Upload
hoangque
View
240
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Genetika Alzheimerovej choroby
Úvod
Alzheimerova choroba (AD), najčastejšia príčina demencie, je ireverzibilné, progresívne neurodegeneratívne ochorenie, charakteristické poklesom
vyšších kognitívnych funkcií. Je to geneticky heterogénne a multifaktoriálne ochorenie. Väčšinou sa klasifikuje na základe veku nástupu ochorenia na
formu so skorým nástupom do 65 roku života – presenilnú demenciu a na formu s neskorým začiatkom po roku 65 – senilnú demenciu. Taktiež sa
rozdeľuje na familiárnu a sporadickú formu. Menej ako 5% pacientov má formu so skorým začiatkom a familiárnym výskytom, 15% až 25% má formu
s neskorým nástupom a familiárnym výskytom a 75% má sporadickú formu s neskorým začiatkom. Prevalencia AD je okolo 4% u jedincov vo veku 65-74
rokov a narastá exponenciálne s vekom. Familiárna Alzheimerova choroba so skorým začiatkom (FAD) predstavuje monogénnu formu
s autozómovo dominantnou dedičnosťou a vysokou penetranciou závislou od veku. Doposiaľ boli popísané tri gény, ktorých mutácie vedú k FAD so
skorým začiatkom. Sú to gén pre amyloidový prekurzorový proteín (APP), lokalizovaný na chromozóme 21, presenilín 1(Psen1) lokalizovaný na
chromozóme 14 a presenilín 2 (Psen2) na chromozóme 1. Prevalencia týchto mutácií výrazne kolíše, asi 20% - 70% predstavujú mutácie v Psen 1, 10%
- 15% v géne APP a menej ako 5% v Psen 2. Mutácie v jednotlivých génoch vedú k odlišnému veku nástupu ochorenia: PS1 35-60 rokov, APP 40-65,
PS2 45-85. Zatiaľ čo FAD so skorým nástupom je daná mutáciami v už identifikovaných génoch, AD s neskorým nástupom, či už s familiárnym alebo
sporadickým výskytom, je podmienená multifaktoriálne. Predpokladá sa, že 40% až 50% tvoria genetické rizikové faktory. Väčšina foriem AD má
komplexný genetický základ daný jedným alebo viacerými nezávisle pôsobiacimi génmi s neúplnou penetranciou, mnohými interagujúcimi génmi alebo
kombináciou genetických faktorov a faktorov životného prostredia. V sporadickej aj familiárnej forme s neskorým nástupom AD hrá významnú úlohu
Apolipoproteínový E genotyp. ApoE sa vyskytuje v troch izoformách (E2, E3, E4) (obr. 1). Alela ε4 apolipoproteínu E sa považuje za hlavný rizikový
faktor. Najdôležitejšou patologickou abnormalitou pri AD je nahromadenie dvoch fibrilárnych proteínov v mozgu, ß-amyloidového peptidu (Aß)
a proteínu Tau. Aß peptid vzniká po úprave amyloidového prekurzorového proteínu a vytvára v extracelulárnych priestoroch mozgu amyloidové
a senilné plaky. Tau vytvára v neurónoch mozgu neurofibrilárne splete. Úprava a štiepenie APP sa uskutočňuje dvomi cestami: patologickou za vzniku
neurotoxického Aß o dĺžke 40-42 aminokyselín a nepatologickou za vzniku p3 fragmentu (obr. 2). Diagnostický prístup AD zahŕňa rodinnú anamnézu,
neurologické a psychologické vyšetrenia, zobrazovacie metódy a molekulovo-genetickú diagnostiku.
Zdravý
mozog
jazyk
pamäť
jazyk
pamäť
Pacient s Alzheimerovou
chorobou
Pacient s AlzheimerovouchorobouZdravý mozog
Ciele práce
• Určiť frekvenciu alely ε4 Apolipoproteínu E na kontrolnej vzorke zdravých jedincov
a v súbore pacientov so sporadickým a familiárnym výskytom Alzheiemerovej choroby.
• Štandardizácia molekulárno – genetických metód na detekciu mutácií v génoch APP,
Psen 1, Psen 2, Tau.
• Identifikácia mutácii v cieľových génoch u pacientov s familiárnym výskytom AD.
Nepatologická cesta Patologická cesta
ApoE izoformy
Signálny peptidLDL receptor viažuce miesto
Lipid viažuce miesto
Výsledky
Diskusia
Alzheimerova choroba vzhľadom na svoju vysokú prevalenciu a nezvratný priebeh predstavuje závažný medicínsky a socio -
ekonomický problém. Vzhľadom na celkové starnutie slovenskej populácie a v súvislosti s tým očakávaný nárast pacientov s
demenciou je orientácia na túto problematiku vysoko aktuálna. Hoci etiopatogenéza AD, napriek intenzívnemu výskumu, nie je
spoľahlivo objasnená, bežne sa akceptuje úloha genetických rizikových faktorov pri familiárnej aj sporadickej forme. Našla sa
priama asociácia medzi FAD a mutáciami v génoch pre amyloidový prekurzorový proteín, presenilín 1 a presenilín 2. Pri
sporadickej AD jednoznačne preukázané rizikové faktory sú vek a rodinná anamnéza a osobitné postavenie má genetický
rizikový determinant apolipoproteín E. Prítomnosť apoE alely ε4 zvyšuje riziko ochorenia 3x u heterozygotov a 15x
u homozygotov. ApoE alela ε4 znižuje vek nástupu ochorenia o 10 rokov. E4 sa viaže priamo na Aβ, efektívnejšie ako E2, E3 a
urýchľuje ukladanie Aβ a redukuje degradáciu Aβ. Na základe epidemiologických štúdií sa uvažuje aj o ďalších rizikových
faktoroch (pohlavie, vzdelanie, fajčenie, hypertenzia, srdcovo-cievne ochorenia). Doposiaľ je popísaných približne 25 rôznych
missense mutácií v 16. a 17. exóne APP génu (Alzheimer Disease Mutation Database - www.molgen.ua.ac.be/ADMutations).
Mutácie v APP selektívne zvyšujú produkciu Aβ. Nadprodukcia Aβ sa zdá byť ústredným patogenetickým mechanizmom AD.
Akumulácia Aβ vedie k tvorbe plakov, čo vyvolá mikrogliálnu aktiváciu, sekréciu cytokínov, čo vedie k tvorbe
vysokoreaktívnych kyslíkových substrátov (ROS- reactive oxygene substrate), čo navodzuje vznik oxidačného stresu
v mozgu. V dôsledku oxidačného stresu nastane porušenie membrány a smrť neurónov. V patologickom a neurotoxickom
efekte u pacientov s AD má dôležitú úlohu proteín Tau. V dôsledku oxidačného stresu u pacientov s AD nastáva
hyperfosforylácia Tau, čo znižuje jeho schopnosť viazať a stabilizovať mikrotubuly. Hyperfosforylovaný Tau sa zhlukuje a tvorí
neurofibrilárne splete, čo vedie k poruche axonálneho transportu a strate funkcií neurónu. Do dnešnej doby je popísaných 165
rôznych mutácií v psen 1 a 10 v psen 2. Predpokladá sa, že biologická funkcia presenilínov spočíva v γ sekretázovej aktivite pri
štiepení APP.
U pacienta sa identifikovala mutácia v géne pre amyloidový prekurzorový proteín: Val717Phe
(GTC→ TTC) (275341 G>T). Pacient je heterozygot pre mutáciu V717F v 17 exóne APP génu. Symbol
K znamená súčasnú prítomnosť G a T v tej istej polohe v analyzovanej nukleotidovej sekvencii. Poloha
mutácie v sekvencii je znázornená šípkou nad nukleotidom, ktorý podlieha substitúcii.
918272
48
34
Sekvenčná analýzaGenotypizácia ApoE.
Kontrolný súbor tvorilo 100 žien a 100 mužov bez podozrenia na AD. Súbor pacientov s AD
tvorilo 26 pacientov z I. Neurologickej kliniky LF UK a FNsP. Na diagnostiku AD sa použili
diagnostické kritériá podľa DSM-IV a NINCDS-ADRDA. Genotypy ApoE u pacientov s AD:
E3/E4-15, E3/E3- 6, E4/E4-4, E2/E2-1. Percentuálne zastúpenie apoE izoforiem je v tab. 1.
Izoforma
ApoE
AD
pacienti
Kontrolný
súbor (spolu)
Kontrolný
súbor (ženy)
Kontrolný
súbor (muži)
E3 51,9% 83% 85,5% 80,6%
E4 44,2% 9,9% 8% 11,7%
E2 3,9% 7,1% 6,5% 7,7%
Molekulárno – genetická diagnostika AD
•izolácia DNA z leukocytov periférnej krvi
• amplifikácia jednotlivých exónov kauzálnych génov pre AD: APP(e16, e17), Psen1
(12exónov), Psen2 (12 exónov), Tau (e9, e10, e11) pomocou PCR (Polymerase chain reaction)
• sekvenčné analýzy jednotlivých exónov génov
• určenie izoforiem apoE restrikčnou analýzou pomocou HhaI (PCR – RFLP)
NINCDS-ADRDA kritériá – National Institute of Neurological and Communicative disease and Stroke/Alzheimer´sDisease and Related Disorders Association (NINCDS-ADRDA ) Criteria For The Clinical Diagnosis of Alzheimer´s disease
Murrell J, Farlow M, Ghetti B, Benson MD. A mutation in the amyloid precursor protein associated with hereditary Alzheimer's disease. Science 254: 97-99, 1991 (PubMed ID: 1925564)
Tab .1:Percentuálne zastúpenie apoE izoforiem u pacientov s AD a v kontrolnom súbore.
Závery:
• V súbore pacientov s AD sa alela ε4 vyskytovala vo výrazne vyššej frekvencii (44,2%) v
porovnaní s kontrolným súborom (9,9%), čo súhlasí s údajmi popísanými v literatúre a
potvrdzuje, že alela ε4 je genetický rizikový determinant pri AD.
• Molekulárno – genetickou analýzou sme identifikovali mutáciu V717F v APP géne. Po
prvý krát bola popísaná Murell a kol. v roku 1991. Doposiaľ bola popísaná v troch
rodinách. Priemerný vek nástupu ochorenia je 41,2 roka. V rodine postihnutého plánujeme
uskutočniť genetickú analýzu génu aj u rodinných príslušníkov a určiť tak nosičov
patologickej mutácie v presymptomatickom štádiu, zostaviť rodokmeň a sledovať spôsob
dedičnosti.
• Sekvenčnými analýzami cieľových génov plánujeme zistiť zastúpenie mutácií v súbore
slovenských pacientov s FAD a porovnať výsledky s údajmi z ostatných krajín.
• V spolupráci s I. Neurologickou klinikou LF UK a FNsP Bratislava spracuvávame
zdravotnú dokumentáciu pacientov s AD, čím chceme zhodnotiť asociáciu rizikových
genetických a enviromentálnych faktorov s Alzheimerovou chorobou so sporadickým
a familiárnym výskytom.
Obr. 1: Izoformy apoE.
Obr. 2: Štiepenie APP.
Katarína Kolejáková, Robert Petrovič, *Stanislav Šútovský, Ján Chandoga, *Peter Turčáni
Centrum lekárskej genetiky FNsP Bratislava a Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky LF UK a FNsP Bratislava
* I. Neurologická klinika LF UK a FNsP Bratislava
E3/E3 E2/E4 E3/E3 E2/E3 E3/E4 E3/E3 E3/E3 E3/E3 E2/E3 E3/E3 E3/E3 E3/E3 E3/E4
Obr. 3: Možné genotypy ApoE, ktoré vzniknú restrikčnou
analýzou.Obr. 4: PCR-RFLP ApoE.
918272
4834
100 bp
50 bp
- dlhé obdobie bol cholesterol považovaný hlavne za štruktúrny komponent biomembrán
- dôležitá zložka myelínu
- negatívny faktor vo familiálnej hypercholesterolémií a ateroskleróze
- hlavná príčina srdcovo-cievnych ochorení
- pohľad na význam a úlohu cholesterolu sa rozšíril, keď bol v roku 1993 popísaný
SMITH-LEMLI-OPITZOV SYNDRÓM
SLOS je charakteristický množstvom klinických fenotypov
-pred objasnením biochemickej príčiny SLOS, väčšina autorov rozdeľovala SLOS do dvoch
kategórií na základe závažnosti a početnosti anomálií
-SLOS typu I bol charakteristický miernejším fenotypom
-SLOS typu II bol charakteristický vážnejším fenotypom. Vyznačoval sa ťažkými externými
a internými anomáliami vedúcimi k smrti
keďže medzi SLOS typu I a II je veľa medzistupňov, na hodnotenie fenotypu sa používa aj skóre
klinickej závažnosti. Na základe tohto skóre sa fenotyp SLOS pacientov delí do troch kategórií:
mierny fenotyp (<20), klasický fenotyp (25-50), ťažký fenotyp (>50)
-incidencia v Európe: 1:15 000 – 1:40 000
-incidencia v SR: 1:15 000 – 1:20 000
- frekvencia heterozygotov: 0,8% – 2%
Molekulárno-genetické aspekty
- ľudský DHCR7 gén je lokalizovaný: 11q12-13
DHCR7 gén: 14 100 bp, 9 exónov a 8 intrónov
- kódujúca oblasť: exón 3-9
-v danom géne bolo identifikovaných 121 mutácií
- proteín: 475 aminokyselín
SMITH-LEMLI-OPITZOV SYNDRÓM:
ochorenie, ktoré odhalilo význam cholesterolu
Úloha cholesterolu v embryogenéze
Mnohopočetné vrodené anomálie charakteristické pre SLOS, boli objasnené, keď sa zistilo, že
cholesterol hrá dôležitú úlohu v embryonálnom vývoji a morfogenéze
- úloha cholesterolu v modifikácií a regulácií Hedgehog proteínov
- Hh proteíny sú signálne molekuly esenciálne pre morfogenézu a embryogenézu
- kovalentná väzba cholesterolu je esenciálna časť autoprocesingu Sonic hedgehog
- Hh signálna dráha: aktivácia promótorov niektorých dôležitých génov, potrebných pre diferenciáciu tkanív
v embryonálnom vývoji
- Shh: vývoj predného mozgu a správny vývoj končatín
- Indian hedgehog a Desert hedgehog sú zodpovedné za správny vývoj genitálií a skeletu
- autozómovo recesívne, dedičné metabolické ochorenie
charakteristické širokým spektrom vrodených externých a interných anomálií:
- kraniofaciálne malformácie (mikrocefália, rázštep podnebia)
- anomálie skeletu, malformácie končatín (polydaktýlia, syndaktýlia 2-3 prstov na nohe)
- anomálie vnútorných orgánov
- anomálie genitálií
- poruchy CNS a mentálna retardácia
Pacientka s miernou formou SLOS. Klinické
príznaky: microcefália s bitemporálnym zúžením,
antevertované nostrily, rázštep uvuly, 2./3.
syndaktýlia na nohe, rastová a mentálna retardácia.
Tvár SLOS pacienta Syndaktýlia medzi druhým a tretím prstom na nohe, typická pre 90% pacientov so SLOS
Hypospádia semeníka
CIEĽ
Uskutočniť genotypovo – fenotypovú koreláciu a koreláciu biochemických
parametrov s fenotypom u pacientov so SLOS (diagnóza SLOS bola stanovená na
základe biochemickej a molekulárno – genetickej analýzy).
Stanovenie genotypovo - fenotypovej korelácie
rozdelenie mutácií na základe ich lokalizácie v proteíne a vplyvu na aktivitu proteínu:
nulové mutácie (0)
mutácie v 4. cytoplazmatickej slučke (4CS)
mutácie v transmembrán. doménach (TM)
mutácie v C-terminálnej doméne (CT)
genotypy pacientov: TM/TM, 0/TM, 0/4CS, 0/0
skóre závažnosti ochorenia: hodnotí sa rozsah anomálií mozgu, očí, úst, skeletu, srdca, pečene, obličiek, pľúc, GIT a genitálií (0, 1,2)
biochemické parametre: hodnoty 7-DHC, cholesterolu, stanovenie pomeru 7-DHC/cholesterol
Vyhodnotenie genotypovo - fenotypovej
korelácie
Skóre závažnosti: mierny fenotyp (<25), klasický fenotyp (25-50),
závažný fenotyp (>50)
Pomer 7-DHC/cholesterol: mierny fenotyp (<0,5), klasický fenotyp
(0,5-1), závažný fenotyp (>1)
Fenotypy pacientov so SLOS
ťažký klinický fenotyp: 0/0, 0/4CS
klasický klinický fenotyp: 0/TM
mierny klinický fenotyp: TM/TM
Tabuľka 1: Biochemické, klinické a molekulárne charakteristiky pacientov so SLOS.
Pacient Chol. (mmol/l)
enzým. met.
Chol. (mmol/l)
GC/MS
7-DHC
(mmol/l)
Pomer 7-DHC
a chol.
Skóre
závažnosti
Genotyp Klasifikácia
mutácií
Pacient 1 1,16 - prítomný - 58 W151X/L109P 0/TM
Pacient 2 2,06 0,40 0,28 0,7 25 L109P/L109P TM/TM
Pacient 3 1,8 0,47 0,88 1,8 44 V326L/W151X TM/0
Pacient 4 0,92 0,12 1,16 9,6 67 W151X/W151X 0/0
Pacient 5 1,15 0,91 0,83 0,9 50 W151X/W151X 0/0
Pacient 6 0,42 0,12 0,7 5,8 44 W151X/W151X 0/0
Pacient 7 2,13 1,05 0,21 0,2 31 V326L/V326L TM/TM
Pacient 8 1,13 0,34 0,45 1,3 50 V326L/ W151X TM/0
Pacient 9 1,98 1,91 1,19 0,6 42 V326L/W151X TM/0
Pacient 10 0,74 0,18 0,76 4,2 57 W151X/G410S 0/4CS
Pacient 11 1,47 1,32 0,43 0,3 25 V326L/V326L TM/TM
Pacient 12 1,53 - prítomný - 55 V326L/W151X TM/0
DISKUSIA
Smith-Lemli-Opitzov syndróm je autozómovo recesívne, dedičné metabolické ochorenie charakteristické širokým spektrom vrodených
anomálií, ktoré boli objasnené, keď sa zistilo, že cholesterol hrá dôležitú úlohu v embryonálnom vývoji a morfogenéze stavovcov.
SLOS je typický množstvom rôznych klinických fenotypov. Stanoviť presnú koreláciu medzi genotypom a fenotypom je zložité, pretože
je málo pacientov s kompletnými údajmi týkajúcimi sa mutácie, biochemických a klinických prejavov. Túto situáciu sťažuje široké
spektrum SLOS mutácií a fakt, že väčšina pacientov sú zložení heterozygoti. Genotypy pacientov so SLOS sme rozdelili podľa typu a
lokalizácie mutácií do kategórií: TM/TM, 0/TM a 0/0, 0/4CS. Sledovali sme vzťah medzi týmito kategóriami genotypov a skóre závažnosti
ochorenia. Pacienti s najťažším klinickým fenotypom boli homozygoti alebo zložení heterozygoti pre mutácie, ktoré vedú k výrazne
malej alebo žiadnej enzýmovej aktivite 7-DHCR (nulové mutácie) a mutácie v 4. cytoplazmatickej slučke (0/0, 0/4CS) a mali najvyššie
skóre klinickej závažnosti. Pacienti s genotypom 0/TM mali hodnoty skóre závažnosti v strednom intervale a zhodnotili sme, že majú
klasický fenotyp SLOS. Najnižšie hodnoty skóre závažnosti sme detekovali v kategórií TM/TM, teda ak boli obe mutácie lokalizované
v transmembránovej doméne a pacienti mali mierny fenotyp. Našla sa korelácia medzi závažnosťou fenotypu a nasledujúcim poradím
genotypov (od mierneho k ťažkému fenotypu): TM/CT < TM/TM < 0/TM < 4S/TM < 0/4S < 4S/4S <0/0 Sledovali sme aj vzťah medzi
kategóriami genotypov a pomerom 7-DHC/cholesterol. Pacienti s mutáciami TM/TM majú najnižšie hodnoty pomeru 7-DHC/cholesterol
a majú mierny fenotyp. Pacienti s mutáciami 0/TM majú hodnoty v strednom intervale a predpokladáme, že títo pacienti majú klasický
typ SLOS. Pacienti s dvomi nulovými mutáciami 0/0 a 0/4CS majú najvyššie hodnoty pomeru 7DHC/cholesterol a preto
predpokladáme, že majú najzávažnejší fenotyp.
Centrum lekárskej genetiky FNsP Bratislava a Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky LF UK a FNsP Bratislava
Katarína Kolejáková, Robert Petrovič, Mária Fischerová, Jozef Adámať, Danka Maceková, Ján Chandoga