Laporan Praktikum Genetika

ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

Widya Setyaningtyas*, Haniyya, I. Sobari, K.S. Juarna, N. Restiana, Nuruliawati, A. Nurfitriana, R. Arita

Universitas Indonesia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Departemen Biologi

Mei 2012

Abstrak

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) merupakan metode uji imunologi berdasarkan reaksi spesisfik

antara antigen dan amtibodi. ELISA digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen dan antibodi pada suatu sampel.

Prinsip kerja ELISA adalah reaksi spesifik antara antigen dan antibodi dengan menggunakan enzim sebagai penanda

reaksi. Antigen merupakan makromolekul yang dapat menginduksi pembentukan antibodi. Antibodi adalah protein yang

diproduksi oleh sistem imun akibat keberadaan antigen. Pemanfataan ELISA adalah untuk mengidentifikasi keberadaan

antigen dan antibodi, menghitung konsentrasi antigen dan antibodi, serta sebagai alat diagnostik suatu penyakit. Hasil

praktikum adalah didapatkan nilai kuantitatif dan kualitatif dari suatu sampel protein.

Kata kunci: ELISA; antigen; antibodi

1. Pendahuluan

Tujuan dilakukannya praktikum ELISA adalah

untuk memahami prinsip kerja ELISA, mengetahui

konsentrasi antigen atau antibodi dalam sampel. Selain

itu juga untuk menentukan suatu sampel negatif atau

positif mengidap suatu penyakit tertentu berdasarkan

teknik ELISA. Latar belakang dilakukannya praktikum

dengan menggunakan metode enzyme-linked

immunosorbent assay (ELISA) adalah untuk mendeteksi

keberadaan protein (Albala & Smith 2003: 132). ELISA

juga digunakan untuk menentukan keberadaan antigen

dan jumlah antigen dalam suatu sampel (Ausubel dkk.

2003: 1647).

Enzyme-linked immunosorbent assay

(ELISA) adalah metode untuk mendeteksi serta

menghitung konsentrasi antibodi atau antigen

sampel secara spesifik (Ravichandra 2010: 337).

Protein pada sampel yang telah dipisahkan

berdasarkan berat molekulnya dengan teknik

*) Kelompok 2A 1

SDS-PAGE, sulit untuk dipastikan jumlah relatif

protein tersebut. Teknik ELISA digunakan

untuk menghitung serta memastikan konsentrasi

dari protein dari suatu sampel (Miller 2006: 43).

Teknik ELISA didasarkan pada reaksi

spesifik antara antigen dengan antibodi yang

memiliki sensitivitas dan spesifitas tinggi

dengan menggunakan enzim sebagai indikator.

Prinsip dasar ELISA adalah analisis interaksi

antara antigen dan antibodi dengan

menggunakan enzim sebagai penanda reaksi

(Yusrini 2005: 16--17). Prinsip kerja ELISA

adalah adanya ikatan antara antigen dan antibodi

kompleks dengan penambahan substrat tertentu

dan enzim peroksida yang akan memberikan

perubahan warna pada hasil yang positif (Azwar

1985: 2).

ELISA memiliki 3 macam tipe yang

terdiri atas direct ELISA, indirect ELISA, dan

sandwich ELISA. Sandwich ELISA dapat

dibedakan menjadi 2 jenis yaitu direct sandwich

ELISA dan indirect sandwich ELISA (Ausubel

dkk. 2003: 1654). Direct ELISA merupakan

metode ELISA yang paling sederhana. Direct

ELISA digunakan untuk mengukur konsentrasi

antigen pada sampel. Direct ELISA mendeteksi

antigen dengan cara mengikat antigen dengan

antibodi yang telah dilabel dengan enzim.

Reaksi pengikatan tersebut terjadi secara

spesifik (Ausubel dkk. 2003: 1658). Direct

ELISA memerlukan antibodi yang khas untuk

antigen yang dideteksi. Kelemahan utama dari

direct ELISA adalah tidak fleksibel. Enzim yang

digunakan untuk amplifikasi reaksi diikatkan

secara kovalen pada antibodi yang langsung

berikatan dengan antigen (Akin 2006: 125).

Indirect ELISA banyak digunakan untuk mengukur

konsentrasi antibodi. Enzim diikatkan pada antibodi

sekunder yang berikatan dengan antibodi primer.

Antigen dan antibodi sekunder biasanya dibuat konstan

dan yang berubah adalah antibodi primer (Akin 2006:

126). Sandwich ELISA atau ELISA lapis ganda

dicirikan oleh antibodi penangkap antigen yang

diikatkan pada fase padat. Teknik tersebut terdiri dari

dua macam, yaitu direct sandwich ELISA dan indirect

sandwich ELISA. Antibodi penangkap pertama kali

diletakkan ke dalam wells kemudian antigen dari darah

atau urin ditambahkan ke dalam wells sehingga

berikatan dengan antibodi penangkap. Jika ke dalam

wells langsung ditambahkan antibodi detektor yang telah

dilabel enzim maka disebut dengan direct sandwich

ELISA, sedangkan apabila ditambahkan antibodi

detektor yang tanpa dilabel enzim terlebih dahulu

disebut dengan indirect sandwich ELISA (Berg 2002:

1).

Antigen merupakan substansi makromolekul

yang muncul dalam tubuh atau akibat introduksi dari

luar sehingga dapat menginisiasi reaksi imun. Respon

dari reaksi imun terhadap munculnya antigen adalah

memproduksi antibodi dalam jumlah yang efektif untuk

menghilangkan antigen dari tubuh (Ahluwalia 2009:

331). Antibodi adalah suatu protein dapat larut yang

dihasilkan sistem imun sebagai respon terhadap

keberadaan antigen (Sloane 1995: 256). Antigen

merupakan zat yang ada di dalam tubuh dan berasal dari

luar tubuh (sel asing) yang dapat memulai reaksi

kekebalan. Antigen ada pada permukaan sel darah merah

dan sel darah putih yang penting dalam sistem imun

tubuh (Ahluwalia 2009: 331). Antibodi berfungsi

2

mengikat antigen pada organisme penginvasi, dan

mencetuskan proses di mana organisme tersebut

kemudian menjadi tidak aktif atau dihancurkan.

Antibodi memberi tanda pada organisme asing tersebut

sehingga dapat dihancurkan oleh sel fagositik (Marks

dkk. 1996: 89).

Aplikasi dari ELISA salah satunya adalah

clinical laboratory. Uji clinical laboratory umumnya

digunakan untuk mendeteksi protein dari patogen, atau

“marker” yang mengindikasi adanya infeksi atau

penyakit. Aplikasi umum dari ELISA dalam uji infeksi

adalah identifikasi antibodi patogen spesifik dalam

serum (Walker & Rapley 2005: 419). Aplikasi dari

ELISA lainnya yaitu untuk mendeteksi infeksi virus HIV

(Nicholl 2008: 228).

2. Metodologi

Alat yang digunakan dalam praktikum ELISA

antara lain 96 well plate, multichannel pipet, tips, ELISA

reader, dan ELISA washer. Bahan yang digunakan pada

praktikum ELISA adalah washing buffer, blocking

buffer, antigen, 0.2 sampai 10 μg/ml antibodi

penangkap (antibodi monoklonal atau antibodi

poliklonal), 50 μL antibodi detektor yang telah dilabel

dengan enzim phosphatase dan 75 μL substrat

chromogenic. Substrat chromogenic dapat berupa 4-

methylumbelliferyl phosphate (MUP) atau p-nitrophenyl

phosphate (NPP).

Cara kerja pada praktikum ELISA adalah

pertama wells ELISA (96 polystryrene well plate)

dilapisi dengan antibodi penangkap, dan diinkubasi

selama satu malam. Kedua, blocking buffer dimasukkan

ke dalam wells kemudian antigen juga dimasukkan ke

dalam wells tersebut. Ketiga, antibodi detektor yang

telah tertaut enzim HRP (Horse Radish Peroxides)

dimasukkan ke dalam wells. Keempat, yaitu proses

pencucian (washing). Kelima, chromogenic substrate

TMB (3,3’,5,5’ tetramethylbenzidine) dimasukkan,

sehingga substrat teroksidasi menjadi hidrogen

peroksida yang berwarna biru. Keenam, asam H2SO4

ditambahkan ke dalam wells agar reaksi enzimatik

berhenti sehingga berubah warna menjadi kuning.

Ketujuh, optical density (OD) diukur dengan ELISA

reader, sehingga didapatkan konsentrasi antigen atau

antibodi.

3. Hasil dan Pembahasan

Pemberian blocking buffer berfungsi

untuk menjaga pH dan menghindari ikatan

antibodi dengan antigen yang tidak spesifik

(Walker 2002: 1086). Washing buffer adalah

larutan buffer yang berfungsi untuk

menghilangkan antigen dan antibodi yang tidak

berikatan. Larutan yang dapat menjadi washing

buffer antara lain tris-buffered saline (TBS) atau

phosphate buffer saline (PBS). Antibodi

monoklonal atau poliklonal dapat digunakan

sebagai antibodi penangkap pada tipe sandwich

ELISA. Antibodi monoklonal mempunyai

monospesifitas yang memungkinkan hasil

deteksi yang baik dan perbedaaan kuantitas yang

kecil pada konsentrasi antigen. Antibodi

poliklonal digunakan untuk menarik sebanyak

mungkin antigen (Noonan 2012: 1). Inkubasi

dilakukan agar antibodi dan antigen dapat saling

berikatan dengan sempurna. Penambahan asam

H2SO4 bertujuan untuk menghentikan reaksi

3

enzimatis (Ausubel dkk. 2003: 1661). Pemberian

chromogenic substrate TMB akan

menyebabkan substrat terwarnai sehingga

mengekspresikan besarnya nilai OD (Walker

2002: 1087).

Pengamatan hasil ELISA dilakukan

secara kuantitatif maupun kualitatif. Hasil

ELISA secara kuantitatif dapat diamati dari nilai

optical density (OD) yang diukur dengan

menggunakan ELISA reader (Miller 2006: 7).

Hasil kuantitatif adalah data ELISA dapat

diinterpretasikan dalam perbandingan dengan

kurva standar (purifikasi antigen) agar dapat

secara tepat digunakan untuk menghitung

konsentrasi antigen dalam berbagai sampel

(Sylvest 2010: 1). Hasil ELISA secara kualitatif

dapat diamati dengan adanya perubahan warna

menjadi kuning pada reaksi pengujian jika

sampel yang diuji mengandung virus. Semakin

tinggi intensitas warna yang terbentuk, maka

semakin tinggi pula konsentrasi virus pada

sampel tersebut (Miller 2006: 8). Semi-

kuantitatif adalah data ELISA dapat digunakan

untuk membandingkan tingkat relatif dari

antigen di dalam sampel uji karena intensitas

sinyal akan bervariasi secara langsung terhadap

konsentrasi antigen. Data ELISA biasanya

digambarkan dengan nilai optical density (OD)

dan konsentrasi log untuk menghasilkan kurva

sigmodial. Hal ini dapat dilakukan dengan

menggambar grafik langsung atau dengan

software curve fitting yang biasanya ada pada

ELISA reader (Sylvest 2010: 2).

Persamaan linear dari kurva standar pada

lampiran soal adalah y = 0,0019x + 0,0457.

Nilai sampel rasio didapatkan dari perhitungan

nilai OD sampel dibagi dengan nilai OD cut off

(nilai minimum sampel dikatakan positif) yaitu

sebesar 0.2. Kriteria sampel negatif apabila nilai

sampel rasio ¿ 0.5. Kriteria sampel positif

apabila nilai sampel rasio ≥ 0.5. Sampel rasio

dengan OD value 0,050 adalah 0,25, sehingga

sampel dinyatakan negatif menderita penyakit

demam berdarah. Sampel dengan OD value

0,0487 bernilai 0,2435, sampel dinyatakan

negatif menderita penyakit demam berdarah.

Sampel terakhir memiliki OD value 1,563 yang

bernilai 7,815 dinyatakan positif menderita

demam berdarah.

4. Kesimpulan

Prinsip kerja ELISA didasarkan pada reaksi

antara antigen dan antibodi secara spesifik, dengan

menggunakan enzim sebagai penanda reaksi.

Konsentrasi antigen dalam suatu sampel dapat diketahui

dengan menggunakan kurva standar dan perhitungan

persamaan linear. Untuk menentukan sampel negatif

atau positif menderita suatu penyakit tertentu

berdasarkan teknik ELISA yaitu dengan cara

membandingkan nilai sampel rasio dengan kiteria

masing-masing sampel positif dan negatif. Sampel

dengan rasio yang bernilai kurang dari 0,5 bernilai

negatif, sedangkan sampel yang bernilai positif memiliki

nilai minimal 0,5.

Daftar Pustaka

4

Ahluwalia, K. B. 2009. Genetics. 2nd ed. New Age

International Ltd., New Delhi: xvi + 444 hlm.

Akin, H. M. 2006. Virologi tumbuhan. Kanisius,

Yogyakarta: 191 hlm.

Albala, J. S. & I. H. Smith. 2003. Protein Arrays,

Biochips, and Proteomics: The next phase of

genomic discovery. Marcel dekker, Inc., USA: xiv

+ 407 hlm.

Ausubel, F.M., R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore,

J.G. Seidman, J.A. Smith & K. Struhl. 2003.

Current Protocols in Molecular Biology. John

Wiley & Sons, Inc., USA: xii + 4384 hlm.

Azwar, I. G. M. 1985. Kemungkinan Penggunaan

Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Dalam Diagnosa Serologis Brucellosis: 10 hlm.

http://repository.ipb.ac.id/bitstream/handle/12345

6789/39637/B85igm_abstract.pdf?sequence=2. 19

Mei 2012, pk. 17.04.

Berg, J. M. 2002. Indirect ELISA and Sandwich ELISA:

1 hlm.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22420/

20 Mei 2012 15.40.

Marks, D. B., A. D. Marks & C. M. Smith. 1996. Basic

medical biochemistry: a clinical approach. Terj.

dari Biokimia kedokteran dasar: sebuah

pendekatan klinis oleh B.U. Pendit. EGC,

Jakarta: ix + 770 hlm.

Miller, D. C. 2006. Mechanism(s) of enhanced vascular

cell response to polymeric biomaterials with

nano-structured surface features. ProQuest

Information and Learning Company, Ann

Arbor: 84 hlm.

Nicholl, D.S.T. 2008. An Introduction to Genetic

Engineering, 3rd ed. Cambridge University Press,

London: xii + 302 hlm.

Noonan, M. 2012. Overview of ELISA: 1 hlm.

http://www.piercenet.com/browse.cfm?

fldID=F88ADEC9-1B43-4585-922E-

836FE09D8403 20 Mei 2012 19.21.

Ravichandra, N. G. 2010. Methods and techniques in

plant nematology. PHI Learning Private

Limited, New Delhi: 616 hlm.

Sloane, E. 1995. Anatomi dan fisiologi untuk pemula.

Terj. dari Anatomy and physiology: an easy

learner oleh James Veldman. EGC, Jakarta: x +

389 hlm.

Sylvest, L. 2010. An Introduction to ELISA: 1 hlm.

http://www.abdserotec.com/resources/elisa-

technical-resources-and-troubleshooting/an-

introduction-to-elisa.html 19Mei 2012 20.43.

Walker, J. M. & R. Rapley. 2005. Medical biomethods

handbook. Humana Press Inc., New Jersey: 644

hlm.

Walker, J. M. 2002. The protein protocols handbook.

2nd ed. Humana Press Inc., New Jersey: 1146

hlm.

Yusrini, H. 2005. Teknik analisis kandungan aflatoksin

B1 secara elisa pada pakan 20 hlm.

http://pustaka.litbang.deptan.go.id/publikasi/bt1

01055.pdf, 19Mei 2012. Pk. 08.15.

Sylvest, L. 2010. An Introduction to ELISA: 1 hlm.

http://www.abdserotec.com/resources/elisa-

technical-resources-and-troubleshooting/an-

introduction-to-elisa.html 20 Mei 2012 pk 20.43.

5

LAMPIRAN

1. Tugas Latihan saat Praktikum ELISA

Tabel data:

Konsentrasi NS1

(pg/ml)OD value

0 0.075

7.8 0.127

15.6 0.173

31.2 0.274

62.5 0.489

125 0.846

250 1.594

500 2.831

1. Kurva standar dan persamaan linearnya

6

0 100 200 300 400 500 6000

0.5

1

1.5

2

2.5

3f(x) = 0.00555343498370069 x + 0.112429644083819R² = 0.997303579710157

Kurva Standar

Series2Linear (Series2)

Konsentrasi NS1

OD

Val

ue

2. Konsentrasi antigen NS1 pada sampel yang diketahui memiliki OD value 0,785

Dik. y = 0,785

y = 0,0056x + 0,1124

0,785 = 0,0056x + 0,1124

0,785 - 0,1124 = 0,0056x

0,6726 = 0,0056x

x = 0,67260,0056 = 120, 107 pg/ml

3. Sample ratio

ODvalue sampel = 0,785

ODvalue cut off = 0,2

Kriteria sampel negatif : sample ratio < 0,5

Kriteria sampel positif : sample ratio ≥ 0,5

Jawab:

Sample ratio = ODvalue sampelODvalue cut off

= 0,7850,2

= 3,925 > 0,5

Sampel dinyatakan positif.

7

2. Tugas Latihan untuk Laporan

Tabel data:

Konsentrasi NS1

(pg/ml)OD value

0 0.067

7.8 0.094

15.6 0.092

31.2 0.100

62.5 0.124

125 0.235

250 0.546

500 1.013

1. Kurva standar dan persamaan linearnya

8

0 100 200 300 400 500 6000

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

f(x) = 0.00192024216781044 x + 0.0457409681644081R² = 0.991512031026666

Kurva Standar

Series2

Linear (Series2)

Konsentrasi Anti-NS1 (pg/ml)

OD

Val

ue

2. Konsentrasi antigen NS1 pada sampel yang diketahui memiliki ODvalue:

a. 0,050

y = 0,0019x + 0,0457

0,050 = 0,0019x + 0,0457

0,050 - 0,0457 = 0,0019x

0,0043 = 0,0019x

x = 0,00430,0019 = 2,26 pg/ml

b. 0,487

y = 0,0019x + 0,0457

0,487 = 0,0019x + 0,0457

0,487 - 0,0457 = 0,0019x

0,4413 = 0,0019x

x = 0,44130,0019 = 232,26 pg/ml

c. 1,563

y = 0,0019x + 0,0457

1,563 = 0,0019x + 0,0457

1,563 - 0,0457 = 0,0019x

1,5173 = 0,0019x

x = 1,51730,0019 = 798, 57 pg/ml

9

3. Sample ratio

ODvalue cut off = 0,2

Kriteria sampel negatif : sample ratio < 0,5

Kriteria sampel positif : sample ratio ≥ 0,5

a. ODvalue sampel = 0,050

Sample ratio = ODvalue sampelODvalue cut off

= 0,0500,2

= 0,25 < 0,5

Sampel yang dihasilkan bernilai negatif menderita demam berdarah.

b. ODvalue sampel = 0,0487

Sample ratio = ODvalue sampelODvalue cut off

= 0,04870,2

= 0,2435 < 0,5

Sampel yang dihasilkan bernilai negatif menderita demam berdarah.

c. ODvalue sampel = 1,563

Sample ratio = ODvalue sampelODvalue cut off

= 1,5630,2

= 7,815 > 0,5

Sampel yang dihasilkan bernilai positif menderita demam berdarah.

10