (gain) gös-terilir. Bu yöntemle metaplazik de€ifliklikler de sapta-n›r. PZR (polimeraz zincir reaksiyonu) ile kombine edi-lirse az say›da hücreden elde edilen az miktarda DNAile çal›flmaya imkan tan›r (28).

CGH için analiz edilecek DNA (test DNA’s›) ile normalDNA (kontrol DNA’s›) farkl› florokromlarla iflaretlenir venormal hücrelerden elde edilen metafaz kromozomlar›ile hibridize edilir (fiekil 7). Test DNA yeflil (Biotin-avi-din), kontrol DNA k›rm›z› (Digoksin-antidigoksigenin) ifla-retlidir. Farkl› floresan fenotipi gösteren DNA’lar nor-mal metafaz kromozomlar› ile hibridize olduklar› zamanbirbirleri ile tam örtüflüyorlarsa, mavi-turuncu bir renk-te izlenirler. E€er test DNA’s›nda bir delesyon söz ko-nusu olursa bu bölgede hibridizasyon gerçekleflmez, do-lay›s›yla bölge k›rm›z› renkte izlenir. Buna karfl›l›kDNA’da bir amplifikasyon varsa, bu bölgede hibridizas-

yon daha yo€un oldu€u için bölge di€er bölgelerden da-ha parlak yeflil olarak izlenir (26-28). Görüntü analiz sis-teminin program›yla bilgisayarda hibridizasyon oranlar›-na göre kromozom hibridizasyon profilleri (CGH oranprofili)hesaplanabilir (fiekil 8). Tekni€in Temel Avantaj›,iki renkli görüntüleme sistemi kullan›lmas› sonucundametafaz pla€› üzerinde kromozom anomalilerinin normalkaryotip analizine göre daha güvenilir saptanabilmesi veen az iki genomun birbirleri ile karfl›laflt›r›lmas›na ola-nak sa€lamas›d›r. Dezavantaj› ise düflük kararl›l›k(10.000-20.000 kb) ve verimliliktir.

2. MOLEKÜLER GENET‹K YÖNTEMLER

‹nsan Genom Projesi (HUGO) kapsam›nda yap›lan çal›fl-malar sonucunda, insan genomunun yaklafl›k olarak33.000 adet gene sahip oldu€u anlafl›lm›fl ve bunlar›nbüyük ço€unlu€unun özellikleri belirlenmifltir. Günümüz-de klinikte konulan hastal›k tan›lar›, moleküler tan› iledesteklenmektedir (29,30). Ayr›ca, ilaç etkinli€inde ge-notip-fenotip iliflkisi giderek önem kazanmakta ve kul-lan›lan ilaçlardan en az zararla, en etkin flekilde yarar-lanma olanaklar› araflt›r›lmaktad›r. Afla€›da genetik has-tal›klar›n moleküler genetik tan›s›nda kullan›lan temelyöntemlerden bahsedilecektir.

I. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)= (PolymeraseChain Reaction)

Kary Mullis’in buluflu olan ve kendisine Nobel ödülü ka-zand›ran PZR, hücre içinde do€al olarak gerçekleflenDNA replikasyonunun tüp içinde taklit edilmesiyle iste-nilen bir bölgenin çok fazla say›da ço€alt›lmas›n› sa€la-yan bir yöntemdir (31).

Çok az miktarda DNA yeterlidir. PZR spesifik DNA veRNA dizilerinin in vitro amplifikasyon tekni€idir. ‹ki oli-gonükleotid primer dizilimi aras›nda yer alan hedef DNAbölgesinin enzimatik olarak birkaç milyon kat ço€alt›l-mas› ifllemidir. Bir çeflit in vitro klonlama yöntemidir.Çok az miktardaki örnekten spesifik bir gen bölgesiniço€altmak ve tan›ya yönelik incelemeler yapmak içinyeterli genetik materyal sa€lamak amac›yla kullan›lmak-tad›r. Primerlerden biri hedef bölgenin 5’→3’ yönünde-ki zincirinin, di€eri 3’→5’ yönündeki zincirinin bafllan-g›ç bölgesine komplementerdir.

Ortamda ço€alt›lacak olan kal›p DNA örne€i, DNA’da ço-€alt›lmas› planlana bölgenin iki ucunda yer alan DNA di-zilerini özgül olarak tan›y›p ba€lanacak primerler, buprimerlere ba€lan›p sentez yapacak olan ›s›ya dayan›kl›"Taq" polimeraz enzimi, sentez iflleminde kullan›lacakdeoksiribonükleotid trifosfatlar (dNTPs=dATP, dTTP,dGTP, dCTP), gerekli pH ve iyon (Mg+2) koflullar›n› sa€-layan tampon kar›fl›m› bulunmal›d›r (32).

PZR ile DNA’n›n iki zincirinin yüksek ›s› ile birbirindenayr›lmas› (denatürasyon), daha sonra sentetik oligonük-

153



154



fiekil 7. CGH protokolü (Özon YH. Komperatif genomik hibridizasyon tekni¤inin prenatal tan›da uygulanmas›. [Doktora Tezi].Eskiflehir Osmangazi Üniversitesi, 2000: 22.

leotidlerin hedef DNA’ya ba€lanmas› (primer hibridizas-yonu, annealing), enzimatik DNA sentezi (polimerizas-yon: ekstansiyon) döngüsünün 25-40 kere tekrarlanmas›sonucu hedef DNA’n›n bir kaç milyon kopyas›n›n eldeedilmesi sa€lan›r (fiekil 9). Sonuçta tek bir DNA frag-mentini 2n kadar ço€alt›l›r (n= döngü say›s›). Her ad›mfarkl› ›s›larda gerçekleflir; s›ras›yla birinci basamak 94-98°C; ikinci basamak 37-65ºC; üçüncü basamak 72ºC.Bütün ifllem bir-iki saat içerisinde tamamlan›r.

PZR’nin genetikte kullan›m alanlar›:

• Onkogenezis araflt›rmalar›,

• Kal›tsal hastal›klarda tafl›y›c›n›n ve hastan›n tan›s›(mutasyon analizi),

• Prenatal tan›,

• Klinik örneklerde patojen organizmalar›n saptanmas›,

• Adli t›p (DNA parmak izi araflt›rmas› vb.),

• Prob oluflturulmas›/klonlama/gen ekspresyon araflt›r-malar›,

• DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerininoluflturulmas›nda,

• Bilinmeyen dizilerin tayininde,

• Geçmifl DNA’n›n incelenmesinde,

• Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)analizinde,

• ‹n vitro fertilizasyon yap›lan tek hücrede, implantas-yon öncesi genetik testlerin yap›lmas›,

• DNA protein interaksiyonunun araflt›r›lmas›nda (foot-printing) kullan›labilir.

‹lgili DNA bölgesi PZR ile ço€alt›ld›ktan sonra bu bölge-deki mutasyonlar birkaç de€iflik metod ile direkt olarakanaliz edilebilir: PZR ürünlerinin agaroz veya poliakrila-mid jel ile analizi, PZR/RFLP, “Allele Specific Oligonuc-leotid (ASO)” veya Dot Blot analizi, “Amplification Ref-ractory Mutation System (ARMS)”, DNA dizi analizi, mic-roarray analizi vb.

PZR yönteminin her geçen gün kullan›m alan› geniflle-mektedir. Uygulanan PZR çeflitlerinin say›s› da her ge-çen gün artmaktad›r. PZR uygulamalar› aras›nda, Nes-ted-PZR, RT-PZR, Inverse-PZR, DOP-PZR, Asimetrik PZR,vb. say›labilir. PZR tekni€i giderek moleküler araflt›rma-larda ön ifllem halini almaktad›r.

II. Allel-Özgü Oligonükleotid “Allele-SpecificOligonucleotid (ASO)”

Bu yöntemle hastal›€a sebep olan mutasyon biliniyorsa,hastadan al›nan DNA örne€inde bu mutasyonun bulunupbulunmad›€› tespit edilir. Biri normal gene özgül, di€e-ri bilinen bir genetik mutasyona özgün sentetik oligonük-leotidler, prob olarak kullan›l›r. Problar›n k›sa oluflu ana-liz edilen örnekte bulunabilecek tek bir baz çifti uyufl-mazl›€›n› bile duyarl› olarak saptama olana€› verir (18).

Problar sadece tam olarak komplementer olan diziylehibridize olur tek bir baz uyuflmazl›€› bile hibridizasyo-nu engeller. Bu yöntemle homozigot ve heterozigot bi-reyler birbirinden ay›rt edilebilir (fiekil 10A,B). ASO ana-lizlerinde al›nan sonuçlar yorumlan›rken dikkat edilme-

155



fiekil 8. Analiz edilen kromozomlardaki kopya say›s›ndaki de¤ifliklikleri gösteren bilgisayar sonuç örne¤i (Wegner RD. Diagnosticcytogenetics. Berlin: Springer-Verlag, 1999: 377).

lidir. ASO ile araflt›r›lan dizilimin d›fl›nda yer alan böl-gelerde mutasyonlar olabilir. Yaln›zca s›n›rl› ve az say›-daki farkl› mutasyonlarla karakterize genetik hastal›klariçin uygundur.

III. DNA Dizi Analizi

En yayg›n kullan›lan yaklafl›m Sanger dizi analizidir. Gü-nümüzde bu ifllemi yapan aletler bulunmaktad›r. Yön-tem, rekombinant Taq polimerazlar›n gelifltirilmesi ilePCR ile gerçeklefltirilebilir hale gelmifltir. Hem normalhem de mutant genlerin analizi için rutin kullan›l›r.Birçok dizi analizi yöntemi olmas›na ra€men burada oto-matik dizi analiz sistemlerinin kulland›€› zincir sonlan-d›rma (chain termination, Sanger yöntemi) yöntemi an-lat›lacakt›r. Sanger dizi analizinin avantaj› DNA polime-

raz› inhibe etmek için nükleotidlerin kimyasal analogla-r›n›n kullan›lmas›d›r. Bu analoglar dideoksinükleotidtri-fosfatlar (ddNTP)’d›r. 2’,3’ dideoksinükleotidtrifosfat’la-r›n (ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddATP), klasik dNTP’lerdenfarkl›l›€› deoxyriboz’un 3’ karbonunda hidroksil grubu-nun bulunmamas›d›r. Büyüyen/sentezlenen DNA zinciri-ne, dNTP’ler DNA polimerazlar arac›l›€› ile ba€lan›rlar.Bu ba€lanma 5’trifosfat gruplar› arac›l›€› ile olur. Fa-kat, ddNTP’lerde 3’hidroksil grubunun olmamas› nede-niyle, ard›ndan gelen dNTP’lerin fosfodiester ba€› olufl-turmas› engellenir (fiekil 11). Do€al olarak DNA zinciri-nin daha fazla uzamas› imkans›z hale gelir ve zincirsonlan›r. ddNTP ile klasik dört dNTP bir reaksiyon ka-r›fl›m›n›n içine konuldu€uda, DNA zincir uzamas› için

156



fiekil 9. PZR amplifikasyonu (Alberts B, Bray D, Hopkin K, et al. Essential Cell Biology. 2nd ed. Spain: Garland Science; 2004:349)’dan modifiye edilerek al›nm›flt›r).

aralar›nda bir yar›flma olur, seyrek fakat spesifik son-lanmalar oluflur. Sonuçta sentez sonras› farkl› uzunluk-ta DNA parçalar› ortaya ç›kar. Dört farkl› enzimatik re-aksiyonda, dört farkl› ddNTP kullan›larak (A, C, G, T

için) birer reaksiyon elde edilir. Ürünler poliakrilamidjel veya kapiller elektroforezde yürütülerek radyoizotopya da floroforlar görüntülenir (fiekil 12). Görüntü oto-matik görüntüleme aletine aktar›larak analiz edilir (fie-kil 13). Çok aç›k ve net bir yöntem olmas›na ra€menbazen teknik güçlükler yaflanabilir. Heterozigot bireyler-de tek nükleotidlik de€iflimlerin görüldü€ü mutant aleljelde zay›f bir band, otomatik görüntüleme aletinde dezay›f bir pik verip yanl›fl negatif sonuçlara yol açabilir(18,32,33).

IV. Mikroarray Tekni€i

Tek bir array üzerinde tüm genomu inceleme yöntemi-dir. ‹lk kez 1997 de Solinas-Toldo ve ark. hedef (tar-get) diziyi cam matriks üzerine immobilize ederek mik-roarrayin temelini att› (34). Pollack ve ark. array plat-formu üzerine cDNA dizisini (target) immobilize ederekgenom düzeyinde DNA’daki kopya say›s›ndaki de€iflmele-ri inceledi (35). Moleküler biyolojik ve robotik teknik-lerin bir arada kullan›m› sonucunda, cam matriks üze-rinde her biri spesifik bir geni temsil eden binlerce DNAparças›n›n (sentetik oligonükleotidler, cDNA’lar, BAC,PAC ve kozmitler, PZR ürünleri) yap›flt›r›lmas› ile eldeedilen arrayler ile hücrelerde, gen ekspresyon analizle-ri ve tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP) genotiple-melerini yapmak mümkün oldu. BAC, PAC ve kozmitler-den elde edilen problar, PZR, cDNA, oligonukleotidler-den elde edilen problara göre daha güçlü sinyal yo€un-lu€u verir. Standart bir mikroarray matriksi, yaklafl›kolarak, bir cm2’sinde 100 µm çap›nda 40.000 spot (be-nek) içerir.

Tekni€in kullan›m alanlar›:

• Kanser araflt›rmalar›,

• Gen ekspresyon çal›flmalar›,

• Normal ve patolojik durumlarda gen ekspresyon fark-l›l›klar›n›n incelenmesi,

• Mutasyon ve polimorfizm tespiti,

• ‹laç hedeflerinin tan›mlanmas›,

• Gen haritalamas›,

• DNA dizi analizi,

• SNP analizleri

• Epigenetik modifikasyonlara yönelik çal›flmalard›r.

Tekni€in aflamalar›; test ve referans hücrelerden geno-mik DNA izole edilir (fiekil 14). ‹zole edilen DNA veyaRNA’dan elde edilen cDNA’lar farkl› renkte florokrom-larla [Cy 3 (yeflil) ve Cy5 (k›rm›z›)] iflaretlenir. Ard ar-da tekrarlanan bölgelerden kaynaklanabilecek hatal› efl-leflmeleri önlemek için Human Cot-1 DNA ile muameleedilir. Test ve referans DNA örnekleri array üzerindebulunan prob DNA’lar ile uygun koflullarda hibridize edi-

157



fiekil 10. ASO analizi (Nussbaum LR, Malnnes RR, Willard HF.Thompson ve Thompson t›bbi genetik. Ankara: Günefl Kitabevi,2005: 41).

lir. Hibridizasyondan sonra fazla olan iflaretli DNA ör-neklerini ortamdan uzaklaflt›rmak için cam matriks y›ka-ma ifllemine tabi tutularak kurutulur. Floresan lazer ileelde edilen ›fl›malar bir dedektör yard›m›yla alg›lan›r.Ifl›ma emisyon spektrumu ölçülür. Okunan emisyon spek-trumu bilgisayar ortam›na aktar›larak çeflitli analiz prog-ramlar› ile de€erlendirilir. Test ve referans DNA örnek-lerinin verileri birbiri üzerine çak›flt›r›larak, her nokta-c›€›n yeni bir renk vermesi sa€lan›r. Noktalar›n k›rm›-z›/yeflil oranlar› kaydedilir. Bu oranlara göre de€erlen-dirme yap›l›r. Oran bir ise gen ekspresyonunda de€iflimyok, birden yüksek ise gen ekspresyonunda art›fl, birdendüflük de€erlerde ise gen ekspresyonunda düflme olarakde€erlendirilir (33,36,37).

Mikroarray tekni€inin avantajlar› flunlard›r; farkl› renk-lerde florokromlar›n kullan›lmas› genom boyunca DNAkopya say›s›ndaki de€iflimlere ba€l› olarak ortaya ç›kankromozom anomalilerinin güvenilir flekilde tespit edil-mesini ve s›n›fland›r›labilmesini sa€lar, birden fazla ge-

nomun birbirileri ile karfl›laflt›r›labilmelerine olanak sa€-lar, az miktarlarda DNA örne€i yeterlidir, metafaz pla-€› gerekli de€ildir, yüksek kararl›l›k ve verim elde edi-lir ve DNA üzerindeki tek baz de€ifliklikleri bile sapta-nabilir. Mikroarray tekni€inin s›n›rland›€› noktalar damevcuttur. Bunlar; heterojen doku ve hücre popülas-yonlar› ile çal›flman›n zorlu€u, standardizasyonun zorlu-€u, dolay›s›yla tetkiki sadece alan›nda uzman kiflilerinyapabilmesidir.

M‹N‹ GENET‹K SÖZLÜK

Akrosentrik: Sentromeri bir uca çok yak›n oldu€u içinkollar›ndan biri çok k›sa olan kromozom.

Allel: Özdefl kromozomlar›n özel bir loküsünde oturmuflolan herhangi bir genin seçenekli biçimlerinden biri.

Anöploidi: Kromozom say›s›ndaki temel kromozom say›-s›n›n katlar› kadar olmayan artma ya da eksilmeler.

Delesyon: Bir kromozomdan DNA dizisinin koparak kay-bolmas›.

158



fiekil 11. dNTP ve ddNTP'nin flematik görünümü (Deichmann K. Sequencing. In: Hildebrant F, Igarashi P (eds). Techniques in mo-lecular medicine. Berlin: Springer-Verlag, 1999: 187-8.

Duplikasyon: Kromozom materyalinde ortaya ç›kan, bel-li bir nükleotidin ya da belli bir dizilime sahip DNA par-ças›n›n gen yap›s›na tekrar sokulmas› sonucunda ortayaç›kan baflkalafl›m.

F e n o t i p : Bir organizma ya da hücrenin genotip veçevre aras›ndaki etkileflim sonucu oluflan ve varl›€›türlü yollarla ortaya konabilen özelliklerinden biri yada tümü.

Genom: Bir efley hücresinin, kiflinin veya türün tüm ge-netik bilgisini tafl›yan DNA dizisinin tümü.

Genotip: (1) Fenotipten ayr› olarak bir kiflinin genetikyap›s›. (2) Bir loküsteki tüm alleller.

Heterozigot: Diploid organizmalarda ayn› gen loküsündebirbirinden farkl› iki allel tafl›yan kifli.

Homozigot: Diploid organizmalarda herhangi bir gen lo-küsünde bulunan iki allelin birbiri ile özdefl olmas› du-rumu ya da böyle bir kifli.

‹nsersiyon: Bir kromozom parças›n›n homolog olmayanfarkl› bir kromozomun içine yerleflmesi durumu.

‹nversiyon: Bir kromozom parças›n›n kopup 180° tersdönerek koptu€u yerlere yap›flmas›d›r. Sentromeri içerirveya içermez.

Kimerizm: Ayn› organizmada, farkl› zigotlardan kaynak-lanm›fl ve farkl› genetik yap›da birden çok hücre gru-bunun bir arada bulunmas›d›r.

Loküs: Üzerinde genlerin bulundu€u varsay›lan kromo-zom kesimi.

Mozaisizm: Ayn› organizmada, ayn› zigottan kaynaklan-m›fl, fakat genetik yap›lar› birbirinden farkl› olan birdenfazla hücre grubunun bir arada bulunmas› durumu.

Polimorfizm: Birbirlerinden kesinlikle ayr›labilen fakatayn› loküsteki genlerle oluflturulan iki ya da daha çokseçenekli fenotipin ayn› toplumda ve hemen hemen ay-n› s›kl›kta birlikte bulunmas› durumudur.

Poliploidi: Herhangi bir bireydeki kromozom say›s›n›n,haploid kromozom say›s›n›n üç ya da daha çok kat› ol-mas› durumu.

Sentromer: Kromozomlar üzerinde kardefl kromatidlerintutundu€u ve kinetekorun oluflturdu€u ana bo€um.

159



fiekil 12. Zincir sonland›rma ile yap›lan dizi analizi reaksiyonuve jel görütüsü flematik gösterimi (Deichmann K. Sequencing.In:Hildebrant F, Igarashi P (eds). Techniques in molecular medi-cine. Berlin: Springer-Verlag, 1999:187-8).

fiekil 13. Otomatik dizi analizi yapan aletlerden elde edilen birdizi analizi sonucu (Alberts B, Bray D, Hopkin K, et al. Essentialcell biology. 2nd ed. Spain: Garland Science, 2004: 333).

160



fiekil 14. Mikroarray yöntemi (Alberts B, Bray D, Hopkin K, et al. Essential cell biology. 2nd ed. Spain: Garland Science; 2004:339.

Telomer: Her kromozomun kollar›n›n ucu

Translokasyon: Bir kromozom parças›n›n di€er bir kro-mozoma aktar›lmas›.

Trizomi: ‹nsan kromozomlar›n›n herhangi birinin iki ye-rine üç tane bulunmas› durumudur (2n + 1=47).

KAYNAKLAR1 . Watson JD, Crick FH. Molecular structure of nucleic acids. A

structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 1953; 171: 737-8.

2. Ba€c› H. ‹nsan genom projesi. DEU T›p Fakültesi Dergisi ÖzelSay›s›, 2002: 11-9.

3. Vogel F, Motulsky AG. Human genetics. 3rd ed. New York:Springer-Verlag, 1998.

4. Waldeyer, W. Ueber karyokine und ihre Beziehung zu den.Befruchtungsvorgangen. Arch Mikr Anat 1888; 32: 1.

5. Tjio JH, Levan A. The chromosome number of man. Heredi -tas 1956; 42: 1-6.

6. Bozkurt G, Tabakç›o€lu K. Psikiyatrik genetik araflt›rmalardakullan›labilecek genetik yöntemler: III. Psikiatri ve sitogene -tik. 3P Dergisi 2004; 12: 20-30.

7. Baflaran N. T›bbi genetik. ‹stanbul: Bas›m Nobel t›p kitabev -leri, 1999.

8. Barch MJ, Knutsen T, Spurbeck JL. The AGT cytogenetics la -boratory manual. 3rd ed. Washington: Lippincott-Raven, 1997.

9. Verma SM, Babu A. Human chromosomes manual of basictechniques. New York: Pergamon Press, 1989.

10. Lüleci G, Baflaran S, Ba€c› G, Keser ‹. Sitogenetik uygulamayöntemleri. Ankara: Meteksan, 1990.

11. Shaffer, LG, Tommerup, N. ISCN 2005: An international sys -tem for human cytogenetics nomenclature. Basel: Karger,2005.

12. Demirel S, Zamani AG. Mikronükleus tekni€i ve kullan›m alan -lar›. Genel T›p Derg 2002; 12: 123-7.

13. Karabacak H. Çeflitli kanser türlerinde aphidicolin ile uyar›l -m›fl fragile bölgelerin incelenmesi. [Y. Lisans Tezi]. Konya:Selçuk Üniversitesi, 2006.

14. Finnis M, Dayan S, Hobson L, et al. Common chromosomalfragile site FRA16D mutation in cancer cells. Hum Mol Genet2005; 14: 1341-9.

15. Smith DI, Zhu Y, McAvoy S, Kuhn R. Common fragile sites,extremely large genes, neural development and cancer. Can -cer Lett 2005; 323: 48-57.

16. Ferguson-Smith MA, Smith K. Cytogenetic analysis. In: Rimo -in DL, Connor JM, Pyeritz RE, Korf BR (eds). Emery and Ri -moin’s principles and practice of medical genetics. 4th ed.China: Elsevier, 2002: 690-722.

17. Alberts B, Bray D, Hopkin K, et al. Essential cell biology. 2nd

ed. Spain: Garland Science, 2004: 323-59.

18. Nussbaum LR, Malnnes RR, Willard HF, Boerkoel CF. Thomp -son and Thompson genetics in medicine. 6th ed. Philadelphi -a: WB Saunders, 2001.

19. Wegner RD. Diagnostic cytogenetics. Berlin: Springer-Verlag;1999.

2 0 . Trask BJ. Fluorescence in situ hybridisation:applications incytogenetics and gene mapping. Trends Genet 1991; 7 : 1 4 9 - 5 4 .

21. Schröck E, Du Manoir S, Veldman T, et al. Multicolor spec -tral karyotyping of human chromosomes. Science 1996; 273:494-7.

22. Lee C, Gisselson D, Jin C, et al. Limitations of chromosomeclassification by multicolor karyotyping. Am J Hum Genet2001; 68: 1043-7.

23. Speicher M, Barllard SG, Ward DC. Karyotyping human chro -mosomes by combinatorial multifluor FISH. Natur Genet 1996;12: 368-75.

2 4 . Tanke HJ, Wiegant J, van Gijlswijk RPM, et al. New strategyfor multi-colour fluorescence in situ hybridisation: COBRA: Com -bined Binary Ratio labelling. Eur J Hum Genet 1999; 7: 2 - 1 1 .

25. Müller S, Rocchi M, Ferguson-Smith MA, Wienberg J. Towarda multicolor chromosome bar code for the entire human kar -yotype by fluorescence in situ hybridization. Hum Genet 1997;100: 271-8.

26. Kallioniemi A, Kallioniemi O, Sudar D, et al. Comparative ge -nomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of so -lid tumors. Science 1992; 258: 818-21.

27. Özon YH. Komperatif genomik hibridizasyon tekni€inin prena -tal tan›da uygulanmas›[Doktora Tezi]. Eskiflehir: OsmangaziÜniversitesi, 2000.

28. Bryndorf H, Kirchoff M, Rose H, et al. Comparative genomichybridization in clinical cytogenetics. Am J Hum Genet 1995;57: 1211-20.

29. Zamani A, Zamani AG. Akci€er hastal›klar› geneti€i. Sendrom1999; 11: 104-9.

30. Zamani AG, Kutlu R, Durakbafl›-Dursun HG, et al. Y chromo -some microdeletions in Turkish infertile men. Ind J Hum Ge -net 2006; 12: 66-71.

31. Mullis KB. The unusual origin of polimerase chain reaction.Sci Am 1990; 262: 56-65.

32. Akar N. Klinik moleküler patolojiye girifl. Ankara: Ant›p AfiT›p Kitaplar› ve Bilimsel Yay›nlar, 1999.

33. Yürür Kutlay N, Tükün A. Akci€er hastal›klar›na moleküleryaklafl›m. ‹ç: Zamani A (editör). Gö€üs hastal›klar›nda tan›yöntemleri-II özel say›s›. Türkiye Klinikleri J Int Med Sci 2006;2: 81-8.

34. Solinas-Toldo S, Lampel S, Stilgenbauer S, et al. Matrix-ba -sed comparative genomic hybridisation: Biochips to screen forgenomic imbalances. Genes Chromosomes Cancer 1997; 20:399-407.

35. Pollack JR, Perou CM, Alizadeh AA, et al. Genom-wide analy -sis of DNA copy-number changes using cDNA microarrays. NatGenet 1999: 23; 41-6.

3 6 . Yurter HE. Gen ekspresyon analizinde microarray teknolojisininkullan›m›. DEÜ T›p Fakültesi Dergisi Özel Say›s›, 2 0 0 2: 4 1 - 7 .

37. Atabey N, Eresen Ç, Sak›zl› M. Psikiyatrik genetik araflt›rma -larda kullan›labilecek genetik yöntemler: IV-B. ‹nsan genomuprojesi ve psikiatri geneti€i. 3P Dergisi 2004: 12; 50-62.

161



Documents

Genetik Tan› Yöntemleri · hücreler, kistik higroma, fetus ya da yenido€an kan› gi-bi dokular›n hücreleridir. Genetik Tan› Yöntemleri Yrd. Doç. Dr. Ayﬂe Gül ZAMAN‹