Genetikai és epidemiológiai vizsgálatok

cisztás fibrózisban,

21-hidroxiláz defektus okozta congenitalis adrenalis hyperplasiában

és a natriuretikus hormonok génexpressziójában

Írta: Dr. Garami Miklós

Témavezeto: Dr. Fekete György

Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekgyógyászati Klinika

Budapest, 2004.

Semmelweis Egyetem Doktori Iskola

„Molekuláris orvostudományok:

A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai”

címu Ph.D. program keretében

Szigorlati bizottság:

Elnök: Dr. Horváth Attila, tanszékvezeto egyetemi tanár, MTA doktora Semmelweis Egyetem Bor- és Nemikórtani Klinika

Tagok: Dr. Szalai Csaba, tudományos munkatárs, Ph.D. Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet

Dr. Marcsek Zoltán, osztályvezeto, Ph.D. Fodor József Országos Közegészségügyi Központ

Opponensek:

Dr. Rácz Károly, egyetemi tanár, MTA doktora Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika

Dr. Váradi András, tudományos tanácsadó, MTA doktora MTA Szegedi Biológiai Központ Enzimológiai Intézet

1

GENETIKAI ÉS EPIDEMIOLÓGIAI VIZSGÁLATOK

CISZTÁS FIBRÓZISBAN,

21-HIDROXILÁZ DEFEKTUS OKOZTA

CONGENITALIS ADRENALIS HYPERPLASIÁBAN

ÉS A NATRIURETIKUS HORMONOK

GÉNEXPRESSZIÓJÁBAN

Doktori (Ph.D.) dolgozat

Dr. Garami Miklós

Témavezeto: Dr. Fekete György

Semmelweis Egyetem

2004.

2

TARTALOMJEGYZÉK

RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK 6.

FOGALMI MEGHATÁROZÁSOK 8.

EGY BETUS ÉS HÁROM BETUS AMINOSAV-SZIMBÓLUMOK 10.

BEVEZETÉS 15.

CÉLKITUZÉSEK 19.

IRODALMI HÁTTÉR 18.

I. CISZTÁS FIBRÓZIS 18.

A cisztás fibrózis jelentosége – epidemiológia 18.

Klinikai tünetek 19.

Diagnosztikai módszerek 20.

CF diagnózisának feltételei 24.

CFTR-gén 25.

CFTR felépítése és szerepe egészséges szervezetben 26.

CFTR gén mutációinak osztályozása 27.

Genetikai és klinikai heterogenitás, a rendszerezés és prognózis megalkotásának szükségessége 28.

II. 21-HIDROXILÁZ DEFEKTUS OKOZTA

CONGENITALIS ADRENALIS HYPERPLASIA 30.

Congenitalis adrenalis hyperplasia jelentosége - epidemiológia 30.

CAH regiszter 32.

Prenatalis vizsgálatok 32.

21-hidroxiláz locus 34.

Genetikai és klinikai heterogenitás , a rendszerezés és prognózis megalkotásának szükségessége 35.

3

III. NATRIURETIKUS HORMONOK (hANP, hBNP) 38.

Pitvari natriuretikus hormon felfedezése – történelmi visszatekintés 38.

A natriuretikus hormon család 38.

Az ANP kémiai szerkezete 39.

Az ANP fiziológiája 41.

Az ANP regulációja 42.

A plazma ANP koncentrációja 43.

Natriuretikus peptidek génexpressziójának szövetspecifikus szabályozása 43.

Natriuretikus peptidek jelentosége cardiomyopathiában 44.

MÓDSZEREK 47.

I. CISZTÁS FIBRÓZIS KLINIKAI ÉS GENETIKAI ADATAINAK VIZSGÁLATA 47.

Cisztás Fibrózis Regiszter 47.

Beteganyag 48.

Statisztikai analízis 51.

A genotípus-meghatározás módszertana 51.

II. 21-HIDROXILÁZ DEFEKTUS VIZSGÁLATÁNAK MÓDSZERTANA 55.

Beteganyag 55.

DNS mintavétel 55.

PCR amplifikáció 55.

III. EMBERI NATRIURETIKUS HORMONOK GÉNEXPRESSZIÓJÁT BEFOLYÁSOLÓ

TÉNYEZOK VIZSGÁLATÁNAK MÓDSZERTANA 56.

Plazmid konstrukciók 56.

Sejt preparáció, transzfekció 56.

Gél shift, DNA – fehérje footprint, Northern blot analízis, szekvenálás és radioimmunoassay (RIA) 57.

Mechanikus stressz 57.

Beteganyag 57.

4

EREDMÉNYEK 59.

I. A cisztás fibrózis (CF) megbetegedésnek a klinikai gyakorlatban is hasznosítható, feltételezett klinikai és genetikai összefüggéseivel kapcsolatos megállapítások 59.

II. A congenitalis adrenalis hyperplasiát (CAH) okozó 21-(szteroid) -hidroxiláz enzim defektusnak a klinikai gyakorlatban is hasznosítható, klinikai és genetikai összefüggéseivel (genotípus vs. fenotípus elemzés) kapcsolatos megállapítások 61.

III. Emberi natriuretikus hormonok génexpresszióját befolyásoló mechanizmusokkal kapcsolatos megállapítások 63.

MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK 65.

I. CISZTÁS FIBRÓZIS MEGBETEGEDÉS GENOTÍPUS – FENOTÍPUS ELEMZÉSE 65.

Magyarországi CF-es populáció genotípusának jellemzése (mutációs spektrum) 65.

Magyarországi CF-es populáció klinikai adatainak elemzése a genotípus tükrében 68.

II. 21-OHD DEFEKTUS OKOZTA CAH GENOTÍPUS – FENOTÍPUS ELEMZÉSE 71.

Magyarországi 21-OHD-os populáció genotípusának jellemzése (mutációs spektrum) 75.

III. NATRIURETIKUS HORMONOK GÉNEXPRESSZÓJÁT BEFOLYÁSOLÓ

TÉNYEZOKKEL KAPCSOLATOS EREDMÉNYEK ELEMZÉSE 73. ANP génexpresszióját befolyásoló hemodinamikai változások 73.

BNP génexpresszióját befolyásoló hemodinamikai változások 73.

ANP gén transzkripciós regulációja 77.

BNP gén transzkripciós regulációja 77.

AZ ÉRTEKEZÉSBEN SZEREPLO VIZSGÁLATOKBAN EGYÜTTMUKÖDO NEMZETKÖZI INTÉZMÉNYEK 80.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 81.

5

AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN KÉSZÜLT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK 82.

1. TUDOMÁNYOS CIKKEK (KÖZLEMÉNYEK : I. – IX.) 82.

2. IDÉZHETO ELOADÁS-KIVONATOK (ABSZTRAKTOK) (KÖZLEMÉNY: X.) 84.

3. ISMERETTERJESZTO CIKK 86.

4. TUDOMÁNYOS KÖNYVFEJEZET 86.

5. ELSO SZERZOS TUDOMÁNYOS ELOADÁSOK 87.

AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉHEZ SZOROSAN KAPCSOLÓDÓ EGYÉB SZAKMASPECIFIKUS ALKOTÁSOK (közlemény: XI.) 93. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉHEZ SZOROSAN NEM KAPCSOLÓDÓ EGYÉB SAJÁT KÖZLEMÉNYEK 94.

1. TUDOMÁNYOS CIKKEK 94.

2. ISMERETTERJESZTO CIKKEK 96.

3. TUDOMÁNYOS KÖNYVFEJEZETEK 96.

4. IDÉZHETO ELOADÁS-KIVONATOK (ABSZTRAKTOK) 96.

IRODALOMJEGYZÉK 101.

ÖSSZEFOGLALÓ 131.

ABSTRACT 132.

6

RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK

21-OHD: 21-hidroxiláz enzimdefektus

ABC-transzporterek: ATP Binding Cassette

AGS: adrenogenitális szindróma

ANP: pitvari natriuretikus hormon (atrial natriuretic peptide)

AR: autoszomalis recesszív öröklodés menet

ASA: allél-specifikus amplifikáció

BNP: agyi natriuretikus hormon (Brain Natriuretic Peptide)

CAH: congenitalis adrenalis hyperplasia

CAT: kloramfenikol-acetiltranszferáz

(Chloramphenicol Acetyltransferase)

CBAVD: veleszületett, kétoldali vas deferens hiánya

(Congenital Bilateral Absence of the Vas Deferens)

CF: cisztás fibrózis

CFTR-gén: cisztás fibrózis transzmembrán regulátor gén

(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator gene)

CVS: chorionboholy-mintavétel (Chorionic Villus Sampling)

CYP21: 21-hidroxiláz enzim génje

CYP21P: 21-hidroxiláz enzim pszeudogénje

DIOS: disztális bélszakasz obstrukciója okozta szindróma

(Distal Intestinal Obstruction Syndrome)

FEV1 : eroltetett kilégzés térfogata (Forced Exspiratory Volume)

FRC: funkcionális reziduális kapacitás (Functional Residual Capacity)

HGP: Emberi Genom Kutatási Program (Human Genom Project)

JNK: c-Jun N-terminal kináz (c-Jun N-terminal Kinase)

LO: késoi forma (Late Onset)

MAPK: mitogén-aktivált fehérje kináz (Mitogen-Activated Protein Kinase)

NC: nem klasszikus (Non-Classic)

ORCC: Outward Rectifying Chloride Channel

7

PCR: polimeráz- láncreakció (Polimerase Chain Reaction)

RV: reziduális térfogat (Residual Volume)

SNP: egypontos nukleotid polimorfizmus

(Single Nucleotide Polymorphism)

SV: szimpla virilizáció (Simple Virilizing)

SW: sóveszto (Salt-Wasting)

TLC: totálkapacitás (Total Lung Capacity)

VC: vitálkapacitás (Vital Capacity)

8

FOGALMI MEGHATÁROZÁSOK

Aktivátor: többnyire fehérjetermészetu faktor, amely a promóteren vagy annak

közelében kapcsolódva serkenti az átírást.

Cisz-hatás: ugyanazon a DNS molekulán (kromoszómán) található szekvenciák

(pl. promóterek) által kiváltott transzkripciót befolyásoló hatás.

Downstream (szekvencia): gén leolvasási irányában a kezdopont (origo) „alatti”

(„folyásirányban lévo”, „völgymene ti”).

Enhancer (serkento) szekvencia: eukarióta DNS-en található szekvenciák, amelyek

felpörgethetik (gyorsíthatják, upregulate) a szomszédos, illetoleg a

mindkét irányban távolabb fekvo gének átírását.

Exon: eukarióta DNS-szakasz, melybol végül funkcioná lis mRNS keletkezik.

Folyásirányban lévo: lásd downstreem

Hegymeneti (upstream): gén leolvasásának kezdopontja (origo, nulla pont) felett,

”folyásiránnyal szemben” elhelyezkedo, negatív számokkal jelzett

nukleotid szekvencia.

Hegymeneti elemek: promóter-mag felett található szekvenciák, melyek specifikus

fehérjék megkötése révén modulálják a transzkripciót.

Intron: eukarióta génnek azok a szakaszai, amelyek a keletkezett RNS-bol az

átírás után kivágódnak, nem jutnak ki a sejtmagból.

Konszenzus-szekvencia: számos gén összehasonlító vizsgálata alapján kialakított

egyezményes (konszenzusos) nukleotid-szekvencia, melyben az adott

helyen leggyakrabban talált nukeotid jele szerepel.

9

Negatív szabályozás: transzkripció gátlása represszorok révén.

Plazmid: kettos szálu, többnyire körkörös és viszonylag kicsi DNS molekula,

amely a baktérium-kromoszómát (genofor) kiegészíto géneket hordoz.

A plazmidokat a molekuláris genetikában általánosan használják gének

klónozására.

Pozitív szabályozás: amikor egy gén átírási üteme megno egy aktivátor (többnyire

fehérje molekula) hatására.

Promóter: transzkripció kezdete szempontjából kulcsfontosságú DNS szakasz,

amely „hegymenetben” többnyire közvetlenül a gén origo pontja felett

található.

Represszor: gén átírását megakadályozó, a promóter (operátor) szakaszához

kapcsolódó fehérjefaktor.

Transz-hatás: olyan faktorok hatása, amelyek nem az adott génrol származnak. A

transzkripciós faktorok pl. transz-hatású faktorok.

Transzkripciós faktorok: általában fehérje-jellegu molekulák, amelyekre a

transzkripció megkezdéséhez van szükség és amelyek nem integráns

részei az RNSpol molekulának, de befolyásolják annak muködését.

10

EGY BETUS ÉS HÁROM BETUS AMINOSAV-SZIMBÓLUMOK

A Ala - alanin

C Cys - cisztein

D Asp - aszparginsav

E Glu - glutaminsav

F Phe - fenilalanin

G Gly - glicin

H His - hisztidin

I Ile - izoleucin

K Lys - lizin

L Leu - leucin

M Met - metionin

N Asn - aszparagin

P Pro - prolin

Q Gln - glutamin

R Arg - arginin

S Ser - szerin

T Thr - treonin

V Val - valin

W Trp - triptofán

X xxx - ismeretlen, egyéb (stop kodon is)

11

BEVEZETÉS

A Human Genom Project (HGP, Emberi Genom Kutatási Program) a

természettudomány eddigi legnagyobb vállalkozása. 1989-ben kezdodött, és 2001

februárjában jelentették be elso szakaszának befejezését (Nature, 409(6822): 813-958,

2001; Science, 291(5507): 1145-1434, 2001). Sokak szerint ez az emberi megismerés

egyik legnagyobb vívmánya, aminek bejelentése egyedülálló szakaszhatár a tudomány

történetében. A program végso célja, hogy az emberi kromoszómákon levo kb. 30-40

ezer gén (a korábban jósolt kb. 120000 -150 000 helyett [157, 245]) pontos helyzetét

meghatározzák - és esetleg a teljes emberi DNS génszekvenciát is meghatározzák, amely

kb. 3x109 bázispárból (bp) áll. Korábban az emberi géneknek kb. két százalékát

lokalizálták és viszonylag kisszámú - kb. 400 - genetikai betegséget tudtak visszavezetni

hibás génekre. A Human Genom Project keretében létrejött egy olyan térkép, amely a

fobb (gén-) határjelek helyzetét ábrázolja (draft sequence). További cél feltárni az egyes

génekhez tartozó bázisszekvenciákat. Esetleg a kromoszómák teljes DNS-szekvenciája is

meghatározható lesz, beleértve azt a 90 százalékot is, amely nem vesz részt gének

alkotásában.

Mivel a fenti kutatás eredménye szabadon hozzá férheto és közvetlenül (on- line) elérheto

központi adatbázisokból (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/;

http://www.gene.ucl.ac.uk/hugo/; http://www.hgmp.mrc.ac.uk/;

http://www.sanger.ac.uk/HGP/), ezért ma már számos, ismert genetikai eltérés talaján

kialakult betegség esetében lehetoség van a betegségért felelos génszakasz

szekvenálására, ismert, ill. új mutációk azonosítása céljából.

Jelenleg még nem állnak rendelkezésünkre olyan bioinformatikai módszerek,

amelyek lehetové tennék a gének közötti kapcsolatok, a génexpresszió

programjának predikcióját pusztán a genomszekvencia számítógépes elemzése

alapján. Ma már nagy teljesítoképességu módszerek (pl. DNS-chip technikák)

segítségével követni lehet, hogy egy élettani állapotváltozás hogyan hat az egyes gének

kifejezodésére, az egyes gének kifejezodésének vá ltozása milyen program szerint

történik. Ezekkel a módszerekkel fontos információt nyerhetünk arra vonatkozóan, hogy

12

melyek azok a gének, amelyek szerephez jutnak egy adott élettani folyamatban. A

funkcionális genomika és a bioinformatika egyik legizgalmasabb feladata a gének

expresszióját szabályozó régiók szisztematikus azonosítása, muködésük

törvényszeruségeinek tisztázása, hogy a jövoben a genomszekvencia számítógépes

elemzésével lehessen megjósolni a gének kapcsolathálózatait.

A klinikai genetikai tanácsadás szempontjából az egyik legnehezebb problémát

az autoszomalis recesszív (AR) öröklodésmenetu betegségek jelentik (a szülok

általában egészségesek; a testvérek között a betegek aránya 25%). A klasszikus mendeli

öröklodés szabályai szerint autoszomá lis recesszív génmutációk csak homozigóta

egyénekben okoznak tüneteket. Tudjuk ma már, hogy néhány gén recesszív hibája

fenotípusbeli eltérést okoz akkor is, ha csak az egyik lókuszon van jelen. A

recesszív öröklodésu monogénes betegségeket okozó mutációk heterozigóta

formában sem „ártalmatlanok”, és/vagy fokozott betegséghajlamot jelentenek, vagy

olyan jelleget, ami meghaladja a populációs variancia normális határait. Ez egyúttal

jelentosen kibovíti azok körét, akik egy gén hibája következtében betegségi tünetet

mutatnak.

Értekezésemben két monogénes, autoszomalis recesszív (AR) öröklodésmenetu

betegség, a rendkívül gyakori (1:2500 újszülött) cisztás fibrózis (CF) és a súlyos

fejlodési rendellenességgel járó congenitalis adrenalis hyperplasia (CAH) molekuláris

genetikai vizsgálatát mutatom be a korábban is alkalmazott klasszikus (restrikciós

fragment analízis, PCR amplifikáció stb.) módszereken túl felhasználva a Human Genom

Program eredményein alapuló szekvenálási módszereket is (direkt DNS szekvenálás;

bázis eltérésen alapuló összehasonlító DNS elemzés, SNP: single nucleotide

polymorphism).

Az értekezésben bemutatásra kerülo módszerek mindkét betegségcsoportban lehetové

teszik a prenatalis szurés elvégzését. Lehetoséget teremtve a családoknak, hogy az

idoben elkezdett terápiával egészséges gyermeket hozzanak a világra.

13

Értekezésem további tárgya az ugyancsak kóros sejtmuködéssel járó állapotokban

a natriuretikus hormonok (ANP, BNP) szekréció, ill. génexpresszió eltéréseinek

elemzése, amelyet endogén és iatrogén cardiomyopathia vonatkozásában vizsgáltunk. Az

emberi natriuretikus hormonok termelodését meghatározó patofiziológiai tényezok, ill. a

hormonokat kódoló génszakaszok szabályozásának megismerése közvetlen, a

betegellátás területén is alkalmazható eredményt hozhat. Ennek jelentoségét az alábbi két

szempont figyelembevételével szeretném bemutatni:

1. A cisztás fibrózisos megbetegedések klinikailag súlyosabb formáiban a tüdoben

fennálló krónikus gyulladás talaján a kiserek számának csökkenése és

periarteriolaris fibrózis alakul ki. Ennek következtében megnövekszik az artéria

pulmonálisban uralkodó nyomás, no a jobb szívfél terhelése (megnövekedett

afterload). Kompenzatórikusan a jobb szívfél hipertrófiája alakul ki, ami secunder

dilatatív cardiomyopathiát is okozhat. A kezdeti élet minoségét befolyásoló

tényezon túl, a folyamat elorehaladtával életet veszélyezteto faktorrá is

válhat.

2. Az anthracyclinek a gyermekkorban is a leghatásosabb citosztatikus szerek

közé tartoznak, amelyeket kiterjedten használnak számos szolid tumor, akut

lymphoid és myeloid leukémia kezelésére. A gyógyszer adásának

legfontosabb korlátozó tényezoje cardiotoxikus mellékhatása. A

cardiotoxicitás korai felismerése, kezelése és megelozése vitális kérdés, hiszen a

cardiomyopathia mortalitása magasabb, mint 6% és a növekedésben lévo

szervezetben évekkel a terápia befejezése után is manifesztálódhat. Az ANP és

BNP számos vazoaktív anyag szekrécióját, effektusát gátolni képes,

amelyek az anthracyclin cardiomyopathiában szerepet játszanak.

A szérum ANP és BNP változása korai és érzékeny jellemzoje a CF

megbetegedésben kialakuló dilatatív-, és az anthracyclin terápia kapcsán kialakuló

akut és krónikus toxikus cardiomyopathianak.

14

A legmodernebb technika is téves eredményre vezethet, ha pl. nem pontosan

összeállított betegcsoportokon kerül alkalmazásra. A Human Genom Project által

elérhetové vált információ tömeg, az új „genetikai paradigma” csak akkor tud majd átüto

sikert hozni, ha tudományos igényességgel folytatott tradicionális klinikai

tevékenységgel társul. A genomikával felértékelodött a fenotípus hagyományos

eszközökkel való vizsgálatának szerepe.

A fenotípusra vonatkozó eddigi ismereteinket felül kell vizsgálni, ki kell egészíteni, s a

genomot jellemzo pontos és precíz adatok mellé hasonlóan pontos és precíz fenotípusbeli

adatokat kell helyeznünk. A genotípus-fenotípus összefüggések segíthetnek a

genetikai heterogenitásból adódó számos tisztázatlan, gyakorlati szempontból

jelentos kérdés megválaszolásában. Mind az allélikus heterogenitásból (egy génlókusz

mutációi eltéro klinikai képet okoznak), mind a lókusz heterogenitásból (egyféle vagy

hasonló klinikai kép hátterében különbözo lókuszok mutációi állhatnak) adódó

nehézségek csak olyan adatok segítségével oldhatók meg, amelyek tudományos

igényességgel folytatott genotípus - és fenotípusbeli elemzésekbol születnek.

A cisztás fibrózisos és a congenitalis adrenalis hyperplasiás

betegcsoportoknál – Magyarországon elsoként – országos CF és CAH regiszterek

adatbázisát felhasználva genotípus - fenotípus elemzést is végeztünk, többek között

azzal a céllal, hogy munkánk felhasználható legyen a kezeloorvosok által is.

A cisztás fibrózis betegek eredményes kezelésére egy jól muködo, egységes kezelési

szempontokat figyelembe vevo, országos, CF gondozóközpontokból álló hálózat

alakult. Ugyanakkor a betegek tüneteit, laboratóriumi vizsgálatainak eredmé nyeit

egységes szempontrendszer szerint feldolgozó, és a megbetegedésekért felelos CFTR

mutációkat is nyilvántartó országos regiszter nem létezett. Ezért, szorosan

együttmuködve a CF gondozóközpontokkal, egy Országos Cisztás Fibrózis Regiszter

létrehozását valósítottuk meg.

15

CÉLKITUZÉSEK

Az értekezésben négy gén szekvencia, a cisztás fibrózis (CF) kialakulásáért felelos

CFTR gén, a congenitalis adrenalis hyperplasia (CAH) kialakulásáért felelos 21-

(szteroid)-hidroxiláz defektust (21-OHD) okozó CYP21 gén mutációinak vizsgálatát,

valamint a cardiomyopathiákban szerepet játszó emberi natriuretikus hormonok (hANP,

hBNP) génjeinek szekvenciáit elemezzük. A CF és CAH betegségek esetében vizsgáltuk

a klinikai tünetek és a betegség kialakulásáért felelos genetikai elváltozások közötti

lehetséges összefüggéseket is.

I. A cisztás fibrózis (CF) megbetegedésnek a klinikai gyakorlatban is hasznosítható,

feltételezett klinikai és genetikai összefüggéseinek megismeréséhez célul tuztük ki:

1. A cisztás fibrózisos betegek klinikai tüneteinek és laboratóriumi eltéréseinek

egységes szempontrendszer szerinti leírását és új osztályozás bevezetését

Magyarországon.

2. Az egységes szempontrendszeren alapuló, Országos Cisztás Fibrózis Regiszter

létrehozását.

3. A magyarországi CF Regiszter epidemiológiai adatainak összehasonlítását a

környezo és más európai országokéval.

4. A cisztás fibrózis kialakulásáért felelos CFTR gén magyarországi mutációs

spektrumának meghatározását.

5. Cisztás fibrózisos betegek genotípus – fenotípus összefüggéseinek elemzését.

16

II. A congenitalis adrenalis hyperplasiát (CAH) okozó 21-(szteroid)-hidroxiláz

enzim defektusnak (21-OHD) a klinikai gyakorlatban is hasznosítható,

feltételezett klinikai és genetikai összefüggéseinek megismeréséhez célul tuztük ki:

1. A 21-hidroxiláz enzim defektus kialakulásáért felelos CYP21 gén

magyarországi mutációs spektrumának meghatározását.

2. A 21-OHD betegek genotípus – fenotípus összefüggéseinek elemzését.

III. Cardiomyopathiákban is jelentos, emberi natriuretikus hormonok (hANP,

hBNP) génexpresszióját befolyásoló mechanizmusok megértése érdekében célul

tuztük ki:

In vitro modellkísérletekben (patkány szívizom sejtkultúrákban vizsgálva):

1. A hANP gén szövetspecifikus génexpresszióját meghatározó génszakasz

azonosítását.

2. A hBNP gén szövetspecifikus génexpresszióját meghatározó génszakasz

azonosítását.

3. Mechanikus stressznek, a hBNP génexpresszióra gyakorolt hatásának

vizsgálatát.

4. Anthraciklinnek (doxorubicinnek) a hANP - és hBNP génexpressziókra

gyakorolt szelektív hatását.

17

In vivo humán kísérletek során vizsgálva:

5. Anthraciklinek által kiváltott cardiomyopathia elorejelzését (prognózisát) a

szérum hANP koncentrációjának mérésével.

18

IRODALMI HÁTTÉR

I. CISZTÁS FIBRÓZIS

A cisztás fibrózis jelentosége – epidemiológia

A cisztás fibrózis (CF; OMIM# 219700) a leggyakoribb autoszomalis

recesszív öröklodésu, halálos kimenetelu genetikai betegség a fehérboru népesség

körében [76, 308]. Európában a génhordozók gyakorisága 1:25, így megközelítoleg

minden 625. házasságkötés két heterozigóta egyén között történik. Ezekbol a

házasságokból 25%-os valószínuséggel születnek homozigóta, beteg utódok, így a

betegség újszülöttkori elofordulása átlagosan 1:2500-ra teheto [109]. Ezt a feltunoen

magas gyakoriságot egy szelekciós elony jelenlétével magyarázzák, amely szerint a

heterozigóta hordozók kevésbé érzékenyek a koleratoxin szekréciófokozó hatására,

melyre csökkent Cl̄ -transzporttal, illetve csak mérsékelt szekretoros típusú hasmenéssel

válaszolnak [46, 83, 218].

A CF a leggyakoribb etiológiai tényezo a gyermekkori súlyos, idült

tüdobetegségben, és jelentos forrása az idült tüdobeteg fiatal felnottek

morbiditásának és mortalitásának. A CF felelos számos gyermekkori és kora

felnottkori exokrin hasnyálmirigy-elégtelenségért, továbbá számos orrpolyposisért,

sinusitisért, rectalis prolapsusért, nonketotikus inzulin-dependens hyperglycaemiáért és

biliaris cirrhosisért ezekben a korosztályokban. Mindezen tényezok indokolják, hogy e

genetikai defektus vizsgálataira nagy érdeklodés irányul.

Bár az elso megfigyelések 1650- ig nyúlnak vissza, a CF kutatása a 20. században

kezdodött [75, 276]. A betegség elso pontos klinikai leírása, illetve maga az elnevezés

1938-ból, Dorothy Andersentol származik [5], az öröklodés tisztázása pedig Carter

nevéhez fuzodik [16, 32, 33]. Jelentos állomás, amikor 1953-ban di Sant’Agnese eloször

mutatta ki az emelkedett Na -̄ és Cl̄ -tartalmat a verejtékben [61]. A genetikai

ismereteink 1985 óta – amikoris a CF-gént a 7. kromoszómára (7q31) lokalizálták [298]

– folyamatosan bovülnek. A CFTR-gén (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance

19

Regulator Gene; OMIM# 602421) felfedezésére 1989-ben került sor [215, 220], a CFTR-

fehérjét pedig Kartner és mtsai azonosították [18, 126]. A genetikai heterogenitásból

fakadóan a kutatás továbbra sem állt le, és mára már az ismert mutációk száma

meghaladtja az 1200-at (http://www.genet.sickkids.on.ca/).

Klinikai tünetek

A cisztás fibrózis a diabetes mellitus után a második leggyakoribb

anyagcsere-betegség. Az alapdefektus az összes külso elválasztású mirigyben

megfigyelheto. Elégtelen a klorid, illetve másodlagosan a nátrium és a víz hámfelületre

történo kiválasztása. Míg normális körülmények között a szekretoros csatornákban

képzodo elsodleges folyadékból klorid, majd nátrium szívódik vissza, itt ez nem

következik be, így a verejtékkel nagy mennyiségu só távozik. A többi exokrin

mirigyben is suru, tapadós váladék képzodik, ami obstrukciót okoz.

Légzorendszeri elváltozások

A betegek mintegy 90%-a mutat légzorendszeri tüneteket. CF-ben a krónikus

infekció elsosorban a légzorendszerben jelentkezik. A bejutó baktériumok a suru,

mukózus váladék miatt könnyen megtelepednek a bronchiális urben, amelyet késobb

bronchiolitis, illetve a nagyhörgok gyulladása követ [153]. A hörgorendszer

destrukciója idovel egyre fokozódik. Légúti obstrukció alakul ki, bronchiektázia,

szubpleurális bullák jelennek meg, ha rupturálódnak, következményes

pneumothorax észlelheto, majd a folyamat végstádiumban fibrózisba megy át. A

fokozódó pulmonális ellenállás egyre nagyobb terhet ró a jobb kamrára és cor

pulmonale alakul ki.

Gasztrointesztinális vonatkozások

Az emésztorendszer az esetek kb. 80%-ában érintett. Emésztési zavar a

hasnyálmirigy-enzimek 75%-os kiesése esetén lép fel. Az emésztés elégtelensége miatt

a felszívódási viszonyok romlanak, a testtömeg gyarapodása elmarad, a boséges

táplálkozás ellenére malnutriciós tünetek lépnek fel. Mindez a zsírban oldódó

vitaminok hiányára jellemzo tünetegyüttes kialakulásához vezet.

20

A jelentosebb megjelenési formák és szövodmények közé tartozik az esetek 10-15%-

ában eloforduló meconium ileus; a krónikus köhögés, a hasi disztenzió és a

tranzitido megnyúlása miatt fellépo gasztrooesophagealis reflux; valamint a

vékonybél bakteriális kontaminációja. A májtünetek az elhúzódó icterustól egészen a

fibrózisig terjedhetnek [96, 271]. Kialakulhat cirrhosis is portális hipertenzióval,

következményes ascitessel, lépduzzanattal, nyelocso-varixokkal és akár fatális

kimenetelu vérzéssel is. Nem ritka a rectum-prolapsus, amit a nagytömegu, emésztetlen

széklet, a perisztaltika megváltozása, a rectum körüli zsírszövet csökkenése, valamint a

köhögés miatti fokozott hasuri nyomás hoz létre.

Húgy- és ivarszervek érintettsége

95%-ban jellemzo az aspermia. Lányoknál adoleszcens korban gyakori a

szekunder amenorrhoea.

Diagnosztikai módszerek

Verejtékteszt

A verejtékteszt indikációi: újszülött és csecsemokorban meconium ileus, meconium

peritonitis, icterus, hypochloraemiás alkalosis és hotúltengés, gyermekkorban

gyarapodási zavar, rectum prolapsus, orrpolyposis, sinusok fedettsége/parasinusitis,

pancreatitis, epekövek és ismeretlen eredetu cirrhosis, illetve bármely életkorban

diagnosztizált azoospermia (a vas deferens kétoldali veleszületett hiánya miatt),

visszatéro vagy állandó pneumonia, Staphylococcus pneumonia, mucoid Pseudomonas a

légutakban, bronchiectasiák és a pozitív családi anamnézis.

A verejtéktermelés serkentésére pilocarpin-iontophoresist alkalmaznak. Három

egymás utáni, különbözo idopontban mért pozitív, azaz 60 maeq/l feletti NaCl-értéket

tekinti a szakirodalom a CF-re diagnosztikusnak, de 40-60 maeq/l közötti értéknél sem

lehet egyértelmuen elvetni a diagnózist. Az életkor elorehaladtával no a verejték NaCl-

tartalma, így egészséges felnotteknél is elofordulhatnak 60 maeq/l körüli értékek. A

hazai gyakorlatban ezért ma már az 50-70 maeq/l közötti értéket tekintjük

átmenetinek, és a 70 maeq/l feletti értéket pozitívnak [17, 89, 152, 262, 300].

21

Az emelkedett verejték Cl--szint miatt differenciál-diagnosztikai problémát, álpozitivitást

okozhatnak az alábbi betegségek: kezeletlen mellékvesekéreg-elégtelenség, ectodermalis

dysplasia, öröklött nephrogen diabetes insipidus, glukóz-6-foszfatáz-hiány,

hypothyreosis, hypoparathyreoidismus, familiaris cholestasis, pancreatitis, a

mucopolysaccharidosisok, fucosidosisok és a malnutritio. Álnegatív eredményt adhat a

teszt hypoproteinaemiás, oedemás gyermekben.

Légzésfunkció

A légzésfunkciómérés általában 5-6 éves kor felett ad megbízható eredményt. A

középkilégzési csúcsáramlás csökkenése korai jel, és a kislégutak obstrukciójára utal.

Korai tünet még a reziduális térfogat (RV) és a funkcionális reziduális kapacitás (FRC)

növekedése. A késobb jelentkezo légzésfunkciós változások már a restriktív elváltozásra

utalnak: ilyen a totálkapacitás- (TLC) és a vitálkapacitás-csökkenés (VC), amely értékek

a tüdoparenchyma érintettségével és a fibrózis mértékével arányosak [40, 43]. A

végállapotú tüdot már a FEV1 értékének (FEV: forced expiratory volume; FEV1 : a

vizsgált személy 1 mp alatt a vitálkapacitásának maximális erokifejtéssel kilélegezett

hányada) 30% alá csökkenése jellemzi, hypoxia és/vagy hypercapnia (PAO2 < 55 Hgmm,

PACO2 > 50 Hgmm, ) kíséretében [153, 323].

Képalkotó eljárások (röntgen, ultrahang, CT)

A képalkotó eljárások közül a tüdofolyamatok diagnosztizálásához a

mellkasröntgen és a mellkas-CT használatos [60, 128, 217, 230, 323]. A mellkasröntgen

csak elorehaladottabb folyamatok detektálására képes, így a legkorábbi jel a

tüdofelfújtság, a jelentos hörgofal-megvastagodás, dugaszképzodés, és a bronchiectasiára

utaló gyurus árnyékok, melyek eloször a felso lebenyekben (a legkorábbi és

legjelentosebb elváltozások többnyire a jobb felso lebenyben) jelennek meg. Késobb már

gócos transzparencia-csökkenést, foltos atelectasiákat és egybefolyó infiltrátumokat is

láthatunk. Megnagyobbodott hilusi nyirokcsomók is elofordulhatnak. Elorehaladott

tüdofolyamat esetén még jelentosebb eltérések ábrázolódnak a röntgenképen: látványos

felfújtság, mélyen álló rekeszek, a szívárnyék elkeskenyedik (végállapotú tüdo esetén

22

azonban a cor pulmonale következtében újra kiszélesedik), a sternum ívben eloreha jlik.

Gyakran láthatók még ciszták, kiterjedt hörgtágulat, tágult pulmonalis artériás rajzolat és

szegmentális vagy lobaris atelectasia. A CF mellkasröntgen-jeleinek értékelésére

nemzetközi pontrendszerek vannak használatban [217, 230].

A CT jóval kifinomultabb eljárás, így a hazai CF-diagnosztikában is kezdi átvenni az

AP-mellkasröntgen szerepét. Segítségével már a korai folyamat – így a kezdeti hörgofal-

megvastagodás és a bronchiectasia is – detektálható. A hasi ultrahang CF-es betegek

esetében elsosorban a hasnyálmirigy és a máj érintettségének meghatározására szolgál,

az arcüreg CT-vel pedig a cisztás fibrózist gyakran kíséro parasinusitis és orrpolyp

diagnosztikájához nyújt segítséget.

Pancreasfunkció

A pancreasfunkció mérésére több vizsgálat is rendelkezésre áll, így például a

háromnapos székletgyujtést követo széklet-zsírtartalom vizsgálata, duodenum-

szondázás és pancreozymin-secretin stimulálás révén az enzimszekréció és aktivitás

meghatározása, a székletminta tripsin- és chymotripsin-tartalmának vizsgálata [22, 28,

147, 238, 241, 299]. Használható még az immunreaktív tripsinogen szerumszintjének

mérése (csak 7 éves kor felett), a glikolizált hemoglobinszint ellenorzése (10 éves kor

felett végezheto, és elsosorban utánkövetésre alkalmas érzékeny módszer, de még nem

általánosan elterjedt), és a szérum karotin-koncentrációjának mérése.

A rendelkezésre álló vizsgálati módszerek azonban a mindennapi gyakorlatban kevésbé

használatosak. Sokkal inkább az a módszer terjedt el, hogy emésztési panaszok és

haspuffadás esetén rögtön enzim-szubsztitúció bevezetésére kerül sor, amelynek a

dózisbeállítása a gyermek panaszainak függvényében elsosorban a szülo feladata,

természetesen a konzultációk alapján [25, 59].

23

Mikrobiológia

A mikrobiológiai tenyésztés torokváladékból és alsó légúti váladékból

(általában köpetbol) történik. A Staphylococcus aureus, a Haemophylus influenzae és a

Pseudomonas aeruginosa jellemzo, a Pseudomonas mucoid formái pedig szinte

specifikusak a cisztás fibrózisra [181, 228, 236]. A H. influenzae 2-5 éves korban a

leggyakoribb, prevalenciája ekkor eléri a 20-25%-ot. A S. aureus prevalenciája 6 és 17

éves kor között éri el csúcsértékét (kb. 50%), a P. aeruginosa pedig elsosorban a

serdülokortól mutatható ki, és 18 éves korra eléri a 80%-os gyakoriságot [181, 228].

Nasalis/bronchialis transepithelialis potenciálkülönbség mérése

Rendkívül érzékeny módszer a CF-re jellemzo transepitheliális potenciál-

különbség mérése a légutakban. Kiküszöbölni látszik a verejtéktesztbol fakadó

pontatlanságot, és csökkenti az álnegatív esetek számát. Magyarországon még nem

terjedt el [259].

Genetikai vizsgálat és prenatalis diagnosztika

A genetikai vizsgálat leírása a módszertan fejezetben található.

A prenatalis diagnosztika történhet a II. trimeszterben a magzatvízbol, a

mikrovilláris membránenzimek aktivitásának mérésével [268-270], és a

chorionboholyból vett minta DNS-analízisével is (a terhesség 9-12. hete között), ha a

szüloi mutációk ismertek [190-192, 194]. Napjainkban már természetesen a DNS

mintavételbol történo módszer használatos [10, 194, 214].

24

CF diagnózisának feltételei

A cisztás fibrózis betegség diagnózisához legalább egy-egy feltételnek teljesülni kell az

alábbi két csoportban felsoroltak közül [45, 221]:

A. csoport:

? típusos légzoszervi manifesztációk

? típusos emésztoszervi megjelenés

? pozitív családi anamnézis (valamelyik testvér vagy szülo betegsége

ismert)

B. csoport:

? a verejték Cl--koncentrációja > 60 (vagy 70)maeq/l

? két CFTR-mutáció kimutatása

A nemzetközi irodalomban egyre inkább körvonalazódik az igény a cisztás fibrózis

definíciójának szukítésére [23, 97, 166, 221]. Ez a jelenség azzal magyarázható, hogy

olyan, a CFTR-mutációk fokozott gyakoriságával járó, a CF-re atipikus betegségek

válnak ismertté, amelyek általában csak egy-egy szervrendszeren mutatnak a CF-re

jellemzo tüneteket, nem okoznak megemelkedett verejték Cl--szintet, és nem

szükségszeruen járnak mindkét allélen mutációval. Cisztás fibrózis diagnózison ezért

csak a több szervre kiterjedo betegséget értik, amely elsosorban a tüdo és a

hasnyálmirigy valamilyen fokú érintettségével jár. Mivel az így definiált betegségben

általában a verejtékmirigyek kivezetocsövének abszorpciós muködése is károsodott, ezért

a CF-betegek túlnyomó része a verejtékteszt segítségével kiszurhetonek tunik. Az

ezeknek a feltételeknek nem megfelelo betegségeket pedig az atipikus CF (CFTR-

asszociált betegség) elnevezéssel illetik. Mivel azonban a szétválasztás, illetve a

genetikai háttér sem teljesen egyértelmu, jelen értekezésemben nem alkalmazom ezt a

felosztást.

25

CFTR-gén

A CFTR-t kódoló gén kb. 250 kilobázis hosszúságú, és 27 exont tartalmaz,

amelyeket nem kódoló intronok választanak el egymástól [129, 215, 220, 325]. 1989 óta

ismert, hogy a 7. kromoszóma hosszú karjának 31.2-es lókuszán helyezkedik el

(National Center for Biotechnology Information: http://www.ncbi.nlm.nih.gov)

[215, 220]. A leggyakoribb, ?F508-as mutáció kimutatását követoen (1989), 1992-ben

kb. 80, 1996-ban pedig már megközelítoleg 400 további mutáció volt ismert. Mai

tudásunk szerint a CFTR-gén több mint 1300-féle mutációt hordozhat (Cystic Fibrosis

Mutation Data Base: http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr), bár a kutatások még nem

zárultak le, tehát lehet a továbbiakban is újabb mutációk felfedezésére számítani. Ezek

azonban minden valószínuség szerint már csak egy-egy családra korlátozódnak, így

kijelenthetjük, hogy mára a gyakoribb mutációk túlnyomó részét ismerjük.

A mutációtípusok választéka igen széles, és missense-, nonsense-, splice-site-,

frameshift-mutációk, illetve aminosav-deléciót okozó génmutációk és -variációk

egyaránt elofordulhatnak. A missense-mutáció során egy aminosavat kódoló bázishármas

valamelyik tagja kicserélodik, és az így megváltozott kodon más aminosavat határoz

meg. A nonsense-mutációban szintén kicserélodés történik a bázishármas valamelyik

tagján, ami egy terminációs kodon megjelenését eredményezi. A splice site-mutáció,

amely az intronok kivágási helyénél okoz hibát. A frameshift-mutáció során valamely

bázishármason belül egy deléció (egy nukleotid kiesése) vagy inserció (egy nukleotid

beépülése) történik, melynek következtében a kodonhatárok eltolódnak.

Ismerünk ezeken kívül még több mint 200 féle benignus szekvencia-módosulatot is,

melyek nem patológiásak, legalábbis erre utal az a tény, hogy ismert mutációkkal

kombinálódva sem okoznak klinikai tüneteket [93, 296].

A mutációk megoszlása a gén különbözo részein nem véletlenszeru, hanem léteznek

ún. „forrópontok” (hotspot), amelyek területén a mutációsuruség nagyobb; ilyen

forrópont pl. a 4., 7. és a 17b. exon, melyek egyenként 30-féle mutációt hordozhatnak,

vagy a 11. exon, melynek területén 5 kodonnyi távolságon belül 11 különbözo mutáció

található [161].

26

CFTR felépítése és szerepe egészséges szervezetben

A Cystic Fibrosis Transmembran Regulator az ABC-transzporterek (ATP Binding

Cassette) szupercsaládjába [136] tartozó 1480 aminosavból felépülo N-glikolizált

fehérjelánc [215]. Az érett, glikolizált forma molekulatömege 180 kd. A CFTR-fehérje

két hidrofób membránköto domént (MSD) tartalmaz, amelyek egyenként hat

transzmembrán szegmensbol épülnek fel, két nukleotidköto domént (NBD), amely ATP-

kötésre képes, és egy szabályozó funkciójú, nagy töltéssel bíró domént (R-domén), amely

több foszforilációs hellyel is rendelkezik a protein kináz A és C számára. A CFTR-

fehérje felépítése megegyezik az ATP-dependens transzportfehérjék felépítésével, ezért

sorolható az ABC-transzporterek családjába. Ennek ellenére funkciója szerint nem ATP-

dependens transzporter, hanem cAMP-aktivált Cl—csatorna [127, 155].

A CFTR-fehérje tehát elsodleges szerepe szerint cAMP-függo Cl--csatorna, de a CF

patomechanizmusának vizsgálata révén fény derült arra, hogy más plazmamembrán-

csatornák muködését is befolyásolja (így az epithelium apicalis membránjában gátolja a

Na+-csatornákat, illetve az alternatív Cl--csatornákat, mint amilyen az ORCC, azaz az

outward rectifying chloride channel), és valószínusítheto az endo- és exocitosis

szabályozása is [112].

A CFTR-t kódoló RNS elsosorban a CF által klasszikusan érintett epithelialis

szövetekben expresszálódik, úgymint a tüdoben, hasnyálmirigyben, májban és

verejtékmirigyekben, de megtalálható a vastagbélben, herében és vesében is. Az

epithelialis sejtek többsége az apicalis membránjában hordozza, de elofordulhat

intracellularisan, a sejtorganellumok (pl. endoplazmatikus retikulum, Golgi-membrán,

endoszómák) membránjában is. A CFTR a légutakban a ciliaris epitheliumon apicalisan,

a submucosus mirigyekben intracytoplasmaticusan fordul elo. A hasnyálmirigyen belül a

ductalis epithelium apicalis membránja tartalmazza. Apicalisan fordul még elo a máj

epeútjainak epiheliumában, a belek kriptáinak bazális sejtjeiben, a vese

gyüjtotubulusaiban, és a verejtékmirigy kivezeto csöveinek epitheliumában. Ez utóbbi

sejtekben a basolateralis membránban is megtalálható. Kimutatták, hogy légutak

epithelialis felszínén csak kis mennyiségben detektálható, ezzel szemben jóval nagyobb

mennyiségben expresszálódik a hasnyálmirigyben, belekben és a légutak submucosus

27

mirigyeiben. Közepes mennyiségben van még jelen a nyál- és verejtékmirigyekben,

továbbá a reproduktív traktusban [39, 184, 185, 223].

A CFTR aktiválása feltehetoen két lépésben történik. Az egyik lépés az R-domén

foszforilálása, ami az intracellularis cAMP-szint növekedése miatt aktiválódott cAMP-

dependens protein-kináz A- és protein-kináz C-hez kötheto. A második lépés az ATP

hidrolízise a nukleotidköto helyeken (elsosorban az NBD1-en), amely megváltoztatja a

CFTR-fehérje szerkezetét, lehetové téve a Cl--áteresztést [207, 239].

CFTR gén mutációinak osztályozása

A mutációk felosztása több szempont szerint is lehetséges, így a klinikai tünetek

súlyossága vagy a molekuláris következmények szerint. Ez utóbbi funkcionális felosztás

öt osztályt különböztet meg [307]:

I. A fehérjetermelés hibái: Ebbe a csoportba tartoznak azok a mutációk, amelyek korai

transzkripciós stopkodont tartalmaznak, illetve azok, amelyek csonka vagy instabil

CFTR-fehérjét eredményeznek. Közös jellegzetességük, hogy a transzláció

károsodásával nem szintetizálódik teljes hosszúságú fehérje, így ezen fehérjék vagy

gyorsabban bomlanak le, vagy már eleve csökkent a funkciójuk, és esetenként el is

veszítik azt. A gyakoribb ide tartozó mutációk: G542X [130], 621+1G? T [324],

3905insT [104], CFTRdele2,3 [66].

II. A poszttranszlációs módosulások és az apicalis membránhoz való szállítás hibáit

okozó mutációk: A mutáció éretlen, kevéssé glikolizált, feltehetoen hibás konformációjú

fehérjét eredményez, mely még mielott elérne a cellularis membránhoz, lebomlik, így a

sejtfelszínen nem mutatható ki CFTR-fehérje. A leggyakoribb, ?F508-on [129] kívül

ide sorolható gyakoribb mutációk még az N1303K [200], a ?I507 [130] és a S549R

[130, 229].

28

III. A szabályozás hibáit eredményezo mutációk: A mutáns fehérjék elérik az apicalis

membránt, de csökkent vagy megszunt az érzékenységük az ATP szabályozó

funkciójával szemben. A mutációk többsége a két nukleotidköto domén egyikében

található. Viszonylag gyakori képviselojük a G551D [47] mutáció.

IV. Hibás Cl--áteresztéshez vezeto mutációk: Amelyek esetén a protein-kináz A és az

ATP megtartott szabályozó funkciója ellenére csökkent a Cl--áteresztés. Mind a Cl--áram

mértéke, mind a Cl--csatorna nyitva tartásának ideje érintett lehet. A gyakoribb

mutációk: R117H [58], R334W [85], R347P [58].

V. Az RNS vagy a fehérje csökkent szintjét eredményezo mutációk: Ezen mutációk

esetén nem történik megfeleloen az mRNS-prekurzorokon a splicing, mely egyrészt

valamelyik többlet exon(ok) jelenlétével, másrészt az mRNS és/vagy a fehérje

érintettségével magyarázható. Gyakoribb képviseloik a 3849+10kbC? T [106], az 5T

[55, 160], a 1811+1.6kbA? G [37] és az A455E [130] mutációk.

Az egyes mutációk osztályokba sorolása azonban nem mindig egyértelmu,

elofordulhatnak átfedések, mint pl. a ?F508 esetén, amelyben a poszttranszlációs

módosulás, illetve az apicalis membránhoz való szállítás hibáit okozó mutáció az

elsodleges abnormalitás, de a funkció hibás szabályozása is közrejátszik.

Genetikai és klinikai heterogenitás – a rendszerezés és prognózis

megalkotásának szükségessége

A CFTR-gén nagyszámú mutációi miatt szembe kellett nézni azzal, hogy a

klinikai kép sem egységes, sot addig teljesen különállónak vélt betegségek is, mint

például a CBAVD, ezen gén mutációival magyarázható [110, 119, 125, 264]. A

kutatókat azonban már az elso mutációk azonosításától foglalkoztatja a genotípus

és fenotípus kapcsolata, összefüggései, amelynek ismerete megkönnyítené a klinikai

tünetek közötti eligazodást, a prognózis megalkotását, és így a megfelelo terápia

29

kialakítását, amelyre nemcsak a klinikai orvosnak, hanem a CF-es betegeknek –

kiknek a terápiás lehetoségek fejlodésével ma már esélyük van a felnottkorba

lépésre – és gyakran a heterozigóta, gyermeket váró szüloknek is szükségük van. A

geno-fenotípus kutatásnak kiterjedt irodalma van, amelyben megpróbálják a CFTR-

génmutáció típusaira, illetve osztályaira lebontva felvázolni a felismert összefüggéseket,

bár a nagyszámú mutációk egymással való kombinálódásából fakadóan, továbbá a

környezeti tényezok jelentosége miatt csak néhány egyértelmu összefüggést sikerült

felismerni. Jelen értekezésben a magyar betegek adatai alapján összeállított

Magyarországi Cisztás Fibrózis Regiszter feldolgozása révén mutatom be a

genotípus és fenotípus közötti bizonyítható összefüggéseket.

30

II. 21-HIDROXILÁZ DEFEKTUS OKOZTA CONGENITALIS ADRENALIS

HYPERPLASIA

Congenitalis adrenalis hyperlasia jelentosége - epidemiológia

A congenitalis adrenalis hyperplasia (CAH), más néven adrenogenitális

szindróma (AGS) autoszomális recesszív módon öröklodo betegség, amely a

koleszterinbol induló kortizol és aldoszteron bioszintézis öt enzimatikus lépése

közül valamelyik zavarának a következménye [56, 195, 266, 310, 311]. A

congenitalis adrenalis hyperplasia oka az esetek 95%-ában a 21-hidroxiláz enzim

defektusa, ami az enzim által katalizált progeszteron – 11-dezoxikortikoszteron ill. a 17-

OH-progeszteron – 11-dezoxikortizol átalakulás zavarát eredményezi (mind az

aldoszteron, mind a kortizol keletkezése elégtelenné válik) (1. ábra) [196].

1. ábra: A szteroid-21-hidroxiláz enzim szerepe az aldoszteron és a kortizol

bioszintézisében

progeszteron 17-OH-progeszteron

21-hidroxiláz

11-dezoxikortikoszteron 11-dezoxikortizol

aldoszteron kortizol (zona glomerulosa) (zona fasciculata)

31

A hibát a 6-os kromoszóma rövid karján található CYP21 gén mutációi okozzák,

amelyek az enzimaktivitás részleges, közel teljes, illetve teljes mértéku kieséséhez

vezetnek [150, 266]. Ennek tükrében a betegségnek három különbözo súlyosságú

klinikai formáját különböztetjük meg, a legsúlyosabb sóveszto (salt wasting, SW),

a közepesen súlyos szimpla virilizáló (simple virilizing, SV), és a legenyhébb nem-

klasszikus (non-classic, NC) (korábbi nevén: késon manifesztálódó, late-onset, LO)

formát. A klasszikus formák gyakorisága Magyarországon 1:15000 az újszülöttek

között.

Az enzimet kódoló gén szerkezetében bekövetkezo különféle mutációk tarka

klinikai tüneteket hoznak létre [8]. A betegség klinikai megjelenési formái jellegzetesen

széles spektrummal rendelkeznek, ahova a késoi életkorban jelentkezo, sokszor alig

diagnosztizált eltérésektol kezdve a sokkal súlyosabb, akár életet veszélyezteto

állapotok is tartoznak. A 21-hidroxiláz defektus klinikai megjelenési formái a

genotípus eltéréseinek mértékétol, helyétol függnek. A különbözo deléciók, splice

mutációk, nonsense és frameshift mutációk jelentos zavart okozhatnak a gén

szerkezetében, ezáltal pedig a gén által kódolt enzimfehérje szerkezetében. Vannak

genotípus eltérések, amelyek egyáltalán nem, vagy csak enyhe problémát okoznak, alig

csökkentve az enzim aktivitását [113, 178].

A 21-hidroxiláz enzim defektus okozta congenitalis adrenogenitalis

szindróma olyan betegség, amely kezelés nélkül a beteg komoly szomatikus,

szexuális és pszichés fejlodési zavaraihoz vezet [101, 107, 141, 163, 208, 210, 227,

256]. Ma azonban már lehetoség van a hiányzó hormonok pótlására a szubsztitúciós

hormonterápiával. Jól beállított glükokortikoid vérszint mellett a túlzott ACTH termelés

is megszunik, így a rendellenesen fokozott androgén termelés is visszaáll a normál

szintre. A hormon szubsztitúciós terápia eredménye azonban annál kedvezobb, minél

korábban ismerik fel a betegséget [142, 180, 258]. A veleszületett genitális torzulások

pedig plasztikai sebészeti beavatkozással helyrehozhatóak [1, 4, 102, 197], így

megfelelo orvosi és lelki segítséget kapva ezek a gyermekek is teljes értéku életet

élhetnek [62, 63, 88].

32

CAH regiszter

Magyarországon 1978-ban Sólyom János és munkatársai (SOTE II. sz.

Gyermekgyógyászati Klinika, szteroidhormonanalitikai, gyermekendokrin

konzultációs központ) széles köru programot indítottak el a 21-hidroxiláz enzim

defektus országos szintu célzott szurésére. A vérminták gyors analízisét, az

eredmények feldolgozását, a magyarországi CAH betegek regisztrálását végzik,

valamint a beküldo kezelo orvossal konzultálnak a gyermek kezelésérol.

Megállapították a különbözo korcsoportokra jellemzo vérfolt 17-OH-progeszteron szint

normál értékét, és felállítottak egy biztonságos "riasztási" értéket, amely felett a

gyermek a betegségre gyanús, így további kontrollokra van szükség. Téves pozitív és

negatív esetek kiküszöbölésére az összes beteg kórlefolyását nyomon követik. Ez az

országos szintu, célzott szurés 1978 óta folyamatosan muködik [72, 87, 140, 246-249,

252, 253, 285, 286]. Az így létrehozott országos CAH regiszterre támaszkodva

kezdodött meg a klinika molekuláris genetikai laboratóriumában a CAH génbank

felállítása.

Prenatalis vizsgálatok

Prenatális vizsgálatokat olyan családokban végzünk, ahol valamelyik gyermek

ebben a betegségben szenved [65, 171, 175, 198, 216, 257]. Ilyen esetekben az újabb

terhesség megállapítása után azonnal elkezdik az anya dexamethason kezelését. A

terápia célja, hogy megakadályozza a magzat külso nemi szerveinek magas

androgénszint miatt bekövetkezo torzulását. A prenatalis terápiát azonban minél elobb

el kell kezdeni, lehetoleg az utolsó menstruációt követo 7. hétig (5 héttel a fogamzás

után). Ez ugyanis az az idoszak, amikor a külso nemi szervek masculinisatiója kezelés

nélkül elkezdodik [30, 198]. Bár a dexamethason kezelés segít megakadályozni a

gyermek virilizációját, tartós adása mellékhatásokkal járhat az anyára nézve [204, 234].

Hogy ezeket a fiatal noket ne kelljen feleslegesen ennek a terhelésnek kitenni, szükség

van a magzat érintettségének mielobbi tisztázására. A korán elkezdett prenatalis terápia

ugyanis valójában egy „vak” terápia; a korábban született beteg testvér alapján

feltételezzük csupán, hogy a magzat beteg. Kezdetben az elso próbálkozás a magzatvíz

17-OH-progeszteron szintjének mérése volt, amelyre azonban csak a terhesség

33

második trimesterében nyílt lehetoség [79, 120, 255, 318]. Késobb felfedezték a 21-

hidroxilázt kódoló gén és a HLA markerek kapcsolatát. A kapcsolt gének vizsgálata

azonban sokszor nem volt elég megbízható [182, 265]. A chorionboholy biopszia

bevezetése újabb lehetoséget jelentett a betegség minél korábbi diagnózisára [65, 225,

255, 279]. A mintából kivont DNS HLA genotipizálása mellett ma már lehetoség van a

mutáció pontos helyének meghatározására is. A chorionboholy mintavétellel a terhesség

9-10. hetében megállapítható a magzat neme és érintettsége [78]. Ha a gyermek nem

érintett, a terápia is elhagyható. Ugyanígy abbahagyható a dexamethason szedése, ha a

magzat érintett, de fiú. Náluk ugyanis a magzati élet ideje alatt nincs terápiát igénylo

kóros elváltozás a külso nemi szerveken, elegendo a kezelés indítása a születés után.

Hazai gyakorlatban, érintett lánymagzat esetén prenatalis terápia végzendo. Ilyenkor

fontos, hogy az anya megszakítás nélkül, az egész terhesség alatt hormonterápiában

részesüljön (2. ábra). CAH-magzat elso magyarországi sikeres kezelésérol Niederland

és mtsai [198] számoltak be.

2. ábra: A szteroid 21-hidroxiláz enzim defektus okozta congenitalis adrenalis

hyperplasiás magzatok prenatális diagnózisának stratégiája

Hetek Teszt 4 - 5.

7 - 10. vagy 14-15.

hCG

CVS vagy amniocentézis

Dexamethason

Kariotípus

Leány Fiú

STOP DNS-analízis

34

Ugyanakkor meg kell említeni, hogy egyes (elsosorban amerikai) iskolák tekintettel a

dexamethason szedés során fellépo esetleges mellékhatásokra (anya

cushingoidizálódása, magzat hossz- és súlygyarapodásbeli elmaradása, újszülött

megnövekedett kockázata cardio-vasculáris megbetegedések kialakulására), továbbra is

„kísérleti” terápiának sorolják be a prenatalisan alkalmazott glükokortikoid terápiát

[204, 234].

A 21-hidroxiláz defektusos beteg genotípusának megállapítására új lehetoséget

hozott a polimeráz láncreakció (PCR) alkalmazása [201, 202]. A 21-hidroxiláz defektust

okozó leggyakoribb mutációk pontos helye és szerkezete ismert, így használható

vizsgálatára a PCR. A. Wedell, stockholmi kutató és mtsai kidolgozták az allélspecifikus

amplifikáció módszerét a 21-hidroxiláz defektus vizsgálatára [303]. E módszer

magyarországi bevezetésével, valamint továbbfejlesztésével foglalkoztak Sasvári Mária

és mtsai (Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet) [15, 279],

velük együttmuködve vezettük be a diagnosztikai módszer klinikai alkalmazását

(közlemények: III. és IV.).

21-hidroxiláz locus

A 21-hidroxiláz génje a 6-os kromoszóma rövid karján a HLA III-as

komplexen belül helyezkedik el (3. ábra) [31, 115, 266, 309]. Itt található meg a

tumor nekrózis faktor (TNF) génje, egy hosokk fehérje génje (HSP-70), a komplement

2-es komponensének génje (C2), a properdin B faktor génje /Bf/. Közvetlen szomszédja

a komplement 4-es komponense (C4), amelynek génje csakúgy, mint a 21-hidroxiláz

génje (CYP21) nem egy, hanem több példányban van jelen a kromoszómán, és a C4-

CYP21 párok tandem ismétlodo egységekként helyezkednek el. A két-két másolat

azonban nem teljesen azonos, ennek alapján megkülönböztetheto C4A és C4B gén, a

21-hidroxiláz esetében pedig CYP21 és CYP21P, azaz pszeudogén. A CYP21 gén 10

exonból és 9 intronból áll és megközelítoleg 3kB hosszúságú. A 21-hidroxiláz aktív

génje és pszeudogénje 98%-ban azonos. A leglényegesebb különbség közöttük az,

hogy a pszeudogén 3. exonjában jelen van egy 8 bázispárnyi deléció, ami az

enzimaktivitást teljesen megszünteti, ezért a pszeudogénrol aktív enzim nem

35

íródhat át. Az aktív CYP21 génben eddig észlelt kb. húszféle mutáció többsége

megtalálható a pszeudogénben, és ebbol kerülnek át a már tárgyalt különbözo

mechanizmusokkal az aktív génbe [105, 183, 201, 304].

Genetikai és klinikai heterogenitás – a rendszerezés és prognózis

megalkotásának szükségessége

A 21-szeroid hidroxiláz enzimdefektus okozta congenialis adrenalis hyperplasia

tüneteinek megjelenése és súlyossága rendkívül eltéro lehet egymástól, attól függoen,

hogy a betegségért milyen fokú enzimkárosodás a felelos. Továbbá, más-más jellegzetes

tünetcsoport figyelheto meg lányokban és fiúkban [195, 196, 312].

Sóveszto (SW) forma. A klasszikus formák 75%-a tartozik ebbe a csoportba. Az

SW formában szenvedõ újszülött fiúkon a születéskor még semmi eltérés nem látszik, a

lánycsecsemoket viszont sokszor fiúnak nézik az androgén túlsúly okozta intersexuális

genitáliák miatt (adrenogenitalis szindróma, AGS). A nem ellenorzött esetekben

mindkét nemben a betegségre a 14-21. napon jelentkezo súlyvesztés, a normális

C4A C4B CYP21P CYP21

HLA I HLA III HLA II

TNF HSP 70 Bf G11

3. ábra: A szteroid 21-hidroxiláz enzimet kódoló gén (CYP21) és környezete a 6.

kromoszómán

36

gyarapodás hiánya, hányás, bágyadtság, szürkés színu, hideg végtagok hívják fel a

figyelmet. Kezeletlen esetekben, ha a csecsemo nem kap megfelelo hormonpótlást, kb. a

3. héten a sóveszto szindróma kiteljesedik: jelentõs hiponatrémia, hiperkalémia lép fel, a

keringo vértérfogat csökken, a magas plazma kálium a szívizomzat károsodását okozza.

Mindehhez metabolikus acidózis, a perifériás keringés összeomlása társul, ami halálhoz

vezet. A létrejövo tünetek alapja fõleg a hiányzó mineralokortikoid hatás. Az ilyen

csecsemo só-vízháztartása idejében történt diagnózis esetén rendben tartható megfelelo

glükokortikoid és mineralokortikoid pótlással [195, 196, 253].

Szimpla virilizáló (SV forma). A klasszikus esetek 25%-a tartozik ebbe a

csoportba. E forma jellemzoje a progresszív virilizáció és a fokozott testi fejlõdés. A

születés pillanatában a fiúcsecsemo lényegében tünetmentes, csupán a magas 17-OH-

progeszteronszint árulkodik a defektusról. A lánymagzatnál a már korábban említett

genitális eltérések indokolják a vér 17-OH-progeszteron kontrollját, ami minden esetben

jó kórjelzoje a betegségnek. Késobb, a lányok 1-3. életévében jelentkezik a pubarche

praecox. Fiúk esetén többnyire 4 éves korig feltuno eltérés nem látható, ekkor náluk is

megjelenik szeméremszorzet, ill. makrogenitosomia. A herék kicsik maradnak [195,

196, 251].

A nem-klasszikus formák (NC) az enzimdefektus enyhe formái részleges 21-

hidroxiláz hiánnyal, másodlagos androgéntúltermeléssel.

Lányoknál a jellemzo tünet a pubarche praecox. Ezekben a betegekben a

szeméremszorzet az 1-8. életévben jelenik meg, gyakran hirsutizmussal, aknéval

társulva. Szórványosan 12-18 évesen oligomenorrhea jellemzo. Sokszor csak akkor

derül fény a problémára, mikor a fiatal no termékenységi problémával fordul orvoshoz.

Fiúknál 4 éves korban a nagyranövés, szeméremszorzet megjelenése relatív kis herék

mellett a kórkép jellemzo tünete. A végso magasság természetesen alacsonyabb lesz az

átlagosnál, mivel idovel az androgének növekedést serkento hatása mellett az epiphysis

porcra gyakorolt záró hatásuk is érvényesül. Mivel a tünetek a késoi életkorban

jelentkeznek, a kórképet late-onset formának is nevezik (LO) [111, 250, 251].

37

Korábban cryptogén formának nevezték az olyan nem-klasszikus formában

szenvedoket, akiknél semmi külso eltérést nem találni. Általában olyan családok

vizsgálatánál fedezik fel oket, ahol egy vagy több gyermek klasszikus, vagy esetleg late-

onset típusú 21-hidroxiláz defektusa ismert. Ilyenkor a szülo 17-OH-progeszteron

szintjének vizsgálatakor az a szülo, akinek a 17-OH-progeszteron szintje stimulációra

magasabb a normál értékeknél; cryptogén, rejtett formájú 21-hidroxiláz defektusban

szenvedonek tekintheto. Ilyen esetekben a következo terhességekben a magzat 17-OH-

progestreron szintjét már prenatálisan vizsgálni kell [195, 196, 250, 251].

Az enzimet kódoló gén szerkezetében bekövetkezett mutációk sokfajta tünetet

hozhatnak lé tre. A betegség klinikai megjelenési formái jellegzetesen széles spektrumon

mozognak, ahová a késoi életkorban jelentkezo - sokszor aluldiagnosztizált -

eltérésektol kezdve a sokkal súlyosabb, akár életet veszélyezteto állapotok is tartoznak.

A különbözo deléciók, splice mutációk, nonsense és frameshift mutációk jelentos zavart

okozhatnak a génben, ezáltal pedig a gén által kódolt enzimfehérje szerkezetében.

Vannak genotípus eltérések, amelyek egyáltalán nem, vagy csak enyhe problémát

okoznak, alig csökkentve az enzim aktivitását [113, 284].

Mindezek alapján (hasonlóan a CF-es betegekhez), a kutatókat már az elso

mutációk azonosítása óta foglalkoztatja a genotípus és fenotípus kapcsolata,

összefüggései, amelynek ismerete megkönnyítené a klinikai tünetek közötti

eligazodást, a prognózis megalkotását, és így a megfelelo terápia kialakítását. Jelen

dolgozatban a Dr. Sólyom János által korábban összeállíott Magyarországi CAH

Regiszter adatainak és a CYP21 gén mutációs spektrumának vizsgálatával nyert

eredmények összehasonlításával mutatom be a genotípus és fenotípus közötti

bizonyítható összefüggéseket (közlemények: III. és IV.).

38

III. ATRIALIS NATRIURETIKUS HORMON

Pitvari natriuretikus hormon felfedezése – történelmi visszatekintés

Eloször Bruno Kisch (1956) [134] írta le bizonyos granulumok jelenlétét

tengerimalacok pitvari szívizom sejtjeiben, amelyek a vese juxtaglomerularis sejtjeihez

voltak hasonlóak. Ugyanebben az évben Henry és mtsai [103] kutya pitvarába

ballonkatétert vezettek, amelyet felfújva azt tapasztalták, hogy a diuresis jelentosen

növekedett. Bompiani és mtsai (1959) [20] patkányok szívpitvar- izomsejtjeiben figyeltek

meg µm-es nagyságrendu granulumokat. Jamieson és Palade (1964) bizonyította, hogy

ezen granulumok specifikus képletek és nem azonosak semelyik korábban ismert

sejtorganellummal sem [118]. Marie és mtsai (1976) [172] patkány kísérletekkel

bizonyították, hogy a pitvari szívizomban található granulumok száma a szervezet

nártrium és az exracelluláris tér folyadék volumenének a függvénye. De Bold és mtsai

1981-ben igazolták, hogy patkány pitvari homogenisatuma, vagy tisztított atrialis

granulumok gyors, eroteljes, de rövid ideig tartó natriuresist, diuresist és vérnyomás

csökkenést okoznak. Ugyanakkor a kamrai szövetkivonat nem okozott semmiféle

változást [52, 53].

Mindezek egy nagyhatású natriuretikus és vasorelaxans anyagot valószínusítettek,

amelyet hatásai alapján atrialis natriuretikus faktornak neveztek el.

A natriuretikus hormon család

A natriuretikus fehérje családba (natriuretic peptide(s), NP) 4 féle hormon tartozik,

amelyet 3 különbözo gén kódol (1. táblázat):

? pitvari natriuretikus hormon (atrial natriuretic peptide, ANP)

? B típusú natriuretikus hormon (brain natriuretic peptide, BNP)

? C típusú natriuretikus fehérje (CNP)

? urodilatin

Az NP családba tartozó fehérjék egy közös, erosen konzervatív, 17 aminosavból álló

gyurus szekezettel rendelkeznek (FGXXXDRIGXXSGL) [138].

39

Gén Natriuretikus

Hormon Lokalizáció

Elsodleges

termelodési hely

Fenotípus

knock out

egerekben

NPPA ANP / 32 as. 1p36.2 pitvari és kamrai

szívizom

só-érzékeny

hipertónia

NPPB BNP / 28 as. 1p36.2 agy,

kamrai szívizomzat

miokardiális

fibrózis

NPPC CNP / 22 as.

CNP / 53 as. 2

agy,

ovárium, uterus, testis

nincsen

adat

1. táblázat: Natriuretikus fehérje család [138]

as.: aminosav

Az ANP kémiai szerkezete

Az ANP primer struktúrájának meghatározása eloször 1985-ben sikerült,

egyszerre két kutatócsoportnak is, egymástól függetlenül [124, 280]. Az atrialis

izomextraktumok számos, struktúrájában alig különbözo olyan peptidet tartalmaznak,

amelyek mindegyike rendelkezik natriuretikus és vasoactív tulajdonságokkal. Az izolált

peptidek molekulasúlya 2500 és 13000 Dalton között van.

Állatban a precursor 152 aminosavat tartalmaz, emberben 151-et (human pre-pro-

ANP). A signál peptid lehasadása után a pro-ANP 126 aminosavból áll. A szekrécióra

kerülo polipeptid- láncok (fehérjék) signál peptidjének valószínuleg az a szerepe, hogy

biztosítsa az endoplazmás reticulumon át történo transzportot. A hormon intracellularis

tárolása inactív pro-ANP formában történik. A pro-ANP alkotja a pitvari

szívizomsejtekben a jellegzetes organellumokat.

40

A hormon proteolitikus enzimek hatására szabadul fel. Az aktív hormon a C-

terminalis 28 aminosavat tartalmazó fragmentuma. A keringésbe csak az aktív

hormon kerül. A keringo hormon – az aktív ANP – 28 aminosavból áll és egy 17

aminosavat tartalmazó gyurut alkot. A 7. és 23. cystein összeköto diszulfid híd jelenléte

nélkülözhetetlen a biológiai aktivitáshoz. A vasorelaxans hatás a C-terminális

közelében fekvo Phe-Arg dipeptidhez kötött, habár hiánya a vasodilatációt csak

jelentosen csökkenti, de teljesen nem szünteti meg (pl. atriopeptin I). A diszulfid híd

utáni N-terminális fragmentumok nem szükségesek a biológiai aktivitáshoz. Az N-

terminális meghosszabodása a biológiai aktivitás csökkenésével jár együtt [116].

A human ANP abban különbözik a patkányétól, hogy isoleucin helyett – a 12.

helyen – metionint tartalmaz (4. ábra).

4.A ábra: A hANP gén struktúrájának és bioszintézisének sematikus ábrája [187]

Szürke színnel jelölve az ANP, BNP és CNP polipeptid- láncok (fehérjék)

felépítésében közös aminosav struktúra.

41

4.B ábra: A hBNP gén struktúrájának és bioszintézisének sematikus ábrája [187]

Szürke színnel jelölve az ANP, BNP és CNP polipeptid- láncok (fehérjék)

felépítésében közös aminosav struktúra.

Az ANP fiziológiája

Az ANP natriuretikus és vasoaktív hatását cGMP útján fejti ki [165], amely az

alábbiak szerint érvényesül:

? befolyásolják a vese hemodinamikáját és elektrolit exkrécióját,

? hatnak a simaizomzatra,

? hatnak a vérnyomásra és a szisztémás keringésre,

? közvetlenül befolyásolják a renin-angiotensin és aldoszteron hormon

rendszereket.

42

Az ANP regulációja

Az atrialis natriuretikus peptid elválasztásánank szabályozásában számos faktor vesz

részt közvetve vagy különbözo regulációs folymatokon keresztül. Az ANP elválasztás

ingere (5. ábra):

? fokozott atrialis feszülés (hypervolemia),

? adrenalin,

? ADH,

? acetilkolin.

1. vérnyomás

2. szív strukturális és funkcionális állapota

3. tüdo-keringés

4. GFR

5. renalis sókiválasztás 6. renalis vízürítés

ANP

és

BNP

1. hipertensio

2. szívelégtelenség

3. szívizom hipertrófia

4. pulmonális hipertensio

5. só és víz retenció

Fiziológiás körülmények Patológiás körülmények

5. ábra: ANP és BNP hormonok szerepe fiziológiás és patológiás

körülmények között [138]

43

A plazma ANP koncentrációja

A plazma ANP koncentrációjának mérése specifikus radioimmunoassay-vel

(RIA) történik. Patkányban elsoként Gutkowska és mtsai (1984), Tanak és mtsai (1984),

valamint Lang és mtsai (1985) végeztek méréseket [94, 146, 274]. Emberi plazmából

eloször 1985-ben sikerült az ANP szintet meghatározni [94, 146]. Felnott egészséges

emberben a plazma ANP koncentrációja 2-15pmol/l (5-50 pg/ml) között változik.

A gyermekkori plazma ANP koncentrációja azonos a felnottkorival, de közvetlenül a

szülés után, illetve koraszülöttekben magasabb [289-292].

Az ANP felezési ideje rövid, 3.1 perc, metabolikus clearance-e 34 ml/min/kg. A

hormon lebontása dönto módon a vesében történik, a vizeletben gyakorlatilag nem

választódik ki. A keringo ANP lebontását az encephalinasek (membran metallo-

endopetidazék) végzik [277].

Natriuretikus peptidek génexpressziójának szövetspecifikus

szabályozása

Natriuretikus receptorokat ezidáig a szívben [3, 49, 135], vesében [99, 164, 203,

212], a mellékvesében [82, 231], a vékonybélben, a colonban [95], a tüdoben [49, 95,

144], a májban [206], a szemben (sugártestben, retinában) [205, 219], az agy speciális

területein (hypothalamus, septum, plexus choroideus, bulbus olfactorius stb.) [35, 49,

95], az érpályában [49, 68, 144, 213, 272] és a placentában [322] sikerült kimutatni in

situ autoradiographiával, illetve receptor kötodési vizsgálatokkal.

Ismerve a natriuretikus hormonok génexpressziójának jelentos eltérését a különbözo

szövetekben, kutatások kezdodtek az eltérések molekuláris mechanizmusának

megértésére.

44

A kérdés megválaszolására alapvetoen két fajta kísérletes úton van lehetoség:

? transzgénikus állat(ok) létrehozásával, azaz egy az embertol eltéro genetikai

állományt tartalmazó állat(ok) vizsgálatával [100, 135];

? tranziens transzfekció(k), azaz idegen DNS bejuttatásával a sejtekbe és a

mesterségesen bevitt DNS génexpresziójának vizsgálatával [316].

Tranziens transzfekciók során történo génmanipulálás egyik hatékony módszere az

elektroporáció. Ekkor a gazdasejt sejtfalának integritását elektrosokkal felbontva (kb.

15kV/cm) nagyszámú (kb. 1010 kolónia/µg) cirkulális DNS bejuttatására van lehetoség.

Garner DG és mtsai [317] a fenti módszerrel számos szövetspecifikus pozitív és negatív

regulációs helyet azonosítottak a hANP és hBNP promóter régióján (közlemények: VI.,

VII., VIII. és IX.).

Natriuretikus peptidek jelentosége cardiomyopathiában

A gyermekkori rosszindulatú betegségek 1 és 14 éves kor között (közúti

balesetek mögött) a halálokok sorában a második helyen állnak. Az utóbbi néhány

évtizedben a terápia gyors fejlodése eredményeként az esetek mintegy 70%-ában

gyógyulás érheto el.

Sajnos minden citosztatikum jelentos mellékhatásokkal bír, amelyek a betegeket

mind rövidtávon, mind hosszútávon igen megviselik. A szupportiv terápia fejlodésével

az akut következmények jól kontrollálhatók, így a figyelem az utóbbi években a

kezelések hosszú távú, az életminoséget befolyásoló késoi mellékhatásai felé fordult. A

kemoterápia következményeként a toxikus hatások érinthetik az intenzív szomatikus és

pszichés fejlodésben lévo gyermekek szinte minden szervét (máj, vese, szív, tüdo,

gyomor - bélrendszer, endokrin és exokrin mirigyek stb.), a reprodukciót, a fizikai és

szellemi képességet és a pszichés - szociális adaptációt is. Alapveto kérdés, hogy

hogyan lehetne a terápia minoségének, adagolási módjának változtatásával és/vagy a

terápia intenzitásának csökkentésével kevesebb mellékhatással ugyanolyan terápiás

effektust elérni. Különös jelentoséget ad e problémának, hogy az ezredfordulón az

adolescensek egy ezreléke gyermekkori malignitásból gyógyult egyén.

45

Az anthracyclinek cardiotoxicitása több évtizede ismeretes [21]. Súlyossága az

alkalmazott kumulatív dózis nagyságának függvénye [295]. E dózisfüggoség ellenére

cardiotoxicitás elofordulhat alacsony kumulatív dózisok alakalmazását követoen is

[145, 232, 261]. Gyermekekben a toxicus hatás nagyobb mértékben érvényesül, mint

felnottekben [211]. Lipschultz és mtsai szerint [159] azoknál, akik a kemoterápia idején

4 évesnél fiatalabbak voltak, különösen gyakori anthracyclin adása után a fokozott

afterlood megjelenése. Az anthracyclin a myocytákat károsítja, amelyet a megmaradó

myocyták hipertrófiája és interstitiális fibrosis követ. A károsodott myocardium fiatal,

növekedo szervezetben nem képes megfeleloen fejlodni, s a késobbiekben

szívelégtelenséghez, dysrhythmiához vezet akár 4-20 évvel az anthracyclin terápia után

[233, 260, 261].

A cardiotoxicitás korai felismerése, kezelése és a toxicitás megelozése vitális

kérdés, hiszen a cardiomyopathia mortalitása nagyobb, mint 6%. Az irodalmi adatok

szerint a betegek jelentos részében a progresszív cardiomyopathia csak évekkel késobb

jelentkezik, függetlenül a kezelés alatt, illetve röviddel utána megfigyelheto cardialis

tünetektol [26, 179, 211, 260, 261, 295].

Az elofordulási gyakorisága kb. 15%, de a növekvo szervezetben évekkel a terápia

befejezése után is manifesztálódhat, s gyakorisága egyes szerzok szerint elérheti a 40%-

ot. Szívizombiopsziával igazolták, hogy azon betegek többségénél, akik 240mg/m2-nél

nagyobb dózisú Doxorubicint kaptak, (a dózis arányában) progresszív elváltozás volt a

szívizomban megfigyelheto [108, 261].

A szívizom-károsodás korai felismerése a klinikai jelek megjelenése elott

életfontosságú, hogy a korrekt kezelést elkezdhessük, s az anthracyclin kezelést

félbeszakíthassuk, vagy cardioprotektor szerekkel együtt adagoljuk, ha a kezelés

folytatása vitális indikációval bír. A diagnózis felállítására leginkább alkalmazható

módszerek:

46

EKG, enzim (foleg kreatin-kináz) vizsgálatok, Holter monitorizálás. A

cardiomyopathia felismerésében dönto jelentoségu a 2D, Doppler echocardiographia. A

kamrafunkció megítélése szempontjából a 2D, Doppler echocardiographia a

legfontosabb. Az irodalmi adatok szerint szenzitivitása 37% [232, 261, 295]. Az egyéb

módszerek közül a radionucleotid angiocardiographiát és a szívizombiopsziát a hazai

gyermekkardiológiában invazív volta miatt nem alkalmazzuk.

A cardiotoxicitás korai felismerése vonatkozásában az újabb kutatások a

natriureticus hormonok (NP: ANP, BNP) felfedezésével új lehetoséget tárnak fel mind

az akut, mind a krónikus cardiotoxicitás detektálásában [143, 186]. Emellett esetleg a

hormon a toxicitás kivédésében is szerepet játszhat. Krónikus balkamra, de pulmonalis

hipertóniát követo jobb kamra elégtelenségben is, azaz dilatációhoz vezeto

cardiomyopathiát követoen jelentosen fokozódik a natriuretikus hormonok szekréciója

[132, 209, 294]. A natriuretikus hormonok szintjének emelkedését megbízható korai

jelnek tartják a cardiomyopathiá t követo szívelégtelenség kifejlodésekor [44, 168, 169].

A NP számos vasoactiv anyag szekrécióját, illetve effectusát gátolni képes (endothelin,

renin-angiotensin-aldosteron rendszer, catecholaminok, stb.) amelyek az anthracyclinek

okozta cardiotoxicus elváltozásokban minden bizonnyal szerepet játszanak. Így az NP

aktivitás emelése akár rekombináns módszerrel eloállított human NP, vagy tartós hatású

analógok, ill. az NP degradációját késlelteto neutrális endopetidáz enzimet gátló

származékok útján, terápiás eredményekhez vezethet a jövoben [36, 54, 168-170].

47

MÓDSZEREK

I. CISZTÁS FIBRÓZIS KLINIKAI ÉS GENETIKAI ADATAINAK VIZSGÁLATA

Cisztás Fibrózis Regiszter

Az országos adatbázis felállítását és feldolgozását elsoként végeztük el,

egységesített pontrendszer alapján (közlemény: XI.). A betegek adatainak

feldolgozását megkönnyíto egységes magyar pontrendszert az ismert nemzetközi

pontrendszerek (Shwachmann score [242, 243], Barbero-féle pontrendszer [13, 14] és

mások [9, 42, 80, 123, 154, 254, 278, 315]) mintájára készítettük el. Az urlap tartalmazza

a személyes adatokat, a diagnózis idopontját, az anamnézist (elsosorban az újszülöttkori

szövodményekre vonatkozólag, úgymint a meconium ileus, elhúzódó sárgaság, anaemia,

hypoproteinaemia), majd 0-3- ig, illetve néhol 0-4-ig terjedo pontokkal jellemzi a

pulmonalis és emésztorendszeri tüneteket (FEV1, FVC, köhögés, köpet, köpettenyésztés,

mellkas RTG/CT, mellkas alakja, dyspnoe, orrpolip, mesterséges O2-ellátás, PTX, kéz

ujjvégek (dobvero ujjak), cardialis status, továbbá étvágy, magasság <percentilis>,

testsúly <percentilis>, hasi fájdalom, széklet, enzim-szubsztitúció, DIOS,

májelváltozások, epehólyag, szénhidrát-anyagcsere szövodmények), majd az általános

klinikai állapotot (közérzet, szocializáció, nemi érés). Az urlap feltünteti még 3

verejtékteszt eredményét is (közlemény: XI.).

A CF-es betegek genotípus és fenotípus összefüggéseinek vizsgálatához az urlapon

feltüntetett adatok közül felhasználtuk a születés idopontját, a diagnózis idopontját

(kiszámítva az életkort a felméréskor és a diagnózis idopontjában), a testmagasság-

percentilishez és testsúly-percentilishez tartozó pontszámokat, továbbá a tüdostátuszt. A

tüdo állapotának, a pulmonalis szövodményeknek, valamint a hasnyálmirigy

muködésének és a gastrointestinalis szövodmények súlyosságának meghatározásához az

ezeket összevontan jellemzo klinikai pontokat használtam, amelyek ezeket a

paramétereket jellemzik. Így a tüdo állapotát a FEV1, FVC, köhögés, köpet, mellkas

RTG/CT, mellkas alakja és a dyspnoe pontszámainak összegével, 0-28-ig terjedo

pontszámmal jellemeztük. A pulmonalis szövodmények meghatározásához a

48

köpettenyésztés, az orrpolip (amely bár nem pulmonalis tünet, mégis a CF légúti

szövodményes manifesztációjának tekintheto), a mesterséges O2-ellátás, a PTX, a

cardialis status és a kéz ujjvégek (dobvero ujjak) (ugyanis a kardiális állapot a

pulmonalis állapotot huen tükrözi) megfelelo pontjainak összegét vettük tekintetbe, és 0-

21-ig pontoztuk. A hasnyálmirigy-muködést, a hasi fájdalmat, a székletet és az enzim-

szubsztitúciót jellemzo pontszámokkal határoztuk meg, melyek összege 0-9 közé eshet.

A gastrointestinalis szövodményeket a DIOS, a májelváltozások, az epehólyag és a

szénhidrát-anyagcsere szövodményeinek pontszámaival jellemeztem, 0-12 között.

Az általános klinikai állapotot leíró paraméterek közül vizsgáltuk a közérzet

(panaszmentes – magábazárkózó, elutasító a környezettel szemben), a szocializációt

(korának mefelelo – teljesen elkülönült egészséges társaitól) és a nemi érést (korának

megfelelo – megkésett).

Az egyes betegek pontszámainak megállapításához az 1999. és 2000. évi pontszámok

számtani átlagát vettük (amennyiben mindkét év adatai benne voltak a nyilvántartásban).

Elofordultak olyan betegek is, akiket több gondozó is nyilvántartott. Az o esetükben az

összes adatot figyelembe vettük, és a pontszámok számtani átlagával dolgoztunk.

Beteganyag

Munkánk során a Magyarországi Cisztás Fibrózis Regiszterben szereplo, 1998.

és 2000. év között évente bejelentett összes (és a 16 magyar Cisztás Fibrózis Gondozót

tartalmazó hálózatban ellátott) betegek (345 fo/’98.év, 392 fo/’99.év és 428fo/’00.év)

demográfiai, légzorendszeri és gasztrointesztinális; valamint az emócionális -, szociális

- és nemi fejlodésre vonatkozó adatait elemeztük. Természetesen az egyes években

nyilvántartott betegek összlétszáma az elozo évben, a regiszterben szereplo

gyermekkorú betegek egy részét is tartalmazza, kiegészítve az új betegek adataival.

A CFTR gén vizsgálatát 766 allél esetében végeztük el 1998 és 2000. év között a fenti

beteganyagon.

49

Külön elemeztük azon betegek adatait, akik legalább az egyik alléljükön hordoznak

egy ismert, a genetikai laboratóriumunk által vizsgált CFTR-mutációt (?F508,

G542X, G551D, R553X, N1303K és CFTRdele2,3). E szempontok alapján 137

?F508/?F508, 2 N1303K/N1303K homozigóta, 5 CFTRdele2,3/?F508, 2 G542X/?F508

compound heterozigóta, illetve 107 ?F508/ismeretlen, 8 N1303K/ismeretlen, 8

G542X/ismeretlen és 6 R553X/ismeretlen compound heterozigóta beteg adatait

dolgoztuk fel (3. táblázat). E betegcsoporthoz még hozzávettünk egy, a regiszterben

szereplo ?F508/3905insT compound heterozigóta beteget is. Összesen tehát 276 beteg

genotípusát és klinikai jellemzoit vizsgáltuk.

A fent ismertetett szempontok szerint kiválasztott betegeket a mutáció típusa, osztálya

(I-V mutációs osztály) szerint csoportosítottuk. A ?F508 és N1303K mutációk a II.

mutációs osztályba tartoznak, így homozigóta formájuk, azaz a II/II. (?F508/?F508 és

N1303K/N1303K) genotípusú betegek kerültek az 1. csoportba (2. táblázat), összesen

139-en. A CFTRdele2,3, a G542X, R553X és a 3905insT mutációk az I. mutációs

osztály tagjai, de mivel homozigóta beteget nem találtunk, I/I. genotípusú csoportot nem

tudtunk alkotni. Ezzel szemben találtunk 8 fo I/II. genotípusú beteget, akiket a 2.

csoportba soroltunk. Ide tehát a ?F508/CFTRdele2,3, a ?F508/G542X és a

?F508/3905insT genotípusú betegek tartoznak. A 3. csoportba pedig azokat a betegeket

soroltuk, akiknek csak az egyik alléljükön sikerült mutációt kimutatni, a másikon nem

ismert a mutáció, azaz ide tartoznak a ?F508/ismeretlen, N1303K/ismeretlen,

G542X/ismeretlen és R553X/ismeretlen mutációjú heterozigóta betegek, szám szerint

129-en.

50

Mut

áció

1

delta

F50

8

N13

03K

3905

insT

CF

TR

dele

2,3

G54

2X

G55

1D

R55

3X

Ism

eret

len

delta F508 137

(1.cs.)

0 1

(2.cs.)

5

(2.cs.)

2

(2.cs.)

0 0 107

(3.cs.)

N1303K 0 2

(1.cs.)

0 0 0 0 0 8

(3.cs.)

3905insT 1 0 0 0 0 0 0 0

CFTRdele2,3 5 0 0 0 0 0 0 0

G542X 2 0 0 0 0 0 0 8

(3.cs.)

G551D 0 0 0 0 0 0 0 0

R553X 0 0 0 0 0 0 0 6

(3.cs.)

Ismeretlen 107 8 0 0 8 0 6 165

2. táblázat: A CFTR gén vizsgált mutációinak csoportosítása

A számok az egyes mutációkhoz tartozó betegszámokat jelzik. A zárójelben megadott

számok a mutációs csoportokat jelzik (1-3. csoport).

51

Statisztikai analízis

Adatok az átlag ±S.D. bemutatásával történtek.

A statisztikai vizsgálatokhoz a Kruskal–Wallis-próbát és a Mann–Whitney

binomiális U-próbát használtuk fel (SPSS v10.0, Statistica v5.1 és STAT v4.0

programokkal); ill. 1-utas ANOVA és Newman-Keuls tesztet a statisztikai

szignifikanc ia számításához.

A genotípus-meghatározás módszertana

DNS kivonása

A vizsgált személyek genomiális DNS-ét teljes perifériás vérbol izoláltuk „salting

out” módszerrel. A kivont DNS mennyisége mintánként 200-1200 µg volt.

DNS-bankban történo tárolás

Az izolált DNS-mintákat -20 °C-on tároltuk, és megfelelo mennyiségu minta

összegyujtése után ezek egy részét használtuk fel a mutáció elemzésére [167].

PCR

?F508 mutáció kimutatása

A ?F508 mutáció környezetében lévo genomiális DNS-t PCR-technikával

amplifikáltuk a CFTR–VA3 (5’GTTTTCCTGGA-TTATGCCTG) és CFTR–VA4

(5’GTTGGCATGCTTTGATGAC) oligonukleotid-primerek jelenlétében. A

reakcióelegy (25 µl) 100-400 ng genomiális DNS-t, 0,4 µM 6-FAM fluoreszcens

festékkel jelölt CFTR–VA3 primert, 0,4 µM CFTR–VA4 primert, 100 µM dNTP-t, 10

mM Tris-HCl-t (pH 8,8), 50mM KCl-t, 2,5 mM MgCl2-t, 0,01%-os zselatint és 1 egység

Taq-polimeráz enzimet tartalmazott. Harminc amplifikációs ciklust hajtottunk végre

(denaturálás 93 °C-on 60 sec., annelálás 59 °C-on 60 sec., és lánchosszabbítás 72 °C-on

180 sec.) (közlemények: I. és II.).

52

G542X, G551D, R553X, N1303K mutációk kimutatása

Klasszikus PCR amplifikációs technikával (közlemények: I. és II.).

CFTRdele2,3 mutáció kimutatása

A 25 µl végtérfogatú reakcióelegy 200 ng genomiális DNS-t, egyenként 1 µM-ot

a 2,3F (5’-GAGCTTCTGAAATTAATTGACCAC-3’) és 2,3R (5’-

GAACCCATCATAGGATACAATG-3’) primerekbol, a végtérfogat 1/10 részének

megfelelo mennyiségu 10× PCR-puffert (10 mM Tris-HCl, pH 8,8, 50 mM KCl, 0,01%

zselatin), 2,5 mM MgCl2-t, 150-150 µM-t mind a négy dezoxiribonukleotidból, és 1,2

egység Taq-polimerázt tartalmazott. 32 amplifikációs ciklust hajtottunk végre.

(Denaturálás 93 °C-on 60 sec., annelálás 56 °C-on 60 sec., lánchosszabbítás 72 °C-on

120 sec.)

A 2,3F (5’-GAGCTTCTGAAATTAATTGACCAC-3’) és 2,3R (5’-

GAACCCATCATAGGATACAATG-3’) primerek, melyek a deléciós töréspontot

szegélyezik, a deléció jelenlétekor egy 206 bázispárnyi terméket sokszorosítanak, míg a

kontroll primer egy 309 bázispárnyi, a CFTR 3. exonját tartalmazó terméket állít elo

(közlemények: I. és II.).

Restrikciós emésztés G542X, G551D, R553X, N1303K mutációk kimutatásánál

Klasszikus PCR amplifikációs technikával (közlemények: I. és II.).

53

Elektroforézis

?F508 mutáció kimutatása

A ?F508 mutáció kimutatása kapilláris-elektroforézis módszerrel, ABI PRISM

310 genetikai analizátor segítségével történt (6. ábra.) (közlemények: I. és II.).

6. ábra: ?F508-heterozigóta házaspár, és ?F508-homozigóta gyermekük

genetikai analízisének eredménye

A 6. ábra tetején látható számozás a bázispárok számát mutatja. A 98. bázispárnál lévo

csúcs jelzi az egészséges génszakaszt, míg a 95. bázispárnál elhelyezkedo csúcs a

?F508-as, 3 bázispárnyi deléciót tartalmazó mutáció jelenlétét jelzi.

54

G542X, G551D, R553X, N1303K, CFTRdele2,3 mutációk kimutatása

A restrikciós endonukleázzal hasított PCR-terméket 3%-os agarózgélen

választottuk el 100V feszültség mellett, 3 órán keresztül. A DNS-sávokat etidium-

bromidos festéssel tettük láthatóvá, majd a gélt UV-fénnyel átvilágítva lefényképeztük

(7. ábra) (közlemények: I. és II.).

7. ábra: Egy CFTRdele2,3-mutációra heterozigóta, ill. egy homozigóta

vizsgálati alany genetikai analízisének eredménye

A fényképen egy CFTRdele2,3 heterozigóta és egy homozigóta DNS-sávjai láthatók,

amiket etidium-bromidos festés után UV-fénnyel átvilágítva fényképeztünk.

CFTRdele2,3

vad típusú allél

55

II. 21-HIDROXILÁZ DEFEKTUS VIZSGÁLATÁNAK MÓDSZERTANA

Beteganyag

Munkánk során a magyarországi CAH regiszterben nyilvántartott 167 beteg

esetében (153 nem rokon betegnél + 14 testvérpárnál, azaz 306 független

kromoszómán) vizsgáltuk meg a 21-hidroxiláz enzim aktív génjén eloforduló

leggyakoribb 8 mutáció (deléció, I2Splice, I172N, ClusterE6, V281L, 1761Tins,

Q318X, R356W) elofordulásának gyakoriságát (közlemények: IIII. és IV.)

DNS mintavétel

Perifériás vér lymphocitáiból Madisen és munkatársai [167] által leírt

technikával nyertünk DNS mintákat (közlemények: III. és IV.).

PCR amplifikáció

Allélspecifikus amplifikáció Wedell és munkatársai [303, 304] által leírt

módszer módosított változata alapján történt (közlemény: III.). A módszer lényege,

hogy a deléció kizárása után a gént két részletben vizsgáljuk. A deléció elotti 1-48-as

fragmentum 2 mutációs helyet tartalmaz: a 2. intronban található úgynevezett G-

mutációt, amelynek nyomán az enzim mRNS-ének splicingja hibás lesz, valamint egy

nem klasszikus klinikai formát létrehozó másik pontmutációt az 1-es exonban. A

deléciós hely utáni nagyobb 55/12-es fragmenten belül a hat leggyakrabban elõforduló

mutációt vizsgáltuk (a fragmensek elnevezésében a számok a megfelelo PCR

primerekre utalnak). Az allélspecifikus amplifikáció (ASA) során két egymással

szemben elinduló kontroll primert alkalmazunk, amelyek közül lényeges, hogy az egyik

a deléció helyétol (a 3. exonban) indul el. Az allél specifikus fragment „érzékelo”

primere a 3' végen tartalmazza vagy a normál genotípusnak, vagy a mutációnak

megfelelo szekvenciát. Ennek megfeleloen, ha normál DNS-sel van dolgunk, csak a

normál primer jelenlétében indul el az allélspecifkus fragment képzodése, ha mutáns

DNS-rol van szó, csak a mutáns primer jelenlétében kapunk allélspecifikus fragmentet,

heterozigóta DNS esetében pedig mindkét allélspecifikus fragmentre elindul a PCR

termék képzodése (közlemények: III. és IV.).

56

III. EMBERI NATRIURETIKUS HORMONOK GÉNEXPRESSZIÓJÁT

BEFOLYÁSOLÓ

TÉNYEZOK VIZSGÁLATÁNAK MÓDSZERTANA

In vitro modellkísérletek (patkány monolayer szívizom-tenyészetekben):

Plazmid konstrukciók

Tranziens transzfekciókhoz használt expressziós vektorok (plazmid

konstrukciók) alapja egy pSVoLCAT vektor volt. Ez egy többszor módosított pSV2-ßG

plazmid. A konstrukciókba a CAT (klóramfenikolacetil transzferáz) génjének bevitele

pBR322-TN9 plazmidból történt [90, 316, 317] (közlemények: VI., VII., VIII. és IX.).

A hANP és hBNP plazmid konstrukciók nevezéktana (negatív számok) utal a

konstrukcióknak a hANP ill., hBNP gének hegymeneti (upstream), a gén leolvasásának

kezdopontja (origo, nulla pont) felett, "folyásiránnyal szemben" elhelyezkedo, negatív

számokkal jelzett nukleotid szekvenciájának a hosszára (közlemények: VI., VII., VIII.

és IX.).

Sejt preparáció, transzfekció

hANP és hBNP gének szövetspecifikus génexpresszióját meghatározó

génszakaszok azonosításához pitvari és kamrai monolayer szívizom-tenyészeteket

használtunk, amelyet egynapos Sprague-Dawley patkányok szívének mechanikus

homogenizálása és enzimes emésztésével nyertünk [84] (közlemények: VI., VII., VIII.

és IX.).

57

Tranziens transzfekciót a célsejt sejtfalának integritását elektrosokkal átmenetileg

felbontva, elektroporációval valósítottunk meg: 280V, ill. 250µF szívizomsejtek esetében

és 280V, ill. 960µF fibroblasztok esetében (Bio-Rad, Richmond, California) [317]

(közlemények: VI., VII., VIII. és IX.).

A sejteket a transzfeciót követoen 72 óra múlva gyujtöttük össze és így került sor a CAT

aktivitás megmérésére [316] (közlemények: VI., VII., VIII. és IX.).

Gél shift, DNS – fehérje footprint, Northern blot analízis, szekvenálás és radioimmunoassay (RIA)

hANP és hBNP gének szövetspecifikus génexpresszióját meghatározó

génszakaszok azonosításához, valamint az itt elhelyezkedo regulációs faktorok

meghatározásához gél shift, footprint, Northern blot analízist, szekvenálást és

radioimmunoassayt használtunk, standard molekuláris biológiai módszerekkel

kivitelezve [24] (közlemények: VI., VII., VIII. és IX.).

Mechanikus stressz

Mechanikus stressznek a hBNP génexpresszióra gyakorolt hatásának

vizsgálatáthoz tranziens transzfekciót követoen, az egy napos patkányok monolayer

szívizom-tenyészetét (1x106 db sejt / edény) elozetesen collagénnel bevont Flex

edényekben helyeztük. A mechanikus stresszt úgy értük el, hogy az edény alját „Flex

Strian” berendezésben ciklikusan (60 ciklus / perc) 20-25%-kal megnöveltük [11, 12]

(közlemény: VIII.).

In vivo humán kísérletek:

Beteganyag

Anthraciklinek a hANP génexpresszióra (mint az anthraciklinek által kiváltott

cardiomyopathia lehetséges prognosztikai faktorra) gyakorolt szelektív hatásának in vivo

tanulmányozása céljából 1994-tol 2000- ig a Semmelweis Egyetem II. sz.

Gyermekgyógyászati Klinikán kezelt ötven hematológiai (ALL, AML, NHL, Hodgkin

58

limfómás) és szolid tumoros (oszteoszarkómás: OSC) beteget vizsgáltunk. A gyermekek

betegségük dignózisának és stádiumának megfelelo – nemzetközi terápiás protokollok

által eloirt – dózisú anthracyclin kezelést kaptak. Harmincketto hematológiai-, ill. 18

solid tumoros –oszteoszarkómás– beteg vett részt a tanulmányban. A vizsgált

betegcsoportban az átlagéletkor 9,1 év volt. A kapott kumulatív anthracyclin dózis 300

mg/m2 körüli érték a szórás figyelembevételével. A szérum ANP szintjét mértük a

kezelés megkezdése elott, különbözo anthracyclin dózisok után, illetve fél, 1 és 2 éves

kontroll idopontokban. Párhuzamosan EKG, szívultrahang (ACUSON 128XP),

vesefunkciós felmérés is történt. A szérum ANP hormon meghatározása

radioimmunometriás próbával (IRMA, immunoradiometric assay) történt (közlemény:

X.).

59

EREDMÉNYEK

I. A cisztás fibrózis (CF) megbetegedéssel kapcsolatos, a klinikai gyakorlatban is

hasznosítható, a betegség klinikai és genetikai összefüggéseit elemzo

megállapítások:

1. Magyarországon elsoként vezettük be a cisztás fibrózisos betegek klinikai

tüneteinek és laboratóriumi eltéréseinek egységes szempontrendszer szerinti

leírását és osztályozását (közlemények: I., I./2. táblázat, II. és XI.).

2. A Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekgyógyászati Klinikán létrehoztuk a

fenti egységes szempontrendszeren alapuló, Magyarországi Cisztás Fibrózis

Regisztert (országos lefedettség) (közlemények: I., II. és XI.).

3. Leíró statisztikai mutatókkal elsoként jellemeztük a teljes, nyílvántartott hazai

CF beteg populációt. A Magyarországi Cisztás Fibrózis Regisztertben

nyílvántartott betegek átlagéletkora 12.5 ± 7.4 év volt (0.01 – 52 év között;

n=417) a 2000. évben. A betegek 3.2%-a 1 évesnél fiatalabb és 21%-a 18

évesnél idosebb volt. A CF-es betegek kb. 10%-ánál a diagózis a születést

követoen 10 nappal került felállításra, 45%-uknál pedig 1 éves koruk elott

(közlemény: I., I./1. ábra, I./2. ábra, I./3. ábra és I./4. ábra).

4. Elsoként közöltük a magyarországi CF-es populációt jellemzo statisztikai

méroszám változását az ido függvényében. A vizsgált idoszak alatt (3 év: 1998-

2000) a betegek tüdoállapotát jellemzo érték szignifikáns növekedést mutatott

(évi 1.1 pontos növekedés), azaz állapot romlást mértünk (p<0.000001).

Hasonló állapotromlást észleltünk a gasztrointesztinális értékeket leíró

mutatóknál (évi 0.32 pontos növekedés; p=0.0017) (közlemény: I./5. ábra).

60

5. Magyarországon elsoként elemeztük és mutattunk ki szignifikáns (p<0.005)

összefüggést a CF-es betegek szomatikus klinikai tünetei, ill. laboratóriumi

eltérései és a betegek közérzete, szocializációja és nemi érése között. Ezzel

közvetlen segítséget tudunk nyújtani a CF-es kezelo orvosok számára a

krónikus beteg ellátás során felmerülo, látszólag nem közvetlenül a gyermekek

alapbetegségével összefüggo problémák megoldására (közlemény: I. és I./3.

táblázat).

6. Elsoként közöltük a magyarországi ismert CF-es betegek CFTR génjének

mutációs spektrumát (országos feldolgozottság). Ezzel megteremtettük a

lehetoséget, hogy Magyarország is bekapcsolódjon a CFTR gén heterogenitását

vizsgáló populáció genetikai európai és egyéb nemzetközi vizsgálatokban. A

CFTR gén leggyakoribb „európai” mutációját, a ?F508 mutációt 766 allél

esetében vizsgáltuk, amelyek közül 52.2%-ban volt kimutatható a mutáció

jelenléte. A „mediterrán” országokra jellemzo mutációk (G542X, R553X és

N1303K) 1% felett fordulnak elo (2.3%, 1.4% és 2.7%) a magyarországi CF-es

populációban. Eredményünk megegyezik a környezo országok CFTR gén

mutációs spektrum elemzésével.

A regiszter elso, 1998-as összeállítása óta a CF-betegeknél nem sikerült

kimutatni egyetlen G551D mutációt sem. Ezen kívül nem találtunk a

CFTRdele2,3, G542X, illetve az R553X mutációkra homozigóta betegeket sem.

Ez tény a felsorolt mutációk ritka voltával és a regiszterben szereplo beteganyag

viszonylag kis számával magyarázható (közlemények: I., I./4. táblázat, II. és

II./3. táblázat).

7. A nemzetközi irodalmi ajánlásoknak megfeleloen, elsoként végeztük el a hazai

genotípus – fenotípus összefüggések országos elemzését. A ?F508 mutáció és a

FEV1, FVC, köhögés, köpet, köpet mikrobiológiai tenyésztése, mellkas alakja,

felso légúti szövodmények, kéz ujjvég, széklet és a DIOS súlyosságát leíró

klinikai tünetek megléte között szignifikáns összefüggés volt kimutatható

(közlemény: II., II./4. táblázat és II./6. táblázat).

61

8. A CFTR gén mutációinak ismeretében, a kezeloorvosok számára megbízható

elorejelzés készítheto a betegségre jellemzo klinikai tünetek, szervi

manifesztációk súlyosságáról. A ?F508 és az N1303K mutációra homozigóta

betegek nagyobb százalékának van súlyosabb pancreas-érintettsége, mint

azoknak a betegeknek, akiknek csak az egyik mutációját sikerült azonosítani

(közlemények: II., II./6. táblázat, II./1. ábra, II./2. ábra).

9. Saját vizsgálataink alapján igazoltuk, hogy a cisztás fibrózisban szenvedo

betegek klinikai prognózisának megítélésében szignifikánsan meghatározó a

kóros hasnyálmirigy-muködés. Amennyiben a betegnél a tünetek

hasnyálmirigy-elégtelenségre utalnak, úgy a tüdo rosszabb állapotára is

számítani kell, és ezek a betegek még szorosabb kontrollra szorulnak

(közlemény: II.).

II. A congenitalis adrenalis hyperplasiát (CAH) okozó 21-(szteroid)-hidroxiláz

enzim defektussal (21-OHD) kapcsolatos klinikai és genetikai megállapítások:

1. Magyarországon elsoként, országos lefedettséget biztosító program keretében

167, a CAH regiszterben nyilvántartott 21-hydroxiláz enzim defektusos beteg

klinikai adatait és a CYP21 gén genetikai analízisét végeztük el. Ez a

legnagyobb genetikai elemzés Közép-Európában ezen betegek körében

(közlemények: III. és IV.).

2. A 167 megvizsgált beteg közül 101 fo (60.5%) volt klinikailag sóveszto (SW),

45 fo (26.9%) szimpla virilizáló (SV) és 21 fo (12.6%) nem klasszikus (NC)

formába besorolható. Mivel a genetikai vizsgálatba bevont betegek nemi

megoszlása és klinikai spektruma megegyezett a teljes magyarországi CAH

regiszterben szereplo betegek adataival, ezért a vizsgálatból levont

következtetések kiterjeszthetoek a teljes magyar CAH populációra

(közlemények: III., III./1. táblázat és IV.).

62

3. Meghatároztuk a magyarországi 167 szteroid 21-hidroxiláz enzimdefektusos

beteg CYP21 génjének mutációs spektrumát (306 független kromoszóma

vizsgálatával). A leggyakoribb 8 mutáció vizsgálatával a 306 kromoszómából

282-ben (92.1%) azonosítottuk a CYP21 gén mutációját. Összesen 12 betegben

(7.2%) nem sikerült mutációt azonosítani, és 17 betegben (10.2%) csak az egyik

allélon tudtunk mutációt igazolni. A leggyakoribb genotípus formák a

következok voltak: In2 / In2 vagy deléció 30.5%-ban; I 172N / I 172N vagy

deléció 10%-ban és deléció / deléció 9%-ban (közlemények: III., III./2.

táblázat és IV.).

4. Meghatároztuk a magyarországi 167 21-OHD CAH beteg genotípusának és

fenotípusának összefüggéseit. Eredményeink szoros genotípus – fenotípus

összefüggést mutattak: a nulla enzimaktivitást eredményezo mutációk (deléció,

Q318X, R356W, 1761Tins és ClusterE6) nagyon súlyos, sóveszto formát

okoznak; a 2%-os maradvány enzimaktivitást eredményezo mutáció (I172N)

középsúlyos, egyszeru virilizáló formát okoz; a mérsékelt (20-50%-os)

enzimaktivitással járó mutáció (V281L) enyhe, késon manifesztálódó

betegségekre vezet. 21-OHD-nál a két allél mutációjából az enyhébb

enzimhibát okozó mutáció határozza meg a fenotípust. (közlemények: III., IV.

és IV./ 2. táblázat).

5. Összehasonlítottuk a hazai és a környezo, ill. más európai országok 21-OHD

betegei genotípus elemzéseinek eredményét. A magyarországi CAH

regiszterben szereplo betegek CYP21 génjének mutációs spektruma

megegyezik a hasonló nemzeti szurési programok során nyert svéd-, lengyel-

ill. görögországi adatokkal (közlemények: III., IV. és V.).

63

III. Emberi natriuretikus hormonok (hANP, hBNP) génexpresszióját befolyásoló

mehanizmusokkal kapcsolatos megállapítások:

In vitro patkány modellkísérletek során vizsgálva:

1. Tranziens transzfekciókkal azonosítottunk egy szövetspecifikus, a

transzkripcióra gátló (negatív) hatással bíró elemet a -1206 és -1152

nukleotidok közötti (54 bázispár) hosszú szakaszon a hANP gén leolvasásának

kezdopontja felett, „folyásiránnyal szemben” (upstream) (közlemény: VI.,

VI./1. ábra).

2. Bizonyítottuk, hogy ezen régió monolayer fibroblaszt-tenyészetben

kapcsolatban áll több szolubilis proteinnel. DNS – fehérje footprint analízis 4

db „fedett” területet igazolt az 54 bázispár szakaszon (közlemény: VI., VI./2.

és 3. ábra).

3. Az 54 bázispár hosszú hANP génszakasz egy E-boxot (CAACTG) tartalmazó

elemének „site-directed mutageneis”-sel történo megváltoztatása csökkentette a

fehérje kötést, valamint a génszakasz szövetspecifikus aktivitását (közlemény:

VI., VI./ 4., 5. és 6. ábra).

4. Tranziens transzfekciókkal igazoltuk, hogy a teljes hBNP promóter, a gén

leolvasásának kezdopontja felett, „folyásiránnyal szemben” (upstream) (-1818

és +100 bp. között) szignifikánsan aktívabb a kamrai, mint a pitvari monolayer

szívizom-sejt tenyészetben és teljesen inaktív fibroblaszt tenyészetben

(közlemény: VII. és VII./2. ábra).

5. A hBNP promóter génszakasz disztális része tartalmaz mind negatív, mind

pedig pozitív regulációs elemeket (közlemény: VII., VII./3. ábra).

6. A hBNP promóter génszakasz proximális része (-127 és -40 bp. között) felelos

a szövetspecifikus génexpresszióért (közlemény: VII. és VII./4. ábra).

64

7. Elsoként igazoltuk hBNP génexpressziójának növekedését mechanikus, ciklikus

stressz hatására (közlemény: VIII. és VIII./1. ábra).

8. Igazoltuk MAPK (mitogén-aktivált fehérje kináz) és JNK (c-Jun N-terminal

kináz) szerepét hBNP génexpressziójának növekedésében mechanikus, ciklikus

stressz hatására (közlemény: VIII., VIII./2., 3., 4., 5. és 6. ábra).

9. Elsoként azonosítottuk a natriuretikus peptideket (hANP és hBNP), mint

doxorubicin toxicitás okozta cél molekulákat szívizomsejtekben (közlemény:

IX.).

10. Doxorubicin gátolja a natriuretikus hormonok (NP) szekrécióját, az mRNS

termelodését, valamint a hANP és hBNP génexpresszióját (közlemény: IX.,

IX./1., 2., 3., 4. és 5. ábra).

11. A doxorubicin okozta NP gátlás kifejezettebb hBNP mint hANP szekréció és

génexpresszió gátlás esetében (közlemény: IX., IX./2. és 4. ábra).

In vivo humán kísérletek során vizsgálva:

12. Anthraciklinnel kezelt malignus betegségben szenvedo gyermekek szérum ANP

szintjét mértük a kezelés megkezdése elott, különbözo anthracyclin dózisok

után, illetve fél, 1 és 2 éves kontroll idopontokban. A vizsgálat idotartama alatt

egy esetben észleltünk klinikai tünetekkel is járó és EKG, szívultrahanggal

igazolt súlyos cardiomyopathiát, amelyet a szérum ANP szignifikáns

emelkedése is kimutatott megelozve a szívultrahanggal (ECHO) kimutatható

elváltozásokat (p=0,005) (közlemény: X.).

65

MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK

Értekezésemben négy gén szekvencia, a cisztás fibrózis (CF) kialakulásáért

felelos CFTR gén, a congenitalis adrenalis hyperplasia (CAH) kialakulásáért felelos

21-(szteroid) -hidroxiláz enzim defektust (21-OHD) okozó CYP21 gén mutációinak

vizsgálatát, valamint cardiomyopathiákban a natriuretikus hormonok, a hANP és a

hBNP gének szekvenciáit, továbbá in vitro modellkísérleteken a szövetspecifikus

termelodéséért felelos hANP és hBNP génexpresszióját meghatározó tényezoket

elemzem.

I. CISZTÁS FIBRÓZIS MEGBETEGEDÉS GENOTÍPUS – FENOTÍPUS ELEMZÉSE

Magyarországi CF-es populáció genotípusának jellemzése

(mutációs spektrum)

A Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekgyógyászati Klinikájának molekuláris

genetikai laboratóriumában 1990. évben a ?F508 mut áció (a ?F508 mutáció a ? I507

mutációt is detektálja), majd 1992-tol további négyféle mutáció (G542X, G551D,

R553X, N1303K) elemzésére van lehetoség a CF-es betegektol beérkezett

vérmintákon. Indokolt esetben lehetoség van további 32 mutáció vizsgálatára is, egy

speciális kitt révén. E hat mutáció az európai populáció körében a leggyakoribbak

közé tartozik, és vizsgálatukkal a CF-es (klinikai tünetekkel bíró, a CF diagnózis

kritériumainak megfelelo) betegek kb. 32%-ában mindkét, kb. 28%-ában pedig

legalább az egyik kromoszómán diagnosztizálható mutáns gén. Megközelítoleg a

vizsgált betgek 40%-ban nem tudtuk igazolni a betegségért felelos CFTR gén

mutációt. Az általunk vizsgált mutációk részletezése jellegük és gyakoriságuk

szerintaz I., II. és XI. közleményekben ismertetem.

66

A ?F508 mutáció [129] 3 bázispár delécióját eredményezi a gén 10. exonjában

(az NBD1-et kódoló területen), az 1652. és 1655. nukleotidok között, ami a fehérjelánc

508. helyén egy fenilalanin hiányához vezet. Feltételezik, hogy ez a mutáció a neolitikus

korban, 3-6 ezer évvel ezelott terjedt el a Közép-Keletrol bevándorló telepesek által, és

fokozatosan haladt Északnyugat-Európa felé [48, 73, 74]. Ezzel magyarázható a

jellegzetes földrajzi megoszlása: a mutáció gyakorisága északnyugatról délkelet felé

haladva csökken [19], a dániai 90%-ról a törökországi 30%-ra [114, 321]. Több európai

populációban, így Belgiumban, Németországban, Hollandiában [41, 57, 98, 177, 293,

302], valamint Angliában és Franciaországban 70% feletti a gyakorisága [162, 301], míg

az askenázi zsidók között csupán 30% [2]. Relatív gyakorisága 67,2%-ra teheto [48, 73,

74, 86]. A mutáció hazai elofordulásáról több cikk is közölt már adatokat [71, 77, 188,

189, 193, 275]. Ezek közül az általunk végzett, legnagyobb betegszámú (276 beteg)

vizsgálat szerint a mutáció gyakorisága a biztos diagnózisú betegek körében (CF klinikai

diganózis megléte és pozitív verejték teszt) 63,3%, a teljes betegszámra (CF klinikai

diagnózis megléte és negatív vagy pozitív vereték teszt) vonatkoztatva pedig 50,3%. A

?F508 a II. mutációs osztály tagja.

A G542X mutáció a CFTR-gén 1756. nukleotidjában, a 11. exonon (az NBD1-et

kódoló területen) egy guanin? timin cserét eredményez, mely a kódolt fehérje 542.

aminosav-pozíciójában stopkodont okoz egy glicin helyén [34]. A mutáció relatív

gyakorisága 3,4%. Európában a leggyakoribb elofordulási gyakoriság (8%-os) a spanyol

populációban tapasztalható [48, 73, 74, 86]. Az eddig közölt adatok szerint a magyar

populáción belüli elofordulása a biztos CF-es betegekre vonatkoztatva 4%, az összes

betegre vonatkoztatva 3,2% [189]. Az I. mutációs osztályba tartozik.

A G551D mutáció az elozohöz hasonló pontmutáció a 11. exonon, az NBD1-

génszakasz területén. Az 1784. nukleotid guanin? adenin cseréjét okozza, ami a fehérje

551. aminosavának, egy glicinnek aszparaginsavra való felcserélodésével jár [47].

Európában relatív gyakorisága 2,4% [48, 73, 74, 86], de 1996-ig hazai betegben nem

sikerült azonosítani [189]. A regiszter azóta sem tart nyilván ilyen mutációt hordozó

67

beteget. A legnagyobb gyakorisággal az angol populációban fordul elo [235]. A III.

mutációs osztályba sorolható.

Az R553X mutáció szintén az NBD1-et érinto génszakaszt, pontosabban a 11.

exont érinti, és az 1789. nukleotid citozin? timin szubsztitúciója, ami a fehérjeláncon

egy stopkodon megjelenéséhez vezet az 553. aminosav-pozícióban lévo arginin helyén

[47, 130]. Relatív frekvenciája európai adatok szerint 1,3%. A német populációra

jellemzo mutáció [48, 73, 74, 86]. Németh és mtsai 1,3%-os és 1,7%-os elofordulási

gyakoriságot mutattak ki az összes beteg, illetoleg a biztosan CF-es betegek körében

[189]. Az I. mutációs osztály tagja.

Az N1303K mutáció az NBD2-t érinto pontmutáció. A 21. exonon található, és a

4041. nukleotid citozin? guanin cseréjét eredményezi, ami a fehérjén az 1303.

aszparagin lizinre való felcserélodésével jár [200]. Relatív gyakorisága 1,8%. Európán

belül Olaszországban fordul elo a legnagyobb arányban [48, 73, 74, 86].

Magyarországon az összes beteg körében 1,6%-os frekvenciával, a biztos CF-es betegek

között pedig 2%-os gyakorisággal szerepel [189]. A II. osztályba tartozó mutáció.

A CFTRdele2,3 mutáció egy hatalmas, 21 080 bázispárt felölelo, az 1-3. intronra

kiterjedo deléció, melynek eredményeképp a 2. és 3. exon eltunik az epithelialis CFTR

mRNS-érol. Ezáltal a 4. exonon belül egy korai transzlációs terminációs szignál

keletkezik [66]. A nyugati és keleti szlávok jellegzetes mutációja. Leggyakoribb

elofordulása a cseh populáción belül észlelheto (6,4%), míg a délszláv populációban nem

fordul elo [66]. Az I. mutációs osztályba sorolható.

A CFTR gén leggyakoribb „európai” mutációjának, a ?F508 mutációnak és a

„mediterrán” országokra jellemzo (G542X, R553X és N1303K) mutációknak a

gyakorisága megegyezik a környezo országok CFTR gén mutációs spektrumával

(közlemények: I. és II.) [48, 73, 74, 86]. Európai országokkal összehasonlítva

hazánkban a ?F508 mutáció alacsonyabb ill. a G542X, R553X és N1303K mutációk

magasabb elofordulást mutatnak (hasonlóan Szlovákia és Ausztria esetében) [121, 122,

148, 267, 297]. Mindez Magyarország esetében magyarázható a Dunán és a Tiszán

68

megvalósuló retrográd kolonizációval, valamint a 150 éves török megszállás alatt az

ország népességének 4 millióról 1.4 millióra történt csökkenésével, ami lehetoséget

teremtett a jelentos számú betelepülésre (közlemények: I. és II.) [29, 131, 222].

Magyarországi CF-es populáció klinikai adatainak elemzése

a genotípus tükrében

A Magyarországi Cisztás Fibrózis Regiszterben (2000) nyilvántartott betegek

adatainak feldolgozása során 276, legalább részben ismert genotípusú beteg genetikai és

klinikai jellemzoin keresztül vizsgáltuk a CF-betegség geno-fenotípus összefüggéseit. A

276 beteget két szempont szerint soroltuk csoportokba. Az elso szempont a kimutatott

mutációk típusa volt, amelynek alapján 3 csoportot hoztunk lé tre. Az 1. csoport tagjai az

I. mutációs osztályra voltak heterozigóták. A 2. csoportba az I. és II. osztályra

heterozigóták kerültek. A 3. csoportot azokból a betegekbol alkottuk, akik az egyik

alléljükön I. vagy II. osztálybeli mutációt hordoznak, a másik mutációjuk viszont

ismeretlen.

A másik szempont, a hasnyálmirigymuködés megváltozásának mértéke volt. Ennek

alapján a betegeket két csoportra osztottuk. Az A. csoport tagjainak

hasnyálmirigymuködése jó vagy csak enyhén károsodott, míg a B. csoport tagjainak

klinikai tünetei súlyosabbak.

E csoportokat az alábbi jellemzok alapján vizsgáltuk: a diagnózis idopontjában vett

életkor, a jelenlegi életkor, a testmagasság- és testtömeg-percentilis, a tüdo állapot, a

tüdoszövodmények, a pancreasfunkció és az emésztoszervi szövodmények.

Szignifikáns eltérés az elso vizsgálati szempont alapján csak a diagnózis idopontjában

lévo életkor, azaz a betegség felismerésének idopontja és a pancreasfunkció

szempontjából volt az 1. és 3. csoport között. Ez alapján azt mondhatjuk, hogy a II./II.

homozigóták esetében a cisztás fibrózis betegség korábban kezdodik, míg az I-

II/ismeretlen genotípusú 3. csoportban a betegség viszonylag késobb kerül felismerésre.

A II/II. genotípusú betegek hasnyálmirigy-muködést jellemzo klinikai tünetei

súlyosabbak, mint az I-II/ismeretlen genotípusú betegek tünetei, feltehetoen a

panreasfunkció súlyosabb károsodása miatt. A többi paraméter függvényében egy

69

csoport sem mutatott eltérést. Ezenkívül az is megállapítható, hogy a II/II. csoportba

tartozó ?F508-as és a N1303K mutációra homozigóta betegek nagyobb százalékának van

komolyabb pancreas-érintettsége, mint azoknak a betegeknek, akik csak egy ismert

mutációt hordoznak.

A diagnózis idopontjában lévo életkort vizsgáltuk a genotípuscsoportok

függvényében. Az 1. betegcsoport mediánértéke 0,3 év (a 25 percentilis 0,1 év, a 75

percentilis 1,5 év) volt. A 2. betegcsoportban ugyanerre a jellemzore a mediánérték 0,46

év (25 percentilis 0,1, 75 percentilis 0,6 év), míg a 3. csoport mediánértéke 0,6 év (25

percentilis 0,2, 75 percentilis 4 év) volt. Szignifikáns különbséget találtunk az 1. és a

3. csoport diagnózis idopontjában vett életkorának mediánja között (p=0,03) (8.

ábra).

8. ábra. A diagnózis idopontjában vett életkor a csoportok függvényében

Min-Max 25%-75% Median value

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1 2 3

p = 0,03

Betegcsoportok

Éle

tkor

(év)

70

A hasnyálmirigy-muködés minden esetben összefüggött a vizsgált klinikai

tünetekkel. A pancreas eredetu tünetek tekintetében nagyobb pontszámmal bíró betegek

jelenleg fiatalabbak, kisebb a testmagasság és testsúly-percentilisük, betegségüket

általában korábban ismerik fel, tüdo állapotuk elorehaladottabb betegségre utal, továbbá

gyakran súlyosabbak a tüdo- és gastrointestinalis szövodményeik is.

A kapott eredmények alapján a szakorvosok figyelmét arra kell felhívni, hogy a

prognózis megítélésében meghatározó a hasnyálmirigy-muködés érintettségének

mértéke. Amennyiben egy betegnél a tünetek hasnyálmirigy-elégtelenségre utalnak,

úgy a tüdo rosszabb állapotára, valamint komolyabb pulmonalis és

gastrointestinalis szövodmények megjelenésére vagy jelenlétére lehet számítani, és

ezek a betegek még szorosabb kontrollra szorulnak.

A genotípus alapján azt állíthatjuk, hogy a II. osztály mutációira (elsosorban a ?F508-ra)

homozigóta betegek esetében a hasnyálmirigy-muködésre nagyobb figyelmet kell

fordítani, mivel ez a genotípus gyakrabban társul pancreas-elégtelenséggel, ami a fentiek

értelmében rosszabb prognózisra utalhat (közlemények: I., II. és XI.).

A Magyarországi Cisztás Fibrózis Regiszter adatai alapján elvégzett genotípus –

fenotípus elemzés, tekintheto az elso magyarországi CF-es populációt leíró

vizsgálatnak. A cisztás fibrózis klinikai megjelenése és a betegség kialakulásáért

felelos CFTR gén mutációs spektruma közötti összefüggés megegyezik más európai

országok nemzeti adataival [48, 73, 74, 86]. Jelen munkában módosító gének direkt

vizsgálata nem volt célkituzés. Cisztás fibrózis klinikai megjelenési formájában játszott

szerepükre az azonos CFTR gén mutációs spektrummal rendelkezo, de klinikailag

jelentosen eltéro tüneteket mutató betegek megfigyeléseibol következtethetünk.

Vizsgálataink megerosítik azt a feltételezést, hogy habár a cisztás fibrózist jelenleg

klasszikus monogénes betegségként tartjuk számon, ugyanakkor a kialakuló tünetek, ill.

ezek súlyosságában valószínuleg az un. modifikáló gének is szerepet játszanak [69, 224,

326].

71

II. 21-OHD DEFEKTUS OKOZTA CAH GENOTÍPUS – FENOTÍPUS ELEMZÉSE

A genotípus-fenotípus kutatás egyre bovülo nemzetközi irodalma ellenére,

hazánkban még nem történt meg egy országos vizsgálat keretében a magyarországi

CYP21 gén mutációs spektrumának feldolgozása, valamint a hazai genotípus – fenotípus

összehasonlító elemzés elvégzése. Jelen dolgozat, mint az elso országos beteganyagon

történt elemzés ehhez szolgál adatokkal, ezzel segítséget nyújtva a hazai

kezeloorvosok munkájában (közlemények: III. és IV.).

Magyarországi 21-OHD-os populáció genotípusának jellemzése

(mutációs spektrum)

Jelen dolgozat egyik célkituzése volt, hogy meghatározzuk a magyarországi

szeroid 21-hidroxiláz enzim defektus okozta congenitális adrenális hyperplásiás betegek

genotípus megoszlását, ill. hogy elemezzük a genotípus vs. fenotípus összefüggéseit. Ez

a legnagyobb genetikai elemzés Közép-Európában ezen betegek körében [64, 81,

139]. 167 diagnosztizált 21-OHD CAH betegnél (153 nem rokon betegnél + 14

testvérpárnál, azaz 306 független kromoszómán) végeztük el a CYP21 gén mutáció

analízisét. Ez a szám 62.3%-át teszi ki a magyarországi CAH regiszterben szereplo élo

betegek számának. Munkánk során a 8 leggyakoribb mutáció meglétét vizsgáltuk. Ezzel

a módszerrel 155 (92.8%) CAH beteg mutációját sikerült meghatározni, ugyanakkor 12

fo (7.2%) genetikai vizsgálatánál nem sikerült a mutációt kimutatni. Eredményünk

megfelelo, ha figyelembe vesszük, hogy az általunk vizsgált 8 mutáció a CYP21 génen

eloforduló mutációk 90-92%-át alkotja [183, 305] (közlemények: III., IV. és V.).

Szteroid 21-hidroxiláz enzim defektus esetében, az enzimet kódoló génszakasz

(CYP21) nagy variabilitása miatt, a genetikai diagnózis felállítása komplikáltabb, mint a

legtöbb monogénes öröklodésu betegségben. Vizsgálatok támasztják alá, hogy a klinikai

fenotípus megoszlása nem mindig egyezik meg a CYP21 gén mutációs spektrumával

[313]. Például az In2 mutáció jelenléte számos klinikai formához társulhat [226, 314],

72

habár az általunk vizsgált betegeknél az In2 mutáció jelenléte minden esetben súlyos

mineralokortikoid defektus klinikai képét mutatta. Ugyanakkor azt találtuk, hogy az

I172N mutáció jelenléte nagyfokú klinikai variabilitást mutat. Ezen eredményünk

megegyezik Jääskeläinen és munkatársai (1997) eredményeivel [117]. Ismert, hogy az

I172N mutáció jelenléte erosen csökkent szeroid 21-hidroxiláz enzim aktivitással társul.

Az enzim aktivítása 1-2%-a a vad típusú alléllal rendelkezokének. Klinikailag az I172N

mutáció jelenléte szimpla virilizáló (SV) formához társul, ugyanakkor az I172N/deléció

típusú genotípust sóveszto (SW) betegekben is leírták [38, 312] (közlemények: III.,

IV.és V.).

A magyarországi CAH regiszterben szerpelo betegek CYP21 génjének mutációs

spektruma megegyezik a hasonló nemzeti szurési programok során nyert román-, svéd-,

ill. görögországi adatokkal [67, 81, 92, 305, 312] (közlemények: III., IV.és V.).

73

III. NATRIURETIKUS HORMONOK GÉNEXPRESSZÓJÁT BEFOLYÁSOLÓ

TÉNYEZOKKEL KAPCSOLATOS EREDMÉNYEK ELEMZÉSE

ANP génexpresszióját befolyásoló hemodinamikai változások

Állatkisérletes vizsgálatokaban a kamrai ANP génexpressziójának növekedését

döntoen a szívet ért volumen túlterhelés és szívizom hipertrófia okozza [151, 173]. ANP

az egyik legjobb molekuláris markere a szívizom hipertrófiának, tekintettel arra, hogy a

fiziológiás körülmények között alacsony ANP mRNS szint szívizom hipertófiában 10-

15-szörös emelkedést mutat [133, 149]. Krónikus szívelégtelenség fokának

megállapítására a szérum ANP szint mérése megfeleloen érzékeny marker lehet [51,

282, 320].

BNP génexpresszióját befolyásoló hemodinamikai változások

Vizsgálatok azt igazolják, hogy a szérum BNP szint érzékenyebb molekuláris

markere a szív balkamra funkciójának monitorizálására, valamint krónikus

szívelégtelenség diagnózisának felállítására, mint a szérum ANP koncentrációjának

mérése [50, 137, 176, 319]. Továbbá a szérum BNP mérése krónikus

szívelégtelenségben prognosztikai faktorként és a terápia monitorizálására is alkalmas

molekuláris marker [199, 287, 288].

ANP gén transzkripciós regulációja

A patkány és az ember ANP génjének nagyfokú azonossága (homológiája)

alapján feltételezhetjük, hogy az ANP gén transzkripciós regulációjában osi, az

evolúciós fejlodés során nem sok változáson keresztülment regulációs elemek vesznek

részt [6].

Tranziens transzfekciókkal azonosításra került egy pozitív hatású, szövespecifikus elem

(-400 és -333 nukleotidok közötti szakaszon; a hANP gén leolvasásának kezdopontja

felett; „folyásiránnyal” szemben (upstream)), amely felelos a hANP szívizom-sepcifikus

génexpressziójáért [316].

74

Patkány ANP gén promóter régiójának vizsgálatakor -700 bp-nál (-136 és -700 bp

közötti szakaszon) egy, a szív fejlodése során a pitvari és kamrai szívizomban történo

eltéro mértéku génexpresszióért felelos elemet írtak le [7].

Saját vizsgálatainkkal igazoltunk egy szövetspecifikus, a transzkripcióra gátló (negatív)

hatással bíró elemet -1206 és -1152 nukleotidok közötti (54 bázispár) hosszú szakaszon

a hANP gén leolvasásának kezdopontja felett, „folyásiránnyal szemben” (upstream)

(közlemény: VI., VI./1. ábra).

Idáig, számos az ANP génexpressziójában alapveto fontosságú kötodési hely, ill.

regulációs elem került azonosításra. Ezek közül kiemelem:

? E-box szekvenciát tartalmazó kötodési hely (E-box motif: CANNTG):

Eloször 1991-ben leírt [306] kötodési helyet tartlamazó génszakasz, amely a

myoD (a mioblasztokban aktív gén, a mioblaszt érését stimulálja; a myoD

protein család tagja a miogenin, az Myf5, és az MRF4 is) és HLH fehérjékkel

lép kapcsolatba (helix- loop-helix (HLH), helix-hurok-hélix (HHH); ezek a

fehérjék két amfipatikus helix-szerkezetet, hidrofób aminosavakat (leucint,

fenilalanint) és egy poláris részt tartalmaznak; ezek diméreket képezve

szabályozzák a génmuködést; ebbe a csoportba fontos rákkelto gének, emberi

proto-onkogének, pl. a c-myc gén, illetve termékei tartoznak).

Tranziens transzfekciókkal azonosítottunk egy szövetspecifikus, a transzkripcióra

gátló (negatív) hatással bíró elemet -1206 és -1152 nukleotidok közötti (54

bázispár) hosszú szakaszon a hANP gén leolvasásának kezdopontja felett,

„folyásiránnyal szemben” (upstream) (közlemény: VI., VI./1. ábra).

Bizonyítottuk, hogy a hANP promóter régió -1206 és -1152 bp. közötti szakasza

monolayer fibroblaszt-tenyészetben kapcsolatban áll több szolubilis proteinnel.

DNS – fehérje footprint analízis 4 db „fedett” területet igazolt az 54 bázispár

szakaszon (közlemény: VI., VI./2. és 3. ábra).

75

Az 54 bázispár hosszú hANP génszakasz, egy E-boxot (CAACTG) tartlamozó

elemének „site-directed mutageneis”-sel történo megváltoztatása csökkentette a

fehérje kötést, valamint a génszakasz szövetspecifikus aktivitását (közlemény:

VI., VI./ 4., 5. és 6. ábra).

? NKE (Nkx-2.5 response element: Nkx-2.5 regulációs elem):

egyéb transzkripciós faktorokkal együtt a szívizom-specifikus génexpresszióért

felelos [70].

? NKE2 (egy másik , az NKE-tol disztálisan elhelyezkedo Nkx-2.5 regulációs

elem): patológiás körülmények alatti ANP génexpresszióért felelos

transzkripciós faktor [240, 273].

? GATA fehérjék (WGATAR): számos GATA kötodési helyet írtak le -117

és -3003 bp között patkány ANP promóter génszakaszán [281], valamint ketto

helyet az emberi ANP promóter génszakaszán (-290 és -122 bp-nál) [91]. A

GATA fehérjék elsosorban a bazális, szívizom-specifikus ANP génexpresszióért

felelosek [91]. A GATA fehérjék (elsosorban GATA-4) nem csak önnállóan,

hanem számos más transzkripciós faktorral együtt fejtik ki hatásukat az ANP

génexpressziójára (9. ábra).

76

9. ábra: GATA-4 és más transzkripciós faktorok kooperatív hatásának

sematikus ábrázolása az ANP génexpressziójára [240]

A. Amikor a promóter régión megtalálható mind az NKE, mind pedig a

GATA transzkripciós elem, akkor a Csx/Nkx-2.5 és a GATA-4

transzkripciós faktorok együttes, pozitív hatást fejtenek ki a

transzkripcióra. A GATA-4 és a DNS szakasz közötti kapcsolat lehet

direkt, vagy indirekt.

B. Amikor a promóter régión csak az NKE található, akkor a Csx/Nkx-2.5

és a GATA-4 transzkripciós faktorok szintén együttes, pozitív hatást

fejtenek ki a transzkripcióra. A GATA-4 és a DNS szakasz közötti

kapcsolat fehérje- fehérje (Csx/Nkx-2.5 és a GATA-4 közötti) interkación

keresztül valósul meg.

77

C. Amikor a promóter régión csak a GATA található, akkor a Csx/Nkx-2.5

és a GATA-4 transzkripciós faktorok együttes, gátló (negatív) hatást

fejtenek ki a transzkripcióra.

BNP gén transzkripciós regulációja

Saját munkánkkal igazoltuk, hogy az ember és a patkány BNP génszekvenciája

65%-ban azonos nukleotidokból áll (közlemény: VII. és VII./1. ábra). Az emberi BNP

gén -1818 és +100 bp. közötti szakasza, in vitro kísérletekben, szívizomban erosebb

génexpressziót mutatott, mint kötoszöveti sejtekben (közlemény: VII. és VII./2. ábra).

Ezen szakasz számos pozitív és negatív transzkripciót befolyásoló regulációs faktor

kötodési helyet tartalmaz (közlemény: VII. és VII./3. ábra). Bizonyítottuk, hogy az

emberi BNP gén promóter régiójának proximális részén számos cisz transzkripciós

faktor együttes hatása felelos a szívizom-specifikus génexpresszióért (közlemény: VII.

és VII./4. ábra). In vivo vizsgálatokkal igazoltuk, hogy az emberi BNP promóter -408

és +100 bp. közötti szakasza felelos a szívizom-specifikus génexpresszióért

(közlemény: VII. és VII./4. ábra).

A patkány BNP promóter régiójának 5’végéhez közel számos GATA és AP-1

kötohelyett azonosítottak [91, 281]. Ezen transzkripciós faktorok kötodési helyei erosen

konzervatívok (magas szekvencia azonosság) patkány, kutya és ember esetében (10.

ábra) [237, 281].

10. ábra: Patkány BNP promóter régiójának és cisz transzkripciós faktorok

sematikus ábrázolása [281, 283]

78

Patkány és emberi BNP gének -30 bp-nál lévo GATA köto helyei elsosorban TATA

fehérjék megkötését segíti elo [237, 281]. In vivo gén transzfekciós vizsgálatokkal

igazolták, hogy patkány BNP -114 bp-nál lévo GATA és AP-1 köto helyei elsosorban a

bazális kamrai szívizom-specifikus génexpresszióért felelosek [174]. Ugyancsak in vitro

vizsgálatok bizonyítotják, hogy a szív-specifikus génexpresszióért elsosorban a

proximális (-114 bp-nál lévo) génszakasz felelos [91].

A patkány BNP promóter régiójával szemben, az emberi BNP promóter proximális

régióját (-111 és -40 bp. között) tartalmazó expressziós vektort szívizom sejtekbe

juttatva azt tapasztaltuk, hogy az emberi BNP génexpresszióban a GATA és az AP-1

transzkripciós faktorok nem játszanak dönto szerepet (közlemény: VII.).

Saját munkánkal igazoltuk az emberi BNP génexpressziójának növekedését mechanikus,

ciklikus stressz hatására (közlemény: VIII. és VIII./1. ábra). Továbbá vizsgáltuk

MAPK (mitogén-aktivált fehérje kináz) és JNK (c-Jun N-terminal kináz) szerepét hBNP

génexpressziójának növekedésében mechanikus, ciklikus stressz hatására (közlemény:

VIII., VIII./2., 3., 4., 5. és 6. ábra). További vizsgálatok igazolták, a megnövekedett

emberi BNP génexpresszióban a p38 és a MAPK szerepét [156, 158].

Jelen értekezés célkítuzésének megfeleloen in vitro is in vivo kísérletekben

vizsgáltuk a hANP és a hBNP génexpressziót befolyásoló hatásokat. Munkánkkal

hozzájárultunk a natriuretikus hormonok génexpressziójának további megismeréséhez.

Számos, a natriuretikus hormonok promóter régióján elhelyezkedo negatív és pozitív

cisz-hatású elemet lokalizáltunk. A NP szekrécióját, mRNS termelését és

génexpresszióját is befolyásoló – a gyermekkrori daganatos betegségek kezelése

szempontjából alapveto – doxorubicin estében eloször mutattuk ki ennek specifikus

hatását hANP és hBNP génekre. Az értekezésben elemzett, in vitro alkalmazott

mechanikus stressz terhelésre jelentkezo hANP és hBNP génexpressziós változások

többek között a korábban ismertetett in vivo elváltozásokat modellezik

(közlemények: VI., VII., VIII., IX. és X.).

79

A cisztás fibrózisos megbetegedések klinikailag súlyosabb formáiban, a tüdoben

fennálló krónikus gyulladás és következményes fibrózis következtében a szívet ért

megnövekedett afterload hatására cor pulmonale alakulhat ki, amely dilatatív

cardiomyopathiát is okozhat [27, 168-170, 244, 263]. A cardiomyopathia

diagnosztikájában (és terápiájában) az ANP és BNP fontos szerepet játszhat.

80

AZ ÉRTEKEZÉSBEN SZEREPLO VIZSGÁLATOKBAN

EGYÜTTMUKÖDO NEMZETKÖZI INTÉZMÉNYEK

Cisztikus Fibrózis (CF) European Thematic Network for Cystic Fibrosis

5th Framework program

Az „Európai Cisztikus Fibrózis Hálózat” egyedülálló együttmuködési területe több mint

160 európai genetikai diagnosztikai laboratóriumnak, CF kezeloorvosoknak, betegeknek

és családtagjainak a betegséggel kapcsolatos genetikai, orvosi, etikai és szociális

problémák megoldása területén (http://www.cfnetwork.be).

1991 - jelenleg

Congenital Adrenalis Hyperplasia (CAH) MEWPE-CAH Study Group

(Middle European Workshop on Paediatric Endocrinology)

Közép-Európai országokat tömöríto szervezet, amelynek fo érdeklodési területe a

gyermekkori endokrinológiai megbetegedések. Kiemelt projekt a congenitalis adrenalis

hyperplasia megbetegedéssel kapcsolatos epidemiológiai, klinikai és genetikai

vizsgálatok megszervezése, támogatása, ill. a kapott nemzeti eredmények összehasonlító

elemzései.

1994 - jelenleg

Nátriuretikus Hormonok (hANP, hBNP) Metabolic Research Unit

University of California, San Francisco (UCSF)

San Francisco, Kalifornia, Egyesült Államok

1992 - jelenleg

81

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönetemet szeretném kifejezni munkámhoz nyújtott segítségéért:

? Dr. Fekete György professzor úrnak, témavezetomnek, akitol, mint

klinikaigazgatótól is rengeteg segítséget kaptam, és mindvégig maximális támogatást

nyújtott munkámhoz.

? Dr. Sólyom János professzor úrnak és Dr. Sasvári Mária docens asszonynak,

akik a congenitalis adrenalis hyperplasia (CAH) klinikai és genetikai vizsgálataiban

nyújtottak segítséget.

? Dr. Gláz Edit professzor asszonynak, Dr. David G. Gardner (USA), Dr.

Schuler Dezso és Dr. Rácz Károly professzor uraknak, akik a pitvari natriuretikus

hormonnal kapcsolatos vizsgála tokhoz nyújtottak segítséget.

? Dr. Németh Krisztina és Szontágné Ferenczi Anna biológusoknak, valamint

Staub Krisztina asszisztensnek, a II. sz. Gyermekgyógyászati Klinika Molekuláris

Genetikai Laboratórium munkatársainak, akik a cisztás fibrózis és a congenitalis

adrenalis hyperplasia vizsgálatában nyújtottak segítséget.

? Dr. Holics Klára foorvos asszonynak és a Magyarországi Cisztás Fibrózis

Orvosi Munkacsoport tagjainak, a gondozó orvosok, ill. a Cisztás Fibrózis központok

vezetoinek a több éven keresztül nyújtott pontos adatgyujtésükért a CF Regiszter

számára.

? A vizsgálatban részt vevo személyeknek, és a minták összegyujtésében

közremuködoknek.

82

AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN KÉSZÜLT SAJÁT

KÖZLEMÉNYEK

1. TUDOMÁNYOS CIKKEK

Cisztikus Fibrózis (CF)

I. Garami M., Németh K., Borgulya G., Patócs B., Staub K., Holics K., Fekete Gy.: Diagnosis of Patients with Cystic Fibrosis: The Hungarian Cystic Fibrosis Database. Human Mutation, 2004. Közlésre benyújtva, lektorálás alatt. IF: 6,328 (JCR-2003)

II. Garami M., Németh K., Borgulya G., Patócs B., Staub K., Holics K., Fekete Gy.: Correlation Between Genotype and Phenotype in Patients Diagnosed with Cystic Fibrosis: Analysis of the Hungarian Cystic Fibrosis Database. Pediatric Research, 2004. Közlésre benyújtva, lektorálás alatt. IF: 3,064 (JCR-2003)

Congenitalis Adrenalis Hyperplasia (CAH)

III. Ferenczi A., Garami M., Kiss E., Pék M., Sasvári-Székely M., Barta Cs., Staub M., Sólyom J. and Fekete Gy.: Screening for Mutations of 21-Hydroxylase Gene in Hungarian Patients with Congenital Adrenal Hyperplasia. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 84(7): 2369-2372, 1999. IF: 5,805 (JCR-1999)

IV. Garami M., Frenczi A., Kiss E., Sasvári-Székely M., Barta Cs., Sólyom J. és

Fekete Gy.: Magyarországi 21-hidroxiláz defektusos gyermekek genotípusának meghatározása. Gyermekgyógyászat, 51(4): 352-359, 2000.

V. Pinterova L., Garami M., Pribilincova Z., Behulova R., Mezenska R., Lukacova

M. and Zorad S.: PCR Based Diagnosis of 21-hydroxylase Gene Defects in Slovak Patients with Congenital Adrenal Hyperplasia. Endocrine Regulations, 34(2): 65-72, 2000.

83

Nátriuretikus Hormonok (hANP, hBNP)

VI. Garami M. and Gardner DG.: An E-box Motif Conveys Inhibitory Activity on the Atrial Natriuretic Peptide Gene. Hypertension, 28(2): 315-319, 1996. IF: 4,736 (JCR-1996)

VII. LaPointe MC., Wu GY., Garami M., Yang XP. and Gardner DG.: Tissue-Specific Expression of the Human Brain Natriuretic Peptide Gene in Cardiac Myocytes. Hypertension, 27(3 Pt 2): 715-722, 1996. IF: 4,736 (JCR-1996)

VIII. Liang F., Wu JM., Garami M. and Gardner DG.: Mechanical Strain Increases Expression of the Brain Natriuretic Peptide Gene in Rat Cardiac Myocytes. The Journal of Biological Chemistry, 272(44): 28050-28056, 1997. IF: 6,963 (JCR-1997)

IX. Chen S., Garami M. and Gardner DG.: Doxorubicin Selectively Inhibits Brain

versus Atrial Natriuretic Peptide Gene Expression in Cultured Neonatal Rat Atrial Myocytes. Hypertension, 34(6): 1223-1231, 1999. IF: 4,913 (JCR-1999)

84

AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN KÉSZÜLT SAJÁT

KÖZLEMÉNYEK

2. IDÉZHETO ELOADÁS-KIVONATOK (ABSZTRAKTOK)

Cisztikus Fibrózis (CF) Garami M., Németh K., Borgulya G., Holics K., Újhelyi R., Váradi A. and Fekete Gy.: The Hungarian Cystic Fibrosis Database: Statistical Analysis and Genetic Data. European Journal of Human Genetics, 9(1, Suppl.): 308, 2001. Congenitalis Adrenalis Hyperplasia (CAH) Garami M., Pék M., Sasvári-Székely M., Sólyom J., Fekete Gy. and Staub M.: Genotyping of 21 Hydroxylase Using Allele-Specific PCR. International Medical Journal of Experimental and Clinical Research, 2(3, Suppl.): 31, 1996. Garami M., Ferenczi A., Kiss E., Sasvári-Székely M., Sólyom J., and Fekete Gy.: Congenitális adrenalis hyperplasiára vezetô szteroid-21-hidroxiláz defektus molekuláris genetikai diagnosztikája és mutációs spektruma magyarországi betegekben. Gyermekgyógyászat, 48(3, Suppl.): 22-23, 1997. Garami M., Ferenczi A., Kiss E., Sasvári-Székely M., Sólyom J., and Fekete Gy.: Molecular Genotype in Congenital Adrenal Hyperplasia due to 21-Hydroxylase Deficiency in Hungarian Population. Pediatric Research, 42(3): 397, 1997. Garami M., Ferenczi A., Kiss E., Sasvári-Székely M., Sólyom J. and Fekete Gy.: Mutations of the 21-hydroxylase Gene in Hungarian Children with Congenital Adrenal Hyperplasia. Endocrine Regulations, 31(4): 238-239, 1997.

85

Garami M., Ferenczi A., Kiss E., Sasvári-Székely M., Sólyom J. and Fekete Gy.: Distribution on Point Mutations and Correlation with Phenotype in Hungarian Children Patients Presenting with 21-hydroxylase Deficiency. European Journal of Human Genetics, 6(1, Suppl.): 1100, 1998. Sólyom J., Eckhardt G. and Garami M.: Clinical, Hormonal and Molecular Genetic Criteria for the Diagnosis of Non-classical 21-hydroxylase Deficiency (21-OHD). Endocrine Regulations, 34(1): 48-49, 2000. Nátriuretikus Hormonok (hANP, hBNP) X. Garami M., Kincs J., Horváth E., Szabolcs J., Kovács G.T., Müller J. and Schuler

D.: Elevated ANP Level May be a Sensitive Indicator of Cardiotoxicity in a Pediatric Population Treated with Anthracyclins. Blood, 98(11): 199b, 2001.

LaPointe MC., Wu GY., Garami M., Gardner DG. and Yang XP.: Tissue-Specific Regulation of Human BNP Gene in Cardiac Myocytes. Hypertension, 26(3): 548, 1995. Wu JM., Garami M. and Gardner DG.: 1,25-(OH)2 Vitamin D3 Inhibits Hypertrophy of Cultured Neonatal Rat Ventricular Myocytes. Hypertension, 26(3): 563, 1995. Garami M. and Gardner DG.: An E-Box Motif Conveys Silencer Activity on the Human Atrial-Natriuretic-Peptide Gene in Non-Myocardial Cells. Hypertension, 26(3): 563, 1995. Garami M. and Gardner DG.: E-Box Motif as a Tissue-Specific Determinants of the Human Atrial Natriuretic Pepetide Gene Expression in Non-Myocardial Cells. International Medical Journal of Experimental and Clinical Research, 2(3, Suppl.): 31, 1996. Garami M., Horváth E. and Gardner DG.: Doxorubicin Effect on the Human Atrial Natriuretic Peptid Gene Expression. Medical and Pediatric Oncology, 29(5): 461, 1997.

86

Garami M., Kincs J., Horváth E., Szabolcs J., Müller J., Kovács G. és Schuler D.: Anthracyclin okozta cardiotoxicitás vizsgálata a szérum pitvari natriuretikus peptid szint méréssel. Magyar Belorvosi Archivum, 5(1, Suppl.): 62, 2001. Garami M., Kincs J., Horváth E., Szabolcs J., Kovács G.T., Müller J. and Schuler D.: Atrial Natriuretic Peptide Acts as an Early Indicator in Anthracycline Induced Cardiotoxicity. European Society for Pediatric Research (ESPR), Pediatric Research, 50(2): 286, 2001 Garami M., Kincs J., Horváth E., Szabolcs J., Müller J., Kovács G. és Schuler D.: Anthracyclin okozta cardiotoxicitás monitorizálása a szérum pitvari natriuretikus hormonszint mérésével. Onkológia, 45(3): 262, 2001.

AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN KÉSZÜLT SAJÁT

KÖZLEMÉNYEK

3. ISMERETTERJESZTO CIKK

Garami Miklós : Humángenetikai szuroprogramok jelentosége. Esszencia (továbbképzo folyóirat védonoknek), 2: 4-8, 1999. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN KÉSZÜLT SAJÁT

KÖZLEMÉNYEK

4. TUDOMÁNYOS KÖNYVFEJEZET

Vessely: Atrial natriuretic peptides: David G. Gardner, Branka Kovacic-Milivojevic and Miklós Garami : Molecular Biology of the Natriuretic Peptides, San Francisco, UC Press Ltd. (pp 15-38.), 1997.

87

AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN KÉSZÜLT SAJÁT

KÖZLEMÉNYEK

5. ELSO SZERZOS TUDOMÁNYOS ELOADÁSOK

Cisztikus Fibrózis (CF) Garami M., Németh K., Kiss E., Holics K., Újhelyi R. és Fekete Gy.: A magyarországi cisztikus fibrózisos betegek genotípus – fenotípus összehasonlítása. A Magyar Biokémiai Egyesület, Molekuláris Biológiai Szakosztálya, 5. Munkaértekezlete, Sopron, Magyarország, 2000. május 8 – 11. Garami M.: A CF regisztráció megvalósulásának elso éve. CF Kezeloorvosok III. Országos Találkozója, Budapest, Magyarország, 2000. szeptember 29 – 30. Garami M., Németh K., Borgulya G., Holics K., Újhelyi R. and Fekete Gy.: The Hungarian Cystic Fibrosis Database I: Statistical Analysis and Clinical Data. 4th International Symposium for Cystic Fibrosis, Budapest, Hungary, December 2 – 3, 2000. Garami M., Németh K., Borgulya G. and Fekete Gy: Phenotype and Genotype Analysis of Patients Diagnosed with Cystic Fibrosis. Human Genome Meeting 2001 (HGM), Edinburgh, Scotland, April 19 – 22, 2001. Garami M., Németh K., Borgulya G., Holics K., Újhelyi R., Váradi A. and Fekete Gy: The Hungarian Cystic Fibrosis Database: Statistical Analysis and Genetic Data. 10th International Congress of Human Genetics (ICHG), Vienna, Austria, May 15 – 19, 2001. Garami M., Németh K., Borgulya G., Holics K., Újhelyi R., Váradi A. and Fekete Gy: The Hungarian Cystic Fibrosis Screening Procedure. 24th European Cystic Fibrosis Conference (ECFS), Vienna, Austria, June 6 – 9, 2001.

88

Garami M., Németh K., Staub K. és Fekete Gy.: Mondjam, ne mondjam? A genetikai tanácsadás aktuális kérdései. Magyar Gyermekorvosok Társasága 2001. évi Nagygyulése (MGYT), Pécs, Magyarország, 2001. június 15 – 16. Garami M. és Fekete Gy.: Az ismeretlen újszülött; a génhibától a tünetekig. Veleszületett és gyermekbetegségek genomikája és genetikája, Genomika és Proteomika eloadássorozat keretében, Budapest, Magyarország, 2002. március 13. Garami M.: The Hungarian Cystic Fibrosis Network: Activity of Hungary as NAS (Newly Associated States) Member. 4th Steering Committee Meeting of the European Thematic Network for C.F., Leuven, Belgium, January 25 – 26, 2003. Congenitalis Adrenalis Hyperplasia (CAH) Garami M., Pék M., Sasvári-Székely M., Sólyom J., Fekete Gy és Staub M.: A 21-hidroxiláz genotipizálása allél specifikus PCR használatával magyarországi beteganyagon. A Magyar Biokémiai Egyesület, Molekuláris Biológiai Szakosztálya, 1. Munkaértekezlete, Seregélyes, Magyarország, 1996. április 16 – 18. Garami M., Pék M., Sasvári-Székely M., Sólyom J., Fekete Gy. and Staub M.: Genotyping of 21 Hydroxylase using Allele-Specific PCR. V. Semmelweis Science Fair, Budapest, Hungary, September 26 – 27, 1996. Garami M., Ferenczi A., Kiss E., Sasvári-Székely M., Sólyom J. and Fekete Gy.: Genetic Diagnosis of Steroid 21-hydroxylase Deficiency in Hungarian Pateints. Scientific Symposium of Molecular Genetic View of Hereditary Diseases in Childhood - Semmelweis Medical School and Medical School, University of Bari, II. Dept. of Pediatrics, Semmelweis Medical Univ., Budapest, Hungary, 1997. Garami M.: Endokrin betegségek genetikai diagnosztikája. Klinikai endokrinológia speciál kollégium 1996/97 tanév II. félév, SOTE, II.sz. Belgyógyászati Klinika, Budapest, Magyarország, 1997.

89

Garami M., Ferenczi A., Kiss E., Sasvári-Székely M., Sólyom J. and Fekete Gy.: Molekulargenetisch bestimmtes Genotyp in Kranken von Adrenogenitaler Syndrome (Defekt der 21-Hydroxylase) in der ungarischen Bevölkerung. 6. Tagung mitteleuropäischer Länder, Pädiatrische Forschung, Universitätsklinik für Kinder- und Jugendheilkunde, Wien, Austria, 13. Juni 1997. Garami M., Ferenczi A., Kiss E., Sasvári-Székely M., Sólyom J. and Fekete Gy.: Congenitális adrenalis hyperplasiára vezetô szteroid-21-hidroxiláz defektus molekuláris genetikai diagnosztikája és mutációs spektruma magyarországi betegekben. A Magyar Gyermekorvosok Társasága 1997. Évi Nagygyulése (MGYT), Szombathely, Magyarország, 1997. június 19 – 21. Garami M., Ferenczi A., Kiss E., Sasvári-Székely M., Sólyom J. and Fekete Gy.: Molecular Genotype in Congenital Adrenal Hyperplasia due to 21-Hydroxylase Deficiency in Hungarian Population. 1997 Annual Meeting of European Society for Pediatric Research (ESPR), Szeged, Hungary, August 31 – September 3, 1997. Garami M., Ferenczi A., Kiss E., Sasvári-Székely M., Sólyom J. and Fekete Gy.: Mutations of the 21-hydroxylase Gene in Hungarian Children with Congenital Adrenal Hyperplasia. The 4th Middle European Workshop on Paediatric Endocrinology (MEWPE), Smolenice, Slovakia, 1997. Garami M., Ferenczi A., Kiss E., Sasvári-Székely M., Sólyom J. and Fekete Gy.: Distribution on Point Mutations and Correlation with Phenotype in Hungarian Children Patients Presenting with 21-hydroxylase Deficiency. 30th Annual Meeting of the European Society of Human Genetics (ESHG), Lisbon, Portugal, May 10 – 13, 1998. Garami M., Ferenczi A., Kiss E., Sasvári-Székely M., Sólyom J. és Fekete Gy.: Mutations of the 21-Hydroxylase Gene in Hungarian Children with Congenital Adrenal Hyperplasia. XVIIIth International Congress of Genetics (ICG), Beijing, China, August 10 – 15, 1998.

90

Garami M.: Magyarországi steroid 21-hidroxiláz enzim defektus diagnózissal kezelt betegek mutációs spektruma. Tapasztalataink országos szuroprogram bevezetése kapcsán. Klinikai genetikai fakultáció 1998/99. oktatási év II. félév, SOTE II. sz. Gyermekgyógyászati Klinika, Budapest, 1999. Garami M.: Endokrin betegségek molekuláris genetikai vizsgálata. Új vizsgáló módszerek a gyermekendokrinológiában. Megújuló gyermekgyógyászat címu eloadássorozat, Budapest, Magyarország, 2002. április 9. Garami M.: Amikor a szülész is tanácstalan: a steroid 21-hidroxiláz enzim defektus mutációs spektruma. Szuroprogram (allél-specifikus PCR, szekvenálás, geno-fenotípus elemzés). Klinikai Genetika fakultáció, Budapest, Magyarország, 2003. február 24. Nátriuretikus Hormonok (hANP, hBNP) Garami M. and Gardner DG.: Characterization of a Silencer Locus on the Human Atrial Natriuretic Peptide Gene. Western Society for Clinical Investigation, Carmel, California, USA, February 9 – 12, 1994. Garami M. and Gardner DG.: An E-box Motif Conveys Silencer Activity on the Human Atrial Natriuretic Peptide Gene in Non-Myocardial Cells. 49th Annual Fall Conference and Scientific Sessions of the Council for High Blood Pressure Research, New Orleans, Louisiana, USA, September 19 – 22, 1995. Garami M. és Gardner DG.: A human pitvari nátriuretikus hormon gén expressziójának szövetspecifikus szabályozása. A Magyar Biokémiai Egyesület, Molekuláris Biológiai Szakosztálya, 1. Munkaértekezlete, Seregélyes, Magyarország, 1996. április 16 – 18.

91

Garami M. és Gardner DG.: E-box elem szerepe a human pitvari nátriuretikus hormon génjének szövetspecifikus szabályozásában. A Magyar Endokrinológiai és Anyagcsere Társaság XVI. Kongresszusa, Debrecen, Magyarország, 1996. június 3 – 5. Garami M. and Gardner DG.: E-Box Motif as a Tissue-Specific Determinants of the Human Atrial Natriuretic Peptide Gene Expression in Non-Myocardial Cells. V. Semmelweis Science Fair, Budapest, Hungary, September 26 – 27, 1996. Garami M., Horváth E. and Gardner DG.: Doxorubicin Effect on the Human Atrial Natriuretic Peptid Gene Expression. XXIX. Meeting of the International Society of Pediatric Oncology (SIOP), Istambul, Turkey, September 23 – 27, 1997. Garami M., Horváth E., Schuler D. and Gardner DG.: Doxorubicin Effect on the Human Atrial Natriuretic Peptide Gene Expression. IX. Semmelweis Symposium, Budapest, Hungary, November 9 – 10, 2000. Garami M., Kincs J., Horváth E., Szabolcs J., Müller J., Kovács G. és Schuler D.: Anthracyclin okozta cardiotoxicitás vizsgálata a szérum pitvari natriuretikus peptid szint méréssel. Magyar Hematológiai és Transzfúziós Társaság XVIII. Kongresszusa (MHTT), Pécs, Magyarország, 2001. május 24 – 26. Garami M., Kincs J., Horváth E., Szabolcs J., Müller J., Kovács G. és Schuler D.: Pitvari natriuretikus peptid hormon, mint lehetséges cardiotoxicitás elorejelzo faktor. Magyar Gyermekorvosok Társasága 2001. évi Nagygyulése (MGYT), Pécs, Magyarország, 2001. június 15 – 16. Garami M., Kincs J., Horváth E., Szabolcs J., Kovács G.T., Müller J. and Schuler D.: Preliminary Study on Behaviour of Atrial Natriuretic Peptide in Anthracycline Induced Cardiotoxicity in Childhood. XVIII. Congress of the European Society for Paediatric Haematology and Immunology (ESPHI), Lucerne, Switzerland, June 17 – 19, 2001.

92

Garami M., Kincs J., Horváth E., Szabolcs J., Kovács G.T., Müller J. and Schuler D.: Atrial Natriuretic Peptide Acts as an Early Indicator in Anthracycline Induced Cardiotoxicity. European Society for Pediatric Research (ESPR), Helsinki, Finland, August 5 – 8, 2001. Garami M., Kincs J., Horváth E., Szabolcs J., Müller J., Kovács G. és Schuler D.: Anthracyclin okozta cardiotoxicitás monitorizálása a szérum pitvari natriuretikus hormonszint mérésével. Magyar Onkológusok Társaságának 24. Kongresszusa (MOT), Budapest, Magyarország, 2001. november 22 – 24. Garami M., Kincs J., Horváth E., Szabolcs J., Kovács G.T., Müller J. and Schuler D.: Elevated ANP Level May be a Sensitive Indicator of Cardiotoxicity in a Pediatric Population Treated with Anthracyclins. 43rd Annual Meeting of the American Society of Hematology (ASH), Orlando, Florida, USA, December 7 – 11, 2001. Garami M., Kincs J., Horváth E., Szabolcs J., Müller J., Kovács G. és Schuler D.: Az anthracyclinek okozta cardiotoxicitás elorejelzése gyermekkorban. Magyar Gyermekorvosok Társasága (MGYT) Gyermek Haematológiai-Onkológiai Szekciójának XXXI. Tudományos Ülése, Debrecen, Magyarország, 2002. május 8 – 11.

93

AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉHEZ SZOROSAN KAPCSOLÓDÓ

EGYÉB SZAKMASPECIFIKUS ALKOTÁSOK

XI. Garami M. és a Magyarországi Cisztás Fibrózis Orvosi Munkacsoport

(szerkesztésében): Magyarországi Cisztás Fibrózis Kinikai Pontrendszere. Budapest, 1998.

Garami M. és Borgulya G. (szerkesztésében): Magyarországi Cisztás Fibrózis Regiszter: Az 1998. évi adatbázis elemzése. Budapest, 2000. Garami M. és Borgulya G. (szerkesztésében): Magyarországi Cisztás Fibrózis Regiszter: Az 1999. évi adatbázis elemzése. Budapest, 2001. Garami M. és Borgulya G. (szerkesztésében): Magyarországi Cisztás Fibrózis Regiszter: Az 2000. évi adatbázis elemzése. Budapest, 2002.

94

AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉHEZ SZOROSAN NEM

KAPCSOLÓDÓ

EGYÉB SAJÁT KÖZLEMÉNYEK

1. TUDOMÁNYOS CIKKEK Wu J., Garami M., Cao L., Li Q. and Gardner DG.: 1,25 (OH)2 D3 Suppresses Expression and Secretion of Atrial Natriuretic Peptide from Cardiac Myocytes. American Journal of Physiology: Endocrinology & Metabolism, 268(6, Pt 1): E1108-E1113, 1995. IF: 3,244 (JCR-1995) Wu J., Garami M., Cheng T. and Gardner DG.: 1,25 (OH)2 Vitamin D3, and Retinoic Acid Antagonize Endothelin-stimulated Hypertrophy of Neonatal Rat Cardiac Myocytes. Journal of Clinical Investigation, 97(7): 1577-1588, 1996. IF: 9,486 (JCR-1996) Schuler D., Horváth E., Apjok E., Koós R., Kajtár P., Zimonyi I., Virág I., Masát P., Garami M. és Borsi J.: Elozetes eredmények a dexrazoxane alkalmazásáról anthracyclinnel kezelt leukaemiás betegekben. Gyermekgyógyászat, 47(6): 536-540, 1996. Schuler D., Horváth E., Apjok E., Koós R., Kajtár P., Zimonyi I., Virág I., Masát P., Garami M. and Borsi JD.: Safety of Dexrazoxane in Children with ALL Undergoing Anthracycline Therapy: Preliminary Results of a Prospective Pilot Study. Pediatric Hematology ? Oncology, 14(1): 93-94, 1997. IF: 0,620 (JCR-1997) Müller J., Czinyéri J., Sasvári I., Garami M. és Kovács G.: Thromboticus thrombocytopéniás purpura (Moschcowitz-szindróma). Gyermekgyógyászat, 51(5): 472-478, 2000. Babosa M., Garami M., Hauser P., Schuler D. és Szendroi M.: A Ewing-sarcomás betegek tünetmentes túlélési esélyeinek értékelése a Gyermekonkológiai Szekció eredményei alapján. Magyar Onkológia, 44(4): 261-264, 2000.

95

Müller J. Czinyéri J., Sasvári I., Garami M. and Kovács G.: Thrombotic Thrombocytopenic Purpura, Moschcowitz Syndrome. International Pediatrics, 16(3): 144-149, 2001. Müller J. Czinyéri J., Sasvári I., Garami M. and Kovács G.: Die thrombotisch-thrombozytopenische Purpura – Morbus Moschkowitz. Kinder- und Jugendmedizin, 4: 121-124, 2001. Földesi E., Hauser P. és Garami M.: „Míg a halál el nem választ”. Kharón, Thanatológiai Szemle, 6(3): 23-31, 2002. Constantin T., Ponyi A., Garami M., Gergely L., Fekete Gy. és Dankó K.: A juvenilis dermatomyositis klinikai sajátosságai. Orvosi Hetilap, 144(25): 1245-1250, 2003. Müller J., Kovács G., Garami M., Schmidt M. és Fekete Gy.: Lázas neutropeniás gyermekek kezelése meronemmel. Orvosi Hetilap, 144(43): 2115-2120, 2003. Török D., Halász Z., Garami M., Homoki J., Fekete Gy. and Sólyom J.: ACTH Limited Value of Serum Steroid Measurements in Identifcation of Mild Form of 21-Hydroxylase Deficiency. Experimental and Clinical Endocrinology and Diabetes, 111: 27-32, 2003. IF: 1.956 (JCR-2003) Hauser P., Jakab Zs., Láng O., Kondás O., Török Sz., Garami M., Bognár L. and Schuler D.: High Incidence of Brain Tumors of Childhood in Hungary Between 1989 and 2001. Medical and Pediatric Oncology, 41(6): 590-591, 2003. IF: 1.737 (JCR-2003) Müller J., Schuler D., Hauser P., Ponyi A., Babosa M., Szendroi M., a Magyar Gyermekonkológiai Hálózat és Garami M.: Gyermekkori Ewing szarkómával szerzett magyarországi tapasztalataink. Focus Medicinae, 6(1): 12-17, 2004.

96

Garami M.: Géntherápiás lehetoségek. Magyar Orvos, 2004. Közlésre benyújtva, lektorálás alatt. Garami M., Schuler D., Babosa M., Borgulya G., Hauser P., Müller J., Paksy A., Szabó E., Hidvégi M. and Fekete Gy.: Fermented Wheat Germ Extract Reduces Chemotherapy Induced Febrile Neutropenia in Pediatric Cancer Patients. J. of Pediatric Hematology / Oncology, 2004. Közlésre elfogadva, megjelenés alatt. IF: 1,463 (JCR-2003) 2. ISMERETTERJESZTO CIKKEK Garami Miklós : A nyomelemek jelentosége. Patika Tükör, 4(9): 60, 1996. Garami Miklós : Csökkent védekezoképesség – Gyakori fertozések. Patika Tükör, 4(10): 16-17, 1996. 3. TUDOMÁNYOS KÖNYVFEJEZETEK Horti József, Riskó Ágnes (szerkesztok): Onkopszichologia a gyakorlatban: Garami Miklós : Gyermekkori daganatos betegségek Medicina Könyvkiadó Rt., 2004. Közlésre elfogadva, megjelenés alatt. Borgulya G. Jakab Zs., Schuler D. and Garami M.: Establishing an Internet Based Paediatric Cancer Registration and Communication System for the Hungarian Paediatric Oncology Network. IOS PRESS, Studies in Health Technology and Informatics, 2004. Közlésre elfogadva, megjelenés alatt. 4. IDÉZHETO ELOADÁS-KIVONATOK (ABSZTRAKTOK) Magyarosy E., Garami M., Koós R., Kálmánchey R., Somló P., Borsi J. and Schuler D.: Central Nervous System Complications During Intensive Induction Therapy of Childhood ALL. Medical and Pediatric Oncology, 20: 403, 1992.

97

Garami M., Paál C., Widemann BC., Horvá th J., Koós R., Schuler D., Adamson PC. and Borsi JD.: Carboxypeptidase-G2 Rescue in Children with Acute Renal Failure Following High Dose Methotrexate Administration. Medical and Pediatric Oncology, 27(4): 343, 1996. Horváth E., Apjok E., Koós R., Kajtár P., Zimonyi I., Virág I., Masát P., Garami M., Borsi JD., and Schuler D.: Cardiotoxicity after Anthracyclin Therapy and Pilot Study for its Prevention with Dexrazoxane (Cardioxane). Medical and Pediatric Oncology, 27(4): 351, 1996. Garami M., Paál K., Widemann BC., Horváth J., Koós R., Adamson PC. és Borsi J.: Alternatív lehetoségek az életveszélyesesen magas szérum metotrexát szintek normalizálására Carboxipeptidase-G2 alkalmazásával. Gyermekgyógyászat, 47(6, Suppl.): 30, 1996. Horváth E., Apjok E., Koós R., Kajtár P., Zimonyi I., Virág I., Masát P., Garami M., Borsi J. és Schuler D.: Anthracyclin terápia utáni cardiotoxicitás és a megelozésére adott dexrazoxane alkalmazása gyermekekben. Gyermekgyógyászat, 47(6, Suppl.): 35, 1996. Horváth E., Apjok E., Koós R., Kajtár P., Zimonyi I., Virág I., Masát P., Garami M., Borsi J. and Schuler D.: Anthracyclin terápia utáni cardiotoxicitás megelozése dexrazoxannal gyermekekben. Magyar Belorvosi Archivum, 1(Suppl.): 18, 1997. Garami M., Bocsi J., Kovács G., Csóka M., Schuler D. and Szende B.: Apoptotic Ratio as an Early Prognostic Factor in Acute Lymphoblastic Leukemia in Children. Medical and Pediatric Oncology, 33(3): 269, 1999. Kovács GT., Szende K., Müller J., Garami M., Koós R. and Schuler D.: Is the Low Serum Total Protein Level a Risk Factor in the Acute Toxicity of Methotrexate? Medical and Pediatric Oncology, 33(3): 286, 1999. Müller J., Schmidt M., Koós R., Garami M. and Kovács G.: The Clinical Significance of Coagulase-Negativ Staphylococcus Infections in Immun-compromised Children. Medical and Pediatric Oncology, 33(3): 286, 1999.

98

Kovács GT., Erlaky H., Tóth K., Garami M., Horváth E., Schuler D.: Incidence and Severity of Late Cardiotoxicity due to Anthracycline Therapy in Children. International Journal of Hematology, 72(1, Suppl.): 8, 2000. Babosa M., Hauser P., Garami M., Bognár L. and Schuler D.: Congenital Malignant Brain Tumors. Medical and Pediatric Oncology, 35(3): 265, 2000. Müller J., Koós R., Kriván G., Poros A., Garami M. és Kovács G.: Aplasztikus anémia miatt sikeres testvérdonoros csontveloátültetés után 12 évvel donor eredetu juvenilis myelomonocyter leukémia (JMMoL) kialakulása. Magyar Belorvosi Archivum, 5(1, Suppl.): 71, 2001. Kovács G., Erlaky H., Tóth K., Horváth E., Szabolcs J., Müller J., Garami M. és Schuler D.: Az anthracyclinek kardiotoxicitása gyermekekben. Magyar Belorvosi Archivum, 5(1, Suppl.): 68-69, 2001. Kovács G.T., Garami M., Erlaky H., Tóth K., Horváth E., Szabolcs J., Müller J. and Schuler D.: Cardiotoxicity of Anthracycline Therapy in Children. Medical and Pediatric Oncology, 37(3): 307, 2001. Kondás O., Láng O., Hauser P., Garami M., Bognár L. és Schuler D.: Központi idegrendszeri metastasisok gyermekkori malignus tumorok esetében klinikánkon. Onkológia, 45(3): 273, 2001. Constantin T., Ponyi A., Garami M., Sallai Á. és Dankó K.: Juvenilis dermatomyositis – klasszifikáció és tünettan. Allergológia és Klinikai Immunológia, 5(2): 46, 2002. Garami M., Müller J., Hauser P., Borgulya G., Schuler D. és a Magyar Gyermekonkológiai Hálózat: Magyarországi Agytumor protokollal szerzett tapasztalataink és az elozetes eredmények medulloblastomás gyermekekben. Gyermekgyógyászat, 53(1, Suppl.): 28, 2002. Müller J., Garami M., Hauser P., Karádi Z., Bognár L. és Schuler D.: Központi idegrendszeri tumorok csecsemokorban. Gyermekgyógyászat, 53(1, Suppl.): 62, 2002.

99

Földesi E., Garami M., Müller J. Hauser P. és Schuler D.: A terminális állapot pszichés vezetésének sajátosságai a gyermekonkológiában. Gyermekgyógyászat, 53(1, Suppl.): 27, 2002. Garami M., Müller J. Hauser P., Borgulya G. Schuler D. and the Hungarian Pediatric Oncology Study Group: National Hungarian Protocol and its Preliminary Results in Treatment of Medulloblastoma in Children. Medical and Pediatric Oncology, 39(4): 341, 2002. Müller J., Garami M., Hauser P., Karádi Z. and Schuler D.: Central Nervous System Tumors in Infants. Medical and Pediatric Oncology, 39(4): 299, 2002. Halász Z., Garami M., Szabolcs J., Hajmássy Zs. And Kovács V.: Metastatic Adrenocortical Carcinoma: History of the First Year of Life. Endocrine Regulations , 36(4): 184, 2002. Constantin T., Ponyi A., Garami M., Gergely L. és Dankó K.: Juvenilis dermatomyositis. Magyar Reumatológia, 43(4): 138, 2002. Müller J., Kovács G., Garami M., Hauser P. és Schmidt M.: Lázas, cytopeniás gyermekek meropenem-kezelése. Gyermekgyógyászat, 54(1, Suppl.): 24, 2003. Garami M., Müller J., Hauser P. és Schuler D.: Izolált bormetasztázis mint elso tünet Wilms-tumoros betegünknél. Gyermekgyógyászat, 54(1, Suppl.): 121, 2003. Müller J., Kovács G., Garami M., Hauser P., Schmidt M. and Fekete Gy.: The Clinical Use of Meropenem in Infections of Immuncompromised Children. Medical and Pediatric Oncology, 41(4): 348, 2003. Hauser P., Láng O., Kondás O., Müller J., Garami M., Bognár L. and Schuler D.: Survival of Pediatrics Patients with CNS Metastasis of Primary Non-CNS Solid Tumors at the 2nd Department of Pediatrics, Semmelweis University from 1989 Through 2001. Medical and Pediatric Oncology, 41(4): 348-349, 2003.

100

Garami M., Müller J. Hauser P. and Schuler D.: Isolated Cutaneuos Metastasis as First Symptom of Wilms Tumor in an Eleven Years Old Girl. Medical and Pediatric Oncology, 41(4): 387, 2003. Garami M., Müller J., Hauser P. és Schuler D.: Wilms tumoros leány cranialis bormetastasisa. Magyar Onkológia, 47(3): 259, 2003. Garami M., Müller J., Hauser P., Schuler D. és Szendroi M.: Hazai Ewing sarcomas gyermek túlélésének prognosztikai szempontjai. Magyar Onkológia, 47(3): 259, 2003. Müller J., Kovács G., Garami M., Hauser P., Schmidt M. és Fekete Gy.: Gyermekkori lázas neutropéniás epizódok során alkalmazott meropenem terápia. Magyar Onkológia, 47(3): 288, 2003. Bertalan R., Hauser P., Müller J., Halász Z., Schuler D., Sólyom J. and Garami M.: Choriocarcinoma Associated with Gonadal Dysgenesis and 46,XY Karyotype. Slovenska Pediatrija, 10(3): 175-176, 2003. Müller J., Haltrich I., Szabó G., Kovács G., Koós R., Garami M., Kriván G., Dobos M. and Fekete Gy.: Donor-derived acute Myelomonocytic Leukaemia in a Patient Receiving Allogenic Bone Marrow Transplant for Severe Aplastic Anaemia. Bone Marrow Transplantation, 33(1, Suppl.): S143, 2004. Müller J., Constantin T., Hauser P., Erlaky H., Szendroi M. and Garami M.: Ewing Sarcoma Six Years After Chronic Monoarthritis. Hungarian Rheumatology, (Suppl.) 42, 2004. Bertalan R., Hauser P., Müller J., Halász Z., Schuler D., Sólyom J. és Garami M.: Choriocarcinomával szövodött gonadoblastoma - esetbemutatás. Orvosi Hetilap, 145(20, Suppl. 3): 1085, 2004. Petrilli A.S., Jakacki R.I., Perek D., Quintana J., Garami M., Hussein H., Gore L., Messina M. and Gollerkeri A.: Randomized Phase II Study of Carboplatin and Irinotecan or Irinotecan Alone in 1-21 Year Old Patients with Refractory Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology, 22(14S): 813s, 2004.

101

IRODALOMJEGYZÉK

1. Abdullah M. A., Katugampola M., al-Habib S., al-Jurayyan N., al-Samarrai A., Al-Nuaim A.,

Patel P. J. and Niazi M.: Ambiguous genitalia: medical, socio-cultural and religious factors affecting management in Saudi Arabia.

Ann Trop Paediatr, 11(4): 343-348, 1991.

2. Abeliovich D., Lavon I. P., Lerer I., Cohen T., Springer C., Avital A. and Cutting G. R.: Screening for five mutations detects 97% of cystic fibrosis (CF) chromosomes and predicts a carrier frequency of 1:29 in the Jewish Ashkenazi population.

Am J Hum Genet, 51(5): 951-956, 1992.

3. Airhart N., Yang Y. F., Roberts C. T., Jr. and Silberbach M.: Atrial natriuretic peptide induces natriuretic peptide receptor-cGMP-dependent protein kinase interaction.

J Biol Chem, 278(40): 38693-38698, 2003.

4. Alizai N. K., Thomas D. F., Lilford R. J., Batchelor A. G. and Johnson N.: Feminizing genitoplasty for congenital adrenal hyperplasia: what happens at puberty?

J Urology, 161(5): 1588-1591, 1999.

5. Anderson D. H.: Cystic fibrosis of the pancreas and its relation to celiac disease: A clinical and pathological study.

Am J Dis Child, 56: 344, 1938.

6. Argentin S., Nemer M., Drouin J., Scott G. K., Kennedy B. P. and Davies P. L.: The gene for rat atrial natriuretic factor.

J Biol Chem, 260(8): 4568-4571, 1985.

7. Argentin S., Ardati A., Tremblay S., Lihrmann I., Robitaille L., Drouin J. and Nemer M.: Developmental stage-specific regulation of atrial natriuretic factor gene transcription in cardiac cells.

Mol Cell Biol, 14(1): 777-790, 1994.

8. Arlt W., Walker E. A., Draper N., Ivison H. E., Ride J. P., Hammer F., Chalder S. M., Borucka-Mankiewicz M., Hauffa B. P., Malunowicz E. M., et al.: Congenital adrenal hyperplasia caused by mutant P450 oxidoreductase and human androgen synthesis: analytical study.

Lancet, 363(9427): 2128-2135, 2004.

9. Assis I., Camargos P. A., Reis F. J., Sulmonett N., Carneiro A. P., Terheggen-Lagro S., Truijens N., van Poppel N., Gulmans V., van der Laag J., et al.: Assessing correlations between spirometry and Shwachman-Kulczycki score in children and adolescents.

Pediatr Pulm, 36(4): 305-309, 2003.

10. Balinsky W., Zhu C. W., Richards C. S. and Grody W. W.: Pediatric cystic fibrosis: evaluating costs and genetic testing.

J Pediatr Health Care, 18(1): 30-34, 2004.

102

11. Banes A. J., Gilbert J., Taylor D. and Monbureau O.: A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro.

J Cell Sci, 75: 35-42, 1985.

12. Banes A. J., Link G. W., Jr., Gilbert J. W., Tran Son Tay R. and Monbureau O.: Culturing cells in a mechanically active environment.

Am Biotechnol Lab, 8(7): 12-22, 1990.

13. Barbero G. J.: Diagnosis of cystic fibrosis of the pancreas. Pediatrics, 24: 658-665, 1959.

14. Barbero G. J.: Cystic fibrosis. Ann Intern Med, 54: 586-587, 1961.

15. Barta C., Sasvári-Székely M. and Guttman A.: Simultaneous analysis of various mutations on the 21-hydroxylase gene by multi-allele specific amplification and capillary gel electrophoresis.

J Chromatogr A, 817(1-2): 281-286, 1998.

16. Batten J., Muir D., Simon G. and Carter C.: The prevalence of respiratory disease in heterozygotes for the gene for fibrocystic disease of the pancreas.

Lancet, 1: 1348-1350, 1963.

17. Baumer J. H., Wang L. and Freedman S. D.: Evidence based guidelines for the performance of the sweat test for the investigation of cystic fibrosis in the UK.

Arch Dis Child, 88(12): 1126-1127, 2003.

18. Bear C. E., Li C. H., Kartner N., Bridges R. J., Jensen T. J., Ramjeesingh M., Riordan J. R., Hanrahan J. W., Naismith A. L., Sun S. Z., et al.: Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).

Cell, 68(4): 809-818, 1992.

19. Bobadilla J. L., Macek M., Jr., Fine J. P. and Farrell P. M.: Cystic fibrosis: A worldwide analysis of CFTR mutations - correlation with incidence data and application to screening.

Hum Mutat, 19(6): 575-606, 2002.

20. Bompiani G. D., Rouiller C. and Hatt P. Y.: [The heart conduction tissue in the rat. Study by electron microscope. I. The common trunk of the bundle of His and the clear cells of the right auricle].

Arch Mal Coeur Vaiss, 52: 1257-1274, 1959.

21. Bonadonna G., Monfardini S., De Lena M. and Fossati-Bellani F.: Clinical evaluation of adriamy cin, a new antitumour antibiotic.

Brit Med J, 3(669): 503-506, 1969.

22. Borowitz D., Shmerling D. H., Walkowiak J., Cichy W. K. and Herzig K. H.: Evidence for the diagnosis of pancreatic insufficiency.

Pediatr Pulm, 29(3): 167-168, 2000.

103

23. Boyle M. P., Lyon E. and Miller C.: Nonclassic cystic fibrosis and CFTR-related diseases. Curr Opin Pulm Med, 9(6): 498-503, 2003.

24. Brent R., Kingston R. E., Seidman J. G., Struhl K., Ausubel F. M., Chanda V. B. and Moore D. D.: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I-II-III. John Wiley & Sons, Inc., New York, 2004.

25. Britto M. T., Kotagal U. R., Chenier T., Tsevat J., Atherton H. D. and Wilmott R. W.: Differences between adolescents' and parents' reports of health-related quality of life in cystic fibrosis.

Pediatr Pulm, 37(2): 165-171, 2004.

26. Bu'Lock F. A., Martin R. P. and Mott M. G.: Increased risk of cardiac dysfunction after anthracyclines in girls.

Med Pediatr Oncol, 24(2): 143-144, 1995.

27. Burghuber O. C., Hartter E., Weissel M., Wolosczcuk W. and Gotz M.: Raised circulating plasma levels of atrial natriuretic peptide in adolescent and adult patients with cystic fibrosis and pulmonary artery hypertension.

Lung, 169(5): 291-300, 1991.

28. Cade A., Walters M. P., McGinley N., Firth J., Brown lee K. G., Conway S. P., Littlewood J. M., Borowitz D., Shmerling D. H., Walkowiak J., et al.: Evaluation of fecal pancreatic elastase-1 as a measure of pancreatic exocrine function in children with cystic fibrosis.

Pediatr Pulm, 29(3): 172-176, 2000.

29. Calafell F., Underhill P., Tolun A., Angelicheva D. and Kalaydjieva L.: From Asia to Europe: mitochondrial DNA sequence variability in Bulgarians and Turks.

Ann Hum Genet, 60(Pt 1): 35-49, 1996.

30. Carlson A. D., Obeid J. S., Kanellopoulou N., Wilson R. C. and New M. I.: Congenital adrenal hyperplasia: update on prenatal diagnosis and treatment.

J Steroid Biochem Mol Biol, 69(1-6): 19-29, 1999.

31. Carroll M. C., Campbell R. D. and Porter R. R.: Mapping of steroid 21-hydroxylase genes adjacent to comple ment component C4 genes in HLA, the major histocompatibility complex in man.

P Natl Acad Sci USA, 82(2): 521-525, 1985.

32. Carter C. O., Batten J., Muir D., Simon G. and Carter C.: Genetic Counselling and Looking to the Future.

J Coll Gen Pract, 17: SUPPL 2:57-66, 1964.

33. Carter C. O., Batten J., Muir D., Simon G. and Carter C.: Genetical aspects of cystic fibrosis of the pancreas.

Bibl Paediatr, 86: 372-380, 1967.

104

34. Casals T., Nunes V., Palacio A., Gimenez J., Gaona A., Ibanez N., Morral N. and Estivill X.: Cystic fibrosis in Spain: high frequency of mutation G542X in the Mediterranean coastal area.

Hum Genet, 91(1): 66-70, 1993.

35. Chang M. S., Lowe D. G., Lewis M., Hellmiss R., Chen E. and Goeddel D. V.: Differential activation by atrial and brain natriuretic peptides of two different receptor guanylate cyclases.

Nature, 341(6237): 68-72, 1989.

36. Chen H. H., Redfield M. M., Nordstrom L. J., Horton D. P. and Burnett J. C., Jr.: Subcutaneous administration of the cardiac hormone BNP in symptomatic human heart failure.

J Card Fail, 10(2): 115-119, 2004.

37. Chillon M., Dork T., Casals T., Gimenez J., Fonknechten N., Will K., Ramos D., Nunes V. and Estivill X.: A novel donor splice site in intron 11 of the CFTR gene, created by mutation 1811+1.6kbA-->G, produces a new exon: high frequency in Spanish cystic fibrosis chromosomes and association with severe phenotype.

Am J Hum Genet, 56(3): 623-629, 1995.

38. Chiou S. H., Hu M. C. and Chung B. C.: A missense mutation at Ile172--Asn or Arg356--Trp causes steroid 21-hydroxylase deficiency.

J Biol Chem, 265(6): 3549-3552, 1990.

39. Chow Y. H., Plumb J., Wen Y., Steer B. M., Lu Z., Buchwald M. and Hu J.: Targeting transgene expression to airway epithelia and submucosal glands, prominent sites of human CFTR expression.

Mol Ther, 2(4): 359-367, 2000.

40. Coates A. L., Desmond K. J., Demizio D., Allen P., Beaudry P. H., Leupold W., Zapletal A., Houstek J., Samanek M., Vavrova V., et al.: Sources of error in flow-volume curves. Effect of expired volume measured at the mouth vs that measured in a body plethysmograph.

Chest, 94(5): 976-982, 1988.

41. Collee J. M., de Vries H. G., Scheffer H., Halley D. J., ten Kate L. P., Kadasi L., Gecz J., Matusek J., Krivusova T., Ferak V., et al.: Relative frequencies of cystic fibrosis mutations in The Netherlands as an illustration of significant regional variation in a small country.

Hum Genet, 102(5): 587-590, 1998.

42. Conway S. P., Pond M. N., Bowler I., Smith D. L., Simmonds E. J., Joanes D. N., Hambleton G., Hiller E. J., Stableforth D. E., Weller P., et al.: The chest radiograph in cystic fibrosis: a new scoring system compared with the Chrispin-Norman and Brasfield scores.

Thorax, 49(9): 860-862, 1994.

43. Cooper P. J., Robertson C. F., Hudson I. L., Phelan P. D., Coates A. L., Desmond K. J., Demizio D., Allen P., Beaudry P. H., Leupold W., et al.: Variability of pulmonary function tests in cystic fibrosis.

Pediatr Pulm, 8(1): 16-22, 1990.

44. Cowie M. R.: B type natriuretic peptide testing: where are we now? Heart, 90(7): 725-726, 2004.

105

45. Crowley S. and Bush A.: Cystic fibrosis: keeping it in the family. Pediatr Pulm, 33(2): 158-161, 2002.

46. Cuthbert A. W., Halstead J., Ratcliff R., Colledge W. H., Evans M. J., Gabriel S. E., Brigman K. N., Koller B. H., Boucher R. C., Stutts M. J., et al.: The genetic advantage hypothesis in cystic fibrosis heterozygotes: a murine study.

J Physiol, 482 ( Pt 2)(5182): 449-454, 1995.

47. Cutting G. R., Kasch L. M., Rosenstein B. J., Zielenski J., Tsui L. C., Antonarakis S. E. and Kazazian H. H., Jr.: A cluster of cystic fibrosis mutations in the first nucleotide-binding fold of the cystic fibrosis conductance regulator protein.

Nature, 346(6282): 366-369, 1990.

48. Cystic Fibrosis, Genetic Analysis Consortium (CFGAC): Population variation of common cystic fibrosis mutations.

Hum Mutat, 4(3): 167-177, 1994.

49. Dagnino L., Drouin J. and Nemer M.: Differential expression of natriuretic peptide genes in cardiac and extracardiac tissues.

Mol Endocrinol, 5(9): 1292-1300, 1991.

50. Dao Q., Krishnaswamy P., Kazanegra R., Harrison A., Amirnovin R., Lenert L., Clopton P., Alberto J., Hlavin P. and Maisel A. S.: Utility of B-type natriuretic peptide in the diagnosis of congestive heart failure in an urgent-care setting.

J Am Coll Cardiol, 37(2): 379-385, 2001.

51. de Boer R. A., Henning R. H., Suurmeijer A. J., Pinto Y. M., Olthof E., Kirkels J. H., van Gilst W. H., Crijns H. J. and van Veldhuisen D. J.: Early expression of natriuretic peptides and SERCA in mild heart failure: association with severity of the disease.

Int J Cardiol, 78(1): 5-12, 2001.

52. de Bold A. J., Borenstein H. B., Veress A. T. and Sonnenberg H.: A rapid and potent natriuretic response to intravenous injection of atrial myocardial extract in rats.

Life Sci, 28(1): 89-94, 1981.

53. de Bold A. J., Borenstein H. B., Veress A. T. and Sonnenberg H.: A rapid and potent natriuretic response to intravenous injection of atrial myocardial extract in rats. Reprinted from Life Sci. 28:89-94, 1981.

J Am Soc Nephrol, 12(2): 403-409; discussion 403-408, 408-409, 2001.

54. de Bold M. L. K., Denholm E. L., Vukic V. L., Shoushtarian A. L., Leger R. L., Bridon D. L. and de Bold A. L.: Pharmacological properties of CJC-1382, a long acting ANF analog.

In: Experimental Biology, Washington, DC; Faseb Journal, 18(4 Suppl.): A687, 2004.

55. De Braekeleer M. and Ferec C.: Mutations in the cystic fibrosis gene in men with congenital bilateral absence of the vas deferens.

Mol Hum Reprod, 2(9): 669-677, 1996.

56. De Crecchio L.: Spora un caso di apparenze virili in una donna. Morgagni, 7: 154-188, 1865.

106

57. de Vries H. G., Collee J. M., de Walle H. E., van Veldhuizen M. H., Smit Sibinga C. T., Scheffer H., ten Kate L. P., Baranov V. S., Ivaschenko T. E., Gorbunova V. N., et al.: Prevalence of delta F508 cystic fibrosis carriers in The Netherlands: logistic regression on sex, age, region of residence and number of offspring.

Hum Genet, 99(1): 74-79, 1997.

58. Dean M., White M. B., Amos J., Gerrard B., Stewart C., Khaw K. T. and Leppert M.: Multiple mutations in highly conserved residues are found in mildly affected cystic fibrosis patients.

Cell, 61(5): 863-870, 1990.

59. DeLambo K. E., Ievers-Landis C. E., Drotar D., Quittner A. L., Britto M. T., Kotagal U. R., Chenier T., Tsevat J., Atherton H. D. and Wilmott R. W.: Association of observed family relationship quality and problem-solving skills with treatment adherence in older children and adolescents with cystic fibrosis.

J Pediatr Psychol, 29(5): 343-353, 2004.

60. Demirkazik F. B., Ariyurek O. M., Ozcelik U., Gocmen A., Hassanabad H. K., Kiper N., Santamaria F., Grillo G., Guidi G., Rotondo A., et al.: High resolution CT in children with cystic fibrosis: correlation with pulmonary functions and radiographic scores.

Eur J Radiol, 37(1): 54-59, 2001.

61. di Sant' Agnese P. A., Darling R. C., Perrera G. A. and Shea E.: Abnormal electrolytic composition of sweat in cystic fibrosis of the pancreas.

Pediatrics, 12: 549, 1953.

62. Dittmann R. W., Kappes M. H., Kappes M. E., Borger D., Meyer-Bahlburg H. F., Stegner H., Willig R. H. and Wallis H.: Congenital adrenal hyperplasia. II: Gender-related behavior and attitudes in female salt-wasting and simple-virilizing patients.

Psychoneuroendocrino, 15(5-6): 421-434, 1990.

63. Dittmann R. W., Kappes M. H., Kappes M. E., Borger D., Stegner H., Willig R. H. and Wallis H.: Congenital adrenal hyperplasia. I: Gender-related behavior and attitudes in female patients and sisters.

Psychoneuroendocrino, 15(5-6): 401-420, 1990.

64. Dolzan V., Stopar-Obre za M., Zerjav-Tansek M., Breskvar K., Krzisnik C. and Battelino T.: Mutational spectrum of congenital adrenal hyperplasia in Slovenian patients: a novel Ala15Thr mutation and Pro30Leu within a larger gene conversion associated with a severe form of the dis ease.

Eur J Endocrinol, 149(2): 137-144, 2003.

65. Domenice S., Billerbeck A. E., Rocha R. O., Nishi M. Y., Medeiros M. A., Bachega T. A., Budunki V. and Mendonca B. B.: Protocol for rapid fetal sex determination in chorionic villus through polimerase chain reaction.

Rev Hosp Clin Fac Med Sao Paulo, 53(2): 80-82, 1998.

107

66. Dork T., Macek M., Jr., Mekus F., Tummler B., Tzountzouris J., Casals T., Krebsova A., Koudova M., Sakmaryova I., Macek M., Sr., et al.: Characterization of a novel 21-kb deletion, CFTRdele2,3(21 kb), in the CFTR gene: a cystic fibrosis mutation of Slavic origin common in Central and East Europe.

Hum Genet, 106(3): 259-268, 2000.

67. Dracopoulou-Vabouli M., Maniati-Christidi M. and Dacou-Voutetakis C.: The spectrum of molecular defects of the CYP21 gene in the Hellenic population: variable concordance between genotype and phenotype in the different forms of congenital adrenal hyperplasia.

J Clin Endocrinol Metab, 86(6): 2845-2848, 2001.

68. Drewett J. G., Fendly B. M., Garbers D. L. and Lowe D. G.: Natriuretic peptide receptor-B (guanylyl cyclase-B) mediates C-type natriuretic peptide relaxation of precontracted rat aorta.

J Biol Chem, 270(9): 4668-4674, 1995.

69. Drumm M. L.: Modifier genes and variation in cystic fibrosis. Resp Res, 2(3): 125-128, 2001.

70. Durocher D., Chen C. Y., Ardati A., Schwartz R. J. and Nemer M.: The atrial natriuretic factor promoter is a downstream target for Nkx-2.5 in the myocardium.

Mol Cell Biol, 16(9): 4648-4655, 1996.

71. Endreffy E., Burg K., Gyurkovits K., Kálmán M., László A. and Raskó I.: Allele frequencies of cystic fibrosis -linked markers and F508 deletion in affected Hungarian families.

Acta Paediatr Hung, 32(2): 101-113, 1992.

72. Erhardt E., Sólyom J., Homoki J., Juricskay S. and Soltész G.: Correlation of blood-spot 17-hydroxyprogesterone daily profiles and urinary steroid profiles in congenital adrenal hyperplasia.

J Pediatr Endocr Metab, 13(2): 205-210, 2000.

73. Estivill X., Bancells C. and Ramos C.: Geographic distribution and regional origin of 272 cystic fibrosis mutations in European populations. The Biomed CF Mutation Analysis Consortium.

Hum Mutat, 10(2): 135-154, 1997.

74. European Working, Group on CF Genetics (EWGCFG): Gradient of distribution in Europe of the major CF mutation and of its associated haplotype.

Hum Genet, 85(4): 436-445, 1990.

75. Fanconi G., Uehlinger E. and Knauer C.: Das coeliakiesyndrom be: Angeborener zysticher pancreas fibromatose und bronkiektasien.

Wien Medical Wochenschr, 86: 753, 1936.

76. Farrell P. M.: Improving the health of patients with cystic fibrosis through newborn screening. Wisconsin Cystic Fibrosis Neonatal Screening Study Group.

Adv Pediatr, 47: 79-115, 2000.

77. Fekete G., Váradi A., Pipiras E., Németh K., Réthy L. A., Holics K. and Ujhelyi R.: [Detection of delta F508 mutation in cystic fibrosis].

Orv Hetil, 133(38): 2423-2424, 2427-2430, 1992.

108

78. Forest M. G., David M. and Morel Y.: Prenatal diagnosis and treatment of 21-hydroxylase deficiency.

J Steroid Biochem Mol Biol, 45(1-3): 75-82, 1993.

79. Frasier S. D., Thorneycroft I. H., Weiss B. A. and Horton R.: Elevated amniotic fluid concentration of 17 alpha-hydroxyprogesterone in congenital adrenal hyperplasia.

J Pediatr, 86(2): 310-312, 1975.

80. Friedrichs F., Kusenbach G., Skopnik H., Benz-Bohm G., Dohmen H., Heimann G., Lewiston N., Moss R., Hindi R., Rubinstein S., et al.: [Cardiopulmonary capacity in patients with mucoviscidosis. Comparison of ergospirometry findings with clinical and radiological scores].

Monatsschr Kinderh, 140(12): 864-868, 1992.

81. Frisch H., Waldhauser F., Lebl J., Sólyom J., Hargitai G., Kovács J., Pribilincova Z., Krzisnik C. and Battelino T.: Congenital adrenal hyperplasia: lessons from a multinational study.

Horm Res, 57 Suppl 2: 95-101, 2002.

82. Fuchs E., Shigematsu K. and Saavedra J. M.: Binding sites of atrial natriuretic peptide in tree shrew adrenal gland.

Peptides, 7(5): 873-876, 1986.

83. Gabriel S. E., Brigman K. N., Koller B. H., Boucher R. C., Stutts M. J., Rodman D. M. and Zamudio S.: Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the cystic fibrosis mouse model.

Science, 266(5182): 107-109, 1994.

84. Gardner D. G., Gertz B. J. and Hane S.: Thyroid hormone increases rat atrial natriuretic peptide messenger ribonucleic acid accumulation in vivo and in vitro.

Mol Endocrinol, 1(3): 260-265, 1987.

85. Gasparini P., Nunes V., Savoia A., Dognini M., Morral N., Gaona A., Bonizzato A., Chillon M., Sangiuolo F., Novelli G., et al.: The search for south European cystic fibrosis mutations: identification of two new mutations, four variants, and intronic sequences.

Genomics, 10(1): 193-200, 1991.

86. Giorgi S., Tandoi C., Ciminelli B. M. and Modiano G.: A correction of the estimates of the least common cystic fibrosis (CF) mutations published by "The Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium" in 1994.

Gene Geogr, 11(1): 57-59, 1997.

87. Gonzalez R. R., Maentausta O., Sólyom J., Vihko R., Hughes I. A., Babosa M., Dizseri T., Galambosi L., Hervei S., Marossy P., et al.: Direct solid-phase time-resolved fluoroimmunoassay of 17 alpha-hydroxyprogesterone in serum and dried blood spots on filter paper.

Clin Chem, 36(9): 1667-1672, 1990.

88. Gordon A. H., Lee P. A., Dulcan M. K. and Finegold D. N.: Behavioral problems, social competency, and self perception among girls with congenital adrenal hyperplasia.

Child Psychiat Hum D, 17(2): 129-138, 1986.

109

89. Gowda V., Roberts M., Wolfe R., Klaustermeyer W. B., Baumer J. H., Wang L. and Freedman S. D.: Recurrent cough and normal sweat chloride test.

Ann Allerg Asthma Imm, 91(6): 527-530, 2003.

90. Greenberg B. D., Bencen G. H., Seilhamer J. J., Lewicki J. A. and Fiddes J. C.: Nucleotide sequence of the gene encoding human atrial natriuretic factor precursor.

Nature, 312(5995): 656-658, 1984.

91. Grepin C., Dagnino L., Robitaille L., Haberstroh L., Antakly T. and Nemer M.: A hormone-encoding gene identifies a pathway for cardiac but not skeletal muscle gene transcription.

Mol Cell Biol, 14(5): 3115-3129, 1994.

92. Grigorescu-Sido A., Schulze E., Grigorescu-Sido P., Heinrich U., Nistor T. and Duncea I.: Mutational analysis and genotype-phenotype correlation in patients with classic 21-hydroxylase deficiency from transylvania (north-west Romania).

J Pediatr Endocr Metab, 15(9): 1505-1514, 2002.

93. Groman J. D., Hefferon T. W., Casals T., Bassas L., Estivill X., Des Georges M., Guittard C., Koudova M., Fallin M. D., Nemeth K., et al.: Variation in a repeat sequence determines whether a common variant of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene is pathogenic or benign.

Am J Hum Genet, 74(1): 176-179, 2004.

94. Gutkowska J., Horky K., Thibault G., Januszewicz P., Cantin M. and Genest J.: Atrial natriuretic factor is a circulating hormone.

Biochem Bioph Res Co, 125(1): 315-323, 1984.

95. Gutkowska J. and Nemer M.: Structure, expression, and function of atrial natriuretic factor in extraatrial tissues.

Endocr Rev, 10(4): 519-536, 1989.

96. Gyurkovits K. and Szabó A.: [Liver complications in patients with mucoviscidosis]. Orv Hetil, 125(8): 437-441, 1984.

97. Haddow J. E., Boyle M. P., Lyon E. and Miller C.: Prenatal screening for cystic fibrosis in the United States -- time to re -evaluate implementation policies.

J Med Screen, 10(3): 105-106, 2003.

98. Halley D. J., Veeze H. J., Sandkuyl L. A., Wesby-van Swaay E., van Damme N. H., Deelen W. H., Witte J. E., Niermeijer M. F., Abeliovich D., Lavon I. P., et al.: The mutation delta F508 on Dutch cystic fibrosis chromosomes: frequency and relation to patients age at diagnosis.

Hum Genet, 85(4): 407-408, 1990.

99. Hannken T., Schroeder R., Stahl R. A. and Wolf G.: Atrial natriuretic peptide attenuates ANG II-induced hypertrophy of renal tubular cells.

Am J Physiol-Renal, 281(1): F81-90, 2001.

110

100. He Q., Wang D., Yang X. P., Carretero O. A. and LaPointe M. C.: Inducible regulation of human brain natriuretic peptide promoter in transgenic mice.

Am J Physiol-Heart C, 280(1): H368-376, 2001.

101. Helleday J., Siwers B., Ritzen E. M. and Carlstrom K.: Subnormal androgen and elevated progesterone levels in women treated for congenital virilizing 21-hydroxylase deficiency.

J Clin Endocrinol Metab, 76(4): 933-936, 1993.

102. Hendren W. H. and Atala A.: Repair of the high vagina in girls with severely masculinized anatomy from the adrenogenital syndrome.

J Pediatr Surg, 30(1): 91-94, 1995.

103. Henry J. P., Gauer O. H. and Reeves J. L.: Evidence of the atrial location of receptors influencing urine flow.

Circ Res, 4(1): 85-90, 1956.

104. Hergersberg M., Balakrishnan J., Bettecken T., Chevalier-Porst F., Bragger C., Burger R., Einschenk I., Liechti-Gallati S., Morris M., Schorderet D., et al.: A new mutation, 3905insT, accounts for 4.8% of 1173 CF chromosomes in Switzerland and causes a severe phenotype.

Hum Genet, 100(2): 220-223, 1997.

105. Higashi Y., Hiromasa T., Tanae A., Miki T., Nakura J., Kondo T., Ohura T., Ogawa E., Nakayama K. and Fujii-Kuriyama Y.: Effects of individual mutations in the P-450(C21) pseudogene on the P-450(C21) activity and their distribution in the patient genomes of congenital steroid 21-hydroxylase deficiency.

J Biochem-Tokyo, 109(4): 638-644, 1991.

106. Highsmith W. E., Burch L. H., Zhou Z., Olsen J. C., Boat T. E., Spock A., Gorvoy J. D., Quittel L., Friedman K. J., Silverman L. M., et al.: A novel mutation in the cystic fibrosis gene in patients with pulmonary disease but normal sweat chloride concentrations.

N Engl J Med, 331(15): 974-980, 1994.

107. Hochberg Z., Gardos M. and Benderly A.: Psychosexual outcome of assigned females and males with 46,XX virilizing congenital adrenal hyperplasia.

Eur J Pediatr, 146(5): 497-499, 1987.

108. Hochster H., Wasserheit C. and Speyer J.: Cardiotoxicity and cardioprotection during chemotherapy.

Curr Opin Oncol, 7(4): 304-309, 1995.

109. Hodge S. E., Lebo R. V., Yesley A. R., Cheney S. M., Angle H. and Milunsky J.: Calculating posterior cystic fibrosis risk with echogenic bowel and one characterized cystic fibrosis mutation: avoiding pitfalls in the risk calculations.

Am J Med Genet, 82(4): 329-335, 1999.

110. Holsclaw D. S., Perlmutter A. D., Jockin H. and Shwachman H.: Genital abnormalities in male patients with cystic fibrosis.

J Urology, 106(4): 568-574, 1971.

111

111. Homoki J., Sólyom J., Teller W. M., Gács G., Keszei K., Láng K., Orley J., Petheo I., Sagodi L. and Kürti K.: Detection of late onset steroid 21-hydroxylase deficiency by capillary gas chromatographic profiling of urinary steroids in children and adolescents.

Eur J Pediatr, 147(3): 257-262, 1988.

112. Hryciw D. H. and Guggino W. B.: Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and the outwardly rectifying chloride channel: a relationship between two chloride channels expressed in epithelial cells.

Clin Exp Pharmacol P, 27(11): 892-895, 2000.

113. Hughes I.: Congenital adrenal hyperplasia: phenotype and genotype. J Pediatr Endocr Metab, 15 Suppl 5: 1329-1340, 2002.

114. Hundrieser J., Bremer S., Peinemann F., Stuhrmann M., Hoffknecht N., Wulf B., Schmidtke J., Reiss J., Maass G. and Tummler B.: Frequency of the F508 deletion in the CFTR gene in Turkish cystic fibrosis patients.

Hum Genet, 85(4): 409-410, 1990.

115. Igaz P., Pap E., Patócs A., Falus A., Tulassay Z. and Rácz K.: Genomics of steroid hormones: in silico analysis of nucleotide sequence variants (polymorphisms) of the enzymes involved in the biosynthesis and metabolism of steroid hormones.

J Steroid Biochem Mol Biol, 82(4-5): 359-367, 2002.

116. Itoh H., Nakao K., Sugawara A., Saito Y., Mukoyama M., Morii N., Yamada T., Shiono S., Arai H., Hosoda K., et al.: Gamma -atrial natriuretic polypeptide (gamma ANP)-derived peptides in human plasma: cosecretion of N-terminal gamma ANP fragment and alpha ANP.

J Clin Endocrinol Metab, 67(3): 429-437, 1988.

117. Jaaskelainen J., Levo A., Voutilainen R. and Partanen J.: Population-wide evaluation of disease manifestation in relation to molecular genotype in steroid 21-hydroxylase (CYP21) deficiency: good correlation in a well defined population.

J Clin Endocrinol Metab, 82(10): 3293-3297, 1997.

118. Jamieson J. D. and Palade G. E.: Specific Granules in Atrial Muscle Cells. J Cell Biol, 23: 151-172, 1964.

119. Jarzabek K., Zbucka M., Pepinski W., Szamatowicz J., Domitrz J., Janica J., Wolczynski S. and Szamatowicz M.: Cystic fibrosis as a cause of infertility.

Reprod Biol, 4(2): 119-129, 2004.

120. Jeffcoate T. N. A., Fleigner J. R. H., Russell S. H., Davis J. C. and Wade A. P.: Diagnosis of the adrenogenital syndrome before birth.

Lancet, 2: 553, 1965.

121. Kadasi L., Gecz J., Matusek J., Krivusova T., Ferak V., Devoto M., Hruskovic J., Romeo G., Halley D. J., Veeze H. J., et al.: Deletion delta F508 and haplotype analysis of CFTR gene region in Slovak CF patients.

Hum Genet, 89(3): 305-306, 1992.

112

122. Kadasi L., Polakova H., Zatkova A. and Kayserova H.: Distribution of 9 common mutations in the CFTR gene in Slovak cystic fibrosis patients.

Gene Geogr, 11(1): 51-56, 1997.

123. Kanga J., Kuhn R., Craigmyle L., Haverstock D. and Church D.: Cystic fibrosis clinical score: a new scoring system to evaluate acute pulmonary exacerbation.

Clin Ther, 21(8): 1343-1356, 1999.

124. Kangawa K., Fukuda A. and Matsuo H.: Structural identification of beta- and gamma -human atrial natriuretic polypeptides.

Nature, 313(6001): 397-400, 1985.

125. Kaplan E., Shwachman H., Perlmutter A. D., Rule A., Khaw K. T. and Holsclaw D. S.: Reproductive failure in males with cystic fibrosis.

N Engl J Med, 279(2): 65-69, 1968.

126. Kartner N., Hanrahan J. W., Jensen T. J., Naismith A. L., Sun S. Z., Ackerley C. A., Reyes E. F., Tsui L. C., Rommens J. M., Bear C. E., et al.: Expression of the cystic fibrosis gene in non-epithelial invertebrate cells produces a regulated anion conductance.

Cell, 64(4): 681-691, 1991.

127. Katsuragi T. and Migita K.: [The mechanism of ATP release as an autocrine/paracrine molecule].

Nippon Yakurigaku Zasshi, 123(6): 382-388, 2004.

128. Kauczor H. U., Chen X. J., van Beek E. J., Schreiber W. G., Demirkazik F. B., Ariyurek O. M., Ozcelik U., Gocmen A., Hassanabad H. K., Kiper N., et al.: Pulmonary ventilation imaged by magnetic resonance: at the doorstep of clinical application.

Eur Respir J, 17(5): 1008-1023, 2001.

129. Kerem B., Rommens J. M., Buchanan J. A., Markiewicz D., Cox T. K., Chakravarti A., Buchwald M. and Tsui L. C.: Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis.

Science, 245(4922): 1073-1080, 1989.

130. Kerem B. S., Zielenski J., Markiewicz D., Bozon D., Gazit E., Yahav J., Kennedy D., Riordan J. R., Collins F. S., Rommens J. M., et al.: Identification of mutations in regions corresponding to the two putative nucleotide (ATP)-binding folds of the cystic fibrosis gene.

P Natl Acad Sci USA, 87(21): 8447-8451, 1990.

131. Kilinc M. O., Ninis V. N., Dagli E., Demirkol M., Ozkinay F., Arikan Z., Cogulu O., Huner G., Karakoc F. and Tolun A.: Highest heterogeneity for cystic fibrosis: 36 mutations account for 75% of all CF chromosomes in Turkish patients.

Am J Med Genet, 113(3): 250-257, 2002.

132. Kim S. H., Han J. H., Kim S. Z. and Cho K.: Role of stretch-activated channels in ANP release. In: Experimental Biology, Washington, DC; Faseb Journal, 18(4 Suppl.): A733, 2004.

113

133. Kinnunen P., Taskinen T., Jarvinen M. and Ruskoaho H.: Effect of phorbol ester on the release of atrial natriuretic peptide from the hypertrophied rat myocardium.

Br J Pharmacol, 102(2): 453-461, 1991.

134. Kisch B.: Electron microscopy of the atrium of the heart. I. Guinea pig. Exp Med Surg, 14(2-3): 99-112, 1956.

135. Kishimoto I., Rossi K. and Garbers D. L.: A genetic model provides evidence that the receptor for atrial natriuretic peptide (guanylyl cyclase-A) inhibits cardiac ventricular myocyte hypertrophy.

P Natl Acad Sci USA, 98(5): 2703-2706, 2001.

136. Klein I., Sarkadi B. and Váradi A.: An inventory of the human ABC proteins. Biochim Biophys Acta, 1461(2): 237-262, 1999.

137. Kohno M., Horio T., Yo kokawa K., Yasunari K., Ikeda M., Minami M., Kurihara N. and Takeda T.: Brain natriuretic peptide as a marker for hypertensive left ventricular hypertrophy: changes during 1-year antihypertensive therapy with angiotensin-converting enzyme inhibitor.

Am J Med, 98(3): 257-265, 1995.

138. Kone B. C.: Molecular biology of natriuretic peptides and nitric oxide synthases. Cardiovasc Res, 51(3): 429-441, 2001.

139. Kotaska K., Lisa L. and Prusa R.: Common CYP21 gene mutations in Czech patients and statistical analysis of worldwide mutation distribution.

Cent Eur J Public Health, 11(3): 124-128, 2003.

140. Kovács J., Votava F., Heinze G., Sólyom J., Lebl J., Pribilincova Z., Frisch H., Battelino T., Waldhauser F., Erhardt E., et al.: Lessons from 30 years of clinical diagnosis and treatment of congenital adrenal hyperplasia in five middle European countries.

J Clin Endocrinol Metab, 86(7): 2958-2964, 2001.

141. Kuhnle U. and Bullinger M.: Outcome of congenital adrenal hyperplasia. Pediatr Surg Int, 12(7): 511-515, 1997.

142. Lacey J. M., Minutti C. Z., Magera M. J., Tauscher A. L., Casetta B., McCann M., Lymp J., Hahn S. H., Rinaldo P. and Matern D.: Improved specificity of newborn screening for congenital adrenal hyperplasia by second-tier steroid profiling using tandem mass spectrometry.

Clin Chem, 50(3): 621-625, 2004.

143. Lainchbury J. G., Espiner E. A., Frampton C. M., Richards A. M., Yandle T. G. and Nicholls M. G.: Cardiac natriuretic peptides as predictors of mortality.

J Intern Med, 241(4): 257-259, 1997.

144. Lakshminrusimha S., D'Angelis C. A., Russell J. A., Nielsen L. C., Gugino S. F., Nickerson P. A. and Steinhorn R. H.: C-type natriuretic peptide system in fetal ovine pulmonary vasculature.

Am J Physiol-Lung C, 281(2): L361-368, 2001.

114

145. Lang D., Hilger F., Binswanger J., Andelfinger G. and Hartmann W.: Late effects of anthracycline therapy in childhood in relation to the function of the heart at rest and under physical stress.

Eur J Pediatr, 154(5): 340-345, 1995.

146. Lang R. E., Tholken H., Ganten D., Luft F. C., Ruskoaho H. and Unger T.: Atrial natriuretic factor--a circulating hormone stimulated by volume loading.

Nature, 314(6008): 264-266, 1985.

147. Lankisch P. G., Serban D. E., Florescu P., Miu N., Cade A., Walters M. P., McGinley N., Firth J., Brownlee K. G., Conway S. P., et al.: Now that fecal elastase is available in the United States, should clinicians start using it?

Curr Gastroenterol Rep, 6(2): 126-131, 2004.

148. Larsen J., Georghiou A., Kury F. D., Gotz M., Sanz K., Dobianer K., Spona J., Wagner K., Zach M. and Rosenkranz W.: Frequency of delta F508 mutation and haplotype analysis in Austrian cystic fibrosis families.

Hum Genet, 89(4): 464-465, 1992.

149. Lattion A. L., Michel J. B., Arnauld E., Corvol P. and Soubrier F.: Myocardial recruitment during ANF mRNA increase with volume overload in the rat.

Am J Physiol, 251(5 Pt 2): H890-896, 1986.

150. Lee H.: CYP21 mutations and congenital adrenal hyperplasia. Clin Genet, 59(5): 293-301, 2001.

151. Lee R. T., Bloch K. D., Pfe ffer J. M., Pfeffer M. A., Neer E. J. and Seidman C. E.: Atrial natriuretic factor gene expression in ventricles of rats with spontaneous biventricular hypertrophy.

J Clin Invest, 81(2): 431-434, 1988.

152. Leigh M. W., Gowda V., Roberts M., Wolfe R., Klaustermeyer W. B., Baumer J. H., Wang L. and Freedman S. D.: Diagnosis of CF despite normal or borderline sweat chloride.

Paediatr Respir Rev, 5 Suppl A(6): S357-359, 2004.

153. Leupold W., Zapletal A., Houstek J., Samanek M., Vavrova V. and Srajer J.: [Lung function and physical performance in patients with mucoviscidosis].

Z Erkr Atmungsorgane, 171(2): 190-198, 1988.

154. Lewiston N., Moss R., Hindi R., Rubinstein S. and Sullivan M.: Interobserver variance in clinical scoring for cystic fibrosis.

Chest, 91(6): 878-882, 1987.

155. Li C., Roy K., Dandridge K. and Naren A. P.: Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane.

J Biol Chem, 279(23): 24673-24684, 2004.

115

156. Liang F. and Gardner D. G.: Mechanical strain activates BNP gene transcription through a p38/NF-kappaB-dependent mechanism.

J Clin Invest, 104(11): 1603-1612, 1999.

157. Liang F., Holt I., Pertea G., Karamycheva S., Salzberg S. L. and Quackenbush J.: Gene index analysis of the human genome estimates approximately 120,000 genes.

Nat Genet, 25(2): 239-240, 2000.

158. Liang F., Lu S. and Gardner D. G.: Endothelin-dependent and -independent components of strain-activated brain natriuretic peptide gene transcription require extracellular signal regulated kinase and p38 mitogen-activated protein kinase.

Hypertension, 35(1 Pt 2): 188-192, 2000.

159. Lipshultz S. E., Colan S. D., Gelber R. D., Perez-Atayde A. R., Sallan S. E. and Sanders S. P.: Late cardiac effects of doxorubicin therapy for acute lymp hoblastic leukemia in childhood.

N Engl J Med, 324(12): 808-815, 1991.

160. Lissens W., Mercier B., Tournaye H., Bonduelle M., Ferec C., Seneca S., Devroey P., Silber S., Van Steirteghem A. and Liebaers I.: Cystic fibrosis and infertility caused by congenital bilateral absence of the vas deferens and related clinical entities.

Hum Reprod, 11 Suppl 4: 55-78; discussion 79-80, 1996.

161. Liu J. S., Sabatti C., Teng J., Keats B. J. and Risch N.: Bayesian analysis of haplotypes for linkage disequilibrium mapping.

Genome Res, 11(10): 1716-1724, 2001.

162. Loirat F. and Lucotte G.: [Frequency of the main mutation (delta F508) of cystic fibrosis in France: new results about 1656 unrelated families].

Arch Pediatr, 3(12): 1279-1281, 1996.

163. London D. R.: The consequences of hyperandrogenism in young women. J Roy Soc Med, 80(12): 741-745, 1987.

164. Lowe D. G., Chang M. S., Hellmiss R., Chen E., Singh S., Garbers D. L. and Goeddel D. V.: Human atrial natriuretic peptide receptor defines a new paradigm for second messenger signal transduction.

EMBO J, 8(5): 1377-1384, 1989.

165. Lucas K. A., Pitari G. M., Kazerounian S., Ruiz-Stewart I., Park J., Schulz S., Chepenik K. P. and Waldman S. A.: Guanylyl cyclases and signaling by cyclic GMP.

Pharmacol Rev, 52(3): 375-414, 2000.

166. Lyon E. and Miller C.: Current challenges in cystic fibrosis screening. Arch Pathol Lab Med, 127(9): 1133-1139, 2003.

167. Madisen L., Hoar D. I., Holroyd C. D., Crisp M. and Hodes M. E.: DNA banking: the effects of storage of blood and isolated DNA on the integrity of DNA.

Am J Med Genet, 27(2): 379-390, 1987.

116

168. Maisel A.: B-type natriuretic peptide levels: diagnostic and therapeutic potential. Cardiovasc Toxicol, 1(2): 159-164, 2001.

169. Maisel A.: B-type natriuretic peptide levels: diagnostic and prognostic in congestive heart failure: what's next?

Circulation, 105(20): 2328-2331, 2002.

170. Maisel A. S., Clopton P., Krishnaswamy P., Nowak R. M., McCord J., Hollander J. E., Duc P., Omland T., Storrow A. B., Abraham W. T., et al.: Impact of age, race, and sex on the ability of B-type natriuretic peptide to aid in the emergency diagnosis of heart failure: results from the Breathing Not Properly (BNP) multinational study.

Am Heart J, 147(6): 1078-1084, 2004.

171. Mao R., Nelson L. , Kates R., Miller C. E., Donaldson D. L., Tang W., Ward K., Speiser P. W., Mathur R., Kabra M., et al.: Prenatal diagnosis of 21-hydroxylase deficiency caused by gene conversion and rearrangements: pitfalls and molecular diagnostic solutions.

Prenatal Diag, 22(13): 1171-1176, 2002.

172. Marie J. P., Guillemot H. and Hatt P. Y.: [Degree of granularity of the atrial cardiocytes. Morphometric study in rats subjected to different types of water and sodium load].

Pathol Biol (Paris), 24(8): 549-554, 1976.

173. Marttila M., Vuolteenaho O., Ganten D., Nakao K. and Ruskoaho H.: Synthesis and secretion of natriuretic peptides in the hypertensive TGR(mREN-2)27 transgenic rat.

Hypertension, 28(6): 995-1004, 1996.

174. Marttila M., Hautala N., Paradis P., Tóth M., Vuolteenaho O., Nemer M. and Ruskoaho H.: GATA4 mediates activation of the B-type natriuretic peptide gene expression in response to hemodynamic stress.

Endocrinology, 142(11): 4693-4700, 2001.

175. Mathur R., Kabra M., Menon P. S., Ritzen E. M., Lajic S., Wedell A., Domenice S., Billerbeck A. E., Rocha R. O., Nishi M. Y., et al.: Diagnosis and management of congenital adrenal hyperplasia: clinical, molecular and prenatal aspects.

Natl Med J India, 14(1): 26-31, 2001.

176. McDonagh T. A., Robb S. D., Murdoch D. R., Morton J. J., Ford I., Morrison C. E., Tunstall-Pedoe H., McMurray J. J. and Dargie H. J.: Biochemical detection of left -ventricular systolic dysfunction.

Lancet, 351(9095): 9-13, 1998.

177. Mercier B., Lissens W., Audrezet M. P., Bonduelle M., Liebaers I. and Ferec C.: Detection of more than 94% cystic fibrosis mutations in a sample of Belgian population and identification of four novel mutations.

Hum Mutat, 2(1): 16-20, 1993.

178. Miller W. L.: Clinical review 54: Genetics, diagnosis, and management of 21-hydroxylase deficiency.

J Clin Endocrinol Metab, 78(2): 241-246, 1994.

117

179. Minow R. A., Benjamin R. S., Lee E. T. and Gottlieb J. A.: Adriamycin cardiomyopathy--risk factors.

Cancer, 39(4): 1397-1402, 1977.

180. Minutti C. Z., Lacey J. M., Magera M. J., Hahn S. H., McCann M., Schulze A., Cheillan D., Dorche C., Chace D. H., Lymp J. F., et al.: Steroid profiling by tandem mass spectrometry improves the positive predictive value of newborn screening for congenital adrenal hyperplasia.

J Clin Endocrinol Metab, 89(8): 3687-3693, 2004.

181. Moore J. E., Shaw A., Howard J. L., Dooley J. S., Elborn J. S. and Saiman L.: Infection control and the significance of sputum and other respiratory secretions from adult patients with cystic fibrosis.

Ann Clin Microbiol Antimicrob, 3(1): 8, 2004.

182. Mornet E., Boue J., Raux-Demay M., Couillin P., Oury J. F., Dumez Y., Dausset J., Cohen D. and Boue A.: First trimester prenatal diagnosis of 21-hydroxylase deficiency by linkage analysis to HLA -DNA probes and by 17-hydroxyprogesterone determination.

Hum Genet, 73(4): 358-364, 1986.

183. Mornet E., Crete P., Kuttenn F., Raux-Demay M. C., Boue J., White P. C. and Boue A.: Distribution of deletions and seven point mutations on CYP21B genes in three clinical forms of steroid 21-hydroxylase deficiency.

Am J Hum Genet, 48(1): 79-88, 1991.

184. Mouchel N., Tebbutt S. J., Broackes-Carter F. C., Sahota V., Summerfield T., Gregory D. J., Harris A., Rowntree R. K., Vassaux G., McDowell T. L., et al.: The sheep genome contributes to localization of control elements in a human gene with complex regulatory mechanisms.

Genomics, 76(1-3): 9-13, 2001.

185. Mouchel N., Broackes-Carter F., Harris A., Tebbutt S. J., Broackes-Carter F. C., Sahota V., Summerfield T., Gregory D. J., Rowntree R. K., Vassaux G., et al.: Alternative 5' exons of the CFTR gene show developmental regulation.

Hum Mol Genet, 12(7): 759-769, 2003.

186. Muders F., Kromer E. P., Griese D. P., Pfeifer M., Hense H. W., Riegger G. A. and Elsner D.: Evaluation of plasma natriuretic peptides as markers for left ventricular dysfunction.

Am Heart J, 134(3): 442-449, 1997.

187. Nakao K., Ogawa Y., Suga S. and Imura H.: Molecular biology and biochemistry of the natriuretic peptide system. I: Natriuretic peptides.

J Hypertens, 10(9): 907-912, 1992.

188. Németh K., Fekete G., Kiss E., Váradi A., Holics K., Ujhelyi R., Pipiras E. and Réthy L. A.: Analysis of five CFTR mutations in Hungarian cystic fibrosis patients.

J Inherit Metab Dis, 19(3): 378, 1996.

189. Németh K., Holics K., Ujhelyi R., Váradi A., Fekete G., Kiss E., Pipiras E. and Réthy L. A.: [Analysis of five mutations of cystic fibrosis occuring in the Hungarian population].

Orv Hetil, 137(17): 899-903, 1996.

118

190. Németi M., Szabó M., Horvath K., Bolodár A., Papp Z., Szeifert G., Damjanovich L., Tóth M., Tóth Z., Teichmann F., et al.: [Diagnosis of cystic fibrosis by DNA studies in the first trimester of pregnancy].

Orv Hetil, 128(49): 2577-2579, 1987.

191. Németi M., Bolodár A., Papp Z., Szabó M., Veress L., Teichmann F., Munnich A., Huszka M., Török O., Tóth Z., et al.: [Prenatal diagnosis of cystic fibrosis based on DNA analysis].

Orv Hetil, 131(44): 2421-2422, 2425-2426, 1990.

192. Németi M., Papp Z., Szabó M., Horvath K., Bolodár A., Szeifert G., Damjanovich L., Tóth M., Tóth Z., Teichmann F., et al.: First trimester diagnosis of cystic fibrosis with linked DNA probes.

Acta U Carol Med, 36(1-4): 135-138, 1990.

193. Németi M., Louie E., Papp Z. and Johnson J. P.: Molecular analysis of cystic fibrosis in the Hungarian population.

Hum Genet, 87(4): 511-512, 1991.

194. Németi M. and Papp Z.: Cystikus fibrosis. In: Klinikai genetika (Ed. Papp Z.), pp. 455-469. Golden Book Kiadó Kft., Budapest, 1995.

195. New M. I. and Newfield R. S.: Congenital adrenal hyperplasia. Curr Ther Endocrinol Metab, 6: 179-187, 1997.

196. Newfield R. S. and New M. I.: 21-hydroxylase deficiency. Ann N Y Acad Sci, 816: 219-229, 1997.

197. Newman K., Randolph J. and Parson S.: Functional results in young women having clitoral reconstruction as infants.

J Pediatr Surg, 27(2): 180-183; discussion 183-184, 1992.

198. Niederland T., Sólyom J., Sasvári-Székely M. and Nagy S.: [Successful management in congenital adrenal hyperplasia: prenatal diagnosis and therapy].

Gyermekgyógyászat, 48: 373-383, 1997.

199. Omland T., Aakvaag A., Bonarjee V. V., Caidahl K., Lie R. T., Nilsen D. W., Sundsfjord J. A. and Dickstein K.: Plasma brain natriuretic peptide as an indicator of left ventricular systolic function and long-term survival after acute myocardial infarction. Comparison with plasma atrial natriuretic peptide and N-terminal proatrial natriuretic peptide.

Circulation, 93(11): 1963-1969, 1996.

200. Osborne L., Knight R., Santis G. and Hodson M.: A mutation in the second nucleotide binding fold of the cystic fibrosis gene.

Am J Hum Genet, 48(3): 608-612, 1991.

201. Owerbach D., Crawford Y. M. and Draznin M. B.: Direct analysis of CYP21B genes in 21-hydroxylase deficiency using polymerase chain reaction amplification.

Mol Endocrinol, 4(1): 125-131, 1990.

119

202. Owerbach D., Draznin M. B., Carpenter R. J. and Greenberg F.: Prenatal diagnosis of 21-hydroxylase deficiency congenital adrenal hyperplasia using the polymerase chain reaction.

Hum Genet, 89(1): 109-110, 1992.

203. Pandey K. N., Nguyen H. T., Sharma G. D., Shi S. J. and Kriegel A. M.: Ligand-regulated internalization, trafficking, and down-regulation of guanylyl cyclase/atrial natriuretic peptide receptor-A in human embryonic kidney 293 cells.

J Biol Chem, 277(7): 4618-4627, 2002.

204. Pang S., Clark A. T., Freeman L. C., Dolan L. M., Immken L., Mueller O. T., Stiff D. and Shulman D. I.: Maternal side effects of prenatal dexamethasone therapy for fetal congenital adrenal hyperplasia.

J Clin Endocrinol Metab, 75(1): 249-253, 1992.

205. Pardhasaradhi K., Kutty R. K., Gentleman S. and Krishna G.: Expression of mRNA for atrial natriuretic peptide receptor guanylate cyclase (ANPRA) in human retina.

Cell Mol Neurobiol, 14(1): 1-7, 1994.

206. Pardhasaradhi K., Kutty R. K., Bertolotti R. and Krishna G.: Expression of mRNA for atrial natriuretic peptide receptor-A in human liver: detection using RT-PCR.

Drug Metab Rev, 27(1-2): 231-239, 1995.

207. Picciotto M. R., Cohn J. A., Bertuzzi G., Greengard P. and Nairn A. C.: Phosphorylation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.

J Biol Chem, 267(18): 12742-12752, 1992.

208. Plante E., Boliek C., Binkiewicz A. and Erly W. K.: Elevated androgen, brain development and language/learning disabilities in children with congenital adrenal hyperplasia.

Dev Med Child Neurol, 38(5): 423-437, 1996.

209. Poulos J. E., Gower W. R., Jr., Sullebarger J. T., Fontanet H. L. and Vesely D. L.: Congestive heart failure: increased cardiac and extracardiac atrial natriuretic peptide gene expression.

Cardiovasc Res, 32(5): 909-919, 1996.

210. Prader A.: [Genital findings in the female pseudo-hermaphroditism of the congenital adrenogenital syndrome; morphology, frequency, development and heredity of the different genital forms.].

Helv Paediatr Acta, 9(3): 231-248, 1954.

211. Pratt C. B., Ransom J. L. and Evans W. E.: Age-related adriamycin cardiotoxicity in children. Cancer Treat Rep, 62(9): 1381-1385, 1978.

212. Rácz K., Kuchel O., Buu N. T., Gutkowska J., Debinski W., Cantin M. and Genest J.: Zona glome rulosa cell responses to atrial natriuretic factor in genetically hypertensive rats.

Am J Physiol, 251(4 Pt 2): H689-692, 1986.

120

213. Rehemudula D., Nakayama T., Soma M., Takahashi Y., Uwabo J., Sato M., Izumi Y., Kanmatsuse K. and Ozawa Y.: Structure of the type B human natriuretic peptide receptor gene and association of a novel microsatellite polymorphism with essential hypertension.

Circ Res, 84(5): 605-610, 1999.

214. Richards C. S. and Grody W. W.: Prenatal screening for cystic fibrosis: past, present and future. Expert Rev Mol Diagn, 4(1): 49-62, 2004.

215. Riordan J. R., Rommens J. M., Kerem B., Alon N., Rozmahel R., Grzelczak Z., Zielenski J., Lok S., Plavsic N. and Chou J. L.: Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA.

Science, 245(4922): 1066-1073, 1989.

216. Ritzen E. M., Lajic S., Wedell A., Domenice S., Billerbeck A. E., Rocha R. O., Nishi M. Y., Medeiros M. A., Bachega T. A., Budunki V., et al.: How can molecular biology contribute to the management of congenital adrenal hyperplasia?

Horm Res, 53 Suppl 1(2): 34-37, 2000.

217. Robinson T. E., Leung A. N., Northway W. H., Blankenberg F. G., Chan F. P., Bloch D. A., Holmes T. H., Moss R. B., Kauczor H. U., Chen X. J., et al.: Composite spirometric -computed tomography outcome measure in early cystic fibrosis lung disease.

Am J Respir Crit Care, 168(5): 588-593, 2003.

218. Rodman D. M. and Zamudio S.: The cystic fibrosis heterozygote--advantage in surviving cholera?

Med Hypotheses, 36(3): 253-258, 1991.

219. Rollin R., Mediero A., Roldan-Pallares M., Fernandez-Cruz A. and Fernandez-Durango R.: Natriuretic peptide system in the human retina.

Mol Vis, 10: 15-22, 2004.

220. Rommens J. M., Iannuzzi M. C., Kerem B., Drumm M. L., Melmer G., Dean M., Rozmahel R., Cole J. L., Kennedy D. and Hidaka N.: Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.

Science, 245(4922): 1059-1065, 1989.

221. Rosenstein B. J. and Cutting G. R.: The diagnosis of cystic fibrosis: a consensus statement. Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel.

J Pediatr, 132(4): 589-595, 1998.

222. Rosser Z. H., Zerjal T., Hurles M. E., Adojaan M., Alavantic D., Amorim A., Amos W., Armenteros M., Arroyo E., Barbujani G., et al.: Y-chromosomal diversity in Europe is clinal and influenced primarily by geography, rather than by language.

Am J Hum Genet, 67(6): 1526-1543, 2000.

223. Rowntree R. K., Vassaux G., McDowell T. L., Howe S., McGuigan A., Phylactides M., Huxley C., Harris A., Chow Y. H., Plumb J., et al.: An element in intron 1 of the CFTR gene augments intestinal expression in vivo.

Hum Mol Genet, 10(14): 1455-1464, 2001.

121

224. Rozmahel R., Wilschanski M., Matin A., Plyte S., Oliver M., Auerbach W., Moore A., Forstner J., Durie P., Nadeau J., et al.: Modulation of disease severity in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator deficient mice by a secondary genetic factor.

Nat Genet, 12(3): 280-287, 1996.

225. Rumsby G. and Honour J. W.: In vitro gene amplification for prenatal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia.

J Med Genet, 27(11): 676-678, 1990.

226. Rumsby G., Massoud A. F., Avey C. and Brook C. G.: Non-expression of a common mutation in the 21-hydroxylase gene: implications for prenatal diagnosis and carrier testing.

J Med Genet, 33(9): 798-799, 1996.

227. Rutgers J. L., Young R. H. and Scully R. E.: The testicular "tumor" of the adrenogenital syndrome. A report of six cases and review of the literature on testicular masses in patients with adrenocortical disorders.

Am J Surg Pathol, 12(7): 503-513, 1988.

228. Saiman L.: Microbiology of early CF lung disease. Paediatr Respir Rev, 5 Suppl A: S367-369, 2004.

229. Sangiuolo F., Novelli G., Murru S. and Dallapiccola B.: A serine-to-arginine (AGT-to-CGT) mutation in codon 549 of the CFTR gene in an Italian patient with severe cystic fibrosis.

Genomics, 9(4): 788-789, 1991.

230. Santamaria F., Grillo G., Guidi G., Rotondo A., Raia V., de Ritis G., Sarnelli P., Caterino M. and Greco L.: Cystic fibrosis: when should high-resolution computed tomography of the chest Be obtained?

Pediatrics, 101(5): 908-913, 1998.

231. Schaff Z., Rácz K., Gutkowska J., Sergev O., Kiss R., Varga I., Szabó Z., Szende B., Lapis K., Fehér J., et al.: Immunohistochemical localization of atrial natriuretic peptide in primary aldosteronism.

J Exp Pathol, 3(3): 229-242, 1987.

232. Schmitt K., Tulzer G., Merl M., Aichhorn G., Grillenberger A., Wiesinger G. and Hofstadler G.: Early detection of doxorubicin and daunorubicin cardiotoxicity by echocardiography: diastolic versus systolic parameters.

Eur J Pediatr, 154(3): 201-204, 1995.

233. Schuler D., Horváth E., Koós R., Kajtar P., Zimonyi I., Virág I., Masát P., Garami M. and Borsi J. D.: Safety of dexrazoxane in children with all undergoing anthracycline therapy: preliminary results of a prospective pilot study.

Pediatr Hematol Oncol, 14(1): 93-94, 1997.

234. Schwab K. O., Kruse K., Dorr H. G., Horwitz A. E. and Spingler H.: [The effect of maternal dexamethasone treatment after the 12th week of pregnancy on fetal genital development in adrenogenital syndrome with 21-hydroxylase deficiency].

Monatsschr Kinderh, 137(5): 293-296, 1989.

122

235. Scotet V., Barton D. E., Watson J. B., Audrezet M. P., McDevitt T., McQuaid S., Shortt C., De Braekeleer M., Ferec C. and Le Marechal C.: Comparison of the CFTR mutation spectrum in three cohorts of patients of Celtic origin from Brittany (France) and Ireland.

Hum Mutat, 22(1): 105, 2003.

236. Scott F. W. and Pitt T. L.: Identification and characterization of transmissible Pseudomonas aeruginosa strains in cystic fibrosis patients in England and Wales.

J Med Microbiol, 53(Pt 7): 609-615, 2004.

237. Seilhamer J. J., Arfsten A., Miller J. A., Lundquist P., Scarborough R. M., Lewicki J. A. and Porter J. G.: Human and canine gene homologs of porcine brain natriuretic peptide.

Biochem Bioph Res Co, 165(2): 650-658, 1989.

238. Serban D. E., Florescu P., Miu N., Cade A., Walters M. P., McGinley N., Firth J., Brownlee K. G., Conway S. P., Littlewood J. M., et al.: Fibrosing colonopathy revealing cystic fibrosis in a neonate before any pancreatic enzyme supplementation.

J Pediatr Gastr Nutr, 35(3): 356-359, 2002.

239. Sheppard D. N. and Welsh M. J.: Structure and function of the CFTR chloride channel. Physiol Rev, 79(1 Suppl): S23-45, 1999.

240. Shiojima I., Komuro I., Oka T., Hiroi Y., Mizuno T., Takimoto E., Monzen K., Aikawa R., Akazawa H., Yamazaki T., et al.: Context -dependent transcriptional cooperation mediated by cardiac transcription factors Csx/Nkx-2.5 and GATA-4.

J Biol Chem, 274(12): 8231-8239, 1999.

241. Shmerling D. H., Walkowiak J., Cichy W. K. and Herzig K. H.: Fecal immunoreactive lipase, a simple diagnostic test for cystic fibrosis.

Eur J Pediatr, 158(4): 339, 1999.

242. Shwachman H. and Kulczycki L. L.: Long-term study of one hundred five patients with cystic fibrosis: studies made over a five- to fourteen-year period.

Am J Dis Child, 96: 6-15, 1958.

243. Shwachman H., Kowalski M. and Khaw K. T.: Cystic fibrosis: a new outlook. 70 patients above 25 years of age. 1977.

Medicine (Baltimore), 74(1): 48-58; discussion 58-62, 1995.

244. Siahanidou T., Nikolaidou P., Doudounakis S., Georgouli E., Papadimitriou A. and Karpathios T.: Plasma immunoreactive endothelin levels in children with cystic fibrosis.

Acta Paediatr, 89(8): 915-920, 2000.

245. Smaglik P.: Researchers take a gamble on the human genome. Nature, 405(6784): 264, 2000.

246. Sólyom J., Hammond G. L., Vihko R., Gonzalez R. R., Maentausta O., Hughes I. A., Babosa M., Dizseri T., Galambosi L., Hervei S., et al.: A method for identification and follow-up of patients with a steroid-21-hydroxylase deficiency.

Clin Chim Acta, 92(2): 117-124, 1979.

123

247. Sólyom J.: Blood-spot 17 alpha-hydroxyprogesterone radioimmunoassay in the follow-up of congenital adrenal hyperplasia.

Clin Endocrinol, 14(6): 547-553, 1981.

248. Sólyom J., Hervei S., Marossy P., Sólyom E., Babosa M. and Szombathy G.: "Dot-17 alpha-hydroxyprogesterone" radioimmunoassay for identification of congenital adrenal hyperplasia in young infants.

Acta Paediatr Scand, 70(6): 913-917, 1981.

249. Sólyom J., Babosa M., Dizseri T., Galambosi L., Hervei S., Marossy P., Sólyom E., Vágvölgyi E. and Szombathy G.: [The 17-hydroxyprogesterone blood test in newborn and young infants with congenital adrenal hyperplasia].

Orv Hetil, 123(3): 139-145, 1982.

250. Sólyom J. and Kürti K.: [Cases of late onset and latent steroid-21-hydroxylase defect]. Orv Hetil, 125(23): 1377-1380, 1383, 1984.

251. Sólyom J., Gács G., Keszei K., Láng K., Orley J., Petho I., Ságodi L. and Kürti K.: Detection of late-onset adrenal hyperplasia in girls with peripubertal virilization.

Acta Endocrinol (Copenh), 115(3): 413-418, 1987.

252. Sólyom J., Hughes I. A., Babosa M., Dizseri T., Galambosi L., Hervei S., Marossy P., Sólyom E., Vágvölgyi E. and Szombathy G.: [Screening for congenital adrenal hyperplasia in Hungary].

Orv Hetil, 130(37): 1979-1982, 1985-1976, 1989.

253. Sólyom J., Gonzalez R. R., Maentausta O., Vihko R., Hughes I. A., Babosa M., Dizseri T., Galambosi L., Hervei S., Marossy P., et al.: [Management of congenital adrenal hyperplasia].

Orv Hetil, 133(25): 1539-1544; 1547, 1992.

254. Sood M., Hambleton G., Super M., Fraser W. D., Adams J. E., Mughal M. Z., Kanga J., Kuhn R., Craigmyle L., Haverstock D., et al.: Bone status in cystic fibrosis.

Arch Dis Child, 84(6): 516-520, 2001.

255. Speiser P. W., Laforgia N., Kato K., Pareira J., Khan R., Yang S. Y., Whorwood C., White P. C., Elias S., Schriock E., et al.: First trimester prenatal treatment and molecular genetic diagnosis of congenital adrenal hyperplasia (21-hydroxylase deficiency).

J Clin Endocrinol Metab, 70(4): 838-848, 1990.

256. Speiser P. W., Serrat J., New M. I. and Gertner J. M.: Insulin insensitivity in adrenal hyperplasia due to nonclassical steroid 21-hydroxylase deficiency.

J Clin Endocrinol Metab, 75(6): 1421-1424, 1992.

257. Speiser P. W., Mathur R., Kabra M., Menon P. S., Ritzen E. M., Lajic S., Wedell A., Domenice S., Billerbeck A. E., Rocha R. O., et al.: Molecular diagnosis of CYP21 mutations in congenital adrenal hyperplasia: implications for genetic counseling.

Am J Pharmacogenomics, 1(2): 101-110, 2001.

258. Speiser P. W.: Improving neonatal screening for congenital adrenal hyperplasia. J Clin Endocrinol Metab, 89(8): 3685-3686, 2004.

124

259. Standaert T. A., Boitano L., Emerson J., Milgram L. J., Konstan M. W., Hunter J., Berclaz P. Y., Brass L., Zeitlin P. L., Hammond K., et al.: Standardized procedure for measurement of nasal potential difference: an outcome measure in multicenter cystic fibrosis clinical trials.

Pediatr Pulm, 37(5): 385-392, 2004.

260. Steinherz L. J., Steinherz P. G., Tan C. T., Heller G. and Murphy M. L.: Cardiac toxicity 4 to 20 years after completing anthracycline therapy.

JAMA, 266(12): 1672-1677, 1991.

261. Steinherz L. J., Steinherz P. G. and Tan C.: Cardiac failure and dysrhythmias 6-19 years after anthracycline therapy: a series of 15 patients.

Med Pediatr Oncol, 24(6): 352-361, 1995.

262. Stern R. C., Boat T. F., Abramowsky C. R., Matthews L. W., Wood R. E. and Doershuk C. F.: Intermediate-range sweat chloride concentration and Pseudomonas bronchitis. A cystic fibrosis variant with preservation of exocrine pancreatic function.

JAMA, 239(25): 2676-2680, 1978.

263. Stern R. C., Borkat G., Hirschfeld S. S., Boat T. F., Matthews L. W., Liebman J., Doershuk C. F., Abramowsky C. R. and Wood R. E.: Heart failure in cystic fibrosis. Treatment and prognosis of cor pulmonale with failure of the right side of the heart.

Am J Dis Child, 134(3): 267-272, 1980.

264. Stern R. C., Boat T. F. and Doershuk C. F.: Obstructive azoospermia as a diagnostic criterion for the cystic fibrosis syndrome.

Lancet, 1(8286): 1401-1404, 1982.

265. Strachan T., Sinnott P. J., Smeaton I., Dyer P. A. and Harris R.: Prenatal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia.

Lancet, 2(8570): 1272-1273, 1987.

266. Stratakis C. A. and Bossis I.: Genetics of the adrenal gland. Rev Endocr Metab Disord, 5(1): 53-68, 2004.

267. Stuhrmann M., Dork T., Fruhwirth M., Golla A., Skawran B., Antonin W., Ebhardt M., Loos A., Ellemunter H., Schmidtke J., et al.: Detection of 100% of the CFTR mutations in 63 CF families from Tyrol.

Clin Genet, 52(4): 240-246, 1997.

268. Szabó M., Münnich A., Teichmann F., Huszka M., Veress L., Papp Z., Németi M., Bolodár A., Török O., Tóth Z., et al.: Discriminant analysis for assessing the value of amniotic fluid microvillar enzymes in the prenatal diagnosis of cystic fibrosis.

Prenatal Diag, 10(12): 761-769, 1990.

269. Szabó M., Teichmann F., Huszka M., Münnich A., Veress L., Papp Z., Bolodár A., Horváth K., Németi M., Damjanovich L., et al.: Genetic counselling and prenatal diagnosis of cystic fibrosis in Debrecen (Hungary) - prenatal diagnosis by microvillar enzyme assay from amniotic fluid.

Acta U Carol Med, 36(1-4): 132-134, 1990.

125

270. Szabó M., Veress L., Teichmann F., Münnich A., Huszka M., Papp Z., Török O., Tóth Z., Bolodár A., Horváth K., et al.: Amniotic fluid microvillar enzyme activity in fetal malformations.

Clin Genet, 38(5): 340-345, 1990.

271. Sztriha L., Gyurkovits K., Ormos J. and Monus Z.: Congenital hepatic fibrosis with polycystic disease of the kidneys.

Hepatogastroenterology, 29(6): 259-262, 1982.

272. Takahashi Y., Nakayama T., Soma M., Izumi Y. and Kanmatsuse K.: Organization of the human natriuretic peptide receptor A gene.

Biochem Bioph Res Co, 246(3): 736-739, 1998.

273. Takimoto E., Mizuno T., Terasaki F., Shimoyama M., Honda H., Shiojima I., Hiroi Y., Oka T., Hayashi D., Hirai H., et al.: Up-regulation of natriuretic peptides in the ventricle of Csx/Nkx2-5 transgenic mice.

Biochem Bioph Res Co, 270(3): 1074-1079, 2000.

274. Tanaka I., Misono K. S. and Inagami T.: Atrial natriuretic factor in rat hypothalamus, atria and plasma: determination by specific radioimmunoassay.

Biochem Bioph Res Co, 124(2): 663-668, 1984.

275. Tanaka K., Gregersen N., Ribes A., Kim J., Kolvraa S., Winter V., Eiberg H., Martinez G., Deufel T., Leifert B., et al.: A survey of the newborn populations in Belgium, Germany, Poland, Czech Republic, Hungary, Bulgaria, Spain, Turkey, and Japan for the G985 variant allele with haplotype analysis at the medium chain Acyl-CoA dehydrogenase gene locus: clinical and evolutionary consideration.

Pediatr Res, 41(2): 201-209, 1997.

276. Taussig L. M.: Cystic fibrosis: An overview. In: Cystic Fibrosis (Ed. Taussig L. M.). Thieme -Stratton, New York, 1984.

277. Taylor D. G. and Kaplan H. R.: New Antihypertensive Drugs. In: New Therapeutic Strategies in Hypertension (Eds. Kaplan N. M., Brenner B. M. and Laragh

J. H.), pp. 125-139. Raven Press, New York, 1989.

278. Terheggen-Lagro S., Truijens N., van Poppel N., Gulmans V., van der Laag J., van der Ent C., Sood M., Hambleton G., Super M., Fraser W. D., et al.: Correlation of six different cystic fibrosis chest radiograph scoring systems with clinical parameters.

Pediatr Pulm, 35(6): 441-445, 2003.

279. Theodoropoulou M., Barta C., Szoke M., Guttman A., Staub M., Niederland T., Solyom J., Fekete G. and Sasvari-Szekely M.: Prenatal diagnosis of steroid 21-hydroxylase deficiency by allele-specific amplification.

Fetal Diagn Ther, 16(4): 237-240, 2001.

280. Thibault G., Garcia R., Cantin M. and Genest J.: Atrial natriuretic factor. Characterization and partial purification.

Hypertension, 5(2 Pt 2): I75-80, 1983.

126

281. Thuerauf D. J., Hanford D. S. and Glembotski C. C.: Regulation of rat brain natriuretic peptide transcription. A potential role for GATA-related transcription factors in myocardial cell gene expression.

J Biol Chem, 269(27): 17772-17775, 1994.

282. Tikkanen I., Fyhrquist F., Metsarinne K. and Leidenius R.: Plasma atrial natriuretic peptide in cardiac disease and during infusion in healthy volunteers.

Lancet, 2(8446): 66-69, 1985.

283. Tokola H., Hautala N., Marttila M., Magga J., Pikkarainen S., Kerkela R., Vuolteenaho O. and Ruskoaho H.: Mechanical load-induced alterations in B-type natriuretic peptide gene expression.

Can J Physiol Pharmacol, 79(8): 646-653, 2001.

284. Torres N., Mello M. P., Germano C. M., Elias L. L., Moreira A. C. and Castro M.: Phenotype and genotype correlation of the microconversion from the CYP21A1P to the CYP21A2 gene in congenital adrenal hyperplasia.

Braz J Med Biol Res, 36(10): 1311-1318, 2003.

285. Török D., Muhl A., Votava F., Heinze G., Sólyom J., Crone J., Stockler-Ipsiroglu S., Waldhauser F., Kovács J., Lebl J., et al.: Stability of 17alpha-hydroxyprogesterone in dried blood spots after autoclaving and prolonged storage.

Clin Chem, 48(2): 370-372, 2002.

286. Török D., Eckhardt G., Sólyom J., Halász Z., Garami M., Homoki J., Fekete G., Muhl A., Votava F., Heinze G., et al.: Twenty years experience in rapid identification of congenital adrenal hyperplasia in Hungary.

Eur J Pediatr, 162(12): 844-849, 2003.

287. Troughton R. W., Frampton C. M., Yandle T. G., Espiner E. A., Nicholls M. G. and Richards A. M.: Treatment of heart failure guided by plasma aminoterminal brain natriuretic peptide (N-BNP) concentrations.

Lancet, 355(9210): 1126-1130, 2000.

288. Tsutamoto T., Wada A., Maeda K., Hisanaga T., Maeda Y., Fukai D., Ohnishi M., Sugimoto Y. and Kinoshita M.: Attenuation of compensation of endogenous cardiac natriuretic peptide system in chronic heart failure: prognostic role of plasma brain natriuretic peptide concentration in patients with chronic symptomatic left ventricular dysfunction.

Circulation, 96(2): 509-516, 1997.

289. Tulassay T.: [Atrial natriuretic peptide: a new hormone affecting fluid volume and electrolyte balance].

Orv Hetil, 128(7): 343-347, 1987.

290. Tulassay T., Rascher W., Láng R. E., Seyberth H. W., Scharer K. and Seri I.: Atrial natriuretic peptide and other vasoactive hormones in nephrotic syndrome.

Kidney Int, 31(6): 1391-1395, 1987.

291. Tulassay T., Seri I. and Rascher W.: Atrial natriuretic peptide and extracellular volume contraction after birth.

Acta Paediatr Scand, 76(3): 444-446, 1987.

127

292. Tulassay T.: Pitvari natriureticus peptid és egyéb vasoactiv hormonok szabályozó szerepe a folyadék- és elektrolytháztartásban.

Doktori értekezés. Semmelweis Orvostudományi Egyetem, Budapest, 1988.

293. Tummler B., Storrs T., Dziadek V., Dork T., Meitinger T., Golla A., Bertele-Harms R. M., Harms H. K., Schroder E., Claass A., et al.: Geographic distribution and origin of CFTR mutations in Germany.

Hum Genet, 97(6): 727-731, 1996.

294. von Harsdorf R., Edwards J. G., Shen Y. T., Kudej R. K., Dietz R., Leinwand L. A., Nadal-Ginard B. and Vatner S. F.: Identification of a cis -acting regulatory element conferring inducibility of the atrial natriuretic factor gene in acute pressure overload.

J Clin Invest, 100(5): 1294-1304, 1997.

295. Von Hoff D. D., Layard M. W., Basa P., Davis H. L., Jr., Von Hoff A. L., Rozencweig M. and Muggia F. M.: Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure.

Ann Intern Med, 91(5): 710-717, 1979.

296. Vrettou C., Tzetis M., Traeger-Synodinos J., Palmer G. and Kanavakis E.: Multiplex sequence variation detection throughout the CFTR gene appropriate for preimplantation genetic diagnosis in populations with heterogeneity of cystic fibrosis mutations.

Mol Hum Reprod, 8(9): 880-886, 2002.

297. Wagner K., Zach M. and Rosenkranz W.: Frequency of delta F508 and haplotype association in Austrian cystic fibrosis families.

Hum Genet, 89(4): 437-438, 1992.

298. Wainwright B. J., Scambler P. J., Schmidtke J., Watson E. A., Law H. Y., Farrall M., Cooke H. J., Eiberg H. and Williamson R.: Localization of cystic fibrosis locus to human chromosome 7cen-q22.

Nature, 318(6044): 384-385, 1985.

299. Walkowiak J., Cichy W. K. and Herzig K. H.: Comparison of fecal elastase-1 determination with the secretin-cholecystokinin test in patients with cystic fibrosis.

Scand J Gastroentero, 34(2): 202-207, 1999.

300. Wang L. and Freedman S. D.: Laboratory tests for the diagnosis of cystic fibrosis. Am J Clin Pathol, 117 Suppl: S109-115, 2002.

301. Watson E. K., Mayall E. S., Simova L., Thompson E. M., Warner J. O., Williamson R. and Williams C.: The incidence of delta F508 CF mutation, and associated haplotypes, in a sample of English CF families.

Hum Genet, 85(4): 435-436, 1990.

302. Wauters J. G., Hendrickx J., Coucke P., Vits L., Stuer K., van Schil L., van der Auwera B. J., Van Elsen A., Dumon J., Willems P. J., et al.: Frequency of the phenylalanine deletion (delta F508) in the CF gene of Belgian cystic fibrosis patients.

Clin Genet, 39(2): 89-92, 1991.

128

303. Wedell A., Ritzen E. M., Haglund-Stengler B. and Luthman H.: Steroid 21-hydroxylase deficiency: three additional mutated alleles and establishment of phenotype-genotype relationships of common mutations.

P Natl Acad Sci USA, 89(15): 7232-7236, 1992.

304. Wedell A. and Luthman H.: Steroid 21-hydroxylase (P450c21): a new allele and spread of mutations through the pseudogene.

Hum Genet, 91(3): 236-240, 1993.

305. Wedell A., Thilen A., Ritzen E. M., Stengler B. and Luthman H.: Mutational spectrum of the steroid 21-hydroxylase gene in Sweden: implications for genetic diagnosis and association with disease manifestation.

J Clin Endocrinol Metab, 78(5): 1145-1152, 1994.

306. Weintraub H., Davis R., Tapscott S., Thayer M., Krause M., Benezra R., Blackwell T. K., Turner D., Rupp R., Hollenberg S., et al.: The myoD gene family: nodal point during specification of the muscle cell lineage.

Science, 251(4995): 761-766, 1991.

307. Welsh M. J. and Smith A. E.: Molecular mechanisms of CFTR chloride channel dysfunction in cystic fibrosis.

Cell, 73(7): 1251-1254, 1993.

308. Welsh M. J. and Smith A. E.: Cystic fibrosis. Sci Am, 273(6): 52-59, 1995.

309. White P. C., Grossberger D., Onufer B. J., Chaplin D. D., New M. I., Dupont B. and Strominger J. L.: Two genes encoding steroid 21-hydroxylase are located near the genes encoding the fourth component of complement in man.

P Natl Acad Sci USA, 82(4): 1089-1093, 1985.

310. White P. C., New M. I. and Dupont B.: Congenital adrenal hyperplasia (1). N Engl J Med, 316(24): 1519-1524, 1987.

311. White P. C., New M. I. and Dupont B.: Congenital adrenal hyperplasia (2). N Engl J Med, 316(25): 1580-1586, 1987.

312. White P. C. and Speiser P. W.: Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. Endocr Rev, 21(3): 245-291, 2000.

313. Wilson R. C., Mercado A. B., Cheng K. C. and New M. I.: Steroid 21-hydroxylase deficiency: genotype may not predict phenotype.

J Clin Endocrinol Metab, 80(8): 2322-2329, 1995.

314. Witchel S. F., Bhamidipati D. K., Hoffman E. P. and Cohen J. B.: Phenotypic heterogeneity associated with the splicing mutation in congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency.

J Clin Endocrinol Metab, 81(11): 4081-4088, 1996.

129

315. Wong E. B., Regnis J., Shnier R. C., Bye P. T., Stewart M. E., Friedrichs F., Kusenbach G., Skopnik H., Benz-Bohm G., Dohmen H., et al.: The relationship between tests of lung function and three chest radiological scoring systems in patients with cystic fibrosis.

Australas Radiol, 37(3): 265-269, 1993.

316. Wu J., LaPointe M. C., West B. L. and Gardner D. G.: Tissue-specific determinants of human atrial natriuretic factor gene expression in cardiac tissue.

J Biol Chem, 264(11): 6472-6479, 1989.

317. Wu J. P., Kovacic-Milivojevic B., Lapointe M. C., Nakamura K. and Gardner D. G.: Cis -active determinants of cardiac-specific expression in the human atrial natriuretic peptide gene.

Mol Endocrinol, 5(9): 1311-1322, 1991.

318. Wurster K. G., Ranke M. B., Heilbronner H. and Gupta D.: Amniotic fluid levels of 17 alpha-hydroxyprogesterone during human pregnancy: pre-natal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency.

Endokrinologie, 80(2): 142-150, 1982.

319. Yamamoto K., Burnett J. C., Jr., Jougasaki M., Nishimura R. A., Bailey K. R., Saito Y., Nakao K. and Redfield M. M.: Superiority of brain natriuretic peptide as a hormonal marker of ventricular systolic and diastolic dysfunction and ventricular hypertrophy.

Hypertension, 28(6): 988-994, 1996.

320. Yasue H., Yoshimura M., Sumida H., Kikuta K., Kugiyama K., Jougasaki M., Ogawa H., Okumura K., Mukoyama M. and Nakao K.: Localization and mechanism of secretion of B-type natriuretic peptide in comparison with those of A-type natriuretic peptide in normal subjects and patients with heart failure.

Circulation, 90(1): 195-203, 1994.

321. Yilmaz E., Erdem H., Ozguc M., Coskun T., Ozcelik U., Gocmen A., Ozalp I., Hundrieser J., Bremer S., Peinemann F., et al.: Study of 12 mutations in Turkish cystic fibrosis patients.

Hum Hered, 45(3): 175-177, 1995.

322. Yoshimura T., Yoshimura M., Yasue H., Ito M., Okamura H., Mukoyama M. and Nakao K.: Plasma concentration of atrial natriuretic peptide and brain natriuretic peptide during normal human pregnancy and the postpartum period.

J Endocrinol, 140(3): 393-397, 1994.

323. Zapletal A., Houstek J., Samanek M., Vavrova V. and Srajer J.: Lung function abnormalities in cystic fibrosis and changes during growth.

B Eur Physiopathol Respir, 15(4): 575-592, 1979.

324. Zielenski J., Bozon D., Kerem B., Markiewicz D., Durie P., Rommens J. M. and Tsui L. C.: Identification of mutations in exons 1 through 8 of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene.

Genomics, 10(1): 229-235, 1991.

130

325. Zielenski J., Rozmahel R., Bozon D., Kerem B., Grzelczak Z., Riordan J. R., Rommens J. and Tsui L. C.: Genomic DNA sequence of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene.

Genomics, 10(1): 214-228, 1991.

326. Zielenski J., Corey M., Rozmahel R., Markiewicz D., Aznarez I., Casals T., Larriba S., Mercier B., Cutting G. R., Krebsova A., et al.: Detection of a cystic fibrosis modifier locus for meconium ileus on human chromosome 19q13.

Nat Genet, 22(2): 128-129, 1999.